DE2807403A1

DE2807403A1 - Peptidderivate des somatostatins, verfahren zu ihrer herstellung, arzneimittel und zwischenprodukte

Info

Publication number: DE2807403A1
Application number: DE19782807403
Authority: DE
Inventors: Dimitrios Sarantakis
Original assignee: American Home Products Corp
Current assignee: Wyeth LLC
Priority date: 1977-02-22
Filing date: 1978-02-21
Publication date: 1978-08-31
Also published as: SE7802015L; DK150618B; DK76378A; FR2382433B1; IE46462B1; DK150618C; FR2382433A1; DE2807403C2; SE447482B; IE780348L

Description

28 07 4 ΠΙ PROF. DR. DR. J. REITSTÖTTER ** ^{v v} ^ V^

DR.-ING. WOLFRAM BUNTE DR. WERNER KlNZEBACH

BAUER8TRAS8E 22. Q-SOOO MÜNCHEN 4O ■ FERNRUF (Ο891 37 63 83 - TELEX S21B2OII ISAR D POSTANSCHRIFT: POSTFACH TBO. D-BOOO MÜNCHEN 43

München, 21. Feoruar 1978 M/19 021

AMERICAN HOME PRODUCTS

CORPORATION

685 Third Avenue

New York, N.Y.10017/USA

Peptidderivate des Somatostatins, Verfahren zu ihrer Herstellung, Arzneimittel und Zwischenprodukte

809835/0720

M/19 021
ÄHP-6853/6854/6853-1-C1/7093

Die Erfindung betrifft Peptidderivate des Somatostatins, das Verfahren zu ihrer Herstellung, Arzneimittels die diese Verbindungen enthalten und Zwischenprodukte, die zur Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen verwendet werden.

Es wurde gezeigt (Brazeau et al . , Science 179, 77 (L973)), | daß der als Somatostatin bekannte cyclische Somatot^Λοριn-frei- j setzungsinhibierende Faktor (SRIF) die folgende Strjktur A j besitzt: '

H-Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ssr-Cys-OH

I I

S S

(A)

wobei sämtliche Aminosäuren der "natürlichen" oder L-Konfigura· tion angehören.

In der Literatur wurden verschiedene Methoden zur Synthese von Somatostatin berichtet. Hierzu gehört die Festphasenmethode von Rivier, J.Am.Chem.Soc. , 9^» ²⁹⁸⁵ (1974), sowie die Lösungsmethoden von Sarantakis et al., Biochemical Biophysical Research Communications _5j4, 234 (1973) und Immer et a1.₉ HeIv. Chim. Acta, 5_7, 730 (1974). Die Pepti df orschung unternimmt große Anstrengungen mit dem Ziel, die pharmakologisehe Wirksamkeit von Somatostatin durch synthetische Modifikation seiner Struktur zu erhöhen.

Die reduzierte Form (offenkettige Form) von Somatostatin (RS) ist das lineare Tetradecapeptid der Formel B

SH

SH I

H-Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-OH

(B)

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Die reduzierte Form (B) wurde durch Total synthese (vgl. Rivier et al., C.R.Acad.Sci.Ser.p.Sci. Natur (Paris) 276, 2737 (1973) und Sarantakis und McKinley, Biochem. and Biophys. Res. Communications, 54_, 234 (1973)) hergestellt; sie kann (B) durch Oxydation in das Somatostatin (A) überführt werden, wobei zwischen den beiden Sulfhydrylgruppen der im Tetradecapeptid befindlichen Cysteinylaminosäurereste eine Brückenbindung gebildet wird.

Es wurden zahlreiche Polypeptide synthetisch hergestellt, die

als Strukturmodifikationen des Somatostatins angesehen werden ^! können. Diese sind in der chemischen Literatur beschrieben. Derartige Polypeptide haben mit dem Somatostatin gewisse Strukturparameter gemeinsam und unterscheiden sich vom Somatostatin dadurch, daß spezifische Aminosäurereste ode" funktionelle Gruppen, die ursprünglich im Somatostatinmolekül enthalten sind, entweder fehlen oder durch andere Aminosäurereste oder funktionelle Gruppen ersetzt sind.

Die vorliegende Erfindung umfaßt neue, synthetische und biologisch aktive Polypeptide, die als Strukturmodifikationen des Somatostatins aufgefaßt werden können. Die erfindungsgemäßen Polypeptide unterscheiden sich vom Somatostatin in folgender Hinsicht:

(a) Das Ala -GIy -Segment liegt entweder vor, fehlt oder ist durch Gly-Gly, Gly-Gly-Gly, Ala-D-Alä, Acetyl oder Benzoyl ersetzt;

(b) der Lys -Rest ist durch Arg oder His ersetzt;

(c) der Asn -Rest ist durch His, GIu oder Asp ersetzt; und

(d) der Trp -Rest ist entweder vorhanden oder durch D-Trp p_der_j^F-D-Trp ersetzt.

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Falls nicht anders angegeben, besitzen sämtliche optisch akti ven Aminosäurereste und Aminosäuren die L-Konfiguration.

Die Erfindung schafft somit chemische Verbindungen der Formel I

X-CyS-X₁-X₉-Phe-Phe-Xo-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-X₄-OH I I

SA SA

(D

worin:

A für Wasserstoff steht oder die beiden Gruppen A entweder eine direkte Bindung zwischen den in der Formel I dargestellten Schwefelatomen S unter Bildung einer cyclischen Struktur, oder eine direkte Bindung zwischen den in der Formel I dargestellten Schwefelatomen S eines Moleküls mit den Schwefelatomen weiterer Verbindungen der Formel I unter Bildung einer linearen oder cyclischen polymeren Struktur, bedeuten, wobei bei polymeren Strukturen zwischen 2 und 100 Struktureinheiten der Formel I miteinander verbunden sein können und wobei im Falle einer polymeren linearen Verbindung die beiden endständigen Schwefelatome S mit Wasserstoff abgesättigt sind;

X für Wasserstoff, AIa-GIy₈ GIy-GIy₅ Al.a-D-Ala, GIy-GIy-GIy₅ Acetyl oder Benzoyl steht;

X_I für His oder Arg steht;

X₂ die Bedeutung His, GIu oder Asp besitzt;

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X₃ für Trp, D-Trp oder 6-F-D-Trp steht; und

X₄ für Cys oder D-Cys steht;

und deren pharmazeutisch verträgliche Salze.

Die Erfindung betrifft somit auch die lineare Form der Ver- I bindungen der Formel I_s d.h. die nicht-cyclischen, reduzierten Verbindungen der Formel Ia₅ die zwei freie Sulfhydrylgruppen enthalten, sowie nicht-toxische, pharmazeutisch verträgliche Säureadditionssalze davon.

SH SH

I I

X-Cys-X₁-X₂-Phe-Phe-X₃-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-X₄-0H

(Ia) '■

Bei den Symbolen, die in der vorliegenden Anmeldung die Amino- Ϊ säuren und Aminosäurereste in den Polypeptiden bezeichnen,
handelt es sich um Symbole, die vom IUPAC-IVB Committee on | Biochemical Nomenclature Recommendation (1971) zugelassen j sind. Sie sind in den Archives of Biochemistry and Biophysics, ^: 150, 1 bis 8 (1972) beschrieben. Das Symbol "6-F-D-Trp" be- ; deutet D-Tryptophan, in dem die 6-Position durch Fluor substi- j tuiert ist. ^!

Die erfindungsgemäßen Verbindungen weisen folgende physikalische Eigenschaften auf: Sie sind weiße bis hellbraune Feststoffe, die in Chloroform, Benzol und dergleichen im wesentlichen unlöslich sind, jedoch in Wasser und wässerigen sauren
Lösungen, wie Chlorwasserstoffsäure und Essigsäure., Löslichkeit besitzen. Die erfindungsgemäßen Verbindungen besitzen
keine klar unterscheidbaren Schmelzpunkte. Sie können bei-

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spielsweise durch Chromatographie gereinigt werden. Die Hydrolyse der erfindungsgemäßen Verbindungen, beispielsweise in 4 η Methansulfonsaure, erlaubt die Bestimmung ihres Aminosäuregehalts j der sich mit den hier angegebenen Strukturen als in Übereinstimmung befindlich erwiesen hat.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind pharmazeutisch wirksam. Kennzeichnend ist, daß durch ihre Verwendung die Freisetzung von einem oder mehr der Hormone Somatotropin, Glucagon oder Insulin inhibiert wird. Dies läßt sich durch übliche pharmakologische Tests feststellen. Durch Regelung der Dosis erlaubt die selektive Wirkung der erfindungsgemäßen Verbindungen die Inhibierung der Somatotropin- und Glucagonfreisetzung, ohne daß die endogenen Insulinsekretionsspiegel beeinträchtigt werden.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können auch in fischung mit Insulin verwendet werden. Sie sind dann für die Behandlung von Diabetes mellitus bei Warmblütern geeignet.

Die Erfindung betrifft insbesondere chemische Verbindungen der Formel I, in der X für Wasserstoff steht. Vorzugsweise steht Xj für D-Trp. Vorzugsweise steht X^ für Cys.

Die Erfindung stellt insbesondere folgende Verbindungen zur Verfugung:

a) Verbindungen der Formel I, worin X für Wasserstoff, Ala-Gly, Ala-D-Ala, Gly-Gly oder Gly-Gly-Gly steht; X^ die Bedeutung His besitzt; X2 für His steht; X3 für Trp oder D-Trp steht; und X^ die Be'deutung Cys besitzt.

b) Verbindungen der Formel I, worin X für Wasserstoffs Ala-Gly, Ala-D-Ala, Gly-Gly oder Gly-Gly-Gly steht;

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X₁ die Bedeutung Arg besitzt; X₂ für His steht; Xg für j Trp oder D-Trp steht und X, für Cys oder D-Cys s;eht. \

c) Verbindungen der Formel I, worin X für Wasserstoff steht, ! X₁ die Bedeutung His besitzt, X₂ für His steht, X₃ für ; Trp oder D-Trp steht, und X* für Cys oder D-Cys steht. 1

d) Verbindungen der Formel I, worin X für Wasserstoff, AIa-GIy₅J GIy-GIy-GIy₅ Ala-D-Ala, Acetyl oder Benzoyl steht;

X₁ für Arg oder His steht; X₂ für GIu oder Asp steht; i Xo für Trp, D-Trp oder 6-F-D-Trp steht; und X- fur Cys
oder D-Cys steht.

Vorzugsweise stehen X₁ und X₂ jeweils für His, oder X₁ steht
für Arg und X₂ steht für GIu.

Besonders bevorzugte erfindungsgemaße Verbindungen sind:

H-Cys-Arg-His-Phe-Phe-D-Trp-Lys-

S s

Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-OH ,

H-Cys-His-His-Phe-Phe-Trp-Lys-

Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-OH

H-Cys-His-His-Phe-Phe-D-Trp-Lys

S_ S

Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-OH

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H-Cys-His-His-Phe-Phe-D-Trp-Lys-

S S

Thr-Phe-Thr-Ser-D-Cys-OH ₉

H-Cys-Arg-Glu-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys und S-= —S

H-Cys-His-Glu-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys

s—: s

und deren reduzierte (offenkettige) Formen.

Die Erfindung betrifft auch geschützte Zwischenprodukte zur Herstellung der Verbindungen der Formel I. Hierzu gehören die Verbindungen der Formel:

I^-Cys-B,-Β,-Phe-Phe-X,-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-X.-OR

I LC O , , 111

Is I

R⁵ R⁷

Sß

worin:

R für eine Carboxylschutzgruppe (beispielsweise Alkyl , Aralkyl) oder einen über eine Methylengruppe gebundenen Polystyrolharzträger, d.h. einen Rest | p_oi_ystyrol-

harzträger

-CH₂-

steht

eine tf-Aminoschutzgruppe bedeutet oder für eine tf geschützte Ala-Gly-, Gly-Gly-, Ala-D-Ala- oder Gly-Gly-Gly-Gruppe, Acetyl oder Benzoyl "steht;

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ir R" ;

ι ι 3 ι

B-, für His oder Arg steht, worin R eine Schutzgruppe für die Seitenketten-Stickstoffatome des Arginins bedeutet

2
und R Wasserstoff oder eine Schutzgruppe für da.s Imidazolstickstoffatom des Histidins darstellt;

B₀ für His mit der vorstehenden Definition, GIu oder Asp, '2 '4 JL 5

D ^* DD

worin R und R jeweils Schutzgruppen für die Seίtenketten-Carboxylgruppen der Glutaminsäure und Asparaginsäure dar- '-. stellen, steht; :

R eine Schutzgruppe für die Seitenketten-Aminogrupoe des Lysins bedeutet;

8 9
R , R und R jeweils Schutzgruppen für die Hydroxylgruppen

des Threonins und Serins bedeuten;

(o für Trp, D-Trp oder 6-F-D-Trp steht; [, für Cys oder D-Cys steht; und

oi und β jeweils eine SuIf hydryl -Schutzgruppe oder Wasserstoff bedeuten, oder worin </ und β eine direkte Bindung zwischen den Schwefelatomen symbolisieren.

Zu Beispielen für oZ-Aminoschutzgruppen der durch R oder Teil von R symbolisierten Art gehören:

(1) Schutzgruppen des Acyl-Typs; hier kann man nennen Formyl , Trifluoracetyl, Phthalyl , p-Toluolsulfonyl (Tosyl), Nitrophenylsulfenyl, und dergleichen;

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(2) Schutzgruppen des aromatischen Urethan-Typs; hier kann

man nennen: Benzyloxycarbonyl und substituierte:; Benzyl- !

oxycarbonyl, wie beispielsweise p-Chlorbenzyloxycarbonyl, ,

p-Nitrobenzyloxycarbonyl; ;

(3) Schutzgruppen des aliphatischen Urethan-Typs; hier kann |

man nennen: tert. -Butyl oxycarbonyl , Di isopropylinethoxy- ! carbonyl, Isopropyloxycarbonyl , AllyloxycarbonyI, 2,2,2- j Trichloräthoxycarbonyl, Amyloxycarbonyl ; !

(4) Schutzgruppen des Cycloalkylurethan-Typs; hier <ann man j nennen: Cycl opentyloxycarbonyl , AdamantyloxycarbDnyl, Cyclo-| hexyloxycarbonyl;

(5) Schutzgruppen des Thiourethan-Typs; hier kann man nennen: Phenylthiocarbonyl;

(6) Schutzgruppen des Alkyl-Typs; hier kann man nennen: Triphenylmethyl (Trityl); I

(7) Trialkylsi 1angruppen, beispielsweise Trimethylsilan. ,

Die bevorzugte Of-Aminoschutzgruppe ist tert. -Butyloxycarbonyl . j

Zu Beispielen für den Rest R³ gehören Nitro, Tosyl , Benzyloxycarbonyl, Adamantyloxycarbonyl oder tert.-Butyloxycarbonyl ;

3
vorzugsweise steht R für Tosyl.

Der Schutz über die Nitro- oder Tosylgruppe erfolgt entweder an den N^u oder N -Stickstoffatomen des Arginins, während die Schutzgruppen des Oxycarbonyl-Typs das N -Stickstoffatom und eines der N^u- oder N^ul-Stickstoffatome schützen.

