DE3887362T2 - Thymopentin-Retro-Inverso-Analoga und deren Fragmente, Verfahren zu deren Herstellung und so erhaltene Zwischenprodukte. - Google Patents
Thymopentin-Retro-Inverso-Analoga und deren Fragmente, Verfahren zu deren Herstellung und so erhaltene Zwischenprodukte.Info
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft neue Thymopentin-Retro-Inverso- Analoga und deren Fragmente, ein Verfahren zur Herstellung der neuen Verbindungen, die dabei erhaltenen Zwischenprodukte und die Verwendung der neuen Verbindungen für die Herstellung pharmazeutischer Zusammensetzungen.
- Ein erster Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Retro- Inverso-Analoga von Thymopentin (TP5) und-seines Tripeptid-Fragments (TP5¹&supmin;³) mit der folgenden allgemeinen Formel sowie die entsprechenden pharmazeutisch verträglichen Säure- oder Base-Additionssalze:
- in der
- R ein Wasserstoffatom oder eine Acylgruppe bedeutet, und
- R¹ eine Gruppe -OR² oder
- bedeutet, wobei R² ein Wasserstoffatom oder eine gerade oder verzweigte Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, eine gerade oder verzweigte Alkenyl- oder Alkinylgruppe mit 3 bis 6 Kohlenstoffatamen oder eine Arylalkyl- oder Alkyl-aryl-Gruppe mit 7 bis 12 Kohlenstoffatomen bedeutet.
- Die neuen erfindungsgemäßen Verbindungen, die durch ihre vorstehende Strukturformel angegeben werden, können kürzer mit Hilfe der international anerkannten Symbole für Peptide bezeichnet werden:
- RNH-gArg-mLys-Asp-R¹ (I)
- wobei R ein Wasserstoffatom oder eine Acylgruppe bedeutet, und R¹ eine Gruppe -OR² oder -Val-Tyr-OR² bedeutet, in der R² wie vorstehend definiert ist.
- In der vorstehenden Formel bezeichnet gArg einen geminalen Diaminorest, der von Arginin durch Ersatz der terminalen Carboxylgruppe durch eine Aminogruppe abgeleitet ist, während mLys einen Malonylrest bedeutet, der in der 2-Position durch eine Lysinseitenkette substituiert ist.
- Asp, Val und Tyr bezeichnen die Asparaginsäure-, Valin- bzw. Tyrosin-Reste.
- In der vorliegenden Anmeldung bezeichnet der Ausdruck "Acylgruppe" Acylgruppen, die von geraden oder verzweigten Alkansäuren mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen abgeleitet sind, wie Formyl, Acetyl, Propionyl, Succinoyl und dergl., oder die von Benzoesäure und substituierten Benzoesäuren abgeleitet sind, wie Benzoyl, 4-Nitrobenzoyl, 2,3,4-Trimethoxybenzoyl und dergl.
- Der Ausdruck "pharmazeutisch verträgliche Salze" bezieht sich in dieser Anmeldung auf Säure- oder Base-Additionssalze der neuen Verbindungen der Formel (I), wobei deren Anionen oder Kationen vergleichsweise nicht-toxisch und für Säuger in Dosierungen, die einer guten biologischen Aktivität entsprechen, unschädlich sind, so daß Nebenwirkungen, die diesen Anionen oder Kationen zugeschrieben werden können, die günstigen Wirkungen der Wirkstoffe nicht aufheben.
- Als Säuren, die zur Bildung pharmazeutisch verträglicher Additionssalze mit diesen Peptiden fähig sind, können anorganische Säuren, wie Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure, Phosphorsäure, Schwefelsäure und dergl., organische Carbonsäuren, wie Ameisensäure, Essigsäure, Propionsäure, Milchsäure, Malonsäure, Bernsteinsäure, Benzoesäure und dergl., sowie organische Sulfonsäuren, wie Methansulfonsäure oder Naphthalinsulfonsäure und dergl., genannt werden.
- Basen, die zur Bildung pharmazeutisch verträglicher Salze mit den Verbindungen der Formel (I) fähig sind, umfassen anorganische Basen, wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniumhydroxid und dergl., sowie organische Basen, wie Triethylamin, Triethanolamin und dergl.
- Die Säureadditionssalze werden entweder direkt durch das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung der neuen Retro-Inverso-Peptide oder durch Umsetzung des Peptids der Formel (I) mit einem oder mehreren Äquivalenten einer geeigneten Säure oder Base gemäß herkömmlichen Verfahren erhalten. Gegebenenfalls wird ein besonderes Säureadditionssalz in ein anderes Säureadditionssalz durch Behandlung mit einem geeigneten Ionenaustauschharz in der von R.A. Boissonas et al. in Helv. Chim. Acta, Bd. 43 (1960), S. 1349, beschriebenen Weise umgewandelt. Geeignete Ionenaustauschharze sind auf Cellulose basierende Kationenaustauscher und stark basische Anionenaustauscherharze.
- Eine bevorzugte Gruppe von erfindungsgemäßen Verbindungen umfaßt diejenigen Verbindungen der Formel (I), in denen R¹ wie vorstehend definiert ist, R² ein Wasserstoffatom bedeutet und R ein Wasserstoffatom oder eine metabolisch labile Acylgruppe, d.h. eine Acylgruppe, die leicht und rasch in vivo in den ersten Stufen des metabolischen Schicksals des Produkts abgespalten wird und die keine toxischen oder kontraindizierten Wirkungen bei der Therapie in der Konzentration zeigt, mit der die gewünschte pharmakologische Wirkung der biologisch aktiven Verbindung der Formel (I) erzielt wird, bedeutet.
- Die am meisten bevorzugte Gruppe von Verbindungen umfaßt diejenigen Verbindungen der Formel (I), in denen R ein Wasserstoffatom bedeutet, R¹ wie vorstehend definiert ist und R² ein Wasserstoffatom bedeutet.
- Die erfindungsgemäßen Verbindungen weisen bemerkenswerte immunpharmakologische Eigenschaften auf.
- In den letzten 15 Jahren haben G. Goldstein und seine Mitarbeiter die biologische Aktivität und mögliche pharmakologische Rolle eines Polypeptidhormons, das von den Epithelzellen der Thymusdrüse abgesondert wird, nämlich Thymopoietin, untersucht (G. Goldstein, Nature, Bd. 247 (1974), S. 11; D.H. Schlesinger et al., Cell, Bd. 5 (1975), S. 361; T. Audhya et al., Biochemistry, Bd. 20 (1981), S. 6195), dessen primäre Sequenz 49 Aminosäuren umfaßt.
- Thymopoietin weist eine Anzahl biologischer regulatorischer Wirkungen auf: es beeinflußt die neuromuskuläre Transmission (G. Goldstein, Lancet, Bd. 2 (1968), S. 119), die Differentiation von T- und B-Zellen (M.P. Scheid et al., J. Exp. Med., Bd. 147 (1978), S. 1727) und die Immunantwort (C.Y. Lau et al., J. Immunol., Bd. 125 (1980), S. 1634).
- Struktur-Wirkungs-Untersuchungen haben gezeigt, daß nicht die gesamte 49 Aminosäuren umfassende Sequenz von Thymopoietin für die biologische Aktivität erforderlich ist, sondern es wurde gezeigt, daß das Pentapeptid H-Arg-Lys-Asp-Val-Tyr-OH (Thymopentin, TP5), das den Aminosäuren 32 bis 36 von Thymopoietin entspricht, sowohl in vitro als auch in vivo die biologischen Eigenschaften des natürlichen Hormons aufweist (G. Goldstein et al., Science, Bd. 204 (1979), S. 1309).
