SU659083A3 - Способ получени сульфата октапептидамида-терминального октапетида холецистокининпанкреазимина - Google Patents

Description

октапептидамида используют соединени  формулы II. JiC-ASp-Tar-Met-Gly-Trp-mi-A9p-PheM уFOPW где X - трет-бутилоксикарбонильна , о6,ос.-диметил- (3,5-диметокси) -бензильма  группа, у - трет-бутилоксигруппа, W - гидроксильна  группа, For - формильна  группа, в качестве сульфирующего агента используют комплекс третичного амина, содержащего по крайней мере одну алкильную группу и трехокись серы, процесс провод т в диоксане с последующей отработкой полученного сульфа та гидроокисью щелочного металла и последующим удалением оставшихс  защитных групп ацидолизом. Предпочтительными вариантами,  вл ютс  использование комплекса-третичного амина с трехокнсьюсеры в 20 30-кратном избь1тке, использование в качестве комплекса комплексного соединени  - N-метилморфолина с трехокисью серы, проведение ацидолиэа динатриевой соли сульфата октапептид а;мид обработк 6й последнего смесью из 70-85% трифторуксусной кислоты, 5-10% меркаптоэтанола, 5-10% воды и 5-10% анизола или меркаптоэтанолсул фокислот.ой, растворимой в лед нойук сусной кислоте. Осуществление сульфировани  октапептидамида формулы II в указанных услови х позвол ет получить сульфат окта пептидамида формулы Г с выходом 77%. Исходный защищенный октапептид (формулы IT) получают постепенным .наращиванием пептидной цепи конденсацией аминокислотных фрагментов с использованием известных методов пептидной химии, например, азидного карбодиимидного, метода активирован ных эфиров и т.п. 3. Не участвующи в реакции функциональные группы защи щают известными защитными группами, которые после проведени  реакции могут быть легко отщеплены гидролиз ацидолизом или другими известными м тодами, селективно или одновременно Азот индола триптофановой молекулы защищают фррмильной группой, поскап куэТа группа при проводимом во вре синтеза молекулы пептида ацидолизе преп тствует образованию нежелатель ных производных третичного бутила. Защищенный октапептидамид формулы II обрабатывают раствором комплек са N-метилморфолина и трехокиси серы (вз том в 20-30-кратном избытке) в диоксане или в смеси диоксана в дим тилформамиде. Комплекс получают в р зультате реакции обмена между клорсульфоновой кислотой и N-метилморфолином 4. 834 Полученный зацщщенный сульфат октапептидамида перевод т в натриевую соль с помощью водного раствора 2 м эквивалентного едкого натра, затем защитные группы трет-булгилоксикарбонила и: трет-бутилокси группу удал ют, обрабатыва  смесью 70-85 об.% трифторкислоты , 5-10 об.% маркаптоэтанола , 5-10 об.% воды и 5-10 об.% анизола или 3 м раствором меркаптоэтансульфокислоты в лед ной уксусной кислоте. Получают целевой сульфат октапептидамида . Если требуетс  дополнительна  очистка, продукт затем хроматографией на колонке с силиг кагелем с применением дл  элюировани  смеси равных частей этилацетата и смеси пиридина, уксусной кислоты и воды в отношении 20:6:11. Получаемый согласно изобретению с высокой чистотой и с высоким выходом октапептидамидсульфатный эфир формулы I по своим характерным физикохимическим свойствам и фармакологическим действи м идентичен с продуктом , полученным по известным методам. При дозах 2-10 мг/кг, при внутривенном применении на собаках, это соединение вызывает значительное сокращение желчного пузыр  и расслабление сфинктера Одди. Продукт можно примен ть как дл  диагностики, так и дл  терапии . Температуру длавлени  соединений определ ют в аппарате Тоттоли. Тонкослойную хроматографию провод т на пластинках из силикагел  (силикагель по Шталю) в следующих системах растворителей: этилацетат-(пиридин-уксусна  кислота-вода 20:6:11)1:1 (1); этилацетат-(пиридин-уксусна  кислота-вода 20:6:11) 6: 4. (2); этилацетат-(пиридин-уксусна  кислота-вода 20:6:11) (3). Пример 1. L-Аспарагил-О-сульфат -Ь-тирозил-Ь-мети онилглицил -L-триптофил-Ь-метионил-Ь-аспарагил-Ь-фенилаланинамид . 1,6 мл (25 ммоль) хлорсульфоновой кислоты раствор ют в 2 мл хлороформа и смешивают при при слабом перемешивании с раствором из 3,3 мл (30 ммоль) N-метилморфолина в смеси из 3 мл диоксана и 3 мл диметилформамида . К образованной суспензии через 5 мин добавл ют раствор из 1,25 г (1,0 ммоль) трет-бутилоксикарбонил- -трет-бутиласпарагил-L-тирозил-L-мeтиoнилглицил-N-фopмил-L-тpиriтoфил-Ь-метионил-Ь-аспарагил-Ь-фенилаланиламида в 8 мл диметилформамида. Смесь перемешивают при комнатной температуре 3 ч, затем охлаждают до при перемешивании, добавл ют 5 мл 4 и.едкого натра. Раствор упаривают досуха, остаток растирают с 20 мл оклажденной до воды, нерастворимый прЪдукт отфильтровывают, дважды промыВают водой (каждый раз 20 мл), затем один раз 20 мл эфира. Полученный сырой защищенный октапептидамидсульфатный эфир раствор ют затем в смеси из 25 мл метанола и 25 мл воды и величину рН раствора поддерживают, добавив 2 мл 4 н. едкого натра, около 8.,Через 20 мин раствор упаривают, остаток растирают со смесью 1:1 ацетона и эфира, отфильтровывают и промывают эфиром. Полученный продукт раствор ют в охлажденной до сме .си из 8 мл трифторуксусной кислоты, 1 мл воды, 1 мл анизола и 1 мл меркаптоэтанола , раствор выдерживают 3 ч при 15-20с и затем при перемешивании вливают в 100 мл эфира. Получают 0,90 г Ь-аспарагил-О-сульфат-Ь-тирозил-Ь-метионилглицил-Ьг -триптофилметионил-Ь-аспарагил-Ь-фенилаланинамида (77% от теоретичес-U кого); R .f, (1) 0,4. В случае необходимости конечный продукт чист т с помощью хроматографии на колонке, содерл ащей 80 г силикагел , в качестве растворител  примен ют смесь этилацетата , пиридина, лед ной уксусной кислоты и воды в соотношении 37:20: :б:11.