Zu Beispielen für R gehören Tosyl, Benzyloxycarbonyl, Adamantyloxycarbonyl und tert.-Butyloxycarbonyl. Vorzugsweise

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steht R für die Tosylgruppe.

Die Seitenketten-Aminogruppe des Lysins ist durch den Rest R
geschützt. Als Beispiele für diesen Rest kann man Tosyl, 1 tert.-Amy1oxycarbonyl, tert.-Butyloxycarbonyl, Diisopropyl- | oxycarbonyl, Benzyloxycarbonyl, Haiogenbenzyloxycarbonyl,
Nitrobenzyloxycarbonyl und dergleichen nennen. Bevorzugt ist J

die 2-Chlorbenzyloxycarbonylgruppe. \

Beispiele für die Schutzgruppen R , R und R für die Hydroxylgruppe des Threonins und Serins sind Acetyl, Benzoyl, tert.-Butyl und Benzyl. Für diesen Zweck ist die Benzylgruppe bevorzugt.

4 5
Beispiele für die Reste R und R sind Benzyl und tert.-Butyl.

Beispiele für die Schutzgruppen ¹X und β für die Sulfhydryl- J gruppe des Cysteinylaminosäurerests sind Benzyl, substituiertes Benzyl, worin es sich beim Substituenten um mindestens einen
der Reste Methyl, Methoxy, Nitro oder Halogen handelt (beispielsweise 3 ,4-Dimethylbenzyl , p-Methoxybenzyl, p-Chlorbenzyl
p-Nitrobenzyl und dergleichen), Trityl, Benzyloxycarbonyl ,
Benzhydryl , p-Methoxybenzyl oxycarbonyl , Benzyl thioirethyl ,
Äthylcarbamoyl, Thioäthyl, Tetrahydropyranyl, Acetamidomethyl,
Benzoyl, s-Sulfonsäuresalz, und dergleichen. Die p-Methoxybenzylgruppe ist bevorzugt.

Die Erfindung schafft auch das Verfahren zur Herstellung
der erfindungsgemäßen Verbindungen.

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Die Verbindungen der Formel I können hergestellt werden, indem man sämtliche Schutzgruppen und den gegebenenfalls vorhandenen Polystyrolharzträger aus einer wie oben definierten Verbindung der Formel II entfernt, das Produkt gewünschtenfali3 oxydiert oder reduziert, um die cyclische oder offenkettige ^rorm zu erhalten und ferner gewünschtenfalIs das Produkt in Form der freien Base oder in Form eines pharmazeutisch vertraglichen Salzes isoliert.

Die Entfernung der Schutzgruppen kann durch Methoden erfolgen, die im Stand der Technik für entsprechende Schutzgruppen bekannt sind. Vorzugsweise entfernt man die Schutzgruppen in einer einzigen Stufe, beispielsweise durch Verwendung von Fluorwasserstoff in Gegenwart von Anisol.

Man kann den Polystyrol harzträger gleichzeitig mit der Entfernung der Schutzgruppen abspalten, indem man beispielsweise Fluorwasserstoff in Gegenwart von Anisol verwendet. Man kann ihn auch durch Umesterung abspalten, wobei man ein Carboxyl geschütztes Zwischenprodukt der Formel II erhält, worin R für eine Esterfunktion steht. So ergibt beispielsweise eine Methanolyse ein Methylester-Zwischenprodukt der Formel II, worin R"für Methyl steht. Die Hydrolyse derartiger Ester liefert die erforderliche C-terminale Carboxyl funktion.

Durch geeignete Wahl der Schutzgruppen können die Schutzgruppen ex und β aus den Verbindungen der Formel II selektiv entfernt werden, wobei man die freien Disulfhydrylderivate der Formel II erhält, worin u und β für Wasserstoff stehen. Wenn beispielsweise w und β die Bedeutungen Trityl oder Acetamido besitzen, können sie durch Einwirkung eines Quecksilber-II- oder Si 1 bersalzes selektiv entfernt werden, wobei man das entsprechende Disulfhydrylderivat in Form seines ertsprechenden Quecksilber-II- oder Disilbersalzes erhält. Das letztere

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Salz kann mit Schwefelwasserstoff behandelt werden, wobei man das entsprechende freie Disulfhydrylderivat der Formel II erhält.

Die freien Disulfhydrylderivate der Formeln I und I] können jeweils cyclisiert werden, indem man sie oxydiert. Man ver- : wendet ein Oxydationsmittel, beispielsweise Jod, Sauerstoff . (beispielsweise Luft), 1,2-Dijodäthan oder Natrium- oder · Kaiiumhexacyanoferrat-III, um die entsprechenden Verbindungen der Formel I zu erhalten, worin die beiden Gruppen A eine ; direkte Bindung bilden, bzw. um die Verbindungen der Formel II J zu erhalten, worin Ύ und β eine direkte Bindung bilden. j

Die Polypeptid-Endprodukte und ihre entsprechenden Zwischen- j produkte können nach der wohlbekannten Festphasenme-;hode hergestellt werden. Diese ist beispielsweise von Merri^rield, J.Am.Chem.Soc. S5_, 2149 (1963) beschrieben. Man kann die Verbindungen auch durch klassische Synthese erhalten. Die vorliegende Erfindung schafft somit ein Verfahren zur Herstel-

lung einer Verbindung der Formel II, worin <xf und β 'Schutz- j gruppen darstellen und R für einen Polystyrolharztriger steht, ι das dadurch gekennzeichnet ist, daß man die entsprechenden, auf geeignete Weise geschützten und/oder aktivierten Aminosäuren der Reihe nach unter Festphasensynthesebedingungen an einen chlormethylierten Harzträger oder einen Hydroxymethylharzträger kuppelt. Alternativ können die Verbindungen der Formel II, worin oi und β Schutzgruppen darstellen und R eine Carboxylschutzgruppe bedeutet, durch Kupplung der entsprechenden, in geeigneter Weise geschützten und/oder aktivierten Aminosäuren oder Gruppen von Aminosäuren durch Methoden hergestellt werden, die zur Bildung von Peptidbindungen bekannt sind, wobei man die gewünschte Aminosäuresequenz erhält. Dann kann man die cx> und ß-Schutzgruppen selektiv entfernen und das Produkt oxydieren, um das cyclische Disulfid der Formel

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II, worin tf und β eine direkte Bindung darstellen, zu erhalten.

Methoden zur Aktivierung von Aminosäuren vor dem Kuppeln und die Kupplungsmethoden als solche sind bekannt; man vergleiche beispielsweise das nachstehend erwähnte Lehrbuch von Schröder und Lübke.

Bei der Auswahl einer bestimmten Seitenketten-Schutzgruppe, die bei der Synthese der erfindungsgemäßen Peptide gebraucht werden s'oll, sollte man sich an die nachfolgenden Regeln halten:

(a) die Seitenketten-Schutzgruppe muß gegenüber dem Reagens und unter den zur Entfernung der α-Aminoschutzgruppe gewählten Bedingungen bei jeder Synthesestufe stabil sein;

(b) die Schutzgruppe muß ihre schützenden Eigenschaften beibehalten (d.h. sie darf unter den Kupplungsbedingungen nicht abgespalten werden); und

(c) die Seitenketten-Schutzgruppe muß beim Abschluß der Synthese, d.h. nachdem man die gewünschte Aminosäuresequenz erhalten hat, unter Reaktionsbedingungen abspaltbar sein₉ die nicht zu einer Änderung der Peptidkette führen.

Bei der auf die erfindungsgemäßen Verbindungen angewendeten : klassischen Methode wird das gewünschte Peptid aufgebaut, indem! man nötigenfalls geschützte Aminosäuren oder Gruppen von Amino-j säuren kondensiert. Die Kondensationsreaktionen können durchgeführt werden, indem man Methoden anwendet, von denen allgemein bekannt ist, daß sie auf dem Gebiet der Peptid- und Penicininchemie zu Amidbi ndungen führen-. Um die Leichtigkeit der Kondensation der Aminosäuren zu fördern, ist es bevorzugt ein Kondensationsmittel einzusetzen. Zu Beispielen für Kon-

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densationsmittel gehören Carbodiimide, beispielsweise N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid, (DCC), und N₅N'-Diisopropyicarbodiimid. Alternativ kann die Kondensation durchgeführt werden, indem man eine oder beide endständigen Gruppen aktiviert. Beispiele für die aktivierte Form der endständigen Carboxylgruppen sind das Säurechlorid, Säureanhydrid, Azid und der aktivierte Ester. Für den Fachmann liegt es auf der Hand, daß die jeweils vorgeschlagene Methode zur Durchführung der Kondensationsreaktioner mit den Schutzgruppen der Aminosäuren vereinbar ist.

Beim Aufbau des Moleküls nach der klassischen Methoce ist es bevorzugt, ein geschütztes Peptid der Formel VIa

R¹-Cys-B₁-B₂-Phe-0H So<

mit einem geschützten Peptid der Formel:

H-Phe-X₃-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-X₄-0R

(VIa)

Ig

R⁹

Sß

won n:

R ,

eine Carboxy-Schutzgruppe (vorzugsweise Benzyl) bedeutet und

R , R , R , R , B₁, B₂, X₃ und X₄ die zuvor genannten Definitionen besitzen und u und β für Schutzgruppen, vorzugsweise für p-Methoxybenzyl, stehen, kondensiert, wobei man eine Verbindung der Formel II erhält, die entschützt und cyclisiert ist.

Bei der auf die erfindungsgemäßen Verbindungen angewendeten Festphasenmethode wird zuerst Cystein, das an der c*-Aminogruppe

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und an der Sulfhydrylgruppe geschützt ist₉ an ein chiormethyliertes Polystyrolharz gekuppelt; anschließend wird mit Hilfe von'Trif luoressi gsä'ure in Methylenchlorid, Trif luoressigsäure alleine oder HCl in Dioxan die v-Aminoschutzgruppe entfernt. Man führt das Entschützen bei einer Temperatur zwischen ungefähr O⁰C und Raumtemperatur durch. Man kann auch andere übliche Spaltungsreagentien und Bedingungen zur Entfernung spezifischer tf-Aminoschutzgruppen gebrauchen, so wie sie beispielsweise in Schröder und Lübke, "The Peptides", l_, 72 bis j 75 (Academic Press, 1965) beschrieben sind. Nach dem Entfernen! der oi-Aminoschutzgruppe werden die nächsten jeweils gewünsch- j ten, geschützten Aminosäuren einzeln und der Reihe nach an ! die vom Harz getragene Sequenz angekuppelt. Alternativ kann man auch kleine Peptidfragmente herstellen, beispielsweise mit Hilfe der Lösungsmethode und diese in der gewünschten Reihenfolge in den Festphasenreaktor einführen. Jede geschützte; Aminosäure oder Aminosäuresequenz wird in ungefähr 4-fachem Überschuß in den Festphasenreaktor eingeführt. Man führt das Kuppeln in Dimethylformamid, Methylenchlorid oder einer Mischung dieser beiden Lösungsmittel durch. Der erfolgreiche Verlauf jeder Kupplungsreaktion wird bei jeder Synthesenstufe mit Hilfe der Ninhydrinreaktion bestimmt. Diese Reaktion ist von E. Kaiser et al., Analyt. Biochem. 34_, 595 (1970) beschrieben. Falls die Kupplung unvollständig war, w'rd die Reaktion wiederholt, bevor die <x-Aminoschutzgruppe zur Einführung der nächsten Aminosäure oder Aminosäurensequenz entfernt wird.

Die bevorzugten Kupplungsreagentien sind 1-Hydroxybenzotriazol und Diisopropylcarbodiimid; andere derartige Reagentien sind dem Fachmann bekannt.

Nachdem die gewünschte Aminosäuresequenz synthetisiert wurde., entfernt man das Polypeptid vom Harzträger. Dies erfolgt bei-

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spielsweise durch Behandlung mit Fluorwasserstoff und Anisol. Hierbei erhält man das vollständig entschützte, lineare PoIypeptid. Man kann das cyclische Disulfid durch Luftoxydation oder beispielsweise durch Oxydation mit KgFe(CN)g herstellen.

Nicht-toxische Additionssalze der linearen und cyclischen Polypeptide werden nach bekannten Methoden mit Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Polyphosphorsäure, Maleinsäure, Essigsäure, Zitronensäure, Benzoesäure, Bernsteinsäure, Malonsäure oder Ascorbinsäure und dergleichen, hergestellt. Das Essigsäuresalz ist bevorzugt.

Die im Verlauf der Festphasensynthese eingesetzten Schutzgruppen sind bekannt. Bei den o(-Aminoschutzgruppen, die bei jeder in der jeweiligen Sequenz des schließlich gewünschten Polypeptids eingeführten Aminosäure gebraucht werden ,1 assen sich in folgende Typen unterteilen:

' r

(1) Schutzgruppen des Acyl-Typs; zur Erläuterung seien genannt: Formyl , Trifluoracetyl, Phthalyl , p-Toluol sulfonyl (Tosyl),, Nitrophenylsulfenyl j und dergleichen; |

(2) Schutzgruppen des aromatischen Urethan-Typs; diese lassen ι sich durch folgende Vertreter erläutern: Benzyloxycarbonyl J und substituiertes Benzyloxycarbonyl, beispielsweise p-Chlorbenzyloxycarbonyl, p-Nitrobenzyloxycarbonyl;

(3) Schutzgruppen des aliphatischen Urethan-Typs; diese lassen sich durch folgende Vertreter erläutern: tert.-Butyloxycarbonyl, Diisopropylmethoxycarbonyl , Isopropyloxycarbonyl , Allyloxycarbonyl, 2,2,2-Trichloräthoxycarbonyl, Amyloxycarbonyl;

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(4) Schutzgruppen des Cycloalkylurethan-Typs ; diese lassen sich durch folgende Vertreter erläutern: Cyclopentyloxycarbonyl, Adamantyloxycarbonyl₉ Cyclohexyloxycarbonyl;

(5) Schutzgruppen des Thiourethan-Typs ; genannt sei hier das Phenylthiocarbonyl als Vertreter;

(6) Schutzgruppen des Alkyl-Typs; als Vertreter sei hier genannt das Triphenylmethyl (Trityl);

(7) Trialkylsilangruppen, beispielsweise Trimethylsilan.

Die bevorzugte tf-Aminoschutzgruppe ist das tert.-Butyloxycarbonyl .

Das Imidazolstickstoffatom des Histidins, als N^im bezeichnet, wird durch eine Gruppe geschlitzt;, bei der es sich um Tosyl , Benzyloxycarbonyl, Adamantyloxycarbonyl oder tert.-Butyloxycarbonyl handeln kann. Bevorzugt ist die Tosylgruppe.

Die Seitenketten-Aminogruppe des Lysins kann durch Tosyl₉ tert.-Amy!oxycarbonyl, tert.-Butyloxycarbonyl₉ Diisopropyloxycarbonyl₉ Benzyloxycarbonyl, Haiogenbenzyloxycarbonyl₅ Nitrobenzyloxycarbonyl, und dergleichen, geschützt sein. Bevorzugt ist die 2-Chlorbenzyloxycarbonylgruppe.