- Genauer gesagt wurde durch in vitro-Experimente gezeigt, daß sowohl Thymopoietin als auch Thymopentin (TP5) selektiv die frühe Differenzierung von T-Lymphozyten induzieren, während sie die Reifung von B-Lymphozyten hemmen.
- Zusätzliche in vivo-Untersuchungen haben gezeigt, daß Thymopentin auch in vivo die T-Zelldifferenzierung in Nacktmäusen, denen angeboren eine Thymusdrüse fehlt und die daher eine verringerte Menge an zirkulierenden reifen T-Lymphozyten aufweisen, steuert (G.E. Ranges et al., J. Exp. Med., Bd. 156 (1982), S. 1057), wodurch eine wesentliche immunologische Funktion dieser Verbindung festgestellt wurde. Thymopoietin und Thymopentin zeigten auch eine immunregulatorische Wirkung, und zwar wahrscheinlich aufgrund einer besonderen, durch cyclisches GMP vermittelten Wirkung auf periphere T-Zellen. Genauer gesagt zeigte sich bei untersuchten Tieren, daß Thymopentin eine immunnormalisierende Wirkung bei Immunungleichgewichten aufweist, die darin besteht, daß es das Immunsystem in Richtung auf einen normalen Zustand führen kann, ob es herauf- oder herunterreguliert ist, d.h. ob es zu stark anspricht, wie bei einer Autoimmunerkrankung, oder ob es zu wenig anspricht, z.B. aufgrund einer Thymectomie oder einer Rückbildung der Thymusdrüse, die mit dem Alter auftritt (E.H. Goldberg et al., Immunogenetics, Bd. 13 (1981), S. 201; C.Y. Lau et al., Cell Immunol., Bd. 66 (1982), S. 217).
- Thymopentin wurde und wird in klinischen Studien zur Behandlung von Autoimmunerkrankungen, wie rheumatoider Arthritis, sowie zur Behandlung primärer Immundefekte, die durch das Fehlen oder die unvollständige Entwicklung der Thymusdrüse und der daraus folgenden Änderung der Reifung der T-Lymphocyten verursacht werden, und akuter und wiederauftretender viraler Erkrankungen sowie als ein Adjuvans bei der Impfung verwendet.
- Das Aufstellen eines geeigneten Behandlungsplans ist jedoch entscheidend, und zwar aufgrund der Schwierigkeiten bei der Bestimmung der wirksamen Dosierung und des geeigneten Wegs und der Weise der Verabreichung. Es ist in der Tat gezeigt worden, daß die pharmakologische Wirkung signifikant abhängig vom Weg und der Weise der Verabreichung variieren kann (T. Audhya et al., Surv. Immunol. Res. Bd. 4, Suppl. 1 (1985), S. 17; T. Audhya et al., Int. J. Peptide Protein Res., Bd. 22 (1983), S. 568).
- Eine sehr interessante Beobachtung wurde von Bolla et al. in: Int. J. Clin. Pharm. Res., Bd. IV(6) (1984), S. 431, berichtet. Nach diesen Autoren wird die Stimulierung der Antikörperbildung, die durch eine subkutane Behandlung mit TP5 induziert wird, vollständig unterdrückt, wenn eine gleiche Dosis intravenös verabreicht wird. Ein möglicher Grund dafür ist die kurze Halbwertszeit vom TP5 im Plasma.
- TP5 erleidet in der Tat einen sehr raschen enzymatischen Abbau in vivo, da es rasch durch im menschlichen Plasma vorhandene Proteasen gespalten wird. Es ist bestimmt worden, daß die Halbwertszeit von Thymopentin im Serum ungefähr 1,5 Minuten beträgt (T.P. Tischio et al., Int. J Peptide Protein Res., Bd. 14 (1979), S. 479).
- Umfangreiche Forschungsanstrengungen sind in den letzten Jahren mit dem Ziel unternommen worden, TP5-Analoga mit einer verbesserten Beständigkeit gegenüber enzymatischem Abbau zu erhalten. Zum Beispiel betreffen EP-A-135 722 und US-4 505 853 synthetische Analoga von Thymopentin mit Variationen an jeder der fünf Positionen.
- Kürzlich ist gezeigt worden (L. Kisfaludy et al., Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem., Bd. 364 (1983), S 933), daß auch das Thymopentin-Fragment 1 bis 3, d.h. H-Arg-Lys-Asp-Oh (TP5¹&supmin;³) eine immunstimulierende Aktivität aufweist. In vorläufigen in vivo-Untersuchungen zeigte es sich als fähig, die Immunantwort bei Mäusen, denen die Thymusdrüse entfernt worden war, wiederherzustellen.
- Auch in diesem Fall stellen jedoch die hohe Empfindlichkeit dieser Verbindung gegenüber enzymatischem Abbau durch Plasmaproteasen und ihre kurze Halbwertszeit wesentliche Nachteile dar.
- Es ist nun festgestellt worden, daß die erfindungsgemäßen Verbindungen der Formel (I) gleichzeitig äquivalente oder verstärkte biologische Aktivität und eine wesentlich erhöhte Beständigkeit gegenüber enzymatischem Abbau zeigen, wenn sie mit den entsprechenden Stammverbindungen TP5 und TP5¹&supmin;³ verglichen werden.
- Insbesondere ist die Empfindlichkeit sowohl von TP5 als auch von [gArg¹,(R,S)mLys²]TP5 gegenüber enzymatischer Hydrolyse in menschlichem Plasma unter Verwendung mit Heparin versetztem menschlichem Plasma und getrennter Inkubation der vorstehenden Peptide bei einer Konzentration von etwa 30 nMol/ml Plasma bestimmt worden. Die Inkubationen wurden bei 37ºC durchgeführt, und Anteile von jeweils 100 ul wurden zu festgelegten Zeitpunkten entnommen, durch Behandlung mit 10 % Trifluoressigsäure blockiert und 5 Minuten bei 10 000 U/min zentrifugiert. Anteile des Überstands wurden durch Chromatographie untersucht, und die Konzentration des Testpeptids zu verschiedenen Zeiten wurde gemessen. Aus den auf diese Weise erhaltenen Kinetiken wurde die Halbwertszeit, d.h. die Inkubationszeit bei 37ºC, die für einen 50 %-igen Abbau des Testpeptids erforderlich war, berechnet. Die Werte sind in der nachstehenden Tabelle 1 angegeben. Tabelle I Stabilität gegenüber enzymatischer Hydrolyse in menschlichem Plasma
- Auch die Verbindung der Formel (I), in der R¹ eine Gruppe -OR&sub2; bedeutet, in der R² ein Wasserstoffatom bedeutet, zeigte eine wesentlich höhere Stabilität gegenüber Plasmaproteasen als die entsprechende Stammverbindung TP5¹&supmin;³, wobei die Halbwertszeit 10 mal höher war.
- Diese wesentlich erhöhte Stabilität der Retro-Inverso-Analoga im Vergleich mit den entsprechenden Stammverbindungen TP5 und TP5(1-3) ist auch gegenüber isolierten Enzymen (Leucinaminopeptidase und Carboxypeptidase) belegt worden.
- Die immunpotenzierende Aktivität von [gArg¹,(R,S)mLys²]TP5 ist sowohl in vitro als auch in vivo im Vergleich mit TP5 untersucht worden, während die Aktivität der Verbindung der Formel (I), in der R ein Wasserstoffatom bedeutet, R¹ eine Gruppe -OR² bedeutet, in der R² ein Wasserstoff bedeutet, direkt im Vergleich mit der entsprechenden Stammverbindung TP5¹&supmin;³ in vivo bewertet worden ist.
- Insbesondere ist als in vitro-Test der Rosette E-Bildungstest sowohl mit peripheren Blutmastzellen (PBMC) als auch mit Cord-Blutzellen (CBC) durchgeführt worden. Die verwendeten CBC ergeben eine prozentuale Rosette E-Bildung mit roten Blutzellen von Schafen (SRBC) von 20 bis 40 %. Der Test basiert auf der Fähigkeit menschlicher T-Zellen zur Bildung von Rosette E mit SRBC. Der Assay ist gemäß den von O.G. Bier et al. in: Fundamentals of Immunology, Springer Verlag (1981), beschriebenen Verfahren durchgeführt worden. Er besteht in der Inkubation von CBC mit oder ohne Testpeptiden über Nacht bei 37ºC in Gegenwart von 5 % CO&sub2;. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle II angegeben. Tabelle II Verbindung % lebende Zellen nach der Inkubation % Bildung an Rosette E CBC-Leerwert
- Als in vivo-Test wurde ein Test mit sogenannten "Plaque-bildenden Zellen", der von N. Jerne (gleiche Druckschrift wie vorstehend) beschrieben wurde, herangezogen. Dieser Test wird durchgeführt, indem Milzzellen von Mäusen, die die Testpeptide erhielten, mit SRBC inkubiert werden und die Anzahl der gebildeten Plaques gezählt wird. Bei der praktischen Durchführung erhielten Gruppen von jeweils 3 Mäusen etwa 1 ng/Maus des Testpeptids i.p. 1 Stunde nach der Antigenimpfung (SRBC). 4 Tage nach dieser Behandlung werden die Milzzellen entnommen, und der Test wird unmittelbar durchgeführt. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle III zusammengestellt. Tabelle III Verbindung Zahl der gebildeten Plaques Log der Zahl der Plaques Leerwert
- In Tabelle III sowie an anderen Stellen dieser Anmeldung hat "RI" die Bedeutung "Retro-Inverso". TP5-RI&sub1;&submin;&sub2; bezeichnet also das Thymopentin- Analogon, das hinsichtlich der 1-2-Peptidbindung retro-invertiert ist. TP5(1-3)-RI&sub1;&submin;&sub2; bezeichnet also das Thymopentin-Tripeptidfragment-Analogon (TP5(1-3)-Analogon), das hinsichtlich der 1-2-Peptidbindung retro-invertiert ist.
- Der Plaque-bildende Zelltest ist wiederholt worden, indem die Testmäuse auf mit TP5 oder mit dem entsprechenden Retro-Inverso-Analogon TP5- RI&sub1;&submin;&sub2; drei Tage vor der Antigen-Injektion (SRBC) behandelt wurden.
- Die erhaltenen Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle IV angegeben. Tabelle IV Verbindung Zahl der gebildeten Plaques Log der Zahl der Plaques Leerwert
- Aus den vorstehenden Ergebnissen ist ersichtlich, daß die erfindungsgemäßen Peptide zur Beeinflussung der Immunantwort des Körpers, und zwar typischerweise zur Stimulierung, wenn sie mangelhaft ist, fähig sind. Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind daher therapeutisch geeignet bei der Behandlung verschiedener Erkrankungen, die durch Immundefekte verursacht werden. Unter diesen Erkrankungen können z.B. das DiGeorge-Syndrom, das durch ein angeborenes Fehlen der Thymusdrüse verursacht wird, oder die chronischen oder lang andauernden Infektionen durch Viren, Pilze oder Mycoplasmen genannt werden.
- Einige der erfindungsgemäßen Verbindungen weisen auch eine immunregulatorische Aktivität auf, die sich darin ausdrückt, daß die Aktivität des Immunsystems unterdrückt wird, wenn sie anomal ist. Von diesen Verbindungen unter Einschluß von TP5-RI&sub1;&submin;&sub2; wird erwartet, daß sie eine breitere therapeutische Anwendung als Immunmodulatoren aufweisen.
- Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind daher pharmazeutische Zusammensetzungen mit einem Gehalt einer therapeutisch wirksamen Menge einer oder mehrerer der Verbindungen der Formel (I).
- Zur Verwendung als Immunstimulatoren oder Immunmodulatoren können die erfindungsgemäßen Verbindungen in geeigneter Weise parenteral, oral, intranasal oder sublingual verabreicht werden. Die Formulierungen, die die neuen Verbindungen enthalten, können gemäß bekannter Techniken durch Mischen des Wirkstoffs mit einem inerten pharmazeutischen Träger und gegebenenfalls mit geeignet ausgewählten herkömmlichen Additiven, von denen bekannt ist, daß sie zur Herstellung eines bestimmten Typs von Zusammensetzung geeignet sind, hergestellt werden. Geeignete pharmazeutische Träger und Formulierungstechniken finden sich in Standardlehrbüchern, wie Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania. Zur oralen oder sublingualen Verabreichung können die erfindungsgemäßen Verbindungen als Tabletten, Kapseln, Drops, Elixiere und dergl. verabreicht werden, die unter Verwendung herkömmlicher Träger/Additive, wie Stärke, Zucker, Wasser, Alkohol und dergl. Additive hergestellt wurden und gegebenenfalls Aromastoffe, Stabilisatoren, Konservierungsmittel, Gleitmittel und dergl. enthalten. Zur parenteralen oder intranasalen Verwendung handelt es sich bei dem Träger der Wahl um steriles Wasser für Injektionen. Additive können gemäß bekannter Techniken zugegeben werden.
- Obwohl die therapeutisch wirksame tägliche Dosierung von Patient zu Patient abhängig von der Art und Schwere der Erkrankung, dem Gewicht und Alter des Patienten, dem Weg der Verabreichung und anderen Faktoren variiert, die ein Fachmann erkennt, liegt die tägliche Dosierung im allgemeinen im Bereich von etwa 10 bis 200 ng/kg Körpergewicht, wobei diese Menge in einer einzelnen oder in mehreren Dosen verabreicht werden kann. Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen enthalten daher die Verbindungen der Formel (I) in einer geeigneten Menge, um eine tägliche Dosierung innerhalb des vorstehend angegebenen Bereiches zu ermöglichen.