Примен емый в качестве исходного вещества трет-бутилоксикарбонил- -трет-бутил-L-аспарагил-Ь-тирозил-Ь-метонил-Ы-формил-Ь-триптофил-Ь-метионил-Ь-аспарагил-Ь-фенилаланинамид получают следующим образом:

Д. N-трет-бутилоксикарбонил-N -формил-Ь-триптофил-Ь-метионил-Ь-аспарагил-ь-фенилаланинамид .

22,34 г (50 ммоль) Ь-метионил-Ь-аспарагил-Ь-фенилаланинамидгидрохлорида раствор ют в 200 мл диметилформамида , смешивают с 11,1 мл (100 ммоль) N-метилморфолина и 23,9 (50 ммоЛь) N-трет-бутилоксикарбонил-Ы-формил-Ь-триптофанпентахлорфенилового эфира. Величину рН раствора регулируют добавкой остального N-метилморфолина до 7-7,5. Через 12 ч реакционную смесь упаривают до 50 мл и при интенсивном перемешивании вливают в охлажденную до-0°С смесь из 200 мл 5%-ного раствора гидросульфата кали  и 100 мл не содержащего перекиси эфира. Осажденный продукт отфильтровывают, промывают эфиром и сушат. Получают 26 г чистого третбутилоксикарбонилтетрапептидамида (72% от теоретического) ; т .пл. -22( в диметилформамиде); Ц(..

Б. трет-Бутилоксикарбонил-Ь-метионилглицинпентахлорфениловый эфир.

Claims (4)

1,9 г (6,2 ммоль) трет-бутилоксикарбонил-Ь-метионилглицина и. 1,92 г (7,2 ммоль) пентахлорфенола раствор ют в 31 мл диметиЛформамида. Смесь охлаждают до 0°С, по капл м при перемешивании к ней добавл ют раствор 1,41 г (6,85 ммоль) дициклогексилкарбодиимида в 6,2 мл диметилформамида и продолжают перемешивать при той же температуре в течение 1 ч. Реакционную смесь выдерживают ночь при комнатной температуре, затем выпавшую в осадок дициклогексилмочевину удал ют фильтрованием и фильтрат упаривают при пониженном давлении. Остаток растирают с , фильтруют, промывают небольшим количеством эфира и перекристаллизовывают из 15-кратного

количества этанола. Получают 2,19 г трет-бутилоксикарбонил-Ь-метионилглицинпентахлорфенилового эфира (63,6% от теоретического); т.пл. 1б9-171°С; R 0,8- (хлороформ-метанол 8:2).

.В. трет-Бутилоксикарбонил-Ь-метиоп НИЛГЛИЦИЛ-N-формил-Ь-гриптофил-Ь-метионил-Ь-аспарагил-Ь-фенилаланинамид .

25,3 г .(35 ммоль) N-трет-бутил оксикарбонил-М -формилтриптофил-Ь-метионил-Ь-аспарагил-Ь-фенилаланинамида раствор ют в 120 мл раствора 1 н. сол ной кислоты в лед ной уксусной кислоте . Через 90 мин Раствор упгфивают до половины объема и, добавив 500 мл

эфира, осаждают тетрапептидамидгидрохлорид . Полученную соль отфильтровывают , промывают, эфиром и сушат. Получают 20,3 г Ы-формил-Ь-триптофил-Ь-метионил-Ь-аспарагил-Ь-фенилаланинамидгидрохлорида (88% от теоретического ) ; т.пл. 207-209°С.

3,3 г (5 ммоль) указанного.тетрапептидамидгидрохлорида и 2,77 г

(5 ммоль) трет-бутилоксикаРбонил-L- .

-метионилглицинпентахлорфенилового эфира раствор ют в 25 мл диметилформамида и смешивают с 1,11 мл (10 ) N-метилморфолина. Спуст  24 ч реакционную смесь упаривают в

вакууме до половины объема, остаток . вливают при перемешивании в смесь из 50 мл 5%-ного раствора гидросульфата кали  и 30 мл эфира. Осадок отфильтровывают , промывают водой, затем эфиром и сушат. Получают 3,7 г трет-бутих1оксикарбонил-Ь-метионил-Ь-глицил-Ы-формил-Ь-триптофил-Ь-метионил-Ь-аспарагил-Ь-фенилаланинамида (81% от теоретического); т.пл.175П9°С; Rf (3) 0,45.

Г. трет-Бутилоксикарбонил-Ь-тирозил-Ь-метионил-Ь-глицил-Ы-формил-L-триптофил-Ь-метионил-Ь-аспарагил-Ь-фенилаланинамид .

3,65 г (4 ммоль) трет-бутилоксикарбрнил-Ь-метионилглицил-Ы -формил-Ь-хриптофил-Ь-метионил-Ь-аспарагил-L-фенилаланиламида раствор ют в; 15 мл раствора 1 н. сол ной кислоты в лед ной уксусной кислоте. Через

30 мин гексапептидамидгидрохлррид осаждают добавкой 30G мл эфирй, отфильтровывают , промывают эфиром и сушат.. Получают 3,2 г L-метионилглицил-Ы-формил-Ь-триптофил-Ъ-метионил-Ь-аспарагил-Ь-фенилаланинамидгид7 рохлорида (94% от теоретического); т.плЛЗО-132 с, 3,2 г СЗ,11 ммоль) указанного гек сапептидамидгидрохлорида и 1,84 г (4 ммоль) трет-бутилоксикарбонил Ь-тирозин-2 ,4,5-трихлорфенилового эфи ра раствор ют в 25 мл диметилформамида и смешивают с 0,9 мл (8 ммоль) N-метилморфолина. Реакционную смесь выдерживают в течение 24 ч, затем упаривают до половины объема и остаток выливают при перемешивании в смесь из 50 мл 5%-ного раствора гидросульфата кали  и 30 мл эфира, Осадок отфильтровывают, промывают водой, затем эфиром и сушат. Получают 3,7 г трет-бутилоксикарВрнил-Ь-тирозил-Ь-метионилглицил к формил-Ь-триптофил-Ь-метионил-Ь-аспарагил-Ь-фенклаланинамида (92% от теоретического); R (3)0,55 Д, трет-Бутилоксйкарбонил-р-трет-бутил-Ь-аспарагил-Ь-тирозил-Ь метионилглицил-N-формил-Ь триптофил-Ь-метионил-Ь-аспарагил Ь-фенилаланинамид . 3,7 г (3,45 млюль) трет-бутилоксикарбонил-Ь-тирозил-Ь-метионилглициЛ-N формил- Ь-триптофил-Ь метионил -Ь-аспарагил-Ь-фенилаланинаг.шда раствор ют в 15 мл раствора 1 и. сол ной кислоты в лед ной уксусной кислоте. Через 30 мин, добавив 30 мл эфира, осаждают а ептапептидамидгидрохлорид , отфильтровывают, промывают эфиром и сушат. Получают 3f45 г Ь-тирозил-Ь-метионилглицил-Ы-формил -Ь-триптофил-Ь-метионил Ь аспарагил -L-фенилаланинамидгидрохлорида (99% от теоретического), 3,04 г (3,0 мг.толь) полученного .: указанным способом гептапептидамидгидрохлорида и 1,7 г (3,17 ммольЯ пентахлорфенилового эфира трет- бутил оксикарбонил- 5-трет-бут11:ласпарагино вой кислоты раствор ют з 20 мл диме. тилформамида и смешивают с О,7 мл (6,3 ммоль) метилморфолина. Реакцио ную смесь выдерживают в течение 24 зате{л при перемешивании вливает в смесь из 50 мл раствора гид росульфата кали  и 30 мл эфира. Оса док отфильтровываютр промывают водой , затем эфиром и сушат. Получают 3,01 г трет-бутилоксикарбоиил-р-тре -б тил-Ь-аспарагил-Ь-тирозил Ь-мети нилглицил-N.-формил--Ь-триптофил-Ь-мети онил-Ь.-аспарагилфен ил аланин ами ( 80% от теоретического); R . (3)0р7 Пр и м е р 2. L- cпapaгил-0 cyл фат-Ь-тирозил-Ь метионилглицил-Ь тр тофил-Ь метнонил-.Ь-аспарагил 1| фени аланинамид. ,2,1 МП (32 мг-толь) хлорсульфоново кислоты раствор ют в 2,1 мл хлорофо ма и при при интенсивном пере мещивании сманивают с раствором 5,2 (47 ммоль) N-метилморфолинав смеси 22 мл диоксана с 5,2 ып диметилформ 3 мида. К полученной суспензии добавл ют раствор 1,05 г (1,0 ммоль) оС ,0 -диметил- (3, 5 диметокси) -бензилоксикар бонил-|Ь-трет-бутил-Ь--аспарагил-Ь-тирозил-Ь-метионилглицил-Н-формил-L-типотофил-Ь-метионил-Ь-аспарагил-Ь-фенилаламинамида в 5 мл диметилформамида . Раствор перемешивают 3 ч при комнатной температуре, затем выливают в 100 МП безводного эфира. При охлаждении в лед ной бане (0°С) из раствора выпадает осадок. Величину рН суспензии довод т до 3 с помощью 4М раствора едкого натра. Защищенный октапептидамидсульфат-сложный эфир отфильтровывшот , пpOIvlывaют небольшим количеством охлажденной воды, сушат. Полученный защищенный оЬтапептидамидсульфат-сложный эфир раствор ют в смеси 3 мл диметилформамида и 10 мл этанола и рН среды довод т до 8 посредством от 4 М раствора едкого натра . Спуст  20 мин раствор упаривают, остаток растирают со смесью ацетона с эфиром 1:1, отфильтровывают и лромывают эфиром. Защитную группу удал ют по.способу, описанному в примере 1. Получают 0,90 г продукта (77-% от теоретического); R (1)0,4 Продукт может быть очищен хроматографированием на колонке, заполненной силикагелем. Исходный IX,оС-ДИметил ( 3,5-диметокси )-бензилоксикарбонил-р трет-бутил Ь-аспарагил-Ь-тйрозил-Ь-метионилглицил-N -формил-L-триптофил-L-метионил Ь-аспарагил-ь-фенилаланинамид получают следующим образом, К раствору 0,5 г (1,3 ммоль) об ,«;-диметил-3 ,5-диметоксибензилоксикарбонил-трет-бутилоксиаспарагиновой кислоты и 0,37 г (1,4 ммоль) пентахлорфенола в 8 мл этилацетата при добавл ют раствор 0,29 г (1,4 ммоль) дициклогексакарбодиимида в 5 мл диметилформамида . Раствор перемешивают 1 ч при 0°С и оставл ют на ночь при коьшатной температуре. Выделившийс  дициклогексилфррмамид отфильтровывают и зтилацетат отгон ют при уменьшенном давлении. Раствор 1,09 г (1,0 ммоль) гептапептидамидгидрохлорида (полученного как указано в примере 1Д) в 10 мл диметилформамида добавл ют к раствору полученного активного сложного эфира в диметилформамиде и к смеси добавл ют 0,22 мл Ы-метилморфолина. Реакционную смесь оставл ют на 24 ч, затем выливают в смесь 25 мл 5%-ного раствора кислого сульфата кали  и 20 мл эфира. Осадок отфильтровывают, промывают водой, эфиром и высушивают, Получалот 1,05 г защищенного октапептидаЬИда (85% от теоретического); Ri (3)-0,7. Пример 3, Исход из 1,25 г (1,0 ммоль) Tplef-бутилоксикарбонил-В-трет-бутил-Ъ-аспарагил-Ь-тирозил-Ь-метионилглицил-ы-формил-Ь-трипто фил-Ь-метионил-Ь-аспарагил-Ь-фенилаланйиамида получают октапептидамн зсульфат-сложный эфир по способу, описанному в примере 1. Полученный продукт раствор ют при комнатной температуре в 10 МП уксусной кислоты, содержащей 3 мол  меркаптоэтансульфокислоты , раствор оставл ют на 10 мин затем вьшивают в 100 мл эфира. Выпавший в осадок продукт отфильтровывают , промывают 2 порци ми эфира по 20 мл и высушивают. Получают

L- Sp-L-Tyr-L-het-L-Gly-L-Trp-L-Met-L-ASp-L-PlrelJH (i)

SOjE

путем взаимодействи  защищенного октапептидамида с сульфирующим агентом в растворителе с последуюгдам сн тием запретных групп и вьщелёнием целевого продукта, отличающийс  тем, что, с целью упрощени  процесса и повышени  выхода целевого продукта, в качестве защищенного октапептидамида используют соединение формулы Ц

X-ASp-Tyr-Met-G-ty-Trp-Met-Asp-Phe-NHГаг

W

где X - трет-бутилоксикарбонильна , Л,й,-диметил-(3,5-диметокси)-бензильна  группа,

у - трет-бутилоксигруппа, W - гидроксильна  группа, For - формильна  группа, в качестве сульфирующего агента используют комплекс третичного аьшна содержащего по крайней мере одну, алкильную группу, и трехокись серы, процесс провод т в эфире с последующей обработкой полученного сульфата гидроокисью щелочного металла и последующим удалением оставшихс  Защитных групп адидолизом.,

2. Срособ по П.1, о т л и ч а. ю-. щи и с   тем, что комплекс, образованный ИЗ третичного амина с трехOKJUCfyKi серы, примен ют в 20-30..-кратном избытгке.

3; Способ по п,1, отлича ю- щ и и с   . тем, что в качестве компекса амин-трехокись серы примен ют комплексное соединение N-метилморфоина и трехокиси серы и в качестве эфира-диоксан.

4.Способ по П.1, отличающийс  тем, что в качестве гидроокиси щелочного металла используют гидрат окиси натри ,

5,Способ поп,1, отличающий с   тем, что ацидолиз осуществл ют смесью из 70-85% трифторуксусной кислоты, 5-10% ёркаптоэтанола , 5-10% воды и 5-10% анизола или раствором меркаптоэтансульфокислоты в лед ной уксусной кислоте.

Источники информации, прин тые во 35 внимание при экспертизе:

1. Патент ФРГ 1922185, кл, С 07 С 103/52, 1975.

2.M.A.Ondett; ,J.P.PEueSe5,E.F.5abo, XT.5heehau, N.WUEiams,synthesis oi oho40 BecyBtokinin-pancreozimin I,Tlie C-terminuB dodecoipeptioii,iI.Am.Chem.5oc.. i970, 92,c.195.

3, Шредер Э., любке К.Пептиды,

Мир

4,1, 1967, с,116,

M,,

45

4.P.Baumgarten,lJber eine Methods zur euBfonierund ordanischen Lind anor.don eche stoffefBenfchte, 1926,59,0.19767 310 0,9 г октапептидамидсулъфата (77% .от теоретического) R (1)0,4. Продукт может быть очищен хроматографированием на колонке, содержащей 80 г силикагеп  по способу, описанному в примере 1. Формула изобретени  1.Способ получени  сульфата октапептидамида - терминального октапептида холецистокининпанкреазимина формулы