Die Seitenketten-Stickstoffatome des Arg.inins_s die als N⁹ bezeichnet sind,sind durch Gruppen geschützt, bei deren es sich um Nitro, Tosyl, Benzyloxycarbonyl₉ Adamantyloxycarbonyl oder tert.-Butyloxycarbonyl handeln kann. Bevorzugt ist die Tosylgruppe. Der Schutz durch die Nitro- oder Tosylgruppe erfolgt entweder an den Ν^ω oder N^u -Stickstoffatomen, während die Schutzgruppen des Oxycarbonyl-Typs das N^-Stickstoffatom und entweder das N^w- oder das N^ul-$tickstoffatom schützen.

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Der Schutz der Hydroxylgruppe des Threonins und Serins kann durch Acetyl, Benzoyl , tert.-Butyl oder Benzyl erfolgen. Für diesen Zweck ist die Benzylgruppe bevorzugt.

Bei der Schutzgruppe für die SuIfhydrylgruppe des Cysteinylaminosäurerests handelt es sich um eine Gruppe, die ausgewählt ist unter Benzyl, substituiertem Benzyl, worin als Substituent mindestens eine Methyl-, Methoxy-, Nitro- oder Halogengruppe enthalten ist (beispielsweise 3 ,4-Dimethyl benzyl , p-Methoxybenzyl, p-Chlorbenzyl, p-Nitrobenzyl , und dergleichen) Trityl, Benzyloxycarbonyl, Benzhydryl , p-Methoxybenzyloxycarbonyl, Benzylthiomethyl , Äthylcarbamoyl, Thioäthyl, Tetrahydropyranyl, Acetamidomethyl, Benzoyl, s-Sulfonsäuresalz_s und dergleichen. Bevorzugt ist die p-Methoxybenzylgruppe.

In gleicher Weise wie das Somatostatin können die erfindungsgemäßen Verbindungen entweder in der monomeren offenkettigen Form (der sogenannten "reduzierten" Form) oder der monomeren cyclischen Form (der sogenannten "oxydierten" Form) vorliegen. Jede dieser Formen kann mit Hilfe einer Arbeitsweise hergestellt werden, die im wesentlichen mit derjenigen identisch ist, die zur Herstellung der entsprechenden Form des.Somatostatins gebraucht wird. Diese Arbeitsweisen sind dem Fachmann bekannt. Die "reduzierte" Form wird hier als diejenige Struktur dargestellt, in der "A" Wasserstoff bedeutet; dies bedeutet, daß sich an den beiden Cys-Aminosäureresten freie Thiolsubstituenten befinden. Die "oxydierte" Form wird hier durch dieselbe Struktur dargestellt in dem Fall, in dem die beiden Gruppen "A" eine direkte Bindung darstellen. Das heißt es besteht eine Einzel bindung zwischen den Schwefelatomen, die von den beiden Cys-Aminosäureresten getragen werden. Es wird somit ein monomerer Ring gebildet.

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Darüber hinaus können die erfindungsgemäßen Verbindungen in einer sogenannten "polymeren reduzierten" Form vorliegen (vgl. beispielsweise US-Patentschrift 3 926 937). D"ese Form ; kann man durch eine Arbeitsweise erhalten_s die im Stand der ^! Technik in Verbindung mit der Herstellung des polymeren reduzier ten Somatostatins beschrieben ist. Die polymere Form kann durch! die Formel Ib:

— (H)

M"

X-L-Cys-X₁-X₂-L-PlIe-L.-Phe-X₃-L-Ly s·- L-Thr-L-Phe-L-Thr-L-Ser-L-X₄-0H

(Ib)

dargestellt werden, worin:

X₈ X₁₈ X₂, X₃ und X₄ dieselben Bedeutungen wie in Formel I be- I sitzen; j

M für 0 oder 1 steht; und j

N eine ganze Zahl von 2 bis 100 einschließlich darstellt.

Soweit in der in den eckigen Klammern befindlichen Struktur X von H verschieden ist, sind die Schwefel-Schwefelbindungen in zufälliger Verteilung zwischen Cys³-Cys³, Cys³-Cys und Cys¹⁴-Cys¹⁴ (wenn X für H steht, Cys¹ anstelle von Cys , und dergleichen) gebildet. Die Struktur ist cyclisch, wenn M für 0 steht, d.h. die Verbindung enthält keine freien SH-Gruppen₉ und es besteht eine Bindung zwischen den an den endständigen Cys-Resten befindlichen Schwefelatomen. Erfindungsgemäß stellen

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die polymeren reduzierten Formen in qualitativer Hinsicht Äquivalente der anderen erfindungsgemäßen Verbindungen dar.

Die pharmakologisehe Aktivität der erfindungsgemäßer Peptide kennzeichnet diese Verbindungen als brauchbar zur Behandlung von Akromegalie und Diabetes, und zwar auf dieselbe Heise wie das Somatostatin selbst. Die Verabreichung der Peptide kann auf den üblichen Wegen erfolgen, die dem Somatostatin und verwandten Polypeptiden gemein sind. Sie erfolgt unter Anleitung eines Arztes in einer Menge, die durch das vom Arzt bestimmte Ausmaß der Fehlfunktion bestimmt wird. Die; Verbindungen können alleine oder in Verbindung mit üblichen, pharmazeutisch verträglichen Trägern und Adjuvantien in Dosiseinheits form verabreicht werden.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind auch brauchbar in Mischung mit Insulin zur Behandlung eines an Diabetes mellitus leidenden Warmblüters. Man vergleiche beispielsweise US-Patentschrift 3 912 807. Dort ist die Verwendung einer wirksamen Menge eines Mittels, bestehend aus Somatostatin, da:; mit Insulin gemischt ist, zur Behandlung eines an Diabetes mellitus leidenden Warmblüters beschrieben.

Bei der therapeutischen Verwendung der erfindungsgemaßen Verbindungen zur Behandlung von Akromegalie, juveniler Diabetes und Diabetes mellitus, wird die Behandlung mit kleinen Dosen eingeleitet. Die Dosisgröße ist kleiner als die optimale Dosis der Verbindung. Danach wird die Dosierung in kleinen Anteilen erhöht, bis unter den jeweiligen Umständen die beste Wirkung erzielt wird. Im allgemeinen werden die erfindungsgemäßen Verbindungen in einer Dosishöhe verabreich^ die im allgemeinen zu wirksamen Ergebnissen führt, ohne daß irgendwelche nachteiligen oder schädlichen Nebenwirkungen auftreten« Jedoch können die Dosen, abhängig von den jeweiligen Erfordernissen

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des Patienten und der jeweils eingesetzten Verbindung, variiert werden. Es ist günstig, die tägliche Gesamtdosis aufzuteilen und gewünschtenfal 1s portionsweise im Verlauf des Tages zu verabreichen.

Die Erfindung schafft somit auch ein pharmazeutisches Mittel» das mindestens eine Verbindung der Formel I oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon in einem pharmakologisch verträglichen Träger enthält. Vorzugsweise ist das Arzneimittel in Dosiseinheitsform formuliert.

Die nachfolgenden Beispiele dienen zur weiteren Erläuterung der Erfindung.

Beispiel 1

tert.-Butyloxycarbonyl-S-p-methoxybenzyl-L-cysteinyT-N¹ -tosyl-L-h ist idyl-N¹¹¹¹- tosyl -L-h ist idyl -L-pheny IaI any 1-L-phenyl al any I D-tryptophyl-N^e-2-chlorbenzyloxycarbonyl-L-Iysy!-0-benzyl-L-threony1-L-phenylal any1-0-benzyl-L-threonyl-O-benzyl-L-seryl-S-p-methoxybenzyl-L-cysteinyl- Hydroxymethy1 polystyrol

Man verestert chlormethyliertes Polystyrol harz (Lab Systems Inc.), das zu 1 % mit Divinylbenzol vernetzt ist, nach der Arbeitsweise von Gisin, HeIv. Chim. Acta, 5J5, 1976 (1973) mit B0C-Cys-(SMBzl)0H. Der Polystyrolharzester wird nach der nachfolgenden Arbeitsweise A behandelt, um die folgenden Substanzen einzuführen: BOC-Ser(Bzl)0H , BOC-Thr(Bzl)0H, BOC-Phe-OH, B0C-Thr(Bzl)0H₅ BOC-Lys(Clz)0H , BOC-D-Trp-OH , BOC-Phe-OH, BOC-Phe-OH, BOC-His(Tos)OH, BOC-His (Tos-)OH und BOC-Cys(SMBzl )0l· Hierbei erhält man das in der Oberschrift näher bezeichnete Peptidharz.

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Arbeitsweise A:

1. Man wäscht.dreimal mit CH₂Cl₂-

2. Man behandelt mit TFA-CH₂Cl₂-EDT (1:1:5 % v/v) während eines Zeitraums von 5 Minuten.

3. Man behandelt 25 Minuten lang wie in Stufe 2 beschrieben.

4. Man wäscht dreimal mit

5. Man wäscht mit DMF.

6. Man behandelt zweimal 3 Minuten lang mit 12 % TEA in DMF.

7. Man wäscht mit DMF.

8. Man wäscht dreimal mit CH₂Cl₂-

9. Man behandelt mit 4 Äquivalenten des entsprechenden Aminosäurederivats in CH₂Cl₂-DMF und rührt 5 Minuten lang, j

10. Man gibt in zwei Anteilen 5 Äquivalente DIC, gelöst in CH₂Cl₂, im Verlauf von 30 Minuten zu. Die Reaktionszeit beträgt 6 Stunden.

11. Man wäscht dreimal mit DMF.

12. Man wäscht dreimal mit CH₂Cl₂-

13. Man führt die Ninhydrinreaktion nach Kaiser et al., Anna! Biochem. 3£> 595 (1970) durch. Im Falle einer unvollständigen Reaktion werden die obigen Stufen 9 bis wiederholt.

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Beispiel

L-Cysteinyl-L-histidyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-phenyl alanyl-D-tryptophyl-L-lysyl-L-threonyl-L-phenylalanyl-L-threonyl-L-seryl-L-cysteincyciisches (1-12) Disuifid

Man vermischt das Peptidharz gemäß Beispiel 1 (9 g) mit Anisol (18 mg) und behandelt mit flüssigem HF (180 ml) in einem Eisbad während eines Zeitraums von 45 Minuten. Das überschüssige HF wird so schnell wie möglich (ungefähr 1 Stunde) im Vakuum entfernt. Man extrahiert den Rückstand mit entgaster 2m Essigsäure und filtriert dann. Das Fi!trat wird mit Äther gewaschen, und die wässerige Schicht wird bei pH 7 mit K₃Fe(CN)₆ oxydiert. Der Oberschuß an Oxydationsmittel wird mit Hilfe eines Ionenaustauscherharzes Bio Rad AG-3 entfernt. Dann wird das Peptid an einem Ionenaustauscherharz Bio Rex 70 absorbiert und mit einem Pyridinpuffer von pH 7 eluiert, wobei man nach dem Lyophilisieren 1,5 g Material erhält. Dieses Material wird auf eine Säule mit Sephadex G 15 (2,5 cm χ 160 cm aufgebracht und mit 15 %-iger wässeriger AcOH eluiert. Die Fraktionen (5,2 ml jeweils) in den Röhrchen 88 bis 90 werden vereinigt und lyophilisiert. Hierbei erhält man 174 mg Titelverb indung.

R_f (BWA, 4:1:1) 0,45

R_f (BWAP, 30:24:6:20) 0,64

Aminosäureanalyse: Thr(2)l,87, Ser(l)0,89, Cys(2)l,16,

Phe(3)3, Lys(l)l,05, His(2)l,76, Trp ND.

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Beispiel 3

C ,

Die pharmakologische Wirksamkeit des in Beispiel 2 hergestell- : ten Dodecapeptids wurde in vivo nach den nachfolgenden Arbeits-| weisen bestimmt. Die Ergebnisse sind nachstehend angegeben: !

Unterdrückung des Wachstumshormons i

Man verabreicht eine subkutane (se) Injektion des in physiologischer Kochsalzlösung gelösten oder suspendierten Peptids an j Charles River CD⁰'mann! iche Ratten. Die Ratten hatten zuvor ι nicht gefastet. Als Kontrolltiere nimmt man Ratten, denen eine . entsprechende Kochsalz-Kontrol1ösung subkutan injiziert wurde, J so daß für jede Testratte eine Kontrollratte vorhanden ist. j

Man hält die Ratten in getrennten Käfigen und verabreicht ι ihnen 20 Minuten vor Ende des Testzeitraums eine intraperito- j neale (ip) Injektion von Nembutar-^ in einer Dosis von 50 mg/kg.j Blutproben werden durch Herzpunktion erhalten. Man trennt das j Plasma ab, um die Konzentration (ng/ml) an Wachstumshormon
(GH) durch Radioimmunoassay zu bestimmen. Man wählt Zeiträume
von 2 und 4 Stunden nach der Injektion, um die Wirkungsdauer
der Peptide bei der Unterdrückung zirkulierender, peripherer
GH-Spiegel zu untersuchen. Die Vergleiche zwischen den GH-Werten bei den Kontrol1 tieren und den Testtieren werden zu jedem
Zeitraum nach dem Student "t"-Test ausgewertet. Die statistische
Signifikanz (p) bei einem Spiegel von 0,05 oder geringer wird
als Aktivitätsindex genommen.

Verbindung (Dosis)

Kontrolle Beispiel 2 (1 mg/kg)

2 Std.

118 + 20
32 + 6

ρ = <0,01

4 Std.

115 + 23 62 + 13

ρ = <0,01

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Unterdrückung von Wachstumshormon, Glucagon und Insulin

Man teilt männliche Albino-Ratten in drei Gruppen zu je 9 Ratten pro Gruppe auf. Man injiziert Nembutal zu 50 mg/kg intraperitoneal. 15 Minuten nach der Nembutal-Injektion wird den Ratten je nach Gruppe (a) Testverbindung, typischerweise 10 bis 2000 ug/kg, (b) SRIF, 200 yg/kg oder (c) physiologische Kochsalzlösung, injiziert. 10 Minuten später injiziert man 0,5 ml Arginin (300 mg/ml; pH = 7,2) in das Herz. 5 Minuten nach der Verabreichung des Arginins werden die Ratten enthauptet, und das Blut in Trasylöl-EDTA gesammelt. Dann werden entsprechende aliquote Anteile auf Wachstumshormon, Glucagon und Insulin untersucht. Als aktive Verbindung wird eine Verbindung klassifiziert, die den Plasmaspiegel irgendeiner dieser Hormone im Vergleich zu den Kochsalzlösung-Kontrollen signifikant verändert. Die Vergleiche zwischen den Test- und Kontrollwerten werden durch die Analyse der Variationsmethode statistisch ausgewertet. Die statistische Signifikanz (p) bei einem Wert von 0,05 oder niedriger wird als Aktivitätsindex gebraucht.

Verbindung
(Dosis pg/kg)

KontrolIe
Beispiel 2 (100)

GH(ng/m1)

163 + 29 20+8

ρ = <0,01

I η s u1 in

278 + 32
202 + 49

Glucagon

(pg/nii)

69 + 13 20 + 8

ρ = >0,05 ρ = <0,01

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Beispiel 4

tert.-Butyloxycarbonyl-S-p-methoxybenzyl-L-cysteinyl-N^-tosyl L-arginyl-N^im-tosyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-phenylalanyl-D-tryρtophyI — N^-2-chlorbenzy 1 oxy carbonyl -L-lysyl-0·- benzyl -L-threonyl-L-phenylalanyl-O-benzyl -L-threonyl -0-benzy'l -L-seryl-S-p-methoxybenzyl-L-cysteinyi-Hydroxymethy!polystyro!ester

Man verestert chlormethyliertes Polystyrolharz (Lab Systems Inc.)» das mit Divinylbenzol zu 1 % vernetzt ist, nach der Methode von Gisin, HeIv. Chim. Acta, _56_,- 1976 (1973) mit Boc-Cys-(SMBzl)-0H. Der Polystyrolharzester wird nach der Arbeitsweise A behandelt, um die Bestandteile: Boc-Ser(Bzl)-0H Boc-Thr(Bzl)-0H, Boc-Phe-OH, Boc-Thr(Bzl)-OH, Boc-Lys(ClZ)-OH, Boc-D-Trp-OH, Boc-Phe-OH, Boc-Phe-OH, Boc-His(Tos)-OH, Boc-Arg(Tos)-OH und Boc-Cys(SMBzl)-0H einzuführen. Man erhält das oben näher bezeichnete Peptidharz.

Arbeitsweise A:

1. Man wäscht dreimal mit CH₂CIp- '

2. Man behandelt 5 Minuten lang mit TFA-CH₂Cl₂-EDT (1:1:5 Ϊ, v/v).

3. Man behandelt 25 Minuten lang wie in Stufe 2 beschrieben.

4. Man wäscht dreimal mit CH₂Cl₂-

5. Man wäscht mit DMF.

6. Man behandelt zweimal 3 Minuten lang mit 12 % TEA in DMF.

7. Man wäscht mit DMF.

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8. Man wäscht dreimal mit

9. Man behandelt mit 4 Äquivalenten des entsprechenden Amino- · Säurederivats in CH₂Cl₂-DMF und rührt 5 Minuten lang. \

10. Man gibt in zwei Portionen 5 Äquivalente DIC₅ gelöst in ι CH₂Cl₂, im Verlauf von 30 Minuten zu. Die Reaktionszeit beträgt 6 Stunden.

11. Man wäscht dreimal mit DMF.

12. Man wäscht dreimal mit CH₂Cl₂-

13. Man führt die Ninhydrinreaktion nach Kaiser et al. , Anal ο Biochem. 3A_, 595 (1970) durch. Im Falle einer unvoll-

" ständigen Reaktion werden die obigen Stufen 9 bis 13 wiederholt.

Beispiel

L-Cysteinyl-L-arginyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-phenylalanyl-D-tryptophyl-L-lysyl-L-threonyl-L-phenylalanyl-L-threonyl-L-s eryl-L-cys te incyclisches (1-12) Disulfid

Man vermischt das Peptidharz des vorherigen Beispiels (8_S5 g) mit Anisol (16 ml) und behandelt dann mit flüssiger HF (100 ml) 45 Minuten lang. Der Überschuß an HF wird so schnell wie möglich im Vakuum entfernt. Der Rückstand wird in 25 %-iger wässeriger AcOH aufgenommen. Man filtriert den polymeren Träger ab und wäscht das Filtrat mit Äther. Die wässerige Schicht wird in 3,5 1 Wasser gegossen. Der pH wird mit NH^OH auf 7 eingestellt, und anschließend oxydiert man die SuIfhydrylverbindung mit K₃Fe(CN)₆. Man stellt den pH mit Eisessig auf 5 ein und ent-

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fernt das anorganische Oxydationsmittel mit Bio Rad AG 3. Das Peptid-Material wird auf Bio Rex 70 absorbiert und mit Pyridinpuffer von pH 7 eluiert. Hierbei erhält man 2 g rohe Verbindung. Dieses Material wird durch eine Säule mit Sephadex G-15 (2,5 χ 160 cm) durchgegeben und mit 15 %-iger wässeriger AcOH eluiert., Das Material in den Fraktionen bis 93 (jede Fraktion beträgt 5,2 ml) mit einem Gewicht von 886 mg wird auf eine Säule mit CM-Sephadex G-25 aufgegeben und unter Verwendung eines stufenweisen NH^OAc-Gradienten (0,1 bis 0,3 molare NH₄OAc) eluiert. Hierbei erhält man die Titel verbindung. Dieses Material wird auf eine Säuls mit Sephadex LH 20 (2,5 χ 92 cm) aufgegeben und mit 10 %-iger wässeriger AcOH eluiert. Die reine Titelverbindung wird in den Fraktionen 55 bis 63 (jeweils 4,1 ml) erhalten. Die Ausbeute beträgt 159 mg.

R_f (BWA, 4:1:1) 0,46 R_f (BWAP, 30:24:6:20) 0,65

Aminosäureanalyse: Thr(2)l,94, Ser(l)0,91, Cys(2)l,79,

Phe(3)3, HiS(I)1,02, Lys(l)0,85, Arg(l)0,95, Trp. ND

Beispiel

Die pharmakologische Wirksamkeit der in Beispiel 5 hergestellten Titel verbindung wurde in vivo durch .die folgende Arbeitsweise bestimmt. Die erhaltenen Ergebnisse sind angegeben:

Unterdrückung von Wachstumshormon, Glucagon und Insulin

Man teilt männliche Albino-Ratten in drei Gruppen zu je 9 Ratten pro Gruppe auf. Man injiziert Nembutal zu 5C mg/kg intraperitoneal. 15 Minuten nach der Nembutal-Injektion wird den Ratten je nach Gruppe (a) Testverbindung

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oder (b) physiologische

Kochsalzlösung₉ injiziert. 10 Minuten später injiziert man 0,5 ml Arginin (300 mg/ml; pH = 7,2) in das Herz. 5 Minuten nach der Verabreichung des Arginins werden die Ratten enthauptet, und das Blut in Trasylöl-EDTA gesammelt. Dann werden entsprechende aliquote Anteile auf Wachstumshormon (GH)₃Gl ucagon ( und Insulin (INS) untersucht. Als aktive Verbindung wird eine Verbindung klassifiziert, die den Plasmaspiegel irgendeiner dieser Hormone im Vergleich zu den Kochsalzlösung-Kontrollen signifikant verändert. Die Vergleiche zwischen den Tost- und Kontrollwerten werden durch die Analyse der Variationsmethode statistisch ausgewertet. Die statistische Signifikanz (p) bei einem Wert von 0_s05 oder niedriger wird als Aktivitätsindex gebraucht.

Dosis Experiment jug/kg

100

10

Ergebni	GH	49	sse	19	GLUN
ng/ml	5*	INS	16*	pg/ml
257 +	43	/jN/ml	26	61 +
61 +	21*	177 +	72	O +
131 +	52 +		42 +
71 +	262 +	4 +
	238 +

p<0,01

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auf 5 ein und behandelt mit Bio Rad AG 3„ Das Peptid-Material wird auf Bio Rex 70 (H⁺-Form) absorbiert und mit Pyridinpuffer (Py-H₂O-AcOH, 30:66:4₅ v/v) eluiert. Die das Peptid-Material enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und lyophilisiert. Hierbei erhält man 1,6 g Rohmaterial. Dieses Rohmaterial wird auf eine Säule mit Sephadex LH-20 (2,5 χ 90 em) aufgebracht und mit 10 %-iger wässeriger AcOH eluiert (Fraktionen zu jeweils 5,8 ml). Das Material, das in den Fraktionen 97 bis auftritt, wird vereinigt und lyophi1isiert, wobei man das oben näher bezeichnete Dodecapeptid erhält. Ausbeute» 171 mg.

TLC (Dünnschichtchromatographie) , mit Avicel vorbeschichtete Glasplatten, R_f (BWA, 4:1:1, v/v) 0,32, v/v) 0,56.

R_f (BWAP, 30:24:6:20,

Aminosäureanalyse:

Thr(2)l,85, Ser(l)0,84, Cys(2)l,29, Phe(3)3, Lys(l)l,05, His(2)l,41, Trp(l)0,75.

Die pharmakologische Aktivität des in Beispiel 8 hergestellten Dodecapeptids wurde in vivo nach den auf das Beispiel 3 folgenden Arbeitsweisen bestimmt. Die erhaltenen Daten sind wie folgt:

	Unterdrückung	des Wachstums	hormons	20
Verbindung	(Dosis)	2 Std.	4 Std.	34
Kontrolle		127 + 22	59 +
Beispiel 8	(1 mg/kg)	20 +_ 3**	107 +
	•*p	<0,001

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Beispiel 7

tert.-Butyloxy-carbonyl-S-p-methoxybenzyl-L-cysteinyl-im-tosyl-j L-histidyl-im-tosyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-phenylalanyl- j D-tryptophy1-ε-2-chlorbenzy1 οxycarbonyl-L-lysyl-O-beηzyl-L- j threonyi-L-phenylalanyl-0-benzyl-L-threonyl-O-benzyl-L-seryl- ι S-p-methoxybenzyl-D-cysteinyi-Hydroxymethyl polys tyro!ester ι

Man verestert chlormethyliertes Polystyrol harz (Lab Systems ! Inc.)» das mit Di vi nyl benzol zu 1 % vernetzt ist, mit Boc-D-CySj-(SMBzI)OH nach der Methode von Gisin, HeIv. Chim. Acta, 56_, \ 1976 (1973). Das Polystyrol harz wird nach der Arbeitsweise ■ A behandelt, um die folgenden Bestandteile: Boc-Ser(BzI)0H, ! Boc-Thr(Bzl)0H, Boc-Phe-OH, Boc-Thr(BzI)0H, Boc-Lys(Cl Z)OH, Boc-D-Trp-OH, Boc-Phe-OH, Boc-Phe-OH₅ Boc-His(Tos)OH, Boc-His(Tos)OH und Boc-Cys(SMBzI)0H einzuführen. Hierbei erhält man das oben näher bezeichnete Peptidharz.

e i s ρ i e 1

L-Cysteinyl-L-histidyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-ohenylalanyl-D-tryptophyl-L-lysyl-L-threonyl-L-phenylalanyl-L-threonyl-L-seryl-D-cystein-cyclisches (1-12) Disulfid; Diacetatsalz

Man vermischt das Peptidharz des vorherigen Beispiels (10 g) mit Anisol (20 ml) und behandelt mit flüssiger HF (150 ml) 45 Minuten lang in einem Eisbad, wobei man für Luftausschluß sorgt. Die überschüssige HF wird im Vakuum entfernt, und der Rückstand wird in 50 %-iger wässeriger AcOH aufgenommen. Man filtriert die Mischung und verdünnt das Filtrat mit Wasser auf 3,5 1. Der pH wird mit verdünntem NH₄OH auf 7 eingestellt, Das Disulfhydrylpeptid wird mit. KgFe(CN)₆ zum cyclischen Disulfid oxydiert. Man stellt den pH der Mischung mit Eisessig

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Unterdrückung von Wachstumshormon, Glucagon und Insulin

Verbi ndung
(Dosis (ug/kg))

Kontrolle
Beispiel 8 (100)

KontrolIe
Beispiel 8 (100)

GH (ng/mi)

279 +_ 53

64 + 20'

201 + 35

110 + 22'

Insu!in
GuU/πΠ)

323 +■ 30
165 + 21*

397 + 36
318 + 54

Glucagon (pci/ml)

42 + 6 Ei + 2*

117 +_ 11 70 + 7*

p<0_s01 ⁺ ρ <0,05

Aus den Daten ist ersichtlich, daß das Peptid gemäß Beispiel 8 zu einer spezifischen Unterdrückung von Glucagon und Wachstumshormon führt, ohne daß die Insulinsekretion beeinträchtigt wirdj Diese Wirkung wird bereits bei niedrigen Dosen hervorgerufen.

B e i s pie I

tert.-Butyloxycarbonyl-S-p-methoxybenzyl-L-cysteinyl-N^ⁿtosy1-L-arginy!-^-benzyl-L-glutamyl-l-phenyIaI anyI-L-phenylal any1-D-tryptophyl-N^£-2-chlor-benzyl oxycarbonyl-L-Iysy1-0-benzyl-L-threonyl-L-phenyIaI any!-0-benzyl-L-threony1-0-benzyl L-seryl-S-p-methoxybenzyl-L-cystein-Hydrpxymethylpolystyrolester

Man verestert chlormethyliertes Polystyrol harz nach der Arbeitsweise von Gisin, HeIv, Chim. Acta., 56_, 1976 (1973) mit Boc-Cys(SMBzl)0H. Dann wird der Aminosäureharzester nach Arbeitsweise A (nachstehend aufgeführt) behandelt, wobei man in Stufe 9 der Arbeitsvorschrift Boc-Ser(Bzl)0H als geschützte

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ΑΗΡ-6853/6854/6853-1-Cl/7093

Aminosäure einsetzt. Anschließend wiederholt man die Arbeitsweise A₉ um nacheinander die folgenden Aminosäuren in das Peptidharz einzuführen:

Boc-Thr(Bzl)-0H

Boc-Phe-OH

Boc-Thr(Bzl)-0H

Boc-Lys(ClZ)-OH

Boc-D-Trp-OH

Boc-Phe-OH

BOC-GIu(OBzI)-0H

Boc-Arg(Tos)-OH

Boc-Cys(SMBzl)-OH

Arbeitsweise A: (zur Behandlung des Harzesters)

1. Man wäscht dreimal mit Methylenchlorid (CH₂Cl₂).

2. Man behandelt 5 Minuten lang mit Trifluoressigsäure/Methylenchlorid (1:1, v/v), enthaltend 5 % 1,2-Äthandithiol .

3. Man wiederholt Stufe 2 und führt diese Behandlung 25 Minuten lang durch.

4. Man wäscht dreimal mit CH₂Cl₂-

5. Man wäscht mit Dimethylformamid (DMF).

6. Man behandelt 3 Minuten lang mit 12 %-igem Triäthylamin in DMF.

7. Man wäscht mit DMF.

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8. Man wäscht dreimal mit

9. Man behandelt mit 4 Äquivalenten der entsprechend geschützten Aminosäure in CHgCIg-DMF und rührt 5 Minuten 1 ang.

10. Man gibt in zwei Anteilen im Verlauf von 30 Minuten

5 Äquivalente Diisopropylcarbodiimid, gelöst in CHgCIg zu. Man läßt die Reaktion 6 Stunden lang erfolgen.

11. Man wäscht dreimal mit DMF.

12. Man wäscht dreimal mit CHgCIg.

13. Man führt die Ninhydriη-Reaktion nach der Arbeitsweise von Kaiser et al., Annal . Biochem. 34-, 595 (1970) durch. Im Falle einer unvollständigen Reaktion werden die obigen Stufen 9 bis 13 wiederholt.

B e i s ρ i e 1

L-Cysteinyl-L-arginyl-L-glutamyl-L-phenylalanyl-L-phenylalanyl-D-tryptophyl-L-lysyl-L-threonyl-L-phenylalanyl-L-threonyl-L-seryl-L-cystein-cyclisches (1-12) Disulfid

Man suspendiert das Peptidharz gemäß Beispiel 9 (8,5 g) in

Anisol (16 ml) und behandelt mit wasserfreiem, flüssigem !

Fluorwasserstoff (HF) 45 Minuten lang in einem Eisbad. An- '

schließend entfernt man die überschüssige HF unter Vakuum j

und extrahiert den Rückstand mit 10 %-iger wässeriger Essig- ;

säure. Das Filtrat wird mit Äther gewaschen, und die wässerige |

Schicht wird in 5 1 Wasser gegossen. Dann bringt man den pH j

mit verdünntem Ammoniumhydroxyd auf einen Wert von 7. Die j

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Mischung wird an der Luft 48 Stunden gerührt und dann wird der pH mit Eisessig auf 5 eingestellt. Schließlich wird das Peptid auf Amberlite CG-50 (H⁺-Form) absorbiert. Man eluiert das Peptid-Material mit 50 %-iger wässeriger Essigsäure und lyophi1isiert, wobei man 850 mg festes Material erhält.

Das Rohprodukt wird auf eine Säule mit Sephadex LH 20 (2₉5 χ 150 cm) aufgebracht und mit 10 %-iger Essigsäure eluiert. Die Fraktionen 94 bis 130 werden vereinigt und lyophi1isiert, wobei man 483 mg Material erhält. Dieses Material wird auf eine Säule mit Sephadex G 25 (1,5 χ 115 cm) aufgebracht und mit 10 %-iger wässeriger Essigsäure eluiert. Die Fraktionen 43 bis 53 werden vereinigt und lyophi1isiert. Hierbei erhält man das oben näher bezeichnete Peptid. Ausbeute 286 mg.

TLC (Dünnschichtchromatographie), mit Avicel vorbeschichtete i Glasplatten, R_f (BWA₅ 4:1:1, v/v) 0,40, R_f (BWAP, 30:24:6:20 j v/v) 0,65.

Aminosäureanalyse: Thr(2)l,92, Ser(l)0,89, GIu(I)I,03,

Cys(2)l,49, Phe(3)3, Lys(l)l,05, Trp(l)0,81, Arg(l)l,02.

B e i s ρ i e 1

11

tert.-Butyloxycarbonyl-S-p-methoxybenzyl-L-cysteinyl-N -tosyI j L-histidyl-^benzyl-L-gl utamyl -L-phenylalanyl-L-phenylalanyl- ! D-tryptophy1-N^-2-chlorbenzylοxycarbonyl-L-lysyl-O-benzyl-L- j threonyl-L-phenylalanyl-O-benzyl-L-threonyl-O-benzyl-L-seryl- j S-p-methoxybenzyi-L-cystei n-Hydroxymethylpolystyrol ester '

Man verestert chiormethyliertes Polystyrol harz nach der Arbeitsweise von Gisin, HeIv. Chi.m. Acta., 5_6, 1976 (1973) mit

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Boc-Cys(SMBzI)-OH. Dann wird das Aminosäureharz nach Arbeitsweise A (vgl. Beispiel 9) behandelt, wobei man in Stufe 9 als geschützte Aminosäure das Boc-Ser(Bzl)-OH einsetzt. Dann wird Arbeitsweise A wiederholt, um nacheinander die folgenden Aminosäuren in das Peptidharz einzuführen:

Boc-Thr(Bz1)-0H Boc-Phe-OH Boc-Thr(Bzl)-OH Boc-Lys(ClZ)-OH Boc-D-Trp-OH Boc-Phe-OH Boc-Phe-OH Boc-Glu(0Bzl)-0H Boc-His(Tos)-OH Boc-Cys(SMBzl)-OH

Beispiel

L-Cysteinyl-L-histidyl-L-glutamyl-L-phenylalanyl-l-phenylalanyl-D-tryptophyl-L-lysyl-L-threonyl-L-phenylaianyl-L-threonyl-L-seryl-L-cystein-cyciisches (1-12) Disuifid

Man behandelt das Peptidharz gemäß Beispiel 11 (8 g) mit flüssigem, wasserfreiem HF, wie in Beispiel 10 beschrieben, und cyclisiert das lineare Disulfhydryldodecapeptid durch Oxydation mit K₃Fe(CN)₆ bei pH 7,3 und bei hoher Verdünnung. Man bringt den pH mit Eisessig auf einen Wert von 5 und behandelt die Mischung mit Bio Rad AG 3-X4 (Cl-Form) Ionenaustauscherharz und absorbiert dann auf Amberlite CG 50 (H -Form). Das Peptid-Material wird mit 30 %-iger wässeriger Essigsäure eluiert und lyophilisiert. Hierbei erhält man 500 mg Rohmaterial. Dieses Material wird durch eine Säule mit Sephadex LH

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ehromatographierts wobei man das oben näher bezeichnete Dodeca-' peptid erhält.

TLC (DUnnschichtchromatographie), mit Avicel vorbeschichtete Glasplatten, R_f (BW, 4:1:1, v/v) 0,43, R_f (tert.-AmOH-Py-W, 7:7:6, v/v) 0,74.

Aminosäureanalyse:

Thr(2)l ,92, Ser(l)0,93, GIu(I)0,94 Cys(2)l,59, Phe(3)3, Lys(l)l,02, HiS(I)0,91, Trp(l)0,81.

Beispiel

Die biologische Aktivität der Peptide gemäß Beispielen 10 und 12 wurde mit Hilfe der nachfolgenden Arbeitsweise bestimmt:

Man verabreicht eine Dosis von 50 mg pro kg Nembutal intraperitoneal an männliche Albino-Ratten. 15 Minuten später wird eine subkutane Injektion der Testverbindung in physiologischer Kochsalzlösung verabreicht. 10 Minuten später werden 0,5 ml Arginin (300 mg pro ml; pH 7_a2) in das Herz injiziert. 5 Minuten nach Verabreichung des Arginins werden die Ratten geköpft, und das Blut wird in Trasylöl-EDTA gesammelt. Entsprechende, aliquote Anteile werden durch Radioimmunoassay auf Wachstumshormon (GH), Insulin und Glucagon untersucht. Die Ergebnisse der Untersuchung sind wie folgt:

B Π B 8 3 H / Π 7 2 Q

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Verbindung	Dosis (/ug/kg)	277	GH ng/kg	Insul μυ/ml	in	Glucagon pg/ral	8	Anzahl Tiere ,
Kontrolle		42	+ 69	301 +	27	46 +	1*	10 ^!
Beispiel 10	200	216	_± 6*	115 +	16*	1,5 +	5	10
KontrolIe	—	28	+ 35	283 +_	28	55 j-	2*	10
Beispiel 10	40	454	± 5*	158 +	57	12 +	10	10
KontrolIe	--	107	+ 106	269 +_	37	60 +	2*	10
Beispiel 12	200	233	+ 29*	205 +	36	4 +_	4	10
Kontrol1e	—	84	+ 35	342 +	45	44 +	4*	10
BeisDiel 12	50	₊ 17*	322 +	40	10 +	10

* - ρ <0,01

Die Daten zeigen, daß die für die erfindungsgemäßen Peptide repräsentativen Peptide der Beispiele 10 und 12 wirksame Mittel zur Unterdrückung des Wachstumshormons und des Glucagons darstellen, ohne daß bei einer Dosis von 40 mg/kg bzw. 50 mg/kg die Insulinspiegel wesentlich beeinträchtigt werden. Die I Peptide der Beispiele 10 und 12 wurden bei mit Nembutal be- ; handelten Ratten auch hinsichtlich der Dauer ihres Einflusses auf die GH-Sekretion untersucht. Das Peptid gemäß Beispiel 10 \

zeigte eine signifikante Inhibierung des GH während mindestens 4 Stunden bei einer Dosis von 1000 mg/kg· (s.c.)· Das Peptid gemäß Beispiel 12 zeigte nach nach 2 und 4 Stunden keine signifikante Inhibierung des GH.

Die hier beschriebenen Verbindungen können an warmblütige Sauger intravenös; subkutan, intramuskulär oder oral verabreicht werden, um bei der Behandlung von Diabetes die Menge

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an Serumglucose zu steuern. Die erforderliche Dosis variiert mit dem jeweiligen Zustand und der Behandlungsdauer.

Man kann den aktiven Bestandteil alleine oder in Verbindung mit pharmazeutisch verträglichen Trägern oder Bindemitteln verabreichen. Geeignete pharmazeutische Mittel lassen sich auf der Grundlage des Fachwissens formulieren.

Beispiel

Klassische Synthese von L-Cysteinyl-L-histidyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-D-tryptophyl-L-lysyl-L-threonyl-L-phenylalanyl-L-threonyl-L-seryl-L-cystein cyclisches (1-12) Disulfid

(a) N-Benzyloxycarbonyl-im-benzyloxycarbonyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-Methylester (I)

Eine Suspension von 42,3 g (0,1 Mol) Z-His(Z)-OH und 21,8 gj (0,1 Mol) Phe-OMe-HCl (98 %) in 1000 ml CH₂Cl₂ wird auf j O⁰C abgekühlt. Dann gibt man 22 g (0,12 Mol) DCC und 10,1 g. (0,10 Mol) Triäthylamin zu. Man läßt die Mischung über ! Nacht Raumtemperatur erreichen. I

Der abgeschiedene Dicyclohexylharnstoff wird abfiltriert ι und das Filtrat wird konzentriert. Hierbei erhält man ein gummiartiges Material. Man löst das Material in Äthyl acetat und filtriert unlösliches Material ab. Das EtOAc wird mit 5 %-iger Zitronensäure, Wasser, eiskalter 5 %-iger| Natriumbicarbonatlösung und wiederum mit Wasser gewaschen. J Die organische Schicht wird über Natriumsulfat getrocknet, auf ein Drittel ihres ursprünglichen Volumens konzentriert, und man gibt Äther (500 ml) zu, bis die Lösung trübe wird. Dann läßt man in einem kalten Raum über Nacht stehen. Der

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gebildete weiße Feststoff wird abgetrennt und getrocknet. j Man erhält 32 g Produkt mit Schmelzpunkt 131 bis 133⁰C.

TLC: Silicagel F-254, CH₂Cl₂=MeOH (9:1) R_f = 0,8

(b) im-Benzyloxycarbonyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-Methylester-' Dihydrobromi dsalz (II) ;

30 g (0,5 Mol) Z-His(Z)-Phe-OMe (I) wird in 300 ml HBr-HOAc; (32 %) gelöst,und die Mischung wird 30 Minuten bei Raum- . temperatur stehengelassen. Dann gibt man Äther zu, um einen; Niederschlag zu erhalten. Der weiche Feststoff wird ab- j filtriert und über Nacht getrocknet. Man erhält 32 g Feststoff mit Schmelzpunkt 135 bis 137⁰C.

TLC: die Substanz wandert nicht.

(c) N-Benzyl oxycarbonyl-im-benzyl oxycarbonyl-L-his tidy 1-imbenzyloxycarbonyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-Methyl ester HiI)

Eine Suspension von 30,5 g (0,05 MoI) His(Z)-Phe-OMe·2HBr (II) und 21,7 g (0,05 MoI) Z-His(Z)-0H in 500 ml CHpCl₂ wird auf O⁰C abgekühlt. Dann gibt man 11 g DCC und 10,1 g (0,10 Mol) Triäthylamin zu. Man läßt die Mischung über Nacht Raumtemperatur erreichen.

Der gebildete Dicyclohexylharnstoff wird abfiltriert, und das Filtrat wird konzentriert. Hierbei erhält man ein glasartiges Material. Man löst den Rückstand in Äthylacetat und wäscht das EtOAc mit 10 %-iger Zitronensäure, H₂O, eiskaltem 5 %-igen Natriumbicarbonat und wiederum mit Wasser. Man trocknet die EtOAc-Phase über Natriumsulfat, konzentriert auf ungefähr ein Drittel ihres Anfangs

die Lösung wurde nach 2 Minuten trüb

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Volumens und gibt Äther zu. Hierbei erhält man eine Trübung in der Lösung. Man läßt in einem kalten Raum stehen. Dann trennt man den gebildeten weißen Feststoff ab. Ausbeute 29^5 g.

(d) L-Histidyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-Methyl es ter-Trihydrochloridsalζ (IV)

Z Z

Eine Mischung aus 29 g Z-His-His-Phe-OMe (IV), 10,8 ml konz. HCl, 180 ml MeOH und zwei Spatelspitzen 10 %-iges Pd-C wird unter Verwendung einer Parr-Hydriervorrichtung 5 Stunden lang hydriert.

Nach dem Abfiltrieren wird das Methanol entfernt, wobei man ein öl erhält. Man gibt Äther zu, um einen Feststoff zu bilden. Für die nachfolgende Reaktion verwendet man 18 g des so erhaltenen Rohmaterials, ohne dieses weiter zu reinigen.

(e) tert.-ButyToxycarbonyl-S-p-methoxybenzyl-L-cysteinyl-L-histidy1-L-histidyl-L-phenylalanyl-Methy!ester (V)

Man rührt 30 Minuten lang eine Mischung aus 13 g Bö-c-Cys(MBzT)-0H (0,038 Mol), 5,4 g Hydroxybenzotriazol (0,040 Mol) und 8,3 g (0,040 Mol) Dicyclohexylcarbodiimid in 1 1 eiskaltem Methylenchlorid. Dann gibt man 19,5 g His-His-Phe-OMe-SHCl (0,0345 Mol) und 10,5 ml N-Methylmorpholin (0,096 Mol)zu und rührt die Mischung über Nacht, wobei sie Raumtemperatur erreicht. Die Suspension wird filtriert, um den Dicyclohexylharnstoff abzutrennen. Dann wäscht man das Filtrat nacheinander mit Wasser, 10 %-igem NaHCOo, wiederum mit Wasser und trocknet dann über Na2S0^. Nach dem Filtrieren wird das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Es beliben 21,0 g Rohprodukt zurück.

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Dieses Material wird 30 Minuten lang in 100 ml Acetonitril ^: bei Raumtemperatur gerührt und dann filtriert. Der Nieder-, schlag wird zuerst mit Acetonitril und anschließend mit j Äther gewaschen und dann getrocknet. Man erhält 11 g j Substanz.

TLC: R_f 0,12 Silicagel 60, CHCl₃^H₃OHrHAc 9:1:0,5 v/v.

Das Filtrat der Acetonitri!-Extraktion enthält Produkt und Verunreinigungen und ist zur Extraktion weiterer Rohproduktfraktionen geeignet.

(f) tert.-Butyloxycarbonyl-S-p-methoxybenzyl-L-cysteinyl-L-histidy1-L-histidy1-L-phenyla1anin (VI)

Man löst 11,0 g Boc-Cys(MBzl)-His-His-Phe-OMe (0,0142 Mol) in 200 ml Methanol und gibt 30 ml In Kaliumhydroxyd zu. Die Lösung wird 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, und das Methanol wird im Vakuum entfernt. Man verdünnt den Rückstand mit 200 ml Wasser und filtriert. Das Filtrat wird mit 10 %-iger Zitronensäure auf pH 5 eingestellt. Der erhaltene gummiartige Niederschlag wird während der Kristallisation stehen gelassen. Man filtriert das Produkt, wäscht mit Wasser und trocknet im Vakuum über P2O5· Die Ausbeute beträgt 7,3 g (67 %).

