DE2315826A1

DE2315826A1 - Psychopharmakologisch aktive peptide und peptidderivate

Info

Publication number: DE2315826A1
Application number: DE2315826A
Authority: DE
Inventors: Hendrik Marie Greven
Original assignee: Akzo NV
Current assignee: Akzo NV
Priority date: 1972-03-31
Filing date: 1973-03-29
Publication date: 1973-10-11
Also published as: DK145665B; BE797612A; ZA731921B; NL175174B; JPS4913168A; GB1429195A; SE392613B; CA1025440A; AU5357873A; DE2315826C2; NL175174C; JPS5747666B2; CH591429A5; FR2182918A1; US3842064A; DK145665C; FR2182918B1; HU169158B; NL7204422A

Description

Psychopharmakologisch aktive Peptide und Peptidderivate

Aus European Journal of Pharmacology 2, 14 (1967) ist es bekannt, daß bestimmte Peptidfragmente von natürlichen adrenocorticotropen Hormonen (ACTPI) