SE447482B - Forfarande for framstellning av somatostatinanaloger - Google Patents

Description

447 482 r Puon 2 ,0flÅUTY Den reducerade formen (den öppna kedjeformen) av somatostatin (RS) utgöres av den linjära tetradekapeptiden med formeln: sH S" H-Ala~Gly-Lys~Lys-Asn-Dhe-Dhe-Trp-Lys-Thr-Dhc~Thr-Ser-àyß-UH (B) Den reducerade formen (B) har framställts enligt en total- syntes [se Rivier et al., C.R. Acad. Sci. Ser. p. Sci. Natur.

(Paris), gig, 2737 (l973) och Sarantakis och McKinley, Biochem. and Biophys. Res. Communications, âg, 234 (l973l] och den (B) kan överföras till somatostatin (A) genom oxidation, varigenom en bryggbildande bindning bildas mellan de båda sulfhydryl- grupperna på de tvâ cysteinylaminosyraresterna i tetradekapep- tiden.

Olika polypeptider, vilka kan betraktas såsom strukturella modifikationer av somatostatin, har framställts syntetiskt och beskrives i den kemiska litteraturen. Sådana polypeptider uppvisar vissa strukturella kännetecken gemensamma med somato- statin och avviker från somatostatin genom att i somatostatin- molekylen ursprungligen närvarande specifika aminosyrarester eller funktionella grupper antingen saknas eller ersättes av andra aminosyrarester eller funktionella grupper. Föreliggande uppfinning hänför sig till nya syntetiska biologiskt aktiva polypeptider, vilka kan betraktas såsom strukturella modifika- tioner av somatostatin. Polypeptiderna enligt uppfinningen avviker från somatostatin i följande avseenden: (ai Alal-Glyl segmentet saknas; (b) Lys4-resten är ersatt av Arg eller His; (dl Asns-resten är ersatt av His eller Glu; och 8 (d} Trp -resten är antingen närvarande eller är ersatt av D-Trp.

Samtliga optiskt aktiva aminosyrarester och aminosyror före- ligger i L-konfiguration, såvida icke annat anges. 447 482 Uppfinningen avser sålunda kemiska föreningar med formeln: H-çys-X1-X2-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser- OH (I) X.- |4 S S vari X1 är His eller Arg, X2 är His eller Glu och X4 är Cys eller D-Cys, och de farmakologiskt godtagbara salterna därav.

De symboler som identifierar aminosyrorna och aminosyraresterna i de häri beskrivna polypeptiderna är sådana som antagits av IUPAC-IVB Committee on Biochemical Nomenclature Recommendation (1971) och beskrives i Archives of Biochemistry and Biophysics, låg, l-8 (1972). Symbolen "6-F-D-Trp" avser D-tryptofan, vari 6-ställningen är substituerad med fluor.

De aktuella utföringsformerna av uppfinningen uppvisar följande fysikaliska egenskaper: de är vita till ljust gulbruna fasta substanser, i huvudsak olösliga i kloroform, bensen och liknande, men uppvisar löslighet i vatten och sura vattenlösningar, såsom saltsyra och ättiksyra. Kompositionerna enligt uppfinningen upp- visar icke någon skarp smältpunkt och kan renas med exempelvis kromatografiska medel. Hydrolys av kompositionerna enligt upp- finningen i exempelvis 4N metansulfonsyra möjliggör bestämning av deras aminosyrahalt, vilken överensstämmer med de ovan an- givna strukturerna.

De aktuella utföringsformerna enligt uppfinningen uppvisar farmaceutisk aktivitet, särskilt beträffande inhibering av frigöringen av ett eller flera av hormonerna somatotropin, glukagon och insulin, vilket fastställes med hjälp av farmako- logiska standardtestmetoder. Genom doseringskontroll möjliggör verkningsselektivitet inhibering av somatotropin- och glukagon- frigöring utan att påverka endogena insulinsekretionsnivåer.

Vidare kan de aktuella utföringsformerna enligt uppfinningen utnyttjas i blandning med insulin för behandling av varmblodiga djur vilka lider av diabetes mellitus. 447 482 Enligt en subgenerisk aspekt omfattar uppfinningen följande: a) en förening med formeln I, vari X1 är His; X2 är His och är Cys. b) en förening med formeln I, vari X1 är Arg; X2 är His och är Cys eller D-Cys. c) en förening med formeln I, vari X1 är His; X2 är His och är Cys eller D-Cys. 4 d) en förening med formeln I, vari X1 är Arg eller His; X2 är Glu och X4 är Cys eller D-Cys; X1 och X2 är företrädesvis båda His eller X är Arg och X2 är Glu. l Särskilt lämpliga föreningar enligt uppfinningen är: H-çys-Arg-Glu-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-çys S S H-Cys-His-Glu-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys I i S S Föreliggande uppfinning avser förfaranden för framställning av de ovan beskrivna föreningarna.

Föreningarna med formeln I kan framställas genom att man avlägsnar samtliga skyddsgrupper och polystyrenhartsbäraren, då en sådan är närvarande, från en förening med formeln II Rl-Cys-X -X -Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-X -OR (II) Ilz Is'7 189” Sa. RR RRs/s vari l R betecknar en4K-aminoskyddande grupp; R betecknar en karboxiskyddande grupp eller en polystyren- hartsbärare bunden via en metylengrupp, dvs. -CH2-poly- 447 482 . 5 styrenhartsbärare; X3 är his eller ?rg, vari R3 är en skyddande grupp för ' 2 3 R R sidokedjekväveatomerna i arginin och R2 är väte eller en skyddande grupp för imidazolkväveatomen i histidin; X är His enligt ovan eller ?lu, vari R4 är en skyddande | R2 R4 grupp för sidokedjekarboxigruppen i glutaminsyra; 2 R6 är en skyddande grupp för sidokedjeaminogruppen i lysin; R7, R8 och R9 är vardera skyddande grupper för hydroxyl- grupperna i treonin och serin; X4 har ovan angiven betydelse; och 04 och ß representerar en sulfhydrylskyddande grupp; och oxíderar den erhållna föreningen, och att man eventuellt isolerar produkten i form av den fria basen eller ett farma- ceutiskt godtagbart salt.

Exempel på R2 är tosyl, bensyloxikarbonyl, adamantyloxi- karbonyl och tert~butyloxikarbonyl; R2 är företrädesvis tosyl.

Exempel på R3 är nitro, tosyl, bensyloxikarbonyl, adamantyl- oxikarbonyl och tert-butyloxikarbonyl; R3 är företrädesvis tosyl.

Exempel på R4 är bensyl och t-butyl.

Sidokedjeaminogruppen i lysin skyddas av R6, som exemplifieras av tosyl, t-amyloxikarbonyl, t-butyloxikarbonyl, diisopropyl- oxikarbonyl, bensyloxikarbonyl, halogenbensyloxikarbonyl, nitrobensyloxikarbonyl och liknande, varvid 2-klorbensyloxi- karbonylgruppen är den lämpligaste.

Exempel på R7-, R8~ och R9-skyddsgrupper för hydroxylgruppen i treonin och serin är acetyl, bensoyl, tert-butyl och bensyl.

Bensylgruppen är den lämpligaste för detta ändamål. 447 482 Eliminering av skyddsgrupperna kan utföras enligt metoder kända i samband med respektive skyddsgrupper. Skyddsgrupperna avlägsnas företrädesvis i ett enda steg, såsom med användning av fluorväte i närvaro av anisol.

Polystyrenhartsbäraren kan spaltas samtidigt som skyddsgrupper~ na avlägsnas, såsom med_användning av fluorväte i närvaro av anisol, eller också kan den_spaltas genom omestring för bild- ning av en karboxiskyddad mellanprodukt med formeln II, vari R är en esterfunktion. Således ger exempelvis metanolys en metylestermellanprodukt med formeln II, vari R är metyl. Hydro- lys av sådana estrar ger den önskade C-ändgruppskarboxifunk- tionen.

Då ä ochlß är väte, kan de fria disulfhydrylderivaten med formeln II ringslutas genom oxidation med användning av ett oxidationsmedel, såsom jod, syre (exempelvis luft), l,2-dijod- etan eller natrium- eller kalium-järn(III)cyanid, för bildning av motsvarande föreningar med formeln II, vari N ochlß bildar en direkt bindning.

Polypeptidslutprodukterna och deras mellanprodukter kan fram- ställas enligt den välkända fastfasmetoden, beskriven exempel- viš av ixerrifieia, J. Am.. Chem. sec. _83, 2149 (1963), eller enligt klassisk syntes. Uppfinningen omfattar således även ett förfarande för framställning av en förening med formeln II, vari e och ß är skyddsgrupper och R är en polystyrenharts- bärare, varvid man i följd kopplar de erforderliga, lämpligen skyddade och/eller aktiverade aminosyrorna under fastfassyntes- betingelser till en klormetylerad eller hydroximetylharts- bärare. Alternativt kan föreningarna med formeln II, vari a och ß är skyddsgrupper och R är en karboxiskyddsgrupp, framställas genom koppling av de erforderliga, lämpligen skyddade och/eller aktiverade aminosyrorna eller grupperna av aminosyror enligt metoder kända i samband med bildning av peptidbindningar i och för bildning av den önskade aminosyrasekvensen. n och fi-skydds- grupperna kan därefter selektivt avlägsnas och produkten oxi- deras för bildning av den cykliska disulfiden med formeln II, vari Q och ß bildar en direkt bindning. 447 482 Metoder för aktivering av aminosyror före koppling och kopp- lingsmetoderna i sig själva är välkända, se exempelvis den i det följande nämnda läroboken av Schröder och Lübke.

Vid val av en speciell sidokedjeskyddsgrupp avsedd att användas vid syntesen av peptiderna enligt uppfinningen bör följande regler följas: (a) sidokedjeskyddsgruppen måste vara beständig mot reaktanten och under de reaktionsbetingelser som väljes för eliminering av n-aminoskyddsgruppen i varje steg av syn- tesen, (b) skyddsgruppen måste bibehålla sina skyddsegenskaper (dvs. icke avspaltas under kopplingsbetingelser) och (c) sido- kedjeskyddsgruppen måste kunna avlägsnas efter fullbordande av syntesen av den önskade aminosyrasekvensen under reaktions- betingelserna på så sätt att peptidkedjan icke ändras.

Enligt den klassiska metod som tillämpas på föreningarna enligt uppfinnigen upphygges den önskade peptiden genom kondensation av aminosyror eller grupper av aminosyror, vilka skyddas om så är nödvändigt. Kondensationsreaktionerna kan utföras med användning av metoder allmänt kända för bildning av amidbind- ningar inom peptid- och penicillin-kemin. För att befrämja en elegant kondensation av aminosyrorna är det lämpligt att an- vända ett kondensationsmedel. Exempel på kondens iionsmedel är larbodiimider, såsom N,N'-dicyklohexylkarbodiimid (DCC) och N,N'-diisopropylkarbodiimid. Alternativt kan kondensationen ut- föras genom aktivering av den ena eller båda ändgrupperna.

Exempel på den aktiverade formen av karboxiändgruppen är syra- kloriden, syraanhydriden, syraaziden och den aktiverade estern.

Det är uppenbart för fackmannen att den föreslagna metoden för utförande av kondensationsreaktionerna icke bör störa skydds- grupperna på aminsyrorna. ' Vid uppbyggnad av molekylen via den klassiska metoden är det särskilt lämpligt att kondensera en skyddad peptid med formeln 447 432 R1-Ers-B1-82-Phe-UH sa (vra) med en skyddad peptid med formeln H-Phc~X3-Lys~Thr-Dhe-Thr-Ser-X4-UR I I R6 R7 ' RB ng sß vari R är en karboxiskyddande grupp (företrädesvis bensyl); Rl, R6, R7, R8, R9, Bl, B2, X3 och X4 har den angivna betydel- sen och d.och ß är sulfhydrylskyddande grupper, företrädesvis p-metoxibensyl, för bildning av en förening med formeln II, som deprotekteras och ringslutes.

I den på föreliggande föreningar tillämpade fastfasmetoden bindes först uramino- och sulfhydrylskyddad cystein vid ett klormetylerat polystyrenharts, varefter man eliminerar «-amino- skyddsgruppen med trifluorättiksyra i metylenklorid, trifluor- ättiksyra separat eller HCl i dioxan. Deprotektioneringen ut- föres vid en temperatur mellan ungefär OOC och rumstemperatur.

Andra standardspaltningsmedel och betingelser för eliminering av specifika araminoskyddsgrupper kan användas, såsom beskrives av Schröder och Lübke, "The Peptides“, l, 72-75 (Academic Press, 1965). Efter eliminering av den d-aminoskyddade gruppen kopplas de följande önskade skyddade aminosyrorna individuellt en efter en till den hartsbundna sekvensen. Alternativt kan små peptidfragment framställas exempelvis enligt lösningsmeto- den och införas i fastfasreaktorn i den önskade ordningsföljden.

Varje skyddad aminosyra eller aminosyrasekvens införes i fast- fasreaktorn i ett ungefär fyrfaldigt överskott. Kopplingen ut- föres i dimetylformamid, metylenklorid eller en blandning av de båda lösningsmedlen. Framgången med varje kopplingsreaktion i varje steg av syntesen bestämmes enligt ninhydrinreaktionen, såsom beskrives av E. Kaiser et al., Analyt. Biochem., åg, 595 447 (482 (1970). När kopplingen är ofullständig, upprepas reaktionen innan den a-aminoskyddade gruppen avlägsnas för införing av den följande aminosyran eller aminosyrasekvensen.

De länpligaste kopplingsmedlen är 1-hydroxibensotriazol och diisopropylkarbodiimid; andra sådana medel är kända av fack- mannen .

När den önskade aminosyrasekvensen har syntetiserats, avlägsnas polypeptiden från hartsbäraren genom behandling med exempelvis fluorväte och anisol för bildning av den fullständigt avpro- tektionerade linjära polypeptiden. Den cykliska disulfiden kan erhållas genom luftoxidation eller exempelvis genom oxida- tion med K3Fe(CN)6.

De icke-toxiska additionssalterna av de linjära och cykliska polypeptiderna framställes enligt metoder allmänt kända inom detta område ur saltsyra, bromvätesyra, svavelsyra, fosforsyra, polyfosforsyra, maleinsyra, ättiksyra, citronsyra, bensoe~ syra, bärnstenssyra, malonsyra eller askorbinsyra och liknande. Ättiksyrasaltet är lämpligast.

De under fastfassyntesen använda skyddade grupperna är allmänt kända. De nraminoskyddade grupperna använda tillsammans med varje aminosyra införd i sekvensen av den slutliga polypeptiden består av (1) acyltypskyddande grupper åskådliggjorda med följande: formyl, trifluoracetyl, ftalyl, p-toluensulfonyl (tosyl), nitrofenylsulfenyl, etc.; (2) aromatisk uretan- typskyddande grupper åskådliggjorda med bensyloxikarbonyl och substituerad bensyloxikarbonyl, såsom p-klorbensyloxikarbo- nyl och p-nitrobensyloxikarbonyl; (3) alifatiska uretanskyddan- de grupper åskådliggjorda med tert-butyloxikarbonyl, diiso- propylmetoxikarbonyl, isopropyloxikarbonyl, allyloxikarbonyl, 2,2,2-trikloretoxikarbonyl, amyloxikarbonyl; (4) cykloalkyl- uretan~typ-skyddande grupper åskådliggjorda med cyklopentyloxi- karbonyl, adamantyloxikarbonyl och cyklohexyloxikarbonyl; (5) tiouretan-typskyddande grupper, såsom fenyltiokarbonyl; (6) 447Ä4s2 10 alkyltypskyddande grupper åskådliggjorda med trifenylmetyl (trityl); (7) trialkylsilangrupper, såsom trimetylsilan. Den >lämpligaste a-aminoskyddade gruppen är tert-butyloxikarbonyl.

Imidazolkväveatomen i histidin, betecknad Nlm, skyddas av en grupp som kan utgöras av tosyl, bensyloxikarbonyl, adamantyl- oxikarbonyl eller tert-butyloxikarbonyl, företrädesvis tosyl- gruppen.

Skydd för sidokedjeaminogruppen i lysin kan åstadkommas med tosyl, t-amyloxikarbonyl, t-butyloxikarbonyl, diisopropyloxi- karbonyl, bensyloxikarbonyl, halogenbensyloxikarbonyl, nitro- bensyloxikarhonyl och liknande, varvid 2-klorbensyloxikarbonyl- gruppen är lämpligast.

Sidokedjekväveatomerna i arginin, betecknad Ng, skyddas av en grupp som kan utgöras av nitro, tosyl, bensyloxikarbonyl, adamantyloxikarbonyl eller tert-butyloxikarbonyl, företrädes- vis tosylgruppen. Skydd via nitro- eller tosylgruppen utföres på endera av Nw- eller Nwl-kväveatomerna, medan de oxikarbonyl- typskyddande grupperna skyddar Ng och vilken som helst av N“;- och N°*l-kväveatomerna.

Skydd av hydroxigruppen i treonin och serin kan utföras med acetyl, bensoyl, tert-butyl eller bensyl. Bensylgruppen är lämpligast för detta ändamål.

Skyddsgruppen för sulfhydrylgruppen i cysteinylaminosyra- resten väljes bland den klass som består av bensyl; substitue- rad bensyl, varvid substituenten utgöres av minst en av grup- perna metyl, metoxi, nitro eller halogen (såsom 3,4-dimetylben- syl, p-metoxibensyl, p-klorbensyl, p-nitrobensyl, etc.); tri- tyl, bensyloxikarbonyl, benshydryl, p-metoxibensyloxikarbonyl, bensyltiometyl, etylkarbamoyl, tioetyl, tetrahydropyranyl, acet- amidometyl, bensoyl, s-sulfonsyrasalt, etc.; varvid p-metoxi- bensylgruppen är lämpligast.

.... -..H- 447 482 ll q- Den farmakologiska aktiviteten av peptiderna enligtxupp- z *rt finningen karaktäriserar föreningarna såsom användbara vid behandling av akromegali och diabetes på samma sätt som somato- statin själv. Administration av peptiderna kan utföras på kon- ventionell väg på samma sätt som för somatostatin och därmed" besläktade polypeptider under ledning av en läkare i en mängd fl._ som bestämmes av omfattningen av besvären, såsom dessa bedömes ¿¿ av läkaren. Föreningarna kan administreras separat eller i blandning med konventionella farmaceutiskt godtagbara bärare " och adjuvanter i enhetsdoseringsform.

Såsom ovan angivits är kompositionerna enligt uppfinningen även användbara i blandning med insulin för behandling av diabetes mellitus. Se exempelvis den amerikanska patentskriften 3.912.807, som beskriver användningen av en effektiv mängd av en komoosi- I tion innehållande somatostatin blandat med insulin för behand- ling av ett varmblodigt djur, som lider av diabetes mellitus.: ~ Vid terapeutisk användning såsom medel för behandling av akromegali, juvenil diabetes och diabetes mellitus initieras behandlingen med små doser, som är mindre än den optimala dosen för föreningen. Därefter ökas doseringen med små tillsatser, tills den optimala effekten under de rådande betingelserna upp- nås. I allmänhet administreras föreningarna enligt uppfinningen i en doseringsnivå som vanligen ger effektiva resultat utan att förorsaka några skadliga biverkningar. Doseringarna kan emellertid varieras alltefter patientens krav och den använda föreningen. Den totala dagliga doseringen kan lämpligen upp- delas och administreras i portioner under dagen, om så önskas.