TLC: R_f 0,52 Silicaqel 60 n-Butanol:Äthylacetat:Essig-

säure:H₂0 1:1:1:1 v/v

R_f 0,43 Silicagel 60 tert.-Amylalkohol:Pyridin:H₂0 7:6:7 v/v.

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(g) N-tert.-Butyloxycarbonyl-0-benzyl-L-threonyl-L-phenylalanin-Methylester (VII)

Eine Lösung von 61,8 g Boc-L-Thr(Bzl)-0H (0,2 Mol) und 22,4 ml NrMethylmorpholin (0,2 Mol) in THF wird auf -15⁰C abgekühlt. Man gibt portionsweise 26,2 ml (0,2 Mol) Isobutylchlorformiat zu, wobei man die Temperatur zwischen -15⁰C und -1O⁰C hält. Nach 15-minütigem Rühren bei -15⁰C gibt man eine kalte Mischung aus 43,1 g L-Phe-OMe-HCl (0,2 Mol) und 22,4 ml N-Methylmorpholiη (0,2 Mol) in DMF portionsweise zu, wobei man die Temperatur zwischen -1O⁰C und -5⁰C hält. Man rührt die Mischung 2 Stunden bei O⁰C und anschließend über Nacht bei Raumtemperatur. Die filtri te Reaktionsmischung wird im Vakuum konzentriert, und der Rückstand wird in Äthylacetat aufgenommen. Man wäscht die Äthylacetatlösung der Reihe nach mit 5 %-iger KHSO-, 5 %-iger KHCOo, mit Kochsalzlösung und trocknet dann über Na₂SO₄. Nach dem Konzentrieren im Vakuum erhält man ein öl das beim Stehenlassen kristallisiert. Der Feststoff wird aus Isopropyläther-Hexan umkristallisiert. Man erhält 74,9 g Produkt (80 %) mit Schmelzpunkt 78 bis 81⁰C. 24

E⁰Od +10,75 (c 1,023, MeOH);
R_f (CHCl₃) 0,35.

Analyse für C₂₅H₃₄N₂O₅ (470,55)

ber. :
gef. :

C 66,36 C 66,72

7,28 7,32

N N

5,95 5,85

(h) N-tert.-Butyloxycarbonyl-O-benzyl-L-threonin-L-phenylalanin (VIII)

Man löst 23,5 g Boc-Thr(Bzl)-Phe-OMe (0,05 Mol) in einer Mischung aus MeOH-Dioxan (100 ml, 1:1) und behandelt 3 Stun

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den lang mit 55 ml 1 η NaOH (bis durch TLC kein Ausgangsmaterial mehr feststellbar ist). Man verdampft die Hauptmenge des Lösungsmittels im Vakuum und verdünnt den Rückstand mit Wasser und säuert dann mit 5 %-iger Zitronensäure an. Das gummiartige Material, das sich abgeschieden hat, wird in EtOAc aufgenommen und mit Wasser (Kochsalzlösung) gewaschen und dann zur Trockne eingedampft. Man kristallisiert den Rückstand aus Et^O-Hexan und erhält 19,8 g (87 %) Produkt mit Schmelzpunkt 118 bis 119⁰C.

R_f (Chloroform-Methanol-Eisessig, 85:10:5) 0,80.

(i) N-tert.-Butyloxycarbonyl-0-benzyl-L-threonyl-0-benzyl-L-serin-Methylester (IX)

Man löst 30,9 g N-tert.-Butyloxycarbonyl-O-benzyl-L-threonin (0,1 Mol) in 200 ml trockenem Tetrahydrofuran, das auf -2O⁰C abgekühlt war, und behandelt mit 11 ml N-Methylmorpholin , gefolgt von 13,4 ml Isobutylchl orf ormiat!

Man rührt die kalte Reaktionsmischung 5 Minuten lang bei j -20⁰C und behandelt dann mit einer Lösung von 25 g 0-Benzyli

L-serin-Methylester—Hydrochlorid (ungefähr 0,1 Mol) in i DME, das 11 ml N-Methylmorpholin enthält und läßt dann ! die Mischung über Nacht Raumtemperatur erreichen. '

Das Lösungsmittel wird im Vakuum entfernt, und der Rückstand wird zwischen Wasser-Äthylacetet verteilt. Man wasch die organische Phase mit 5 %-iger Zitronensäure, Wasser, wässerigem KHCOg und wiederum mit Wasser und trocknet dann über MgSO^. Anschließend dampft man zur Trockne ein, wobei man einen öligen Rückstand erhält, der aus Diäthyläther-Hexan kristallisiert. Man erhält einen gelee-artigen Feststoff (29 g).

R_f (CHCl₃-MeOH, 25:1) 0,85,· R_f (EtOAc-Hexan 1:1) 0,65.

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(j) N-tert.-Butyloxycarbonyl-0-benzyl-L-threonyl-O-benzyl-L-sen*η (X)

Man löst 28,2 g Boc-Thr(Bzl)-Ser(BzI)-0Me (0,0563 MoI) in ungefähr 50 ml Methanol auf und behandelt 1,5 Stunden lang bei Raumtemperatur mit 75 ml In Natriumhydroxyd. Die alkalische Lösung wird mit 10 %-iger Zitronensäure zu pH neutralisiert. Die Hauptmenge des Methanols wird im Vakuum entfernt. Den Rückstand verdünnt man mit etwas Wasser und säuert mit 5 %-igem wässerigem KHSO^ an und extrahiert schließlich mit EtOAc. Die organische Phase wird mit Wasser gewaschen, über Na^SO* getrocknet und zur Trockne eingedampft. Man erhält ein öl. Die Ausbeute ist quantitativ.

R_f (EtOAc-Hexan, 1:1) 0,15 (langgezogener Spot).

(k) N-tert.-Butyloxycarbonyl-O-benzyl-L-threonyl-0-benzyl-L-sery1-S - ρ-methoxybenzyl-L- cystein-Benzyl ester (XI)

Man löst 24,3 g Boc-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-0H (50 mMol) in 250 ml Acetonitril und Dichlormethan (2:3) und vermischt mit 25 g HCys(SMBzI)-Bzl-TosOH (50 mMol) und anschließend mit 6,8 ml Triethylamin und 6,8 g N-Hydroxybenzotriazol. Dann wird die Mischung in einem Eisbad abgekühlt.

Man gibt eine Lösung von 11 g DCC (53 mMoT) in 50 ml Acetonitril zu und rührt die Reaktionsmischung 2 Stunden in der Kälte und anschließend 2 Tage bei Raumtemperatur. Das abgeschiedene DCU (Dicyclohexylharnstoff) wird abfiltriert, und das Filtrat wird zur Trockne eingedampft. Man verteilt den öligen Rückstand zwischen Äthylacetat und Wasser und wäscht die organische Phase mit 10 %-iger Zitronensäure, Wasser, 5 %-iger KHCOo, anschließend mit Kochsalzlösung und trocknet dann über Na2S0«. Das Lösungs-

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mittel wird verdampft, und der ölige Rückstand wird aus Et20-Hexan kristallisiert, wobei man 24,5 g eines weißen Feststoffs mit Schmelzpunkt 87 bis 9O⁰C erhält.

R_f (Chloroform-Methanol, 25:1) 0,54, Spuren bei 0,4 und 0,3 (Heptan-EtOAc, 1:1) 0,64, Spuren bei 0,25

J₂ positiv;^Jp⁵ -14,7 (c 0,98, DMF) Elementaranalyse für C₄₄H₅₂N₃SO₉ (798,9)

ber.:	C	66	,15	H	6	,56	N.	5	,26
gef. :	C	66	,22	H	6	,95	N	5	,29

(1) 0-Benzyl-L-threonyl-O-benzyl-L-seryl-S-p-methoxybenzyl-L-cystein-Benzylester-Trifluoracetat (XII)

Man vermischt 8 g Boc-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Cys(SMBzI)-0Bzl (10 mMol) mit 100 mMol Anisol und behandelt 45 Minuten lang mit 100 ml TFA. Das Lösungsmittel wird im Vakuum ver- ■ dampft, und der Rückstand wird in trockenem Et₂O gelöst. ! Anschließend dampft man im Hochvakuum zur Trockne ein. Hierbei erhält man 7,2 g einer öligen Verbindung (90 ⁰L). '·

R_f (n-Butanol-Wasser-Eisessig, 4:1:1) 0,9 !

R^ (Heptän-EtOAc) 0,0-0,1 langgezogener Spot ι

J₂ positiv und Ninhydrin-positi ν.

(m) N-tert.-Butyloxycarbonyl-0-benzyl-L-threonyl-L-phenylalanyl-O-benzyl-L-threonyl-O-benzyl-L-seryl-S-p-methoxybenzyl-L-cystein-Benzy!ester (XIII)

9,2 g Boc-Thr(B.zl )-Phe-OH (20 mMol) (hergestellt nach der Methode des Beispiels III) werden in 100 ml DMF gelöst und mit 3,4 g N-Hydroxysuccinimid und einer Lösung von

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M/19 021 - 61 - OQm/ no

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20 mMol Thr(Bzl)Ser(Bzl)-Cys(SMBzI)OBzI · TFA-SaIz in ϊ 20 ml DMF, die mit Triäthylamin auf pH 7 neutralisiert
ist, vermischt. Man kühlt die Mischung in einem Eisbad
und behandelt 2 Stunden lang in der Kälte und anschließend!

2 Tage lang bei Raumtemperatur mit 4,5 g DCC. Der DCU \

wird abfiltriert, und das Filtrat wird zur Trockne einge- '

dampft. Man verreibt den Rückstand mit Wasser. Hierbei j erhält man einen Niederschlag, der in EtOAc aufgenommen,
mit 5 %-iger Zitronensäure, mit Wasser, mit 5 %-igem Na₂CO₃

und wiederum mit Wasser gewaschen, über Na₂SO₄ getrocknet ! und zur Trockne eingedampft wird. Der Rückstand wird aus

Et₂0-Hexan verfestigt. Er kann aus MeOH kristallisiert ,

werden und ist in CHCl₃ sehr gut löslich. Man erhält 17,3 g

(70 %) Produkt mit Schmelzpunkt 105 bis 107⁰C. ₍

R_f (CHCl₃-MeOH, 10:1) 0,90 ^l

25

-3,6 (c 1, DMF)
Analyse für C₅₄H₇₅N₅SO₁₂H₂O (1156,2)

ber.:	C	66	,46	H	cn	,71	N	6	,05
gef. :	C	66	,68	H	6	,59	N	CTl	,20

(n) tert.-Butyloxycarbonyl-D-tryptophyl-Ν^ε-benzyloxycarbonyl- j L-lysyl-Methylester (XIV) \

Man löst 30,4 g Boc-D-Trp-OH (0,1 Mol), 33 g Lys(Z)-OMe·HCl (0,1 MoT) und 13,6 ml Triäthylamin in 400 ml DMF und kühlt¹ in einem Eisbad ab. Dann gibt man 22 g Dicyclohexylcarbodiimid zu und läßt die Mischung über Nacht Raumtemperatur
erreichen. Der Dicyclohexylharnstoff, der sich abgeschieden hat, wird abfiltriert. Man konzentriert das Filtrat
auf ein kleines Volumen und gibt dann überschüssiges Wasser zu, wobei man ein gummiartiges Material erhält. Dieses

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Material wird in Äthylacetat aufgenommen und mit 10 %-iger; wässeriger Zitronensäure, H₂O, gesättigter NaHCO₃ und ! wiederum mit Wasser gewaschen und über Na₂SO, getrocknet. ^; Dann dampft man zur Trockne ein. Der Rückstand wird zuerst: mit Äther und dann mit Hexan verrieben. Hierbei erhält man 28 g eines kristallinen Feststoffs.

TLC: Silgel G, Hexan-EtOAc, 1:1, v/v, R_f 0,3.

(0) tert.-Butyloxycarbonyl-L-phenylalany!-D-tryptophyl-N^- , benzyl oxycarbonyl-L-lysin (XV) ''■

A) Man gibt 22 g Boc-ID-Trp-Lys(Z)-OMe (44 mMol) zu einer ' vorgekühlten Mischung aus 220 ml TFA und 25 ml Anisol und rührt 30 Minuten lang in einem Eisbad. Das TFA wird ! so schnell wie möglich bei 27⁰C am Rotationsverdampfer i verdampft, und das zurückgebliebene öl wird mehrmals i mit einem Gemisch Hexan-Äther 2:1 verrieben. Man dekantiert und behandelt unter einer Pumpe, wobei man 21,3 g (36 mMol) Produkt erhält.

B) 9,6 g Boc-Phe-OH (36 mMol), 5,3 g HOBT (39 mMol) und 8 g DCC (39 mMol) werden 20 Minuten lang in 500 ml kaltem Dichlormethan gerührt. Dann gibt man 21,3 g D-Trp-Lys(Z)-OMe-TFA-Salz (36 mMol) in 200 ml Dichlormethan zu, gefolgt von 4,25 ml N-Methylmorpholin (39 mMol). Man rührt das Reaktionsgemisch über Nacht, während man die Temperatur auf Raumtemperatur steigen läßt. Die Mischung wird filtriert, um das DCC zu entfernen, und das Filtrat wird zweimal mit Wasser, zweimal mit 10 %-iger Zitronensäure, zweimal mit gesättigter NaHCOß-Lösung und schließlich zweimal mit Wasser gewaschen und über Na₂SO, getrocknet. Nach dem Filtrieren und Eindampfen erhält man 21,4 g (82 %)

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Rückstand. Dieser wird ohne weitere Reinigu.ng eingesetzt.

TLC: Si 1 gel F-254/CHC1, 9: CH₇OH 1: HAc 0,5

Rr; 0,76 plus Spuren von kleinen Verunreinigungen.

C) Man löst 22,9 g Boc-Phe-D^-Trp-Lys (Z)-OMe (31,4 mMol) in 450 ml p-Dioxan und 100 ml Methanol, gibt 39 ml 1 η wässerige KOH zu und rührt über Nacht bei Raumtemperatur. Die Lösung wird am Rotationsverdampfer eingedampft. Man löst den Rückstand in 500 ml warmem Wasser, säuert mit 10 %-iger Zitronensäure auf pH 3 an, rührt 30 Minuten lang und filtriert. Nach dem Trocknen im Vakuum über Nacht erhält man 21,6 g (96 %) Produkt mit Schmelzpunkt 85 bis 9O⁰C.

[ÖOd^{5 +7}'⁰⁹ (c 0,987 MeOH) R_f O₅63;CHC1₃ 9 : CH₃OH 1 : HAc₃

0,5°Silgel F.-254.