- Die erfindungsgemäßen Verbindungen werden auf bequeme Weise durch Kondensation eines Peptidfragments der Formel (II)
- hergestellt, in der PL eine Schutzgruppe für die Aminofunktion der Seitenkette bedeutet, und
- PG eine geeignete Schutzgruppe für die Guanidinofunktion bedeutet, mit einem Peptidfragment der Formel (III)
- in der R³ eine Gruppe -OR², in der R² wie vorstehend definiert ist, eine Gruppe -OP, in der P eine Carboxylschutzgruppe bedeutet, oder eine Gruppierung der Formel (IV) bedeutet:
- in der P wie vorstenend definiert ist und
- PI eine Schutzgruppe der Hydroxylfunktion des Tyrosins bedeutet, und anschließender Umwandlung der terminalen Amidgruppe des auf diese Weise erhaltenen Zwischenprodukts der Formel (V):
- in eine primäre Aminogruppe durch Behandlung mit I,I-Bis-trifluoracetoxyiodbenzol (TIB), um ein Zwischenprodukt der Formel (VI) zu erhalten:
- wobei anschließend wahlweise die Acylierung der terminalen Aminofunktion und die Entfernung der Schutzgruppen erfolgt. Wenn eine Verbindung der Formel (I) gewünscht ist, in der R ein Wasserstoffatom bedeutet und R¹ eine Gruppe -OR² bedeutet, dann kann die Reihenfolge der Amid/Amin-Umwandlung und der Stufen zur Entfernung der Schutzgruppen umgekehrt werden. Dies ist jedoch nicht durchführbar, wenn eine Verbindung der Formel (I) gewünscht ist, in der R¹ eine Gruppe -Val-Tyr-OR² bedeutet, da die Hydroxylgruppe in Tyrosin empfindlich gegenüber TIB ist und während der Amid/Amin-Umwandlungsstufe geschützt werden muß.
- Wenn eine Verbindung der Formel (I) gewünscht ist, in der R¹ eine Gruppe -OR² bedeutet und eine Abspaltung der Schutzgruppen vor der Amid/Amin-Umwandlung durch TIE durchgeführt wird, erhält man ein Zwischenprodukt der Formel (VII):
- das dann mit TIB umgesetzt wird, um das gewünschte Retro-Inverso-Peptid der Formel (I) zu erhalten.
- Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind daher die Zwischenprodukte der Formeln (V), (VI) und (VII), die bei der Synthese der pharmakologisch aktiven Verbindungen der Formel (I) erhalten werden.
- Genauer gesagt kann die erste Stufe des erfindungsgemäßen Verfahrens in bequemer Weise gemäß beliebigen, in der Literatur für die Peptidsynthese bekannten Kupplungsmethoden durchgeführt werden.
- Optimale Ergebnisse im Hinblick auf Ausbeute und Reinheit der Produkte werden erzielt, wenn ein Carbodiimid, wie Dicyclohexylcarbodiimid oder Diisopropylcarbodiimid, und 1-Hydroxybenzotriazol eingesetzt werden. Insbesondere wird die Reaktion durchgeführt, indem ein geringfügiger Überschuß an 1-Hydroxybenzotriazol zu der Lösung der Ausgangssäure der Formel (II) bei niedriger Temperatur gegeben wird. Anschließend erfolgt die Zugabe von Dicyclohexyl- oder Diisopropyl-carbodiimid und dann des Reaktionspartners der Formel (III).
- Herkömmliche polare aprotische organische Lösungsmittel, die fähig sind, die Reaktanten zu lösen und nicht in negativer Weise mit dem Reaktionsverlauf beeinflussen, werden für diese Kondensationsstufe eingesetzt, die in bequemer Weise bei einer Temperatur im Bereich von 0ºC bis Raumtemperatur durchgeführt wird.
- Lösungsmittel der Wahl sind Dimethylformamid, Acetonitril und Dimethylsulfoxid, die gegebenenfalls mit weniger polaren Lösungsmitteln, z.B. halogenierten aliphatischen Kohlenwasserstoffen, wie Methylenchlorid, Dichlorethan und dergl., gemischt werden.
- Bei den Schutzgruppen, die in geeigneter Weise bei diesem Verfahren eingesetzt werden können, handelt es sich um herkömmliche Schutzgruppen, die in der Literatur bekannt und allgemein in der Peptidchemie eingesetzt werden. insbesondere bedeutet PL gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens eine Benzyloxycarbonylgruppe, die gegebenenfalls Nitro- oder Halogen-substituiert ist; PG bedeutet eine verschiedenartig substituierte Benzolsulfonylgruppe, wie eine Alkylbenzolsulfonylgruppe, z.B. Toluolsulfonyl, oder Alkyl-alkoxy-benzolsulfonyl, z.B. 4-Methoxy-2,3,6-trimethylbenzolsulfonyl; PI bedeutet vorzugsweise eine tert.-Butyl- oder eine tert.-Amylgruppe, da sich diese Gruppen als stabil gegenüber TIB erweisen; und schließlich bedeutet P eine beliebige herkömmliche Schutzgruppe für die terminale Carboxylfunktion, wie eine Alkylgruppe, z.B. eine tert.-Butyl- oder tert.-Amylgruppe, oder eine Aralkylgruppe, z.B. Benzyl oder substituiertes Benzyl.
- Wenn die Kondensationsreaktion, deren Verlauf leicht durch TLC verfolgt werden kann, vollständig abgelaufen ist, dann wird das erhaltene Produkt durch herkömmliche Techniken isoliert.
- Insbesondere wenn gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ein Carbodiimid als Kupplungsmittel verwendet wird, dann beinhalten diese Techniken die Abtrennung des gebildeten Harnstoffs durch Filtration, das Verdampfen des Lösungsmittels, das Waschen des Rückstands oder einer Lösung davon mit leicht basischen und leicht sauren Lösungen und die Reinigung des erhaltenen Zwischenprodukts durch Kristallisation oder Chromatographie.
- Die Reaktion des auf diese Weise erhaltenen Produkts mit TIB wird dann gemäß der Methode, die in der italienischen Patentanmeldung 25755 A/81 beschrieben ist, durchgeführt, wobei die Methode die Umsetzung des Amidsubstrats mit einem leichten Überschuß an TIB in Gegenwart eines Gemisches von Wasser und inerten organischen Lösungsmitteln, wie Dimethylformamid, Acetonitril und dergl., als Reaktionslösungsmittel beinhaltet. Die Reaktion wird durch Einleiten eines inerten Gases, typischerweise Stickstoff, durch das Reaktionsgemisch und Überwachung des Reaktionsverlaufs durch TLC durchgeführt. Wenn die Amid/Amin-Umwandlung vollständig abgelaufen ist, wird das organische Lösungsmittel entfernt, und das Produkt kann leicht durch Lyophilisierung gewonnen werden. Gegebenenfalls kann die Acylierung des erhaltenen Produkts unter Verwendung eines aktiven Esters der Säure R-OH, wie des p-Nitrophenylesters, des 2,4,5-Trichlorphenylesters und dergl., durchgeführt werden. Die Entfernung der Schutzgruppen kann durch dem Fachmann für die entsprechenden Schutzgruppen bekannte Methoden erfolgen. Wenn herkömmliche Schutzgruppen eingesetzt werden, wie tert.-Butyl oder tert.-Amyl zum Schutz der Hydroxylfunktion in Tyrosin und der Carboxylgruppen, tert.-Butoxycarbonyl oder Benzyloxycarbonyl für den Schutz der ε-Aminogruppe im Lysinrest und Benzolsulfonylgruppen für die Guanidinogruppe in Arginin, dann werden diese im allgemeinen in bequemer Weise durch Acidolyse in einem sauren Medium, z.B. verdünnte Chlorwasserstoffsäure in Essigsäure, Trifluoressigsäure oder Gemische aus Trifluoressigsäure und Trifluormethansulfonsäure in der Gegenwart kleiner Mengen an Ethandithiol, Anisol, Thioanisol oder Resorcin als Fänger für die gebildeten Carbokationen abgespalten. Am Ende der Stufe zur Entfernung der Schutzgruppen wird die gewünschte Verbindung der Formel (I) direkt oder als das entsprechende Additionssalz isoliert und nach herkömmlichen Methoden gereinigt.
- Wenn eine Verbindung der Formel (I) gewünscht ist, in der R ein Wasserstoffatom bedeutet und R¹ eine Gruppe -OR² bedeutet, dann wird, wie bereits vorweggenommen wurde, die Reihenfolge der Amid/Amin-Umwandlung und der Stufen zur Abspaltung der Schutzgruppen vorzugsweise umgekehrt.
- Die allgemeinen Methoden zur Durchführung dieser Stufen sind jedoch dieselben.
- Die Homogenität der Verbindungen der Formel (I), die auf diese Weise erhalten werden, wird durch TLC und HPLC untersucht, während ihrer Reinheit durch Aminosäureanalyse und NMR-Spektroskopie bestimmt wird.
- Die Ausgangsverbindungen der Formeln (II) und (III) können leicht aus im Handel erhältlichen Produkten hergestellt werden, oder sie können leicht durch Techniken, die auf dem Gebiet der Peptidchemie und der organischen Chemie bekannt sind, hergestellt werden.
- Insbesondere wird das Fragment der Formel (II) in bequemer Weise gemäß den für die Peptidsynthese bekannten Methoden hergestellt, indem man von einem Amid der Formel (VIII):
- in der PG eine Schutzgruppe der Guanidinofunktion bedeutet, und einem 2- substituierten Malonsäurehalbester der Formel (IX):
- in der PL eine geeignete Schutzgruppe für die Aminofunktion bedeutet, ausgeht.
- Die Verbindung der Formel (VIII) wird wiederum aus der entsprechenden Aminosäure, die in geeigneter Weise an den Guanidino- und Aminofunktionen geschützt ist, durch Bildung des Amids und anschließende Abspaltung der Schutzgruppe der Aminogruppe hergestellt, während die Verbindung der Formel (IX) ausgehend von Diethylmalonat durch Einführung des Substituenten in die 2-Position und anschließende partielle Hydrolyse des Diesters hergestellt wird.
- Die Methoden zur Herstellung des Peptidfragments der Formel (III) sind diejenigen Methoden, die herkömmlicherweise bei der Synthese von Oligopeptiden angewandt werden.
- Die erfindungsgemäßen Verbindungen können in zwei isomeren Formen vorliegen.
- In der Strukturformel (I) liegen in der Tat mindestens drei asymmetrische Kohlenstoffatome vor, die terminale Aminosäure oder die Aminosäuren (Asp, Val, Tyr) weisen jedoch die "natürliche" oder L-Konfiguration auf (Fragment (III) wird ausgehend von geeignet gewählten L-Asparaginsäure-, L-Valin- und L-Tyrosin-Derivaten hergestellt), und die absolute Konfiguration des geminalen Diaminokohlenstoffatoms ist ebenfalls festgelegt, da das Fragment der Formel (VIII) ausgehend von D-Arginin erhalten wird. Schließlich können die asymmetrischen Malonyl-Kohlenstoffatome entweder die R- oder die S-Konfiguration aufweisen. Daher können die Verbindungen der Formel (I) als reine Isomere oder als Gemische davon in beliebigen Anteilen erhalten und verwendet werden. Wenn das Verfahren zur Herstellung der Verbindungen der Formel (I) zu einem Gemisch von Diastereomeren führt, kann das Gemisch jedoch aufgetrennt werden, gegebenenfalls in die einzelnen Diastereomere, und zwar gemäß bekannter Trennverfahren.
- Die nachstehenden Beispiele beschreiben ausführlich einige repräsentative Verbindungen der vorliegenden Erfindung und die Verfahren zu ihrer Herstellung, aber sie sollen nicht als Beschränkung des Schutzumfangs der Erfindung verstanden werden.
- (Die Verbindung der Formel (I), in der R = H bedeutet;
- R² = H)
- 1) L-Tyrosin-O-tert.-butylether-tert.-butylester-formatsalz (H- Tyr(OBut)OBut HCCOH)
- Eine Lösung von Ammoniumformat (0,73 g, 11,7 mMol) in Methanol (10 ml) und Palladium auf künstlicher Kohle (1,5 g) werden zu einer Lösung von L-Tyrosin-O-tert.-butylether-tert.-butylester (Tyr(OBut)OBut), wobei diese Verbindung gemäß dem in "New Aspects in Physiological Antitumor Substances", Karger, Basel (1985), S. 33 beschriebenen Verfahren hergestellt wurde (2 g, 4,68 mMol), in Methanol (20 ml) gegeben. Die erhaltene Lösung wird für etwa 25 Minuten bei 25ºC gehalten. Das Reaktionsgemisch wird anschließend über Celite filtriert, und das Lösungsmittel wird verdampft, wobei man ein klares Öl (1,6 g, 87 %) erhält. Rf (CMA, 85:10:5, bezogen auf das Volumen) 0,2 (CMA = Chloroform:Methanol:Essigsäure).
- 2) Nα-(Nα-Benzyloxycarbonyl-valyl)-tyrosin-O-tert.-butylether- tert.-butylester (Z-Val-Tyr(OBut)-OBut)
- Eine Lösung von 1-Hydroxybenzotriazol (HOBt) (0,652 g, 4,47 mMol) in Dimethylformamid (DMF) (5 ml) und eine Lösung von Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) (0,921 g, 4,47 mMol) in DMF (5 ml) werden unter Rühren zu einer Lösung von Nα-Benzyloxycarbonyl-L-valin (Z-Val) (1,12 g, 4,47 mMol) in DMF (25 ml), die auf 0ºC gekühlt ist, gegeben.
- Etwa 30 Minuten später wird das Eisbad entfernt, und das Rühren wird für weitere 30 Minuten fortgesetzt. Eine Lösung der in Stufe 1) erhaltenen Verbindung (1,19 g, 4,06 mMol) und N-Methyl-morpholin (NMM) (0,41 g, 4,06 mMol) in DMF (15 ml) werden anschließend zugegeben.
- Das Gemisch wird 1 Stunde bei Raumtemperatur belassen. Der gebildete Dicyclohexylharnstoff (DCU) wird dann abfiltriert, und das Filtrat wird zur Trockene eingeengt. Das erhaltene Öl wird in Ethylacetat (AcOEt) (50 ml) aufgenommen und 20 Minuten mit 5 %-iger wäßriger Natriumbicarbonatlösung gerührt. Die organische Phase wird abgetrennt und nacheinander mit 5 %-iger Natriumbicarbonatlösung, Wasser, 0,1 n HCl und schließlich mit Wasser gewaschen. Durch Abdampfen des organischen Lösungsmittels erhält man einen rohen festen Rückstand, der in einer minimalen Menge an heißem Isopropylether gelöst und daraus durch Kühlen kristallisiert wird. Man erhält ein klares, kristallines Produkt (1,6 g, 75 %). Schmelzpunkt: 114-115ºC, Rf (CMA, 85:10:5, bezogen auf das Volumen) 0,8.
- Eine Lösung von HOBt (0,434 g, 2,97 mMol) in DMF (3 ml) und eine Lösung von DCC (0,613 g, 2,97 mMol) in CH&sub2;Cl&sub2; (10 ml) werden zu einer Lösung von Nα-Benzyloxycarbonyl-asparaginsäure-(β-tert.-butylester) (Z- Asp(OBut)-OH(1,06 g, 2,97 mMol) in CH&sub2;Cl&sub2; (20 ml), die auf 0ºC gekühlt wird, gegeben. Es wird kräftig gerührt.