Enligt en ytterligare aspekt av uppfinningen tillhandahålles en farmaceutisk komposition, innehållande en förening med formeln I eller ett farmakologiskt godtagbart salt därav i blandning med en farmakologiskt godtagbar bärare. Företrädesvis föreligger den farmakologiska kompositionen i enhetsdoserings- ~I form. 447 482 12 Uppfinningen åskådliggöres närmare medelst följande exempel, vari de angivna temperaturerna avser Celsius-grader.

Exempel l.

Tert-butyloxikarbonyl-S-p-metoxibensyl-L-cysteinyl-Nim-tosyl- -L-histidyl-Nim-tosyl-L-histidyl-L-fenyla1anyl-L-fenylalanyl- -D-Tryptofyl-Ng -2-klorbensyloxikarbonyl-L-lysyl-O-bensyl-L- -trecnyl-L-fenylalanyl-0-bensyl-L-treonyl-O-bensyl-L-Seryl-S- -p~metoxibensyl-L-cysteinyl-hydroximetylpolystyren Klormetylerat polystyrenharts (Lab Systems, Inc.), 1%-igt tvärbundet med divinylbensen, förestrades med BOC-Cys-(SMBzl)OH enligt Gisin, Helv. Chim. Acta., §§, 1976 (1973). Polystyren- hartsestern behandlades enligt schema A för införlivning av BOC-Ser(Bzl)OH, BOC-Thr(Bzl)OH, BOC-Phe-OH, BOC-Thr(Bzl)OH, BOC-Lys(ClZ)OH, BOC-D-Trp-OH, BOC-Phe-OH, BOC-Phe-OH, BOC-His (Tos)OH, BOC-His(Tos)0H och BOC-Cys(SMBzl)OH i øch för bildning av titelpeptidohartset. ' Schema A: l. Tvätta med CH2Cl2 x 3 2. Behandla med TFA-cflzclz-EDT (l=l=5%f VOIYm/VOlYm) under 5 minuter 3. Behandla enligt 2 under 25 minuter 4. Tvätta med CH2Cl2 x 3 5. Tvätta med DMF. 6. Behandla med 12%-ig TEA i DMF två gånger under 3 minuter 7. Tvätta med DMF 8. Tvätta med CH2Cl2 x 3 7 9. Behandla med 4 ekvivalenter av motsvarande aminosyra- derivat i CH2Cl2-DMF och omrör 5 minuter 10. Tillsätt i två portioner 5 ekvivalenter DIC löst i CH2Cl2 timmar. ll. Tvätta med DMF x 3 l2. Tvätta med CH2Cl2 x 3 13. Testa ninhydrinreaktionen enligt Kaiser et al., Annal.

Biochem., åå, 595 (1970). I fall av ofullständig reak- tion, upprepa punkterna 9-13 ovan. under en tidrymd av 30 minuter. Reaktionstid 6 447 482 13 Exemgel 2.

L-cysteinyl-L-histidyl-L-histidyl-L-fenylalanyl-L-fenylala- nyl-D-tryptofyl-L-lysyl-L-treonyl-L-fenylalanyl-L-treonyl-L- seryl-L-cystein-cyklisk (l~l2)-disulfid 9 g av peptidohartset från exempel l blandades med 18 mg ani- sol och behandlades med 180 ml flytande HF under 45 minuter i ett isbad. Överskottet HF avlägsnades i vakuum så snabbt som möjligt (ungefär en timme) och återstoden extraherades med avluftad 2M isättika, varefter den avfiltrerades. Filtratet tvättades med eter och vattenskiktet oxiderades med K3Fe(CN)6 vid pH 7. överskottet oxidationsmedel avlägsnades med jonbytar- harts, Bio Rad AG-3, varefter peptiden adsorberades på ett jonbytarharts, Bio Rex 70, och eluerades med en pyridinbuffert med pH 7 för att efter lyofilisering ge l,5 g material. Detta påfördes en pelare av Sephadex R G-15 (2,5 x 160 cm) och elue- rades med 15%-ig ACOH i vatten. Fraktionerna (vardera 5,2 ml) i rören 88-90 sammanfördes och lyofiliserades för bildning av titelföreningen, 174 mg.

Rf (BWA, 4:l:l) 0,45 Rf (BWAP, 30:24:6:20) 0,64 Aminosyraanalys: Thr(2)l,87, Ser(l)O,89, Cys(2)l,l6, Phe(3)3, Lys(l)l,05, His(2)l,76, Trp ND.

Exemgel 3.

In vivo-farmakologiska aktiviteten för den enligt exempel 2 framställda dodekapeptiden fastställdes enligt följande proce- durer med de angivna resultaten: Undertryckning av tillväxthormon En subkutan (sc) injektion av peptid solubiliserad eller sus- penderad i fysiologisk natriumkloridlösning tillföres Charles River CD-hanråttor, som icke satts på fastediét. Med ställd natriumkloridkontrollösning sc-injicerade råttor användes såsom kontrolldjur, så att varje försöksråtta kan jämföras med en kontrollråtta. Råttorna upprätthålles i separata burar och 20 minuter före testperiodens slut tillföres de en intraperi- 447 482 14 toneal (i.p.) injektion av nembutal i en dos av 50 mg/kg.

Blodprov uttages genom kardiakpunktur och plasman separeras för radioimmunobestämning av koncentrationen (ng/ml) av tillväxthormon (GH). Tidsperioder efter injektion om 2 och 4 timmar användes för testning av varaktigheten av peptidens aktivitet beträffande undertryckning av cirkulerande perifera GH-nivåer. Jämförelse mellan kontroll- och experiment-GH- värden vid varje tillfälle bestämmes enligt Student t-testet och statistisk signifikans (p) vid 0,05-nivån eller därunder såsom ett index på aktiviteten.

Förening (dos) 2 timmar 4 timmar Kontroll 118 1 20 ll5 1 23 Exempel 2 (1 mg/kg) 32 1 6 62 i 13 P =<0,0l p =<0,0l Undertryckning av tillväxthormon, glukagon och insulin Albinohanråttor anordnas i tre grupper (9 råttor/grupp) och injiceras i.p. med Nembutal R vid 50 mg/kg. l5 minuter efter Nembutal linjektionen injiceras subkutant alltefter gruppen med (a) testföreningen, typiskt 10-2000 Ag/kg; (b) SRIF (200 ,ug/k9); eller (c) fysiologisk natriumkloridlösning. 10 minuter senare injiceras 0,5 ml arginin (3oo mg/ml, pH 7,2) i hjärtat.

Råttorna dekapiteras fem minuter efter att de erhållit argini- net och blodet tillvaratages i Trasylol-EDTA. Lämpliga propor- tioner analyseras därefter med avseende på tillväxthormon, glukagon och insulin. En aktiv föreningar är en sådan som signifikant ändrar plasmanivån av vilket som helst av dessa hormoner i jämförelse med natriumkloridlösningskontrollerna.

Jämförelse mellan kontroll- och försöksvärdena utföres statis- tiskt genom analys enligt variansmetoden och statistisk signi- fikans (p) vid 0,05 eller lägre såsom ett index på aktiviteten.

Förening GH (ng/ml) Insulin Glukagon (dos q/kq) ( U/ml) (pg/ml) Kontroll 163 1 29 278 1 32 68 i 13 Exempel 2 (100) 20 1 8 202 i 49 20 1 8 p = <0,0l p = )0,05 p =<0,0l 447 482 15 ExemEel_§¿ Tert-butyloxikarbonyl-S-p-metoxibensyl-L-cysteinyl-Ngn~tosyl- -L-arginyl-Nlm-tosyl~L-histidyl-L-fenylalanyl-L-fenylalanyl- -D-tryptofyl-Nç-2-klorbensyloxikarbonyl-L-1ysyl-O-bensy1-L- treonyl-L-fenylalanyl-O-bensyl-L-treonyl-O-bensyl-L-seryl~S- p-metoxibensyl-L~cysteinyl-hydroximetyl-polystyrenester Klormetylerat polystyrenharts (Lab Systems, Inc.), 1%-igt tvärbundet med divinylbensen, förestrades med Boc-Cys-(SMBzl)- OH enligt Gisin, Helv. Chim. Acta, äâ, 1976 (1973). Poly- styrenhartsestern behandlades enligt schema A för införing av Boc-Ser(Bzl)~OH, Boc-Thr(Bzl)-OH, Boc-Phe-OH, Boc-Thr(Bzl)-OH, Boc-Lys(ClZ)-OH, Boc-D-Trn-OH, Boc-Phe-OH, Boc-Phe-OH, Boc- His(Tos)-OH, Boc-Arg(Tos)-OH och Boc-Cys(SMBzl)-OH i och för bildning av titelpeptidohartset.

Schema A: l. Tvätta med CH2Cl2 x 3 2. Tvätta med TFA-CH2Cl2-EDT (l:l:5%, volym/volym) under 5 minuter 3. Behandla enligt 2 under 25 minuter 4. Tvätta med CH2Cl2 x 3 5. Tvätta med DMF 6. Tvätta med 12%-ig TEA i DMF 2 gånger under 3 minuter 7. Tvätta med DMF 8. Tvätta med CH2Cl2 x 3 9. Behandla med 4 ekvivalenter av motsvarande aminosyra- derivat i CH2Cl2-DMF och omrör 5 minuter 10. Tillsätt i tvâ portioner 5 ekvivalenter DIC löst i CH2Cl2 under en period av 30 minuter. Reaktionstid 6 timmar ll. Tvätta med DMF x 3 12. Tvätta med CH2C12 x 3 ll. Testa ninhydrinreaktionen enligt Kaiser et al., Anal. Biochem., åí, 595 (1970). I fall av ofullständig reaktion, upprepa punkterna 9-13. 447 482 16 gšempel 5.

L-cysteiny1~L-arginyl-L-histidyl-L-fenylalanvl-L-feny1a1any1- ~D-tryptofy1-L-lysy1-L-treony1-L-fenyla1anyl-L-treonyl-L-seryl- -L-cystein-cyklisk (l-12)-disulfid 8,5 g av peptidohartset från föregående exempel blandades med 16 ml anisol och behandlades med 100 ml flytande HF under 45 minuter. Överskottet HF avlägsnades i vakuum så snabbt som möjligt och återstoden upptogs i 25%-ig Ac0H i vatten. Den poly- mera bäraren avfiltrerades och filtratet tvättades med eter.

