Изобретение относитс к способу получени новых биологически активных соединений - тетрапептидов или их кислотно-аддитивных солей, которые могут найти применение в медицине , Известен способ получени пептидов путем отщеплени Трет -бутилокс ка1)бонильной группы от соответствую щего блокированного пептида путем о работки последнего трифторуксусной кислотой в присутствии анизола при 1 . Цель изобретени - получение новых соединений, обладающих интересными фармакологическими свойствами. Поставленна цель достигаетс способом получени тетрапептидов общей формулы R-Tyr-DAla-mtJ-NR-CH-CONH водород, алкил ;, алкил , циклопропилме X - бром, хлор, йод и метил, И.ПИ их кисло т но-аддитивных солей, закл в том, что защищенный тетр пептид общей формулы fgOC K-Tyr DAlO-Gly-N-Cfl-CONH R ,К и X имеют указанные значе ни , подвергают деблокированию при обраб ке трифторуксусной кислотой. Тетрапептиды формулы(Т)выдел ют виде кислотно-аддитивных приемлемых с фармацевтической точки зрени нетоксичных солей, которые включают с ли органических и неорганических ки лот, например таких, как сол на , серна , сульфо-, винна фумарова , бромистоводородна , гликолева , лимонна , мапеинова , фосфорна , нта на уксусна азотна , бензойна , аскорбинова , h -толуолсульфо-, бен золсульфо-, нафталинсульфо-, пропионова и других. В описании использораны следующие сокращени : (-аминомасл на i кислота, Ala - аланин, Cys - дистеин, Cys(Me) - (5-метил)-цистеин, Cys(Me) (О) - (5-метил)-цистеин сульфоксид, Gly - глидин, Gly(Al) - аллилглицин, Gla(Cp) - циклопропилметмлглицин, Hse - гомосерин. Не - ИЗО-лейцин, Leu лейцин. Met - метионин, Met(O)сульфоксид метионина, Nle - норлейцин , Nva - норвалин, Phe - фенилаланин , Ser - серин, Thr - треонин. Туг - тирозин, Val - валин. Ас - ацетил , АсОМе - ацетоксиметил, А аллил , Ср - циклопропилметил, Me метил , Et - этил, 1р -изо -пропил, Рг -н -пропил, ОМе - метокси, Etm этилтиометил , Fie - 2-фторэтил, Ppg - пропаргил, Ви - н,-бутил, i-Bu -изо -бутил, -трет -бутил, s-Bu -втор- утил. Вое -трет-бутилоксикарбонил , Bzl - бензил, CBZ бензолоксикарбонил , DCC - N.N-дициклогексилкарбодимиид , НВТ - 1-оксибензотриазол , DMF - N N -диметилформамид , TFA - трифторуксусна кислота, THF - тетрагидрофуран, DEAE диэтиламнноэтил , NMM - N-метйлморфолин, IBCF -изо -бутилхлорформиат, 18-крон-6-1 ,4,7,10,13,16 - гексаоксациклооктадекан . Каждое из соединений формуль: имеет заместитель в мета-позиции феналаланина и, кроме того, любое из них или все они могут находитьс в форме приемлемой с фармацевтической точки зрени нетоксичной присоединенной соли кислоты. Пример 1. Получение соли ацетата Ь-(К-метил)тирозил-В-аланил-глицил-Ь- (К-циклопропилметш1)-мета-бромф .енилаланин амида. А. Этиловый сложный эфир N-ацетш1-/ь-циано-В-Ь-метабромфенилаланина . К суспензии 16,8 г (0,35 моль) гидрида натри (50%-ный раствор в минеральном масле) в 260 мл сухого ТГФ при перемешиЁании при комнатной температуре добавл ют небольшими порци ми 59,56 г (0,35 моль) этиладет амидоцианоацетата. В реакционную смесь по капл м добавл ют раствор 37,48 г (0,35 моль) метабромбензилбромида в 50 мл (сухого) ТГФ. Смесь сначала несколько ох.г эждают, а затем перемешивание продолжают при комнатной температуре в течение 72 ч, после чего дес шегмируют в течение 4 ч. Смесь затем охлаждают до комнатной температуры и добавл ют 80 ип этилового спирта. Перемешивание про должают еще в течение 30 мин, а затем вливают реакционную массу в Ш раствор НС1. Водную смесь экстрагируют этилацетатом, слой этилацетата отдел ют и промывают последовательно водой, IN раствором бикарбоната натри и водой. Этилацетат сушат над сульфатом магни и концентрируют в вакууме до масла (107 г). ЯМР ,0 (ацетил), 3,4-3,5 (метилен ) и 7,1-7,5 (мета-бромфенил), Б. В,Ь-Мета-бромфенилапанин. Продукт, полученный на стадии А U07 г, 0,32 моль), суспендируют в растворе 58,8 г (1,47 моль )таблеток гидрата окиси натри и 220 мл воды. Полученную в результате смесь дефлег мируют в течение 24 ч. Далее смесь охлаждают до комнатной температуры и ее рН довод т до 6,5 при помощи 7N раствора НС1. Полученный и выпавший в осадок продукт собирают, сушат получают 41,01 г (53%) соединени . В. N-тpифтopaцeтил D,L-мeтa-бpoмфенилаланин . К 200 мл трифторуксусной кислоты добавл ют 46,53 г (О,19 моль) В,Ъ-ме та-бромфенилаланина. Смесь охлаждают до 0С и в течение 5 мин добавл ют 29,3 мл (0,21 моль ) трифторуксусного ангидрида. Полученный раствор перемешивают при 0°С в течение 1,5 ч и 3 ч при комнатной температуре , после чего реакционную массу кон центрируют в вакууме. Остаток разбавл ют 400 мл воды и выпавший в оса док продукт собирают и сушат. Твердое вещество кристаллизуют из смеси простой эфир-петролейный эфир, получают 28,4 г (44%) соединени . Элементный анализ. Найдено, %: С 39,09;.И 2,46; N 4,32. C..,RgN03BrFi (340,1) Вычислено, %: С 38,35; Н 2,67; N 4,12. Г. L-мета-бромфенилаланин. Смесь 28 г (0,082 мольч) продукта полученного в стадии В, добавл ют к 500 мл воды, перемешивают, а затем к ней добавл ют 2N раствор NaCR до получени прозрачного раствора (рН 7,2 Добавл ют карбоксипептидазу А (25 м и поддерживают температуру раствора (37 С)при noMouui термостатически, ре1 94 гулируемой вод ной ванны и рН 7,2 при помопщ радиометра величины рН.Раствор энергично перемешивают в течение 5 дн, затем рН довод т до 5,0 добавл ют углерод и смесь фильтруют. рН фильтрата довод т до 3,0 при помощи IN НС1 и затем фильтрат экстрагируют трижды, этилацетатом, после чего рН водного раствора довод т до 7,0 при помощи 2N раствора NaOH и раствор., концентрируют в вакууме до начала кристаллизации L-изомера. Смесь охлаждают до комнатной температуры, выпавший в осадок продукт собирают, сушат, получают 10,9 г (l09%) соединени . / Д, трет-Бутилоксикарбонил-Ъ-мета-бромфенилаланин . Б смесь 25 мл трет -бутилового спирта и 20 мл воды добавл ют 9,9 г ( 0,041 моль) продукта со стадии Г, затем 20,5 мл (0,041 моль) 2N раствора NaOH и 8,9 г (0,041 ноль ди-трет-бутил карбоната. Смесь перемешнвают при комнатной температуре в течение 5 ч, после чего добавл ют 150 мл воды и продукт экстрагируют эфиромг Водный слой отдел ют, подкисл ют до рН 2,5 при помощи холодного IN раствора НС1 и экстрагируют эфиром. Эфирный слой промывают водой, сушат над сульфатом магни и упаривают в вакууме. Масл нистый остаток раствор ют в петролейном эфире и раствор вьщерживают при в течение ночи. Выпавшие в осадок кристаллы отфильтровывают , сушат, получают 11,3 г (80%) соединени , точка плавлени 124125 С , (ci)|| ,7° (с,0, EtOH). Элементн й анализ. Найдено, %: С 49,25; Н 5,59; N4,04. (344) Вычислено, %: С 48,85; Н 5,27; N 4,07. Е. ЬРтрет-Бутилоксикарбонил-Ь-мета-бромфенилаланин амид. К смеси 50 мл ДМФ 1 1,5 г (0,033 моль) #-трет -бутилоксикарбонил-Т гм.ета-бром-, фенилаланина,охлажденной до 15°С,добавл ют 3,63 мл (0,033 моль) NMM и 4,33 мл (0,33 моль I И50 -бутил хлосформиата . Смесь перемешивают при в течение 5 мин, после чего через еакционную массу в течение 1 ч барботируют безводный газообразный аммиак (газ). Реакционную массу перемешивают еще в течение 4 ч при -15°С ц вливают в смесь изме.тьченного льда и IN раствора бикарбоната натри . Полученный водный раствор экстрагир ют этилацетатом. Органический слой отдел ют и промывают последовательн водой, 1,5N раствором лимонной кисл ты и, водой. Органическую фазу сушат над сульфатом магни и концентрирую в вакууме до твердого состо ни . Твердое вещество растирают с эфиром и полученный осадок отфильтровывают и сушат, получают 11, (100%/ соединени т. Ш1. 146-147 С, 9,8(,5 МеОН,. Элементный анализ. Найдено, %: С 48,85; Н 5,33; N , (343,2) Вычислено, %:С 48,99; Н 5,58; Ы 8,16. Ж. Хлоргидратна соль Ь-мета-бро фенилаланин амида. В 60 мл свежеприготовленного IN раствораНС1 (газ) в лед ной уксусной кислоте, содержащей 5 мл анизол добавл ют 11,1 г (0,032 моль| прО дукта со. стадии Е,. Смесь перемешившЬт при комнатной температуре в те чение 30 мин, затем вливают в эфир р полученный осадок собирают и суша получают 8,75 г (98%) соединени . (cL),46 ° |(,5 MeOHJ. Злементный анализ. НайденоS %; С 38,55; н4,41; :J 10, CgH N OClBr (279,6) 9 17 J Л.ЛЛ, I Вычислено , %:С 38,67; Н 4,33; 0j02,, 3 К-ЦиклОпропилметил-Ь-мета-бромфенилаланин амид. В 50 МЛ безводного этанола добав л йт г (0,015 моль ) продукта со ;тадии Ж, а затем 5,04 г (0,06 моль твердого безводного бикарбоната нат ри и 2,04 г (0,015 моль) циклопропилметилбромида . Смесь дефлегмируют в течение 7 ч и упаривают в вакууме до масла. Масло раствор ют в 20 мл хлороформа и чист т колоночной хроматографией на колонке типа Грейса и Дэфисона 62 на силикагеле в хлоро форме. Продукт элюируют при помощи послестадийного градиента до 10% метанола. Продукт выдел ют в соответствии с профилем, определенным хроматографией в тонком слое собран ных; фракций, получают 2,2 г (49%) .соединени . ЯМР с ; 1,6(-NH-) и 7,0-7,4 (мета-бромфенил). . И . N-Трет -Бутило,ксикарбонил-В-аланил-глицил-L- (N-циклопропилметил )-мета-бромфенилаланин амид. Б смесь из 40 мл ДМФ и 2,1 г (7,1 моль) продукта со с -адии 3, охлажденную до Ос, добавл ют 1,87 г (7,1 моль) К трет-бутилоксикарбонил-D-аланил-глидила , а затем 0,96 г (,7,1 ммоль J ОБТ и 1,46 г (7,1 ммоль ДЦК. Смесь перемешивают при в течение 4 ч, а затем при комнатной температуре в течение 72 ч. Смесь затем охлаждают до О С, полученный в результате осадок удал ют фильтрацией, фильтрат упаривают в вакууме. Остаток раствор ют в этилацетате и раствор экстрагируют последовательно IN раствором бикарбоната натри , , lj5N раствором лимонной кислоты и водой. Органическую фазу сушат над сульфатом магни и упаривают в вакууме до масла, получают 1,5 г (40%) соединени . К. IF тper-Бyтилoкcикapбoнил-IN-мeтил-L-тиpoзил-D-aлaнил-глицил-L- (№-циклопропилметил )-мета-бромфенилаланин амид. Смесь 50 мл трифторуксусной кислоты , содержащей 5 мл анизола и 1,5 г (2,9 ммоль) продукта со стадии И, перемешивают при 0°С Б течение 30 мин и. упаривают в вакууме без нагревани . Полученное в результате масло разбавл ют простым эфиром. Образующийс сверху в результате отстаивани продукт декантируют, а оставшеес масло сушат в вакууме. В 15 мл даФ добавл ют 0,856 г (2,9 ммоль) N rpeT-бутилоксикарбоил-К -метил-Ь-тирозина . Смесь охлажают до -15 С и в перемешиваемый аствор быстро добавл ют 0,32 мл (2,9 ммоль) NMM и 0,38 мл (2,9 ммоль) ю -бутилхлорформиата. Перемешивание ри -15 С продолжают в течение слеующего процесса Полученную соль ТФК рипептида раствор ют в ,10 мл ДМФ. аствор охлаждают до и добавл ют дну порцию 0,32 мл (2,9 ммоль) NMM. аствор перемешивают до окончани роцесса и добавл ют в ранее полуе нный раствор смешанный ангидрид. олученную в результате смесь переешивают при -15°С в течение 4 ч, заем медленно нагревают до комнатной емпературы и перемешивание продол7108231 жают в течение ночи. Смесь затем вливают в IN раствор бикарбоната натри , водный раствор экстрагируют этилацетатом . Органическую фазу отдел ют и экстрагируют последовательно водой, 5 1,5N раствором лимонной кислоты, и водой. Затем этилацетат сушат над i сульфатом магни и концентрируют в вакууме. Масл нистый остаток (1,6 г) раствор ют в ацетоне и нанос т на две препаративные пластины с тонким слоем. Про вление ведут в смеси хлороформа и .метанола при соотношении 9:1. Основна компонента отдел етс с пластин тех и элюируетс с сили- 5 кагел , получают 0,8 г (39% целевого соединени . Л. Ацетатна соль М -метил-Ь-тирозил-В-аланил-глицил-Ь- (Ы -циклопропилметил )-мета-бромфенилаланин амида. В 15 мл ТФК, содержащей 3 мл анизола , добавл ют 0,8 г (1,2 ммоль) продукта, полученного в стадии К. Смесь перемешивают при 0°С в течение 30 мин, после чего сушат замораживанием . Полученное твердое вещество раствор ют в 9,0 мл 0,1 М раствора ацетата аммони , содержащего 31% ацетонитрила. Полученный раствор 30 хроматографируют на колонке с силикагелем (4x72 смК Колонку обрабатывают давлением 4,2 кг/см и элюат анализируют при 280 нм. Соответствующие фракции собирают и лиофили- 35 зуют. Полученное твердое вещество раствор ют в 0,2 М растворе уксусной кислоты (10 мл) и раствор пропускают через колонку с сефадексом (5x100 см) предварительно уравновешенную тем 40 же растворителем. Элюат анализируют в области 280 нм и соответствующие фракции собирают, лиофилизуют, в результате получают 773 мг (97%)соединени . (oC)J +6,64 (,5, 1NHC1).45 Элементный анализ. Найдено, %: С 54,30; Н 5,99; N 10,28. (662,2) Вычислено, %: С 54,38; Н 6,09; 50 N 10,57. Аминокислотный анализ, %: Ala 0,97 Gly 1,03; NHj 0,99. П р и М е р 2. Ацетатна соль , Ь-(К-метил)тирозил-В-апанил-глицил- js -L-(N-этил)-мcтa-бpoмфeнилaлaнин амида. (oC)J + 7,1° (,5, IN НС1). 9 N N Gl ро та N N Al L-L ам N N Gl Ь-м N N Al L-L ам N N Gl 8 Элементный анализ. Найдено, %: С 53,09; Н 6,13; . 11,13. (636,5) Вычислено, %: С 52,83; Н 6,02; 11,00. Аминокислотный анализ,%:Ala 0,99; y 1,01; NH 1,04. Пример 3. Ацетатна соль L-THзил-В-аланил-глицил-Ь- (N-зтил)-мe-бромфенилаланин амида. (ct)25 . (,5, IN НС1). Элементный анализ. Найдено, %: С 52,13; Н 6,09; 11,39. C2TH3bNy0 r (623) Вычислено, %: С 52,09; Н 5,83; 11,25. Аминокислотный анализ,%: Туг 1,01; a 0,99; Gly 0,99; NH 1,01. П р и М е р 4. Ацетатна соль (N-метил)тирозил-В-аланил-глицил (N-этил-мета-метил фенил ал аа-шн ида. ( 9,2 (с 0,5, IN НС1). Элементный анализ. Найдено, %;С 60,68; Н 7,00; 12,46. C29H4 NjO (517,7) Вычислено, %: С 60,93; Н 7,23; 12, 25. Аминокислотный анализ,%: Ala 0,98; y 1,02; NHj 0,96. П р и М е р 5. Ацетатна соль тирозил-О-аланил-глицил-Ь-(N-этил)ета-хлорфенилаланин амида. (d} - 13,7° (,5, IN НС1). Элементный анализ. Найдено, %: С 55,84; Н 6,37; 12,35. C H j NjO-jCl (578,1) Вычислено, %: С 56,10; Н 6,28; 12,12. Аминокислотный анализ,%: Туг 1,02; a 0,99; Gly 0,98; NHj 0,88. Приме р 6. Ацетатна соль (N-метил)тирозил-В-аланил-глицил- (N-зтил)-мета-хлорфенилаланин ида. (oi)if -9,2 (,5, IN НС1) Элементный анализ. Найдено, %: С 57,11; Н 6,45; 12,15. C28H38N50-,C1 (592,1) Вычислено, %: С 56,80; Н 6,47; 11,83. Аминокислотный анализ, %:А1а 0,99; y 1,00; NHj 1,01. Пример. Ацетатна соль Ъ-тирозил 0-аланил-глнцил-Ь-(Ы-этил мета-йодфенилалаиин амида, ,о (,5.,lN НС1). Элементный анализ. Найдено, %: С 48,40; Н 5,25; N 10,66. C2THasN 07J (669,5) Вычислено, %: ,44; Н 5,42; N 10,46. Аминокислотный анали з,: Туг 1,0 Ala 0,99; Gly 0,99; NH 1,05. П р и м .