- Nach 30 Minuten läßt man die Temperatur auf Raumtemperatur ansteigen, und das Rühren wird für weitere 30 Minuten fortgesetzt. Eine Lösung von HCOOH H-Val-Tyr(OBut)-OBut (1,26 g, 2,7 mMol) (erhalten aus dem in Stufe 2) hergestellten Zwischenprodukt durch herkömmliche Entfernung der Benzyloxycarbonylgruppe durch katalytische Hydrogenolyse mit Ammoniumformat und Palladium) und NMM (0,207 g, 2,7 mMol) in DMF (15 ml) wird zu dem Gemisch gegeben.
- Das Reaktionsgemisch wird 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, der gebildete DCU wird durch Filtration entfernt und das Lösungsmittel wird erneut unter verringertem Druck abgedampft.
- Der Rückstand wird in AcOEt (50 ml) aufgenommen, gesättigte NaHCO&sub3;- Lösung wird zugegeben, und das Gemisch wird 20 Minuten gerührt. Die wäßrige Phase wird verworfen, und die organische Phase mit gesättigter NaHCO&sub3;-Lösung, Wasser, 0,1 n HCl und Wasser gewaschen. Die organische Phase wird über MgSO&sub4; getrocknet und zur Trockene eingeengt.
- Das Produkt wird aus Ethylacetat/Hexan kristallisiert, wobei man ein mikrokristallines klares Produkt (1,7 g, 90 %) mit einem Schmelzpunkt von 184 bis 185ºC und einem Rf-Wert (CMA, 85:10:5, bezogen auf das Volumen) von 0,9 enthält.
- Eine Lösung von 1-Hydroxybenzotriazol-ammoniumsalz (HOBt NH&sub3;) (3,0 g, 16,45 mMol) und DCC (3,38 g, 16,45 mMol) in DMF (10 ml) wird unter Rühren zu einer Lösung von Nα-Fluorenylmethoxycarbonyl-NG-(4-methoxy- 2,3,6-trimethyl)-benzolsulfonyl-D-arginin (Fmoc-D-Arg(Mtr)-OH) (10 g, 16,45 mMol) in DMF (60 ml), die auf 0ºC gekühlt wird, gegeben.
- Nach etwa 1 Stunde läßt man die Temperatur auf Raumtemperatur ansteigen, und das Rühren wird für weitere 60 Minuten fortgesetzt.
- Der gebildete DCU wird anschließend durch Filtration entfernt und mit DMF (10 ml) gewaschen. Die DMF-Waschlösungen werden dann zum Filtrat gegeben. Durch Abdampfen des Lösungsmittels erhält man einen ölartigen Rückstand, der in AcOEt aufgenommen und zuerst mit 5 %-iger Natriumbicarbonatlösung und danach mit gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen wird.
- Die organische Lösung wird anschließend über MgSO&sub4; getrocknet und zur Trockene eingeengt. Der feste Rückstand, den man erhält, wird mit Ethylether (100 ml) verrieben, wobei man einen weißen Feststoff (9,2 g, Ausbeute: 93 %) mit einem Schmelzpunkt von 168-172ºC erhält.
- Chromatographische Analysen (TLC und HPLC) zeigen keinerlei Verunreinigungen.
- Eine Suspension der in Stufe 4) erhaltenen Verbindung (9 g, 15,5 mMol) in einem Gemisch aus DMF und Diethylamin 80:20 (100 ml) wird 1 Stunde gerührt. Das Lösungsmittel wird anschließend unter verringertem Druck abgedampft, und der Rückstand wird in AcOEt (100 ml) aufgenommen und mit verdünnter Chlorwasserstoffsäure (50 ml x 3) extrahiert. Die wäßrigen Extrakte werden vereinigt, mit weiterem AcOEt gewaschen und wiederholt lyophilisiert, wobei man ein farbloses, flockiges Produkt (4,5 g, Ausbeute: 80 %) erhält. Dieses Produkt zeigt keinen klar wahrnehmbaren Schmelzpunkt. Die chromatographische Analyse zeigt keinerlei Verunreinigungen.
- Metallisches Natrium (0,28 g, 0,012 Mol) wird in absolutem Ethylalkohol (EtOH) (9 ml) unter einer Stickstoffatmosphäre gelöst. Das Gemisch wird auf 60ºC erwärmt, und Diethylmalonat (3,8 g, 0,024 Mol) wird anschließend zugetropft. N-tert.-Butoxycarbonyl-4-chlorbutylamin (2, 5 g, 0,012 Mol) wird dann allmählich bei Raumtemperatur zu der erhaltenen Lösung gegeben. Das Reaktionsgemisch wird 2 Stunden bei Raumtemperatur und 6 Stunden bei Rückflußtemperatur gerührt. Anschließend wird es in ein Gemisch aus AcOEt/Wasser (100 ml, 1/1 (Vol./Vol.)) gegossen. Die organische Phase, die abgetrennt wird, wird anschließend wiederholt mit Wasser gewaschen und über MgSO&sub4; getrocknet.
- Das Lösungsmittel wird unter Vakuum bei 100ºC entfernt, wobei man ein rohes ölartiges Produkt erhält, das durch Umkehrphasen-HPLC auf einer RP-18-Säule bei Elution mit einer wäßrigen Phase, die mit CH&sub3;CN (45 Vol.- %) modifiziert ist, gereinigt wird. Die gewünschte Verbindung (1,31 g) wird auf diese Weise als reines Produkt erhalten.
- Eine Lösung von KOH (9,97 mMol) in EtOH (10 ml) wird tropfenweise zu einer Suspension der in der vorstehenden Stufe erhaltene Verbindung (3,48 g, 10,5 mMol) in EtOH (15 ml) gegeben.
- Nach 16 Stunden wird das Reaktionsgemisch in Wasser aufgenommen und mit Ethylether extrahiert. Die wäßrige Phase wird anschließend mit 1 n HCl bis zu einem pH-Wert von 3 angesäuert und erneut mit AcOEt extrahiert. Die organischen Extrakte werden vereinigt, mit gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen und über MgSO&sub4; getrocknet.
- Durch Abdampfen des Lösungsmittels unter verringertem Druck erhält man das gewünschte Produkt als klares Öl. Die HPLC-Analyse zeigt keinerlei Verunreinigungen, während das NMR-Spektrum die angenommene Struktur bestätigt.
- Eine Lösung von HOBt (0,159 g, 1,1 mMol) in DMF (3 ml) und eine Lösung von DCC (0,204 g, 1,0 mMol) in DMF (5 ml) werden zu einer Lösung der in der vorstehenden Stufe erhaltenen Verbindung (0,30 g, 1,0 mMol) in DMF (10 ml), die auf 0ºC gekühlt wird, gegeben, und es wird kräftig gerührt.