(p) tert.-Buty1 oxycarbonyl-L-phenyIaI any1-D-tryptophy1 -N^ebenzyloxycarbonyl-L-lysyl-0-benzy1-L-threonyl-L-phenylalanyl-0-benzyl-L-threonyl-O-benzyl-L-seryl-S-p-methoxybenzyl-L-cysteinyl-Benzyl ester (XVI)

Ä) Man gibt 40,5 g Boc-Thr(Bzl)-Phe-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Cys (SMBzI)-OBzI (XIII) (35 mMol) zu einer kalten Mischung von 400 ml TFA und 40 ml Anisol und rührt 30 Minuten in der Kälte. Das TFA wird am Rotationsverdampfer eingedampft. Der Rückstand wird mit 1 1 1:1 Äther-Hexan verrieben. Man erhält ein weißes Pulver. Nach dem Filtrieren, Waschen in Äther-Hexan und Trocknen im

Vakuum über

NaOH-Pl ätzcfTen erhält man 34₉6 g

Produkt (82 %) mit Schmelzpunkt 136 bis 139⁰C (bei 12O⁰C tritt Erweichung ein).

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■y^Jp = -9,93 (c. 1,04 MeOH)

ί, 0,63 Silgel CHCl, 9 : CH^OH 1 : HAc 0,05

T Oo

kleine polarem Verunreinigung Rf 0,53

B) Man rührt 20,0 g Boc-Phe-rj-Trp-Lys(Z)-OH (27,9 raMol), 4,15 g HOBT (30,8 mMol) und 6,3 g DCC (30,8 raMol) in 2,0 1 kaltem Dichlormethan 30 Minuten lang in einem Eisbad. Man gibt 32,6 g H-Thr(Bzl)-Phe-Thr(Bzl)-Ser(Bzl) Cys(SMBzl)-OBzl-TFA-SaIz (27,9 mMol) zu, gefolgt von 3,35 ml N-Methylmorpholin (30,8 mMol) und rührt über Nacht, während sich die Mischung auf Raumtemperatur erwärmt. Nach 2 Stunden erkennt man anhand von TLC, daß die Reaktion im wesentlichen beendet ist.

Man filtriert die Mischung und wäscht das FiI trat mit Wasser, 10 %-iger Zitronensäure, Wasser, gesättigter NaHCOo-Lösung und wiederum mit Wasser und trocknet dann. Nach dem Filtrieren und Eindampfen zeigt Dünnschichtchromatographie (TLC) an, daß das Produkt und eine polarere Verunreinigung vorliegt. Diese Verunreinigung wird durch Auflösen des Rohprodukts in 200 ml warmem DMF und Zugabe von 1 1 2 %-iger wässeriger NaHC0₃-Lösung entfernt. Man filtriert das Produkt, wäscht mit verdünnter NaHCO₃-LÖsung und Wasser und trocknet im Vakuum über P₂O₅. Die Ausbeute beträgt 36,5 g (75 %) Produkt mit Schmelzpunkt 182 bis 184⁰C (bei 15O⁰C schwindet das j Produkt).

Mn⁶ = ° ic- 0,988 CHCU)

R_f (einzelnes Spot) 0,76 Silgel CHCl

CH₃OH 1

HAc 0,05.

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(q) Herstellung von H-Phe-j)-Trp-Lys(Z)-Thr(BzI)-Phe-Thr(Bzl)-Ser(Bz1)-Cys(SMBzI)-OBzI-Trifluoracetatsal ζ (XVII)

32 g Boc-Phe-J)-Trp-Lys(Z)-Thr(Bzl)-Phe-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Cys(SMBzl)-OBzl und 33 ml Anisol werden in 50 ml Dichlormethan gelöst» und man gibt 100 ml Trif1uoressigsäure zu und rührt 30 Minuten bei Raumtemperatur· Die Lösung wird am Rotationsverdampfer bei 3O⁰C eingedampft. Man verreibt den Rückstand mit wasserfreiem Äther, wobei man ein Pulver erhält, das abfiltriert, mit Äther gewaschen und im Vakuum über PoOc und Natriumhydroxyd-Plätzchen getrocknet wird.

o:

Dünnschichtchromatographie auf Silicagel 60 in CHoOHtHOAc 9:1:0,5 zeigt einen einzelnen Spot mit R_f 0,65. Das protonenmagnetische Resonanzspektrum (HNMR) zeigt keinen Peak für tert.-Butyl.

(r) tert.-Butyl oxycarbonyl-S-p-methoxybenzyl-L-cysteinyl-L-histidyl-L-hist idyl-L-phenyIaI any1-L-phenyIaIanyl-D-tryptophy1 -N^e-benzyl oxycarbonyl-L-lysyl-O-benzyl-L-threonyl-L-phenylalanyl-0-benzyl-L-threonyl-O-benzyl-L-seryl-S-p~ methoxybenzyl-L-cyste in-Benzyl ester (XVIII)

Man rührt 5,5 g Boc-Cys(SMBzI)-His-His-PheOH (7,2 mMol), 1,07 g 1-Hydroxybenzotriazol-Monohydrat (7,9 mMol) und 1,65 g Dicyclohexylcarbodiimid (7,9 mMol) in 100 ml trockenem Dimethylformamid 30 Minuten lang in einem Eisbad. Man gibt 12,5 g H-Phe-^-Trp-Lys(Z)-Thr(BzI )-Phe-Thr(BzI)-Ser(Bzl)-Cys(SMBzI)-OBzI-Trifluoracetatsalζ (7,2 mMol) und 0,855 g N-Methylmorpholin (7,65 mMol) zu und läßt die Mischung über Nacht unter Rühren Raumtemperatur erreichen. Die Suspension wird filtriert, um den Dicyclohexylharnstoff zu entfernen, und das Filtrat wird auf 50 ml eingedampft und mit 500 ml gesättigter wässeriger Natriumbicarbonat-

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lösung verdünnt. Der erhaltene Feststoff wird filtriert, mit Wasser gewaschen und in 200 ml DMF wieder aufgelöst. Man verdünnt die Lösung mit 1 1 5 %-iger wässeriger Zitronensäure und filtriert. Der Feststoff wird mit Wasser gewaschen, in 200 ml DMF gelöst und mit 1 1 gesättigter Natriunibicarbonatiösung ausgefällt, filtriert, mit Wasser gewaschen und im Vakuum bei Raumtemperatur über P0O5 9^e~ trocknet. Die Ausbeute beträgt 15 g.

Aminosäureanalyse: His 1,66(2,0); Lys 1,05(1,0);

Phe(3,0); Ser 1,02(1,0); Thr 2,2(2,0).

(s) L-Cysteinyl-L-histidyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-phenylalanyl-D-tryptophyl-L-lysyl-L-threonyl-L-phenylalanyl-L-threonyl-L-seryl-L-cystein cyclisches (1-12) Disulfid (XIX)j

Man mischt 5 g Boc-Cys(SMBzl)-His-His-Phe-Phe-D-Trp-Lys(Z)-Thr(Bzl)-Phe-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Cys(SMBzl)-0Bzl mit 10 ml Anisol und behandelt mit 100 ml flüssigem HF unter Luftausschluß 60 Minuten lang in einem Eisbad. Man entfernt die überschüssige HF im Vakuum und nimmt den Rückstand in 200 ml 10 %-iger wässeriger AcOH auf und gießt in 7 1 entgastes Wasser. Der pH wird mit verdünnter Na^OH auf 7 eingestellt. Man rührt 24 Stunden an der Luft und bringt dann den pH mit Eisessig auf einen Wert von 5. Dann werden die Lösungen durch eine Säule mit Amberlite CG 50 (H -Form) gegeben. Das auf dem Ionenaustauscherharz absorbierte Peptid-Material wird mit 50 %-iger wässeriger Essigsäure eluiert. Die das Peptid-Material enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und lyophilisiert. Hierbei erhält man 2 g Rohmaterial. Das rohe Dodecapeptid wird durch Säulenchromatographie durch Sephadex G 25, Eluieren mit 10 %-iger wässeriger AcOH und Verteilungschromatographie durch Sephadex G 25 mit dem biphasischen System n-BuOH-Wasser-Eisessig 4:5:1, v/v, gereinigt.

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4 - J²''

TLC, Silicagel Merck AG, Chior-Peptid-Spray, D.E.Nitecki et al . Biochem. 5__s 665 (1966) .

R_f (BWA, 4:1:1) 0,45, R_f (BWAP₅ 30:24:6:20) 0,64

Aminosäureanalyse: Thr(z)l,85, Ser(l)0,79, Phe(3)3,

Lys(l)l,02, His(2)l,75, Cys, Trp ND.

(N.D. = keine Daten)

Für den Fachmann liegt es auf der Hand, daß man in der in Beispiel 14 beschriebenen klassischen Synthese andere Kupplungsmittel und Schutzgruppen einsetzen kann. Man kann auch unterschiedliche Aufbaustufen wählen, um die Aminosäurereste in der gewünschten Sequenz zu verbinden. Alle diese Methoden fallen in den Rahmen der Erfindung.

21/V.

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Claims

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Patentansprüche

Peptidderivate des Somatostatins der Formel I

X-Cys-X,TX^-Phe-Phe-Xo-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-X.-OH

I ^{L ά ό} Γ

SA SA

(I)

worin: !

A für Wasserstoff steht oder die beiden Gruppen A entweder : eine direkte Bindung zwischen den in der Fornel I dar- ' gestellten Schwefelatomen S unter Bildung einer cycli- : sehen Struktur, oder eine direkte Bindung zwischen den
in der Formel I dargestellten Schwefelatomen S eines
Moleküls mit den Schwefelatomen S weiterer Verbindungen j der Formel I unter Bildung einer linearen oder cycli- j sehen polymeren Struktur_? bedeuten, wobei bei polymeren Strukturen zwischen 2 und 100 Struktureinheiten der Formel Ij miteinander verbunden sein können und wobei im Falle
einer polymeren linearen Verbindung die beiden endständigen Schwefelatome S mit Wasserstoff abgesättigt
sind;

X für Wasserstoff, AIa-GIy₁ Gly-Gly,, AIa-D-AIa₈ Gly-Gly-GIy, Acetyl oder Benzoyl steht;

X_I für His oder Arg steht;

X₂ die Bedeutung His, GIu oder Asp besitzt;

X₃ für Trp, D-Trp oder 6-F-D-Trp steht; und

X₄ für Cys- oder D-Cys steht;

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ORiGlNAL INSPECTED

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und deren pharmazeutisch verträgliche Salze.
2. Verbindungen gemäß Anspruch I₅ worin die beiden Gruppen A eine direkte Bindung darstellen.
3. Verbindungen gemäß Anspruch 1 oder 2, worin X für Wasserstoff, Ala-Gly, Ala-D-Ala, Gly-Gly oder Gly-Gly-Gly steht; X₁ die Bedeutung His besitzt; X₂ die Bedeutung His besitzt; X₃ für Trp oder D-Τφ steht; und X₄ die Bedeutung Cys besitzt.
4. Verbindung gemäß Anspruch 1 oder 2, worin X für Wasserstoff, Ala-Gly, Ala-D-Ala, Gly-Gly oder Gly-Gly-Gly steht; X, für Arg steht; Xp für His steht; X₃ für Trp oder D-Trp ; steht; und X» für Cys oder D-Cys steht. ,
5. Verbindung gemäß Anspruch 1 oder 2, worin X für Wasserstoff steht, X₁ für His steht; X₂ für His steht; X₃ für Trp oder D-Trp steht; und X^ für Cys oder D-Cys steht.
6. Verbindung gemäß Anspruch 1 oder 2, worin X für Wasserstoff, Ala-Gly, Gly-Gly-Gly, Ala-D-Ala, Acetyl oder Benzoyl steht; X₁ für Argoder His steht; X₂ für GIu oder Asp steht; X₃ für Trp, D-Trp oder 6-F-D-Trp steht; und X4 für Cys oder D-Cys steht.

7. Verbindung gemäß Anspruch 1, 2 oder 6, worin X₁ für Arg !

steht und X₂ die Bedeutung GIu besitzt. !

8. Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, worin X für j Wasserstoff steht.

9. Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, worin X₃ für D-Trp steht.

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28Q7403

10. Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9_S worin X^ für Cys steht.

11. L-Cysteinyl-L-histidyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-phenylalanyl-D-tryptophyl-L-lysyl-L-threonyl-L-ohenylalanyl-L-threonyl-L-seryl-L-cystein-cyclisches (1 —> 12) Disulfid.

12. L-Cysteinyl-L-arginyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-phenylalanyl-D-tryptophyl-L-lysyl-L-threonyl-L-phenylalanyl-L-threοnyl-L-seryl-L-cystein-cyelisches (1 —> 12) Disulfide

L-Cysteinyl-L-histidyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-phenyl-; alanyl-D-tryptophyl-L-lysyl-L-threonyl-L-phenyIaI anyT-L- j threonyl-L-seryl-D-cystein-cyclisches (1 —ϊ 12) Disulfid. j

14. L-Cysteinyl-L-arginyl-L-glutamyl-L-phenyIaIanyl-L-phenylalanyl-D-tryptophyl-L-lysyl-L-threonyl-L-phenylalanyl-L-threonyl-L-seryl-L-cystein-cyclisches (1 -> 12) Disulfid.j

15. L-Cysteinyl-L-histidyl-L-glutamyl-L-phenylalanyl-L-phenyl-i alany1-D-tryρtoρhy 1-L-Iysy1-L-threonyl-L-phenyIaIanyl -L- i threonyl-L-seryl-L-cystein-cycl isches (1 ->12) Disulfid. |

16. Verbindung der Formel I gemäß einem der Ansprüche 1, 6 bis 10, 14 und 15 in Form des Hydrochlorids, Hydrobromids Sulfats, Phosphats, Polyphosphats, Mal eats, Acetats, Citrats, Benzoats, Succinats, Malonats und Ascorbats.

17. Verbindung der Formel I gemäß Anspruch 3 oder 11 in Form eines pharmazeutisch verträglichen Säureadditionssalzes gemäß Anspruch 16.

M/19 021 -Jt

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18. Verbindung der Formel I gemäß Anspruch 4 oder 1?. in Form

eines pharmazeutisch verträglichen Säureadditionssalzes gemäß Anspruch 16. [

19. Verbindung der Formel ϊ gemäß Anspruch 5 oder 13 in Form j eines pharmazeutisch verträglichen Säureadditionssalzes ' gemäß Anspruch 16.

20. Verbindungen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 16, worin ein oder mehrere Peptidreste geschützte Seitenketten und/oder geschützte terminale Amino- und Carboxygruppen aufweisen.

21. Verbindungen der Formel II

R¹ -Cy s-B j-Bg-Phe-Phe^ -Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-X₄-0R

ll

Sß

(H)

worin:

R eine Carboxyschutzgruppe oder einen über eine Methylen-]· gruppe gebundenen Polystyrol harzträger darstellt;

R eine i^-Aminoschutzgruppe oder eine an der <x-Aminogruppe geschützte Ala-Gly-, Gly-Gly-_S Ala-D-Ala- oder Gly-Gly-Gly-Gruppe, Acetyl oder Benzoyl bedeutet;

3 B-i für His oder Arg steht, worin R eine Schutzgruppe

Io Io

R R

für die Seitenketten-Stickstoffatome des Arginins

bedeutet und worin R für Wasserstoff oder eine Schutzgruppe für den Imidazolstickstoff des Histidins darstellt;

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Bo für das vorstehend definierte His oder für GIu oder

I 2 1,4

4 5
Äsp steht» worin R und R Schutzgruppen fur die

R⁵

Seitenketten-Carboxygruppe der Glutamin- und Asparaginsäure bedeuten;

R eine Schutzgruppe für die Seitenketten-Aminogruppe des Lysins bedeutet;

R s R und R jeweils Schutzgruppen für die Hydroxylgruppen des Threonins und Serins darstellen;

X₃ für Trp_s D-Trp oder 6-F-D-Trp steht; X^ für Cys oder D-Cys steht; und

U und β jeweils für eine Sulfhydryl-Schutzgruppe oder für Wasserstoff stehen_s oder worin <y und β eine direkte Bindung'zwi sehen den Schwefelatomen S der Formel II darstellen.