е р 8. Ацетатна соль Ъ-тирозил В-апанил-глицил-Ь-(Ы-циклопропилметил -мета-йодфенилаланин амида. (о(,)8 ( ,5, IM J Элементный анализ. Найдено, %: С 50,00; Н 5,22; N 1С,23 C2gK gNg07J Вычислено, %: С 50,08; Н 5,51; N 10,07. Аминокислотный анализ,%: Туг 0,9 Ala 1,01; Gly 0,99; NH 0,95. Приме р 9. Ацетатна соль 11,-(К метил)тирозил-В-аланил-глицил-L--{N-циклопропилметил Ьмета-йодфенилаланин анида, (tii +0,787°( ,5, Ш СНдСООН Элементный анализ. Найдено, %: С 50,50; Н 5,40; Н 9,88. Вычислено, %: С 50,78; Н 5,68; N 9,, 81 . Проведены биологические испытани описываемых тетрапецтидов. Болеутол юща активность с эединений формулы (Т } установлена при помощи испытани на мышах с использованием гор чей пластины. В этом исгсытаник примен ют вертикальный акриловый цилиндр, содержащий в качестве основани гор чую плоскую по верхность, температура которой поддерживаетс на уровне 52°С. Мьшам ввод т подкожно заранее определенно количество испытуемого соединени , растворенного или суспендированного в подход щем носителе, через 15 мин после применени испытуемого соединени мышь помещают на гор чую плос кую поверхность. Измер ют скрытое состо ние в секундах до прыжка мьши с гор чей плоской поверхности. Аген обладаю1ций болеутол ющей активность вызывает увеличение этого скрытого состо ни по сравнению с кон-грольнрй мышью, который был введен только носитель. Это может про вл тьс в ;Об ласти доз, которые не вызывают потери моторной координации или способности двигатьс . В табл.1 представлены величины ED, полученные в результате испытаний . ( - величина дозы, котора вызывает болеутол юпц1Й эффект у 50% испытываемых мыщей |. Болеутол ющий эффект определ ют как реакцию скрытого состо ни в присутствии испытуемого соединени , котора больше или равна контрольной реакции скрытого состо ни плюс два стандартных отклонени . Эффект болеутолени в процентах рассматривают как статистическую величину и вычисл ют методами регрессионного анализа данных доза-эффект. Кажда крива доза-эффектдолжна иметь по крайней мере четыре точки и кажда точка определ етс с использованием данных, полученных дл по крайней мере дес ти обработанных мьш1ей и дес ти контрольных мьшей. Таблица 1 Кроме того, соединени .формулы (1| облс1дают низкой склонностью к физической зависимости. Этот факт установлен при помощи испытани , св занного с исследованием двигательной способности мышей. Была установлена высока коррел ци между степенью склонности к физической зависимости сое д нени и его способностью вызывать двигательную активность у мьппей. Двигательную активность у мышей измер ют при ПОМОП1И цилиндрических клеток, изготовленных из проволоки, 5,08 см высотой и 28 см в диаметре. Шесть клеток помещают в звукоизолированную снабженную вентил цией камеру с равномерным освещением. Луч света проходит через центр клетки к фото чейке, расположенной на противоположной стороне. Две мьппи помещают в каждую клетку на 1 ч с целью акклиматизации к окружающим услови м Затем п ти парам мышей подкожно ввод т определенное количество испытуемого соединени , оставша с пара обрабатываетс сол ным носителем, не содержащим испытуемое соединение.
.r lc - i : ifllM :.
Затем мьопей возвращают на 3 ч в соответствующие им клетки. Записываетс число показаний счетчика за каждые 15 мин, а также общее число за трехчасовой период. Каждое прерывание луча света измен ет показание счетчика на единицу.
В табл. 2 приведено среднее значение общих чисел дл каждой группы
из дес ти мышей с использованием конкретного соединени и определенной , дозы.
Из табл.2 видно, что по сравнению с известными соединени ми соединени
формулы (I ) обладают существенно более низкой двигательной активностью.