Vattenskiktet hälldes i 3,5 liter vatten, pH inställdes med NH4OH till 7 och sedan oxiderades sulfhydrylföreningen med K3Fe(CN)6. pH inställdes nå 5 med isättika och det oorganiska oxídationsmedlet avlägsnades med Bio Rad AG 3. Peptidmate- rialet adsorberades på Bio Rex 70 och eluerades med pyridinê buffert med pH 7 för bildning av den orena föreninšïn, 2 g.

G-15 (2,5 x 160 cm) och eluerades med 15%-ig Ac0H i vatten. Materialet Detta material fördes genom en pelare av Sephadex i ïraktionerna 47-93 (5,2 ml i vardera fraktionen), 886 mg, påfördes en pelare av CM-Sephadex ;G~25 och eluerades med en stegvis NH4OAc-gradient (0,1 till 0,3 molär NH4OAc) för bildning av titelföreningen. Detta material påfördes en pelare av Sephadex RILH 20 (2,5 X 92 cm) och eluerades med lO%~iq Ac0H i vatten. Den rena titelföreningen erhölls i fraktionerna 55-63 (vardera 4,1 ml). Utbyte 159 mg.

Rf (BWA, 4:1:1) 0,46, Rf (BWAP, 30:24:6:20) 0,65.

Aminosyraanalysz Thr (2) 1,94, Ser (1) 0,91, Cys (2) 1,79, Phe (3) 3, His (1) 1,02, Lys (1) 0,85, Arg (1) 0,95, Trp. N.D.

Exempel 6.

Den in vivo-farmakologiska aktiviteten av titelföreningen framställd i exempel 5 fastställdes enligt följande procedur med de angivna resultaten: 447 482 17 Undertryckning av tillväxthormon, glukagon och insulin Albinohanråttor anordnas i två grupper (nio råttor per grupp) och injiceras iip. med Nembutal Rti 50 mg/kg. 15 minuter efter Nembutal 5¿injektionen injiceras subkutant alltefter gruppen testföreningen eller fysiologisk natriumhydridlös- ning. 10 minuter senare injiceras 0,5 ml arginin (300 mg/ml, pH 7,2) i hjärtat. Råttorna dekapiteras fem minuter efter att de mottagit argininet och blodet tillvaratages i Trasylol- EDTA. Lämpliga portioner analyseras därefter med avseende nå tillväxthormon (GH), glukaton (GLUN) och insulin (INS). En aktiv förening är en sådan som signifikant ändrar plasmanivån för någon av dessa hormoner från den i natriumhydridsalt- lösningskontrollerna. Jämförelse mellan kontroll- och försöks- värden utföres statistiskt genom analys enligt variansmetoden och statistisk signifikans (p) vid 0,05 eller därunder såsom ett index på aktiviteten.

Resultat Försök nos GH ms GLUN war/kg nq/ml /ß-N/ml pq/ml 1 ---- 257 i 49 177 i 19 61 i 9 1oo 61 + sx 52 i lax o i ox 2 ---- 131 i 43 262 i 26 42 i lo 71 i 21x 238 i 72 4 i X X p 0,01 gšemwel 7.

Tert-butyloxi-karbonyl~S-p-metoxibensyl-L-cysteinyl-im-tosyl- -l~histidyl-im-tosyl-L~histidyl-L-fenylalanyl-L-fenylalanyl- -D-tryptofyl-E -2-klorbensyloxikarbonyl-L-lysyl-D-bensyl-L- treony1-L-fenylalanyl-0-bensyl-L-treonyl-O-bensyl-l-seryl-S- igimetoxibensyl-D-cysteinyl-hydroximetyl-Dolystyrenester Klormetylerat polystyrenharts (Lab Systems, Inc.), 1%-igt tvär- bundet med divinylbensen, förestrades med Box-D-Cys-(SMBzl)OH.

Polystyrenhartset behandlades enligt schema A för införlivning av Boo-Ser(Bzl)OH, Boc-Thr(Bzl)OH, Boo-Phe-OH, Boc-Thr(Bzl)0H, Boc-Lys(Cl7)OH, Boc-D-Trp-OH, Boc-Phe-OH, Boc-Phe-OH, Boc~His 447 482 l8 (Tos)OH, Boc-His(Tos)0H och Boc-Cys(SMBzl)0H i och för bild- ning av titelpevtidohartset.

Exempel 8.

L~cysteinyl-L-histidyl-L-histidyl-L-fenylalanyl-L~fenylalanyl- :D-tryptofyl-L-lysyl-L-treonyl-L-fenylalanyl-L-treonyl-L-seryl- -D-cystein-cykliskt(l-12)-disulfiddiacetatsalt 10 g av peptidohartset från föregående exempel blandades med ,2O ml anisol och behandlades med 150 ml flytande HF i ett is- Kbad under 45 minuter under utestängande av luft. Överskottet flytande HF avlägsnades i vakuum och återstoden upptogs i 50%-ig ACOH i vatten. Blandningen filtrerades och filtratet utspäddes med vatten till 3,5 liter. pH inställdes på 7 med utspädd NH4OH och disulfhydrylpeptiden oxiderades med K3F(CN)6 till cyklisk disulfid. pH i_blandningen inställdes på 5 med isättika och behandlades med Bio-Rad AG 3. Peptidmaterialet adsorberades på Bio Rex 70 (H+-form) och eluerades med pyridin- buffert (Py-H20-AcOH, 30:66:4, volym/volym). De fraktioner som innehöll peptidmaterialet sammanfördes och lyofiliserades för bildning av l,6 g orent material. Denna orena produkt på- fördes en pelare av Sephadex \LH-20 (2,5 x 90 cm) och eluera- des med 10%-ig ACOH i vatten (varje fraktion 5,8 ml). Materialet som erhölls i fraktionerna 97-101 sammanfördes och lyofilisera- des för bildning av titeldodekapeptiden, l7l mg.

TLC, Avicel "precoated“ glasplattor, Rf (BWA, 4:l:l, volym/ volym) 0,32, Rf (BWAP, 30:24:6:20, volym/volym) 0,56.

Aminosyraanalys: Thr (2) l,85, Ser (l) 0,84, Cys (2) 1,29, Phe (3) 3, Lys (l) 1,05, His (2) 1,41, Trp (1) 0,75.

Den in vivo-farmakologiska aktiviteten för dodekapeptiden framställd i exempel 8 fastställdes enligt de procedurer som i detalj beskrives i exempel 3. Man erhöll följande data: "íïíöíløw uUAUlY i 447 482 19 Undertryckning av tillväxthormon Förening (dosL 2 timmar 4 timmar Kontroll 127 i 22 59 i 20 Exempel s (1 mg/kg) zo i axx 1o7 i 34 XX p< 0,001 Undertryckning av tillväxthormon, glukagon och insulin Förening GH (ng/ml) Insulin (AU/ml) Glukagon [dos Ueg/kq)] (P9/ml) xentre11 279 _ ss 323 i se 42 i 6 Exempel s (100) 64 i 20* 165 1 21” s i 2* xentreil 201 3 35 397 i se 117 1 11 Exempel s (100) 110 3 22+ 318 i 54 7o ¿ 7* x) p< 0,01 +>p Det framgår därav av vid låga doser är peptiden från exempel 8 specifik för undertryckning av glukagon och tillväxthormon utan att påverka insulinsekretionen.

Exempel 9.

Tert-butyloxikarbonyl-S-p-metoxibensyl-L-cysteinyl~Ngn-tosyl- -L~arginyl-1'-bensyl-L-glutamyl-L-fenylalanyl-L-fenylalanyl- -D~tryptofyl-NF -2-klor-bensyloxikarbonyl-L-lysyl-0-bensyl-L- -treonyl-L-fenylalany1-O-bensyl-L-treonyl-O-bensyl-L-seryl-S- -p-metoxibensyl-L-cysteinhydroximetylpolystyrenester Klormetylerat polystyrenharts förestras med Boc-Cys(SMBzl)-OH, enligt Gisin, Helv. Chim. Acta., §§, 1976 (1973). Aminosyra- hartsestern behandlas därefter enligt schema A (enligt följande) varvid Boc-Ser(Bzl)~0H användes såsom skyddad aminosyra i steg 9. Schema A upprepas därefter för konsekutiv införlivning av följande aminosyror i peptidohartset: Boc~Thr(Bzl)-OH Boc-Phe-OH Boc-Thr(Bzl)-OH Boo-Lys(ClZ)~OH Boc-D-Trp-OH 447 482 20 Boc-Phe-OH Boc-Phe-OH Boc-Glu(OBzl)-OH Boc-Arg(Tos)-OH Boc-Cys(SMBzl)-OH âghema A: (för behandling av hartsestern) l. Tvätta tre gånger med metylenklorid (CH2Cl2) 2. Behandla med trifluorättiksyra/metylenklorid (l:l, volym/ volym) innehållande 5%-ig 1,2-etanditiol under 5 minuter 3. Upprepa steg 2 under 25 minuter 4. Tvätta 3 gånger med CH2Cl2 5. Tvätta med dimetylformamid (DMF) 6. Behandla med 12%-ig trietylamin i DMF under 3 minuter 7. Tvätta med DMF 8. Tvätta tre gånger med CH2Cl2 9. Behandla med 4 ekvivalenter av den lämpliga skyddade aminosyran i CH2Cl2-DMF och omrör 5 minuter 10. Tillsätt i två portioner under 5 minuter 5 ekvivalenter diisopropylkarbodiimid löst i CH2Cl2. Låt reaktionen förlöpa 6 timmar. ll. Tvätta tre gånger med DMF -=l2. Tvätta tre 9ån9@r meå CH2Cl2 13. Testa ninhydrinreaktionen enligt Kaiser et al., Annal. Bio- chem., Qi, 595 (1970). I fall av ofullständig reaktion, upprepa stegen 9-13 ovan.