Verbindung der Formel II gemäß Anspruch 21, worin R für Forrayl, Trifluoracetyl , Phthalyl , Tosyl , Nitrophenylsulfenyl, Benzyloxycarbonyl₅ p-Chlorbenzyioxycarbonyl , p-Nitrobenzyloxycarbonyl₉ tert.-Butyloxycarbonyi, Diisopropylmethoxycarbonyl_s Isopropyloxycarbonyl , Allyloxycarbonyl, 2,2,2-Trichloräthoxycarbonyl₅ Isopropyloxycarbonyl s, Amyloxycarbonyl _s Cycloperityl oxycarbonyl ₉ Adamantyloxycarbonylj Cyclohexyloxycarbonyl_s Phenylthiocarbonyl, Trityl oder Trimethylsily] als Schutzgruppen oder für einen ATa-GIy-, Gly-Gly-₅ Ala-D-Ala-, Gly-Gly-Gly-Rest_s der durch eine der vorstehenden Schutzgruppen geschützt ist_s steht.

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23. Verbindungen der Formel II gemäß Anspruch 21 ode.r An-

2
spruch 22, worin R für Tosyl, Benzyloxycarbonyl, Adamantyloxycarbonyl oder tert..-Butyl oxycarbonyl steht.

24. Verbindungen gemäß Formel II gemäß einem der Ansprüche 21 bis 23, worin R für Nitro, Tosyl , Benzyloxycarbonyl, Adamantyloxycarbonyl oder tert.-Butyloxycarbony"! steht.

25. Verbindungen der Formel II gemäß einem der Ansprüche 21 bis 24_S worin R und/oder R für Benzyl stehen.

Verbindungen der Formel II gemäß einem der Ansprüche 21 bis 25, worin R für Tosyl, tert.-Amyloxycarbonyl₃ tert.-Butyloxycarbonyl, Diisopropyloxycarbonyl, Benzyloxycarbonyl, Halogenbenzyloxycarbonyl oder Nitrobenzyloxycarbonyl steht.

Verbindung der Formel II gemäß einem der Ansprüche 21 bis

,7

26, worin mindestens einer der Reste R Acetyl, Benzoyl, tert.-Butyl oder Benzyl steht.

R⁸ und R⁹ für

28. Verbindungen der Formel II gemäß einem der Ansprüche 21 bis 27, worin oi und ß für Benzyl, 3 ,4-Dimethylbenzyl, p-Methoxybenzyl, p-Chlorbenzyl, p-Nitrobenzyl, Trityl₉ Benzyloxycarbonyl , Benzhydryl , p-Methoxybenzylcarbonyl , Benzylthiomethyl, Äthylcarbamoyl, Thioäthyl, Tetrahydropyranyl, Acetamidomethyl, Benzoyl oder s-Sulfonsäuresalζ , stehen.

29. Verbindungen gemäß einem der Ansprüche 21 bis 28, worin R für niedriges Alkyl oder Benzyl steht.

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28 0740

30. Verbindungen der Formel II gemäß einem der Ansprüche 21 bis 23₅ 27 und 28_S worin R für eine tf-Aminoschutzgruppe oder of-Amino-geschützte Ala-Gly-, Gly-Gly-, Ala-D-Ala- oder Gly-Gly-Gly-Gruppe steht; B₁ für His steht.. B₉ für His

steht, X₃ für Trp oder D-Trp steht_s X₄ für Cys «steht und R einen über eine Methylengruppe gebundenen Polystyrolharzträger bedeutet.

31. Verbindungen der Formel II gemäß einem der Ansprüche 21 bis 24, 27 und 28_S worin R eine tf-Aminoschutzgruppe oder eine tf-Amino-geschützte Ala-Gly-,, Gly-Gly-., Ala-D-Ala- oder Gly-Gly-Gly-Gruppe bedeutet; B₁ für Arg steht;

I 0

für His steht; R²

für Trp oder D-Trp steht;

für Cys

oder D-Cys steht und R einen über eine Methylengruppe gebundenen Polystyrol harzträger darstellt.

32. Verbindungen der Formel II gemäß einem der Ansprüche 21 bis 23, 27 und 28_S worin R für eine o(-AminoschJtzgruppe steht; B₁ für His steht; B₉ für His steht; X-, für Trp oder

1 I ₉ 6. I ₉ O

R R

D-Trp steht; X« für Cys oder D-Cys steht und R einen über eine Methylengruppe gebundenen Polystyrol harzträger darstellt.

33. Verbindungen der Formel II gemäß einem der Ansprüche 21, ■22 und 24 bis 28, worin R ei ne e^-Ami noschutzgruppe, eine oi-Amino-geschützte Ala-Gly-, Gly-Gly-Gly- oder Ala-D-Ala-Gruppe, Acetyl oder Benzoyl bedeutet; B₉ für GIu oder Asp

R⁴ R⁵

steht und R einen über eine Methylengruppe verbundenen Polystyrol harzträger darstellt.

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N/19 02!

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34. Verbindungen der Formel II gemäß Anspruch 33, worin R

3 für tert.-Butyloxycarbonyl steht; R Tosyl darstellt; R⁴, R⁵, R⁷, R⁸ und R⁹ für Benzyl stehen; R⁶ für 2-Chlorbenzyloxycarbonyl steht und <v und β die Bedeutung p-Methoxybenzyl besitzen.

35. Verbindungen der Formel II gemäß Anspruch 30, worin R J für tert.-Butyloxycarbonyl oder eine tert. -Buty'loxycarbonyl ■ geschützte Ala-Gly-, Gly-Gly-, Ala-D-Ala- oder GIy-GIy-GIy-!

9 R i

Gruppe bedeutet; R für Tosyl steht; R für 2-Chlorbenzyl- [

TQQ ^!

oxycarbonyl steht; R , R und R für Benzyl stehen und j οίund β die Bedeutung p-Methoxybenzyl besitzen.

36. Verbindungen der Formel II gemäß Anspruch 31, worin oe, ß, R¹, R², R⁶, R⁷ und R⁸ die in Anspruch 35 angegesenen Bedeutungen besitzen und R für Tosyl steht.

37. Verbindungen der Formel II gemäß Anspruch 32, WD,rin R für tert.-Butyloxycarbonyl steht und R², R⁶, R , R , R , <* und β die in Anspruch 35 angegebenen Bedeutungen besitzen.

38. tert.-Butyloxycarbonyl-S-p-methoxybenzyl-L-cysteinyl-N tosyl-L-his tidy1-N^1m-tosyl-L-his tidy1-L-phenyIaI anyI-L-pheny1 al any1 -D-1ryρtophyl-N^£-2-chiorbenzyloxycarbonyl-L-1ysy1-0-benzyl-L-threony1-L-phenyIaI any!-O-benzyl-L threonyl-O-benzyl-L-seryl-S-p-methoxybenzyl-L-cysteinyl-Hydroxymethylpolystyrol.

39. tert.-Buty!oxycarbonyl-S-p-methoxybenzyl-L-cysteinyl-N^gntosy1-L-arginyl-N^1m-tosyl-L-histidy1-L-phenyIaI any1-L-pheny IaI any1-D-tryptophyl-N^f-2-chlorbenzyloxycarbonyl-L-Iysy1-0-benzyl-L-threony1-L-phenyl al any!-O-benzyl-L-threonyl-O-benzyl-L-seryl-S-p-methoxybenzyl-L-cystei nyl-

HydroxymethylpolystyroTester.

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M/19 021 - lfr -

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40. tert.-ButyIoxycarbonyl-S-p-methoxybenzyl-L-cysteinyl-N^lmtosyl -L-histidyl-im-tosyl-L-histidyl-L-phenylalcinyl-L-phenylaVanyl-D-tryptophyl-f^-chlorbenzyloxycarbonyl-L-lysyl-0-benzyl-L-threonyl-L-phenylalanyl-O-benzyl-L-threonyl-0-benzyl-L-seryl-S-p-methoxybenzyl-D-cysteinyl-HydrOxymethylpolystyrolester.

41. tert.-Butyloxycarbonyl-S-ρ-methoxybenzyl-L-cysteinyl-Ν" tosyl-L-arginyl-^-benzyl-L-glutamyl-L-phenylalanyl-L-phenylalanyl-D-tryptophyl-N^t-2-chlorbenzyloxycarbonyl-L- 1ysy1-0-benzy1-L-threonyl-L-phenyl al any1-0-benzy1-L-threonyl-O-benzyl-L-seryl-S-ρ-methoxybenzyl-L-cystein-Hydroxymethylpolystyrol ester.

42. tert.-Butyl oxycarbony!-S-ρ-methoxybenzyl-L-cystuinyl-N ^mtosyl-L-histidyl-T-benzyl-L-glutamyl-L-phenylalanyl-L-phenylalanyl-D-tryptophyl-N^f-2-chlorbenzyloxyca "bony!-L- ^ysyl-0-benzy^-L-threonyl-L-phenylalany^ -0-benz./,l -L-threonyl-O-benzyl-L-seryl-S-p-methoxybenzyl-L-cystein-

Hydroxymethylpolystyro!ester.

43. tert.-Butyl oxycarbonyl-S-p-methoxybenzyl-L-cyst sinyl-L-histidyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-phenylalan/1-D-tryρto · ρhy1-Ν^έ-benzyl oxycarbonyl-L-Iysy!-0-benzy1-L-threοnyl-L-phenylal anyl-0-benzy1-L-threonyl-0-benzy1-L-seryl-S-pmethoxybenzyl-L-cyste in-Benzyl ester.

44. Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der Formel I gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Verbin-

. düngen gemäß Anspruch 20 entschützt.

45. Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der Formel I gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man aus einer Verbindung der Formel· II gemäß einem der Ansprüche

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21 bis 29 sämtliche Schutzgruppen und einen gegebenenfalls enthaltenen Polystyrol harzträger entfernt, gewünschtenfalls die gebildete Verbindung der Formel I zur Bildung der cyclischen oder offenkettigen Form oxydiert oder reduziert und gewünschtenfalIs die Verbindung in Form der freien ' Base oder in Form eines pharmazeutisch verträglichen SalzeSj -isoliert. ;

46. Verfahren gemäß Anspruch 45, dadurch gekennzeichnet, daß man den Polystyrolharzträger und/oder die Schutzgruppen ' durch Behandlung mit Fluorwasserstoff in Gegenwart von Anisol in einer einzigen Stufe entfernt.

47. Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der Formel I, worin die beiden Gruppen A eine direkte Bindung zwischen den Schwefelatomen bilden, dadurch gekennzeichnet, daß man eine entsprechende Verbindung der Formel I, worin A für Wasserstoff steht, oxydiert.

48. Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der Formel II gemäß Anspruch 21, worin >y und β Schutzgruppen darstellen und R für einen Polystyrolharzträger steht, dadjrch gekennzeichnet, daß man die entsprechenden, in geeigneter Weise geschützten und/oder aktivierten Aminosäuren unter Festphasen-Synthesebedingungen der Reihe nach an einen chlormethylierten Harzträger oder einen Hydroxynethylharzträger kuppelt.

49. Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der Formel II gemäß einem der Ansprüche 21 bis 29, worin o< und β eine direkte Bindung darstellen, dadurch gekennzeichnet, daß man eine entsprechende Verbindung der Formel II, worin O^ und β jeweils für Wasserstoff stehen, oxydiert.

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50. Verfahren gemäß Ansprüchen 45, 46 oder 49, dadurch gekennzeichnet, daß man die Oxydation unter Verwendung von Sauerstoff oder Kaiiumhexacyanoferrat-III durchführt.

51. Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der Formel II gemäß einem der Ansprüche 21 bis 27 und 29, worin oi und β für Wasserstoff stehen, dadurch gekennzeichnet, daß man aus einer entsprechenden Verbindung der Formel II, worin CX" und ß für Trityl oder Acetamido stehen, selektiv die Sulfhydryl-Schutzgruppen entfernt.

52. Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der Formel II . gemäß Anspruch 21, worin o( und β Schutzgruppen darstellen und R eine Carboxyschutzgruppe darstellt, dadurch gekennzeichnet, daß man die entsprechend geschützten und/oder aktivierten Aminosäuren oder Gruppen von Aminosäuren unter Bildung der gewünschten Sequenz nach an sich für die Bildung von Amidbindungen bekannten Methoden kuppel.t·

53. Verfahren gemäß Anspruch 45 oder Anspruch 46, dadurch gekennzeichnet, daß man die Verbindungen der Formel II nach einem der Verfahren gemäß Ansprüchen 49 bis 52 herstellt.

54. Verfahren gemäß Anspruch 46, dadurch gekennzeichnet, daß man die in Anspruch 30 oder 35 bezeichneten Verbindungen der Formel II einsetzt.

55. Verfahren gemäß Anspruch 46, dadurch gekennzeichnet, daß man die in Anspruch 31 oder 36 bezeichneten Verbindungen der Formel II einsetzt.

56. Verfahren gemäß Anspruch 47, dadurch gekennzeichnet, daß man die in Anspruch 32 oder 37 bezeichneten Verbindungen der Formel II einsetzt.

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57. Verfahren gemäß Anspruch 47, dadurch gekennzeichnet, daß man die in Anspruch 33 oder 34 bezeichneten Verbindungen der Formel II einsetzt. !

58. Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der Formel II, ;

dadurch gekennzeichnet, daß man ein Peptid der Formel VIa: !

R¹-Cys-B₁-B₂-Phe-0H ·

! ■ ι

mit einem Peptid der Formel: !

H-Phe-Xo-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-X.-OR

^J I I 111

R⁰ R^x R^ö R-* Sß

worin:

R für eine Carboxyschutzgruppe steht;

R¹, R⁶, R⁷, R⁸, R⁹, B₁, B₂, X₃ und X₄ die in Anspruch 21 angegebenen Bedeutungen besitzen; und

oi und ß für SuI fhydryl-Schutzgruppen stehen; kondensiert.

59. Verfahren gemäß Anspruch 58, dadurch, gekennzeichnet, daß man Dicyclohexylcarbodiimid verwendet.

60. Arzneimittel, enthaltend mindestens eine Verbindung der Formel I gemäß einem der Ansprüche 1 bis 19 oder dessen pharmazeutisch verträgliches Salz in einem pharmazeutisch verträglichen Träger sowie gegebenenfalls Zusatzstoffe.

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61. Pharmazeutisches Mittel gemäß Anspruch 60 in Doi.isei nhei ts· form.

62. Pharmazeutisches Mittel gemäß Ansprüchen 60 oder 61 mit einem zusätzlichen Gehalt an Insulin.

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