- 1 Stunde später läßt man die Temperatur auf Raumtemperatur ansteigen, und das Rühren wird für weitere 60 Minuten fortgesetzt. Eine Lösung aus der in Stufe 5) erhaltenen Verbindung (0,502 g, 1,2 mMol) und aus NMM (1,120 g, 1,2 mMol) in DMF (10 ml) wird anschließend zugegeben. Nach 4 Stunden, nachdem das Verschwinden von HO-mLys(Boc)-OEt durch TLC überprüft worden ist, wird das Reaktionsgemisch filtriert, und das Filtrat wird zur Trockene eingeengt. Der auf diese Weise erhaltene Rückstand wird in AcOEt aufgenommen, und die organische Lösung wird nacheinander mit 5 %-iger Natriumbicarbonatlösung, Wasser, 0,1 n HCl und Wasser gewaschen. Die organische Lösung wird über MgSO&sub4; getrocknet und eingeengt. Der ölartige Rückstand, den man erhält, wird mit Hexan verrieben, wobei man schließlich ein feinverteiltes weißes Pulver (0,546 g, Ausbeute: 68 %) mit einem Schmelzpunkt von 147-149ºC (Zers.) erhält. Die chromatographischen Analysen (TLC und HPLC) zeigen keinerlei Verunreinigungen, während die NMR-Analyse die angenommene Struktur bestätigt.
- Eine Lösung von KOH (0,017 mg, 0,30 uMol) in EtOH (1 ml) wird tropfenweise innerhalb von 2 Stunden zu einer Lösung der Verbindung der vorstehenden Stufe (180 mg, 0,26 mMol) in EtOH (8 ml), die auf 0ºC gekühlt wird, gegeben, und das Reaktionsgemisch wird anschließend 16 Stunden gerührt. Das Gemisch wird dann mit Wasser verdünnt und durch Einengen unter verringertem Druck auf ein kleines Volumen gebracht. Es wird dann mit Ethylether (3 x 50 ml) extrahiert, die wäßrige Phase wird durch Zugabe von 0,1 n HCl bis zu einem pH-Wert von 3 angesäuert und erneut mit AcOEt extrahiert. Die organischen Extrakte werden vereinigt, über MgSO&sub4; getrocknet und eingeengt. Der ölartige Rückstand wird mit Ethylether verrieben, wobei man die gewünschte Verbindung (0,160 g, Ausbeute: 85 %) als chromatographisch (TLC und HPLC) reines Produkt erhält. Die NMR-Analyse bestätigt die angenommene Struktur.
- Eine Lösung von HOBt (39 mg, 0,26 mMol) und DCC (55 mg, 0,26 mMol) in DMF (4 ml) wird zu einer Lösung der in der vorstehenden Stufe erhaltenen Verbindung (170 mg, 0,26 mMol) in DMF (8 ml), die auf 0ºC gekühlt wird, gegeben. Nach 60 Minuten läßt man die Temperatur auf Raumtemperatur ansteigen, und das Rühren wird für weitere 60 Minuten fortgesetzt.
- Nα-Aspartyl-(β-tert.-butylester)-valyl-tyrosyl-O-tert.-butylether- tert.-butylester (H-Asp(OBut)-Val-Tyr(OBut)-OBut) (243 mg, 0,39 mMol) (erhalten aus der in Stufe 3) hergestellten Verbindung durch Abspaltung der Benzyloxycarbonylgruppe durch katalytische Hydrogenolyse mit Ammoniumformat und Palladium) und NMM (39 mg, 0,39 mMol) werden anschließend zu der vorstehenden Lösung gegeben. Nach 16 Stunden wird der DCU durch Filtration entfernt, und das Filtrat wird zur Trockene eingeengt. Der feste Rückstand, den man erhält, wird mit Hexan verrieben, wobei man ein feinverteiltes weißes Pulver erhält. Das übliche Waschen mit basischen (5 % Natriumbicarbonat) und sauren (0,1 n HCl) Lösungen wird anschließend durchgeführt, indem das erhaltene Produkt in den Waschlösungen suspendiert wird. Auf diese Weise erhält man das gewünschte Produkt (250 mg, Ausbeute: 72 %).
- Die Verbindung der vorstehenden Stufe (300 mg) wird in einem Gemisch aus CH&sub3;CN und H&sub2;O (9 ml CH&sub3;CN und 10 ml H&sub2;O) gelöst. Eine Lösung von TIB (120 mg) in CH&sub3;CN (2 ml) wird anschließend unter Stickstoffatmosphäre zugegeben, und das erhaltene Gemisch wird 3 Stunden gerührt.
- Das Reaktionsgemisch wird anschließend zur Trockene eingeengt, wobei man ein gelbliches Öl erhält. Die Aminosäureanalyse bestätigt, daß das Argininamid in eine geminale Diaminogruppe umgewandelt worden ist.
- Das erhaltene rohe Öl (150 ml) wird anschließend in einem Gemisch aus Ethandithiol, Trifluoressigsäure und Trifluormethansulfonsäure (10:89:1) (100 ml) aufgenommen, und man läßt es etwa 20 Minuten reagieren. Triethylamin (1,5 ml) wird zu dem erhaltenen Gemisch gegeben, das anschließend unter einem Stickstoffstrom zur Trockene eingeengt wird.
- Der Rückstand wird zwischen Ethylether und Wasser verteilt. Die organische Phase wird abgetrennt und gründlich mit Wasser extrahiert. Die wäßrigen Phasen werden vereinigt, mit Ethylether extrahiert, wobei das Ethandithiol verschwindet und anschließend wiederholt lyophilisiert. Das Produkt wird als das Essigsäure-Additionssalz durch Ionenaustauschchromatographie auf einer CM-Sephadex G-25-Säule (15 x 0,9 cm; 2 g) isoliert und mit einem linearen Gradienten mit Ammoniumacetat von 0,1 bis 0,6 m, pH-Wert: 4,4 bei einer Durchflußgeschwindigkeit von 42 ml pro Min. eluiert.
- Diejenigen Fraktionen, die das gewünschte Produkt enthalten, werden vereinigt, unter verringertem Druck auf ein kleines Volumen eingeengt und lyophilisiert. Man erhält 45 mg eines Feststoffs (Ausbeute: 42 % der Theorie).
- Chromatographische Analysen und NMR-Analysen bestätigen die Reinheit der Verbindung und ihre Struktur.
- Eine Lösung von HOBt (28 mg, 0,20 mMol) und DCC (40 mg, 0,20 mMol) in DMF (5 ml) wird zu einer Lösung der in Stufe 9) von Beispiel 1 erhaltenen Verbindung (130 mg, 0,20 mMol) in DMF (5 ml), die auf 0ºC gekühlt wird, gegeben, und es wird gerührt. Nach 60 Minuten läßt man das Gemisch Raumtemperatur erreichen, und das Rühren wird für weitere 60 Minuten fortgesetzt. Eine Lösung von NMM (21 mg, 0,21 mMol) und H-Asp(OBut)-OBut (39 mg, 0,21 mMol) in DMF (3 ml) wird anschließend zugegeben. Nach 16 Stunden wird die Reaktion durch Entfernung des Lösungsmittels beendet. Der erhaltene Rückstand wird anschließend in AcOEt aufgenommen und filtriert. Eine gesättigte Natriumbicarbonatlösung wird zu dem Filtrat gegeben, und das Gemisch wird 30 Minuten gerührt. Die organische Phase wird abgetrennt, nacheinander mit einer gesättigten Natriumbicarbonatlösung, Wasser, 0,1 n HCl und Wasser gewaschen und über MgSO&sub4; getrocknet. Der Rückstand, den man durch Abdampfen des Lösungsmittels erhält, wird anschließend aus AcOEt/Hexan umkristallisiert, wobei man das gewünschte Produkt (140 mg) mit einem Schmelzpunkt von 156-158ºC und einem Rf-Wert (CMA, 85:10:5, bezogen auf das Volumen) von 0,4 erhält.