\ Exempel lO.

L-cysteinyl-L-arginyl-L-glutamyl-L-fenylalanyl-L-fenylalanyl- -D-tryptofyl-L-lysyl-L-treonyl-L-fenylalanyl-L-treonyl-L- -seryl-L-cystein-cyklisk (l-l2)disulfid 8,5 g av peptidohartset från exempel 9 suspenderades i 16 ml anisol och behandlades med vattenfritt flytande fluorväte (HF) under 45 minuter i ett isbad, varefter överskottet HF avlägsnades i vakuum och återstoden extraherades med 10%-ig ättiksyra i vatten. Filtratet tvättades med eter och vattenskiktet hälldes i 5 liter vatten, varefter pH ínställdes på 7 med utspädd ammoniumhydroxid. Blandningen omrördes i öppna luften under jïrïlíñfi i ÛUALÜÜY _. -___ , ..._ . ma-, 447 482 21 48 timmar, varefter pH inställdes på 5 med isättika och pep- tiden adsorberades på Amber1ite<š)CG-50 (H+-form). Peptid- materialet eluerades med 50%-ig ättiksyra i vatten och lyofili- serades för bildning av 850 mg fast material.

Den orena produkten pâfördes en pelare av Sephadex 6:' LH 20 (2,5 x 150 cm) och eluerades med 10%-ig ättiksyra. Fraktionerna 94-130 sammanfördes och lyofiliserades för bildning av 483 mg material. Detta pâfördes en pelare av Sephadex R'G25 (1,5 x 115 cm) och eluerades med 10%-ig ättiksyra i vatten. Frak- tionerna 43-53 sammanfördes och lyofiliserades för bildning av titelpeptiden, 286 mg.

TLC, Avicel<š\"precoated“ glasplattor, Rf (BWA, 4:l:l, volym/ volym) 0,40, Rf (BWAP, 30:24:6:20, volym/volym) 0,65.

Aminosyraanalys: Thr (2) 1,92, Ser (1) 0,89, Glu (1) 1,03, Cys (2) 1,49, Phe (3) 3, Lys (1) 1,05, Trp (1) 0,81, Arg (1) 1,02.

Exemgel 11. _ _ . im Tert-butyloxikarbonyl-S-p-metoxibensyl~L-cysteiny1-N -tosyl-L- -histidyl-^ï-bensyl-L-glutamyl-L-fenylalanyl-L-fenylalanyl-D- -tryptofyl-Ne -2-klorbensyloxikarbonyl-L-1ysyl-O-bensy1-L-treo- nyl-L-fenylalany1-O-bensyl-L-treonyl-0-bensy1-L-seryl-S-p- -metoxibensyl-L-cystein-hydroximetyl-polystyrenester Klormetylerat polystyrenharts förestras med Boc-Cys(SMBzl)-OH, enligt Gisin, Helv. Chim. Acta., §§, 1976 (1973). Aminosyra- hartset behandlas därefter enligt schema A (se exempel 9), varvid Boc-Ser(Bzl)-OH användes såsom skyddad aminosyra i steg 9. Schema A upprepas därefter för konsekutiv införlivning av följande aminosyror i peptidohartset: Boc-Thr(Bzl)-OH Boc-Phe-OH Boc-Thr(Bzl)-OH Boc-Lys(C1Z)~OH Boc-D-Trp-OH Boc-Phe-OH 447 482 22 Boc-Phe-OH Boc-Glu(0Bzl)-OH Boc-His(Tos)-OH Boc-Cys(SMBzl)-OH Exempel 12.

L-cysteiny1-L-histidyl-L-glutamyl-L-fenylalanyl-L-fenylalanyl- -D-tryptofyl-L-lysyl-L-treonyl-L-fenylalanyl-L-treonyl-L-seryl- -L-cystein- cyklisk (l-12 )disulfid Peptidohartset från exempel ll (8 g) behandlas med flytande vattenfritt HF enligt exempel 10 och den linjära disulfhydryl- dodekapeptiden ringslutes genom oxidation med K3Fe(CN)6 vid pH 7,3 i hög utspädning. pH inställes på 5 med isättika och blandningen behandlas med Bio Rad AG3-X4 (Cl-form)-jonbytar- harts och adsorberas sedan på Amberlite R CG 50 (H+-form).

Peptidmaterialet elueras med 30%-ig ättiksyra i vatten och lyofiliseras för bildning av 500 mg orent material. Detta kromatograferas på en pelare av Sephadex R LH 20 för bildning av titeldodekapeptiden.

TLC, Avicel<š "precoated“ glasplattor, Rf (BWA, 4:l:l, volym/ volym), 0,43, Rf (tert-Am0H-Py-W, 7:7:6, volym/volym) 0,74.

Aminosyraanalys: Th (2) 1,92, Ser (1) 0,93, Glu (l) 0,94, Cys (2) 1,59, Phe (3) 3, Lys (l) 1,02, His (l) 0,91, Trp (1) 0,81.

Exempel l3.

Den biologiska aktiviteten av peptiderna från exempel 10 och l2 bestämdes enligt följande procedur: Till albinohanråttor administreras intraperitonealt Nembutaldà vid en dos av 50 mg/kg. 15 minuter senare administreras en subkutan injektion av testföreningen eller fysiologisk natrium- hydridlösning. 10 minuter senare injiceras 0,5 ml arginin (300 mg/ml, pH 7,2) i hjärtat. 5 minuter efter införingen av argininet dekapiteras râttorna och blodet tillvaratages i 447 482 trasylol-EDTA. En lämplig portion analyseras med avseende på tillväxthormon (GH), insulin och glukagon genom radioimmuno- analys. Resultaten för analysen är följande: Dos GH " Ins lin Förening (uw/xq) nfs/lr-g lin/ru. âflfßäïæn Ad njflarl Kontmn -_ av? i cs sol i 27 46 i s 10 EXem9el 10 ZOO 42|i 6* ll5_i 1G* l.5¿¿ 1* lQ Kontroll ~~ 2l5_i 35 285 i 28 55_: 5 10 Exempel 10 40 ' 28_¿ 5* 158 i 5? 12 i 2* 10 Kontroll _ ~- 454 i_lOG 269_i 37 60_i 10 _ 10 Exempel 12 200 lO7_i 29* 205 :_56 4 ih 2* 10 Kontroll -- 233 _~_x~_ 35 342 _-x_-_ 45 44 i IL 10 Exempel 12 50 $4_¿ 17* 322 :_40 lO|i 4* lO * - p<0.0l Dessa data visar att peptiderna från exempel 10 och 12, repre- sentativa för de övriga peptiderna enligt uppfinningen, utgör effektiva medel för reduktion av tillväxthomonnivån och gluka- gonnivån utan att väsentligt störa insulinnivåerna vid en dos av 40 mg/kg resp. 50 mg/kg. Peptiderna från exempel lO och l2 testades även med avseende på varaktigheten av deras effekt på GH-sekretion hos råttor behandlade med Nembutal . Peptiden från exempel lO visade signifikant inhibering av GH under lägst 4 timmar vid en dos.av lOOO mg/kg (subkutant). Pentiden från exempel 12 visade icke någon signifikant inhibition av GH vid 2 och 4 timmar. 447 482 24 De häri beskrivna föreningarna kan administreras till varm- blodiga djur, antingen intravenöst, subkutant, intramuskulärt eller oralt, för kontroll av serumglukos vid behandling av diabetes. Den erforderliga doseringen varierar med det speciel- la tillstånd som skall behandlas, allvarligheten av tillståndet och varaktigheten av behandlingen.

Den aktiva komponenten kan administreras separat eller i kom- bination med farmaceutishzgodtagbara bärare eller excinienter.

Lämpliga farmaceutiska kompositioner är uppenbara för fack- mannen. gšemnel 14.

Klassisk syntes av L-cysteinyl-L-histidyl-L-histidyl-L-fenyl- alany1-D-tryptofyl-L-lysyl-L-treonyl-L-fenylalanyl~L-treonyl- -L-seryl-L-cystein~cyk1isk (l-§l2)disulfid (a) N-bensyloxikarbonyl-im-bensyloxikarbonyl-L-histidyl-L- fenylalanyl-metylester (I) En suspension av 42,3 g (O,l mol) Z-His(Z)-OH och 21,8 g (0,1 mol) Phc-owe-Hcl (98%) 1 looo m1 cH2c12 kyldes till o°, var- efter 22 g (O,l2 mol) DCC och 10,1 g (O,lO mol) trietylamin tillsattes. Blandningen fick antaga rumstemperatur över natten.

Den utskilda dicyklohexylkarbamiden avfiltrerades och filtratet koncentrerades till ett klisterartad material. Materialet lös- tes i etylacetat och olösligt material avfiltrerades. ETOAC- skiktet tvättades med 5%-ig citronsyra, vatten, iskyld 5%-ig natriumvätekarbonatlösning i vatten och vatten. Det organiska skiktet torkades över natriumsulfat, koncentrerades till l/3 av sin ursprungliga volym, försattes med 500 ml eter, tills lösningen blev grumlig, och förvarades i kyla över natten.

Den bildade vita fasta substansen torkades, 32 mg. Smältpunkt 131-13s°.

TLC: silikagel F-254, CH2Cl2:MeOH (9:l) Rf = 0,8. _ _____,-____.._..- f I 1135-1370 447 482 (b) Im-bensyloxikarbonyl-L-histidyl-L-fenylalanylmetylester- dihydrobromidsalt (II) 30 g (0,5 mol) Z-His(Z)-Phe-0Me (I) löstes i 300 ml HBr-HOAc (32%-iq) (lösningen blev grumlig inom 2 minuter) och bland- ningen förvarades 30 minuter vid rumstemperatur och försattes med eter för bildning av en fällning. Den mjuka fasta substan- sen avfiltrerades och torkades över natten (32 g). Smältpunkt TLC: fläcken rörde sig inte. (c) N-bensyloxikarbonyl-im-bensyloxikarbomyl-L-histidyl-im- bensyloxikarbonyl-L-histidyl-L-fenylalanyl-metylester (III) En suspension av 30,5 g (0,05 mol) His(Z)-Phe-OMe-2HBr (II), 21,7 g (0,05 mel) Z-His(Z)-OH i 500 ml CH2Cl2 kyldes till OO.

Därefter tillsattes ll g DCC och l0,l g (0,l0 mol) trietylamin.

Denna blandningen fick antaga rumstemperatur över natten.

Den bildade dicyklohexylkarbamiden avfiltrerades och filtratet koncentrerades till ett glasartat material. Återstoden löstes i etylacetat och Et0Ac-skiktet tvättades med 10%-ig citronsyra, vatten, iskyld 5%-ig natriumvätekarbonatlösning och vatten.

Et0Ac-skiktet torkades över natriumsulfat, koncentrerades till ungefär l/3 av sin ursprungliga volym, försattes med eter för bildning av en qrumlig lösning och förvarades i ett kallt rum.

Vit fast substans utskilde sig, 29,5 g. (d) L-histidyl-L-histidyl-L-fenylalanyl-metylester~trihydro- kloridsalt (IV) Z Z Blandningen av 29 g Z-åis-åis-Phe-0Me (IV), 10,8 ml koncentre- rad HCl, 180 ml Me0H och två spatlar 10%-igt Pd-C hydrerades 5 timmar med användning av en Parr-hydreringsanordning.

Efter avfiltrering koncentrerades metanolskiktet till en olja och eter tillsattes för bildning av en fast substans. 18 g orent material användes för nästa reaktion utan ytterligare roninq. 447 482 26 (e) tert-butyloxikarbonyl-S-p-metoxibensyl-L-cystein-L-histidyl- -L-histidyl-L~fenvlalanyl-metylester (V) 13 g Boc-Cys(MBzl)-OH (0,038 mol), 5,4 g (0,04O mol) hydroxi- benstriazol och 8,3 g (0,040 mol) dicyklohexylkarbodiimid omrördes 30 minuter i l liter iskyld metylenklorid. 19,5 g (0,0345 mol) His-His-Phe-0Me'3HCl och l0,5 ml (0,096 mol) N-metylmorfolin tillsattes och blandningen omrördes över natten, varvid den antog rumstemperatur. Suspensionen filtrerades för eliminering av dicyklohexylkarbamid och filtratet tvättades successivt med vatten, 10%-ig HZCO3 och vatten och torkades över Na2S04. Efter filtrering avlägsnades lösningsmedlet i vakuum för bildning av 21,0 g oren produkt. Detta material omrördes i 100 ml acetonitril under 30 minuter vid rumstempera- tur och filtrerades. Fällningen tvättades med acetonitril och därefter med eter och torkades. Utbyte ll ge TLC: Rf 0,12 silikagel 60, CHCl3:CH3:OH-HAC, 9:l:0,5 volym/ volym.

Filtratet från acetonitrilextraktionen innehåller produkt och föroreningar och kan användas för extraktion av andra orena satser. (f) tert-butyloxikarbonyl-S-p-metoxibensyl-L-cysteinyl-L- histidyl-L-histidyl-L-fenylalanin (VI) ll,O g (0,0l42 mol) Boc-Cys(MBZI)-His-His-Phe-0Me löstes i 200 ml metanol och 30 ml lN kaliumhydroxid tillsattes.

Lösningen omrördes 2 timmar vid rumstemperatur och metanolen avlägsnades i vakuum. Återstoden utspäddes med 200 ml vatten och filtrerades. Filtratet inställdes på pH 5 med 10%-ig citron- syra och den klisterartade fällningen förvarades, tills den kristalliserade. Produkten avfiltrerades, tvättades med vatten och torkades i vakuum över P205. Utbyte 7,3 g, 67 %.

TLC: Rf 0,52 silikagel 60 n-butanol:etylacetatzättiksyraz H2 R 0,43 silikagel 60 tert-amylalkohol:pyridin:H20, f 7:6:7 volym/volym).

O, l:l:l:l volym/volym) 447 482 27 (g) N-tert-butyloxikarbonyl-O-bensyl-L~treonyl-L-fenylalanin- -metylester (VII) En lösning av 61,8 g (0,2 mol) Boc-L-Thr(Bzl)-OH och 22,4 ml (0,2 mol) N-metylmorfolin i THF kyldes till -150. 26,2 ml (0,2 mol) isobutylklorformiat tillsattes i portioner, varvid temperaturen upprätthölls mellan -l5 och -100. Efter 15 minu- ters omröring vid -150 tillsattes en kall blandning av 43,1 g (0,2 mol) L~Phe-OMeHCl och 22,4 ml (0,2 mol) N-metylmorfolin i DMF i portioner, medan temperaturen upprätthölls mellan -10 och -50. Blandningen omrördes två timmar vid Oo och därefter över natten vid rumstemperatur. Den filtrerade reaktionsbland- ningen koncentrerades i vakuum och återstoden upptogs i etyl- acetat. Etylacetatlösningen tvättades konsekutivt med 5%-ig KHSU4, 5%-igt KHCO3 och natriumkloridlösning och torkades över Na2SO4. Efter koncentrering i vakuum erhölls en olja, som kristalliserade vid förvaring. Den fasta substansen om- krlstalliserades ur isopropyleter/hexan, 74,9 g (80 %). smautpunkt 7s-s1°, [a1š4 + 10,75 (c 1,023, meon), Rf (cHc13) 0,35.

C. H N 06 (470,55) ¿6 34 2 Beräknat: C 66,36 H 7,28 N 5,95 Funnet: C 66,72 H 7,32 N 5,85' (h) N-tert-butyloxikarbonyl-O-bensyl-L-treonin-L-fenyl- alanin (VIII) 23,5 g (0,05 mol) Boc-Thr(Bzl)-Phe-OMe löstes i en blandning av lOO ml MeOH/dioxan (l:l) och behandlades med 55 ml lN-NaOH under 3 timmar (tills utgångsmaterial icke längre kan påvisas med TCI). Huvuddelen av lösningsmedlet avdunstades i vakuum och återstoden utspäddes med vatten, varefter den surgjordes med en 5%-ig citronsyra. Den utskilda klisterartade substansen upptogs i EtOAc och tvättades med vatten (koncentrerad natrium- kloridlösning) och indunstades till torrhet. Återstoden kri- stalliserades ur Et2O/hexan, 19,8 g (87 %), smältpunkt 118-ll9o.

R; (kloroform/metanol/isättika, 85:lO:5) 0,80. 447 482 (i) N-tert-butyloxikarbonyl-O-bensyl-L-treonyl-O-bensyl-L- -serin-metylester (IX) 30,9 g (0,1 mol) N-tert-butyloxikarbonyl-0-bensyl-L-treonin löstes i 200 ml torr tetrahydrofuran kyld till -200 och be- Khandlades med ll ml N-metylmorfolin och därefter med 13,4 ml isobutylklorformiat. Den kalla reaktionsblandningen omrördes 5 minuter vid -200 och behandlades sedan med en lösning av 25 g (ungefär O,l mol) O-bensyl-L-serin-metylester-hydroklo- rid, innehållande ll ml N-metylmorfolin, i DME och blandningen fick antaga rumstemperatur över natten.

Lösningsmedlet avlägsnades i vakuum och återstoden fördelades mellan vatten och etylacetat. Den organiska fasen tvättades med 5%-ig citronsyra, vatten, KHC03 i vatten och vatten och torkades över MgS04, varefter den indunstades till torrhet för bildning av en oljeartad återstod, som kristalliserades ur dietyleter/hexan till en geléliknande fast substans (29 g), Rf (CHCI3-MeOH, 25:l) 0,85, Rf (Et0Ac-hexan, 1:1) 0,65. (j) N-tert-butyloxikarbonyl-0-bensyl-L-treonyl-O-bensyl-L- serin (X) 28,2 g (0,0563 mol) Boc-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-OMe löstes i unge- fär 50 ml metanol och behandlades 1,5 timmar vid rumstempera- tur med 75 ml lN natriumhydroxid. Den alkaliska lösningen neu- traliserades till pH 7 med 10%-ig citronsyra och huvuddelen av metanolen avlägsnades i vakuum. Återstoden utspäddes med en ringa mängd vatten och surgjordes med 5%-ig KHS04 i vatten, varefter den extraherades med EtOAc. Den organiska fasen tvätta- des med vatten, torkades över Na2SO4 och indunstades till torr- het i form av en olja. Utbyte kvantitativt. Rf (EtOAc-hexan, 1:1) 0,15 (lång fläck). (k) N-tert-butyloxikarhonyl-O-bensyl-L-treonyl-O-bensyl-L- seryl-S-p-metoxibensyl-L-cystein-bensylester (XI) 24,3 g (SO mmol) Boc-Thr(Bzl)-Ser(Bz1)-OH löstes i acetonitril och 250 ml diklormetan (2:3) och blandades med 25 g (50 mmol) HCye(SMBzl)-Bzl-Tos0H och därefter med 6,8 ml trietylamin och 6,8 g N-hydroxibensotriazol och blandningen kyldes i ett isbad. 447 482 29 En lösning av ll g (53 mmol) DCC i 50 ml acetonitril till- sattes och reaktionsblandningen omrördes två timmar i kyla och därefter 2 dagar vid rumstemperatur. Utskild DCU avfilt- rerades och filtratet indunstades till torrhet. Den oljeartade återstoden fördelades mellan etylacetat och vatten och den orga- niska fasen tvättades med l0%~ig citronsyra, vatten, 5%-ig KHCO3 Na2S04. Lösningsmedlet avdunstades och den oljeartade återsto- och koncentrerad natriumkloridlösning och torkades över den kristalliserades ur Et20/hexan för bildning av en vit fast substans, 24,5 g, smältpunkt 87-900. Rf (kloroform/meta- nol, 25:l) 0,54, spår vid 0,4 och 0,3 (heptan-EtOAc, l:l), 0,64, spår vid 0,25, I2-positiv [a]š5 -14,7 (c 0,98, DMF).

CMHSZNBSQQ (798,9) Beräknat: C 66,15 H 6,56 N 5,26 Funnet: C 66,22 H 6,95 N 5,29 (1) 0-bensyl-L-treonyl-0-bensyl-L-seryl-S-p-metoxibensy1-L- ~cystein-bensvlester-trifluoracetat (XII) 8 g (10 mmol) Boc-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Cys(SMBzl)-0Bzl blandades med 100 mmol anisol och behandlades med 100 ml TFA under 45 minuter. Lösningsmedlet avdunstades i vakuum och återstoden löstes i torr Et20, varefter den indunstades till torrhet i högvakuum för bildning av en oljeartad förening, 7,2 g (90 %).

Rf n-hutanol/vatten/isättika 4:l:l, 0,9, Rf (heptan/Et0Ac) 0,0-0,l lång fläck, I2-positiv och ninhydrin-positiv. (m) N-tert-butyloxikarbonyl-O-bensyl-L-treonyl-L-fenylalanyl- -0~hensyl-L-treonyl~0-bensyl-L-seryl-S-p-metoxibensyl-L-cystein- bensylester (XIII) 9,2 g (20 mmol) Boc-Thr(Bz1)-Phe-OH (framställd enligt exempel 3) löstes i 100 ml DMF och blandades med 3,4 g N-hydroxisuccin~ imid och en lösning av 20 mmol Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Cys(SMBzl)- OBzl'TFA-salt i 20 ml DMF neutraliserad med trietylamin till pH 7. Blandningen kyldes i ett isbad och behandlades två timmar med 4,5 g DCC i kyla och därefter 2 dagar vid rumstemperatur.

DCU avfiltrerades och filtratet indunstades till torrhet. Åter- stnlen triturerades med vatten för bildning av en fällning, 447 482 30 som upptogs i Et0Ac, tvättades med 5%-ig citronsyra, vatten, 5%-iq Na2C03 och vatten, torkades över Na2SO4 och indunstades till torrhet. Man bringade återstoden att stelna i Et2O-hexan; den kan kristalliseras ur Me0H, mycket löslig i CHCl3. 17,3 g (70 %), smältpunkt 105-1070, Rf (CHCl3-MeOH, lO:l) 0,90; lalšs -3,6 (Q 1, DMF).

C64H75N5SOl2H2O (ll56,2) 7 Beräknat: C 66,46 H 6,71 N 6,05 Funnet: C 66,68 H 6,59 N 6,20 (n) tert-butyloxikarbonyl-D-tryptofyl-N9 -bensyloxikarhonyl- -L-lysyl-metylester (XIV) 30,4 g (0,1 mol) Boc-D-Trp-OH, 33 g (0,1 mol) Lys(Z)-0Me.HCl och 13,6 ml trietylamin löstes i 400 ml DM och kyldes i ett isbad, varefter man tillsatte 22 g dicyklohexylkarbodiimid och blandningen tilläts antaga rumstemperatur över natten.

Den utskilda dicyklohexylkarbamiden avfiltrerades och filtratet koncentrerades till en ringa volym, varefter ett överskott av vatten tillsattes för bildning av ett gummiartad material. Detta material upptogs i etylacetat och tvättades med 10%-ig citron- syra i vatten, vatten, mättad NaHC03-lösning och vatten, torka- des över Na2S04 och indunstades till torrhet. Återstoden tri- turerades med eter och därefter med hexan förbildning av en kristallin fast substans, 28 g.

TLC: silikagel G, hexan/EtOAc, 1:1, volym/volym, Rf 0.3. (0) tert-butyloxikarbonyl-L-fenylalanyl-D-tryptofyl-N57-bensyl- oxikarbonyl-L-lysin (XV) A. 22 q (44 mmol) Boc-D-Trp-Lys(Z)-0Me sattes till en på förhand kyld blandning av 220 ml TFA och 25 ml anisol och omrördes 30 minuter i ett isbad. TFA avdunstades så hastigt som möjligt vid 270 på en roterande indunstare och den kvarvarande oljan triturerades flera gånger med en lösning av hexan/eter, 2:1, och dekanterades för att slutligen bilda en klisterartad pro- dukt. Utbyte 21,3 g, 36 mmol. ... __.-- _.- _ _ _ _ . _-......_._.._..,.._._............_...._,_..._.__.._ .,... 447 482 31 B. 9,6 g (36 mmol) Boc-Phe-PH, 5,3 g (39 mmol) HOBT och 8 g (39 mmol) DCC omrördes i 500 ml kall diklormetan under 20 minu- ter. 21,3 g (36 mmol) D-Trp-Lys(Z)-0Me.TFA-salt i 200 ml di- klormetan tillsattes, varefter man tillsatte 4,25 ml (39 mmol) N-metylmorfolin. Reaktionsblandningen omrördes över natten, medan den uppvärmdes till rumstemperatur. Blandningen filtrera- des för eliminering av DCC och filtratet tvättades två gånger med vatten, två gånger med 10%-ig citronsyra, två gånger med mättad NaHCO3-lösning och två gånger med vatten och torkades över Na2S04. Efter filtrering och indunstning vägde återstoden 21,4 q (82 %) och användes utan ytterligare rening. TLC: silikaqel F~254/CHClq 9: CH OH l: HAC 0,5. Rf 0,76 plus spår 3 av mindre föroreningar.

C. ¿2,9 g (3l,4 mmol) Boc-Phe-D-Trp-Lys(Z)-OMe löstes i 450 ml p~dioxan och 100 ml metanol och 39 ml lN KOH-lösning till- sattes, varefter blandningen omrördes över natten vid rums- tew»_'1tur. Lösningen indunstades på en roterande indunstare. Återstoden löstes i 500 ml varmt vatten, surgjordes till pH 3 meå fo"-iq citronsyra, omrördes 30 minuter och filtrerades.

Effzr torkning i vakuum över natten erhölls 21,6 g (96 %).

Smårtnunkt 85-900. Pdlâß = +7,09 (c 0,987 MeOH). RF 0,63 en 13, 9=cn3on, 1=HAc, 0,5. siiikaqei F-254. * (pä fert-butyloxikarbonyl-L-fenylalanyl-D~tryptofyl-NP -bensyl- oxik~rhonyl~L-lysyl-0-bensyl-L-treonyl-L-fenylalanyl-O-bensyl- -L»treonyl~0-bensyl-L-seryl-S-p-metoxibensyl-L-cysteinyl- :tensvlester (XVI) A. 40,5 q (35 mmol) Boc-Thr(Bzl)-Phe-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Cys- (SMBzl)-OBzl (XIII) sattes till en kall lösning av 400 ml TFA ocn 40 ml anisol och omrördes i kyla under 30 minuter. TFA asdunstades på en roterande indunstare och återstoden triturera- des med l liter eter/hexan (l:l) för bildning av ett vitt Pulver. Efter filtrering, tvättning med eter/hexan och torkning i vakuum över P205 och NaOH-pellets erhölls 34,6 g (82 %). smältpunkt 136-139°, mjuknar vid 12o°. talšö = -9,93 (C 1,04 MeuH;. Ry 0,63 silikagel CHCl3, 9:CH3OH, l:HAc, 0,05 ringa, mera polär förorening, Rf 0.53. 447 482 32 B. 20,0 g (27,9 mmol) Boc-Phe-D-Trp-Lys(Z), 4,15 g (30,8 mmol) HOBT och 6,3 g (30,8 mmol) DCC omrördes i 2,0 liter kall di- klormetan i ett isbad under 30 minuter. 32,6 g (27,9 mmol) H-Thr(Bzl)-Phe-Thr(Bzl)~Ser(Bzl)-Cys(SMB2l)-OBzl-TFA-salt tillsattes och därefter 3,35 ml (30,8 mmol) N-metylmorfolin, varefter omröringen fortsattes över natten, medan blandningen uppvärmdes till rumstemperatur. TLC bekräftade en väsentligen fullständig reaktion efter två timmar.

Blandninqen filtrerades och filtratet tvättades med vatten, 10%-ig citronsyra, vatten, mättad NaHCO3-lösning och vatten och torkades. Efter filtrering och indunstning visade TLC produkten och en mera polär förorening, som avlägsnades genom upplösning av den orena produkten i 200 ml varm DMF och till- sats av l liter 2%-ig NaHC03-lösning i vatten. Produkten av- filtrerades, tvättades med utspädd NaHCO3-lösning och vatten och torkades i vakuum över PZOS. Utbyte 36,5 g, 75 %. Smältpunkt lea-isf (krymper vid 1so°>. mšö = o°, c 0,988, cHc13. Rf (en enda fläck) 0,76 silikagel CHCl3, 9:CH3OH, l:HAc, 0,05. (q) Framställning av H-Phe-D-Trp-Lys(Z)-Thr(Bzl)-Phe-Thr(Bzl)- -Ser(Bzl)-Cys(SMBzl)-OBzl-trifluoracetatsalt (XVII) 32 g Boc-Phe-D-Trp-Lys(Z)-Thr(Bzl)-Phe~Thr(Bz1)-Ser(Bzl)-Cys (SMBzl)-OBzl och 33 ml anisol löstes i 50 ml diklormetan och 100 ml trifluorättíksyra tillsattes och omrördes 30 minuter vid rumstemperatur. Lösningen indunstades på en roterande indunstare vid 300. Återstoden triturerades med vattenfri eter till ett pulver, som avfiltrerades, tvättades med eter och torkades i vakuum över P2O5 och natriumhydroxidpellets.

TLC på silikagel 60 i CHCl3: CH30H: HOAC 9:l:O,5 visade en enda fläck, Rf 0,65 HNMR visade icke någon topp för t-butyl.