- Die Verbindung der vorstehenden Stufe (50 mg) wird in einem Gemisch aus Ethandithiol, Trifluoressigsäure und Trifluormethansulfonsäure (10:89:1) (20 ml) unter Stickstoffatmosphäre gelöst. Nach 15 Minuten wird das Gemisch auf 0ºC gekühlt, und Triethylamin (0,3 ml) wird zugegeben. Das Gemisch wird unter einem Stickstoffstrom zur Trockene eingeengt. Der erhaltene Rückstand wird in Wasser (25 ml) aufgenommen und mit Ethylether (10 ml) extrahiert. Die abgetrennte organische Phase wird mit Wasser (25 ml) extrahiert und anschließend verworfen. Die wäßrigen Extrakte werden vereinigt, mit Ethylether (2 x 10 ml) gewaschen und lyophilisiert, wobei man einen weißen Feststoff (25 mg) erhält.
- I,I-Bis-(trifluoracetoxy)-iodbenzol (36 mg) wird zu einer Lösung des vorstehenden Produkts in CH&sub3;CN/H&sub2;O (50/50 (Vol./Vol.)) (6 ml) gegeben. Das Reaktionsgemisch wird 4 Stunden gerührt und zur Trockene eingeengt. Der Rückstand wird in H&sub2;O (50 ml) aufgenommen und mit Ethylether (3 x 25 ml) gewaschen. Die wäßrige Phase wird anschließend verdünnt und lyophilisiert. Das in der Überschrift angegebene Produkt wird durch Ionenaustauschchromatographie auf einer CM-Sephadex G-25-Säule (15 x 0,9 cm; 2 g) isoliert und mit einem linearen Gradienten mit Ammoniumacetat von 0,15 bis 0,6 m, pH-Wert: 4,4 in 8 Stunden bei einer Durchflußgeschwindigkeit von 42 ml/min eluiert.
- Fraktionen wurden alle 6 Minuten gesammelt.
- Diejenigen Fraktionen, die das gewünschte Produkt enthalten, werden vereinigt, unter verringertem Druck zu einem kleinen Volumen eingeengt und lyophilisiert. Die in der Überschrift genannte Verbindung (12 mg) wird auf diese Weise als weißer Feststoff (Ausbeute: 43 %) erhalten.
- Chromatographische Analysen (Rf (BPAW) 0,15) und NMR-Analysen bestätigen die Reinheit des Produkts und die angenommene Struktur.
Claims (11)
1. Verbindung der folgenden Formel (I) sowie die entsprechenden
pharmazeutisch verträglichen Säure- oder Base-Additionssalze:
in der
R ein Wasserstoffatom oder eine Acylgruppe bedeutet, und
R¹ eine Gruppe -OR² oder
bedeutet, wobei R² ein Wasserstoffatom oder eine gerade oder
verzweigte Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, eine gerade oder
verzweigte Alkenyl- oder Alkinylgruppe mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen
oder eine Aryl-alkyl- oder Alkyl-aryl-Gruppe mit 7 bis 12
Kohlenstoffatomen bedeutet.
2. Verbindung nach Anspruch 1, in der R ein Wasserstoffatom bedeutet und
R¹ eine Gruppe -OR² oder
bedeutet, in der R² ein Wasserstoffatom bedeutet.
3. Verbindung nach Anspruch 2, in der R¹ eine Gruppe
bedeutet, in der R² ein Wasserstoffatom bedeutet.
4. Verbindung nach Anspruch 3, die unter [gArg¹,(R,S)mLys²]TP5 und
Additionssalzen davon ausgewählt ist.
5. Verbindung nach Anspruch 2, in der R¹ eine Gruppe -OR² bedeutet.
6. Verbindung nach Anspruch 5, die unter [gArg¹,(R,S)mLys²]TP5(1-3) und
Additionssalzen davon ausgewählt ist.
7. Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend eine Verbindung nach
Anspruch 1 als Wirkstoff.
8. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 6 zur Verwendung als
Arzneimittel.
9. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung nach Anspruch 1, wobei das
Verfahren folgende Stufen umfaßt: die Kondensation eines
Peptidfragments der Formel (II)
in der PL eine Schutzgruppe für die Aminofunktion der Seitenkette
bedeutet, und
PG eine geeignete Schutzgruppe für die Guanidinofunktion bedeutet,
mit einer Verbindung der Formel (III)
in der R³ eine Gruppe -OR², in der R² wie vorstehend definiert ist,
eine Gruppe -OP, in der P eine Carboxylschutzgruppe bedeutet, oder
eine Gruppierung der Formel (IV) bedeutet:
in der P wie vorstehend definiert ist und
PI eine Schutzgruppe der Hydroxylfunktion des Tyrosins bedeutet,
und die anschließende Umwandlung der terminalen Amidgruppe des auf
diese Weise erhaltenen Zwischenprodukts der Formel (V):
in eine primäre Aminogruppe durch Behandlung mit
I,I-Bis-trifluoracetoxy-iodbenzol (TIB), um ein Zwischenprodukt der Formel (VI) zu
erhalten:
in der P, PG, PL und R³ wie vorstehend definiert sind, wobei
anschließend wahlweise die Acylierung der terminalen Aminofunktion und
die Entfernung der Schutzgruppen erfolgt;
wobei das Verfahren ferner dadurch gekennzeichnet ist, daß, wenn eine
Verbindung der Formel (I) gewünscht ist, in der R ein Wasserstoffatom
bedeutet und R¹ eine Gruppe -OR² bedeutet, das Zwischenprodukt der
Formel (V) zuerst eine Stufe zur Entfernung der Schutzgruppen
unterworfen werden kann, um ein Zwischenprodukt der Formel (VII) zu
erhalten:
das wiederum anschließend-durch Behandlung mit
I,I-Bis-trifluoracetoxy-iodbenzol in die gewünschte Verbindung der Formel (I) umgewandelt
wird.
10. Zwischenprodukte der Formeln (V), (VI) und (VII)
in denen
PL eine Schutzgruppe für die Aminofunktion der Seitenkette bedeutet,
und
PG eine geeignete Schutzgruppe für die Guanidinofunktion bedeutet,
R³ eine Gruppe -OR², in der R² wie in Anspruch 1 definiert ist, eine
Gruppe -OP, in der P eine Carboxylschutzgruppe bedeutet, oder eine
Gruppierung der Formel (IV) bedeutet:
in der P wie vorstehend definiert ist und
PI eine Schutzgruppe der Hydroxylfunktion des Tyrosins bedeutet.
11. Zwischenprodukt der Formel (V), (VI) oder (VII) nach Anspruch 10, in
der
PL eine tert.-Butoxycarbonyl oder eine tert.-Amylgruppe bedeutet,
PG eine wahlweise Benzolsulfonylgruppe bedeutet,
R³ eine Gruppe -OR², in der R² wie in Anspruch 1 definiert ist, eine
Gruppe -OP, in der P eine tert.-Butyl-, eine tert.-Amyl-, eine
Benzyl- oder eine substituierte Benzylgruppe bedeutet, oder eine Gruppe
der Formel (IV) bedeutet:
in der
P wie vorstehend definiert ist und
PI eine tert.-Butyl- oder eine tert.-Amylgruppe bedeutet.
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