Poon .SIQALITY 447 482 33 (r) tert~buty1oxikarbonyl-S-p~metoxibensyl-L-cysteinyl-L- histidyl-L-histidy1-L-fenylalany1-L-fenylalanyl-D-tryptofy1- ~N<--bensyloxikarbony1-L-lysyl-0-bensyl-L-treony1-L-fenyla1a- nyl~O-bensyl-L-treony1-D-bensyl-L-seryl-S-p-metoxibensyl-L- cystein-bensylester (XVIII) 5,5 g (7,2 mmol) Boc-Cys(SMBz1)-His~His-PHEOH, 1,07 g (7,9 mmol) 1~hydroxibenstriazol-monohydrat och 1,65 g (7,9 mmol) dicyklo- hexylkarbodiimid omrördes i 100 ml torr dimetylformamid i ett isbad under 30 minuter. 12,5 g (7,2 mmol) H-Phe-D-Trp-Lys(Z)- -Thr(B21)-Phe-Thr(Bzl)-Ser(Bz1)-Cys(SMBzl)-0BZl-trifluoracetat- salt och 0,855 q (7,65 mmol) N-metylmorfolin tillsattes och hlandninqen fick antuqa rumstemperatur över natten under om- röring. Suspensionen filtrerades för eliminering av dicyklo- hexiltnrtamid och filtratet indunstades till 50 ml och utfälldes med 500 ml mättad vattenlösning av natriumvätekarbonat. Den erhållna fasta substansen avfiltrerades, tvättades med vatten och löstes äter i 200 ml DMF. Lösningen utspäddes med 1 liter 5%-fw citronsyra i vatten och filtrerades. Den fasta substansen tvättades med vatten, löstes i 200 ml DMF och utfälldes med 1 liter mättad natriumvätekarbonatlösning, filtrerades, tvättades med vatten och torkades i vakuum över P205 vid rumstemperatur.

Utbyte 15 q.

Aminosyraanalysz His (2,0) 1,66, Lys (1,0) 1,05, Phe (3,0), Ser (1,0) 1,02, Thr (2,0) 2,2. (s) L~cysteinyl~L-histidyl-L-histidyl-L-fenylalanyl-L-fenyl- alany1-D-tryptofyl~L-lysyl-L-treonyl-L-feny1alanyl-L-treony1- -L-seryl-L~cystein~cyk1isk (1-12) disulfid (XIX) 5 q Boc~Cys(SMBzl)-Hin-His-Phe-Phe-D~Trp-Lyz(Z)-Thr(Bzl)~Phe- -Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Cys(SMBz1)0BZl blandades med 10 ml anisol och behandlades med 100 ml flytande HF under utestängning av luft och i ett isbad under 60 minuter. överskottet HF avlägsna- des i vakuum och återstoden upptogs i 200 ml 10%-ig AcOH i vatten och hälldes i 7 liter avluftat vatten. pH inställdes på 7 med utspädd NH4OH och omrördes i öppna luften under 24 timmar, var Ffef pH inställdes på 5 med isättika och lösningarna för- des ,:nom en pelare av Amberlite CG 50 (H4-form). Peptid- Panna -~-~«--~~« 447 482 34 materialet som adsorberats på jonbytarhartset eluerades med 30%-íq ättiksyra i vatten och fraktionerna innehållande peptid- maßerialet sammdnkördes och lyofiliserades för bildning av 2 g av det orena materialet. Denna orena dodekíåeptid renades R'G-25 och eluera- des med 10%-iq{§cOH i vatten och fördelningskromatografering genom pelarkromatografering genom Sephadex genom Sephadextš G-25 med tvåfassystemet N-BuOH-vatten-isättika, 4:5:l, volym/volym.

TLC, silikagel, Merck A.G., klorpeptidsprej, D.E. Nitecki et al., Biochem. g ess '(1966).

Rf (BWA, 4:l:l) 0,45, Rf (BWAP, 30:24:6:20) 0,64.

Aminosyraanalys: Thr (2) 1,85, Ser (l) 0,79, Phe (3) 3, Lys (1) 1,02, His <2) 1,75, Cys, Trp N.D. êgíífifi* 'WQUALITY f: 447 482 35 gämförande farmakologiska data US patentet 4 061 608 (American Home Products Corporation), publicerat den 6 december 1977, avser Arg4~somatostatin och analoger därav. Dessa polypeptider hämmar sekretionen av tiilväxthormon och i låga doser utmärker de sig speciellt genom att sänka glukagonhalten utan att drastiskt förändra insulinkoncentrationen, varigenom de medför en betydande fördel vid behandlingen av diabetes, då bättre reglering av glukoskoncentration i blodet kan erhållas genom undvikande av insulinhämning. I jämförelse med Arg4,Glu5~SS~derivaten enligt föreliggande uppfinning är föreningarna enligt US-patentet 4 061 608 inte lika långverkande eller lika specifika vid sänkning av glukagonhalten. I spalt 5, raderna 35-45 i US 4 061 608 anges att Arg4-SS-derivatet, i jämförelse med ett blindprov, minskade glukagon från l8 till ll pg/ml vid 400 pg/kg och från 16 till 4 pg/ml vid 20 pg/kg. Produkten enligt exempel 10, som representerar Arg4,Glu5-SS-analogen till ovannämnda förening enligt US patentet 4 061 608, mins- kade glukagon från 46 till 1,5 pg/ml vid 200 pg/kg och från 55 till l2 pg/ml vid 40 pg/kg (se exempel l3). Vidare var Arg4,Glu5-SS~analogen aktiv beträffande minskning av tillväxt- hormon i minst 4 timmar vid en dos av 1000 mg/kg (subkutant), medan Arg4~SS-analogen är jämförbar med somatostatin vad beträffar aktivitetstiden om 0,25 timmar.

De föreningar som anges i "Biochemical and Biophysical Research Communications" (i det följande betecknad BBRC) §2¿ 1202 (1974) och Bßnc _6_5, 752 (1975), nämligen des-/Alaficlyzß SS och olika N~acylerade derivat, är inte långverkande då de administreras på konventionellt sätt. De kan inte jämföras med föreningarna enligt föreliggande uppfinning, eftersom de inte uppvisar någon specificitet för tillväxthormon och glukagon~ sänkning. Detta är välkänt inom detta område.

De föreningar som anges i BBRC 14, 630 (1977) är selektiva vad beträffar hämningen av tillväxthormon och glukagon, men de är 447 482 36 in+e långverkande.

Arqi, Glu5-SS-derivaten enligt föreliggande uppfinning kombi- nerar i en och samma förening de önskvärda egenskaperna att vara selektiva i sin verkan beträffande reglering av tillväxt- hormon och glukagon med långvarig verkan (upp till 4 timmar).

H

Claims (8)

447 482 37 EÉJ____'ENTÉ?AY

1. l. Förfarande för framställning av en förening med formeln I H-Cys-X1-x2~Phe~Phe-D~Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-¥4-OH (I) I S S vari X1 är His eller Arg, X2 är His eller Glu och X4 är Cys eller D~Cys, och farmaceutiskt godtagbara salter därav, k äan n e t e c k n a t därav, att man avlägsnar samtliga skyddsgrupper och polystyrenhartsbäraren, då en sådan är närvarande, från en förening med formeln II Rl-Cye-X -X.-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe~Thr~Ser-X -OR (II) I 1 ¿ I5 17 13 lg 14 su RR RRs/s vari R1 betecknar en u-aminoskyddande grupp; R betecknar en karboxiskyddande grupp eller en polystyren- hartsbärare bunden via en metylengrupp, dvs. -CH2-poly- styrenhartsbärare; är His eller Arg, vari R3 är en skyddande grupp för I? lä sidokedjekväveatomerna i arginin och R2 är väte eller en X1 skyddande grupp för imidazolkväveatomen i histidin; X är His enligt ovan eller Glu, vari R4 är en skyddande 2 |2 |4 R R grupp för sidokedjekarboxigruppen i glutaminsyra; R6 är en skyddande grupp för sidokedjeaminogruppen i lysin; R7, R8 och R9 är vardera skyddande grupper för hydroxyl~ grupperna i treonin och serin; X4 har ovan angiven betydelse; och cc och ß representerar en sulfhydrylskyddande grupp; och oxiderar den erhållna föreningen, och att man eventuellt isolerar produkten i form av den fria basen eller ett farma- ceutiskt godtagbart salt. 447 482 38

2. Förfarande enligt patentkravet l, k ä n n e t e c k n a t därav, att polystyrenhartsbäraren och/eller skyddsgrupperna avlägsnas i ett enda steg genom behandling med fluorväte i .f närvaro av anisol.

3. Förfarande enligt patentkravet l eller 2, k ä n n e - t e c k n a t därav, att oxidationen utföres med användning av syra eller kaliumjärn(III)cyanid.

4. Förfarande enkígâ något av föregående patentkrav, k ä n n e t e c k n a t därav, att R2 är tosyl, bensyloxi- karbonyl, adamantyloxikarbonyl eller tert-butyloxikarbonyl.

5. Förfarande enligt något av föregående patentkrav, k ä n n e t e c k n a t därav, att R3 är nitro, tosyl, bensyloxikarbonyl, adamantyloxikarbonyl eller tert-butyl- oxikarbonyl.

6. Förfarande enligt något av föregående patentkrav, k ä n n e t e c k n a t därav, att R4 är bensyl.

7. Förfarande enligt något av föregående patentkrav, k ä n n e t e c k n a t därav att R6 är tosyl, t-amyloxi- karbonyl, t-butyloxikarbonyl, diisopropyloxikarbonyl, bensyl- oxikarbonyl, halogenbensyloxikarbonyl eller nitrobensyloxi- karbonyl.

8. Förfarande enligt något av föregående patentkrav, k ä n n e t e c k n a t därav, att minst en av R7, RB och R9 är acetyl, bensoyl, tert-butyl eller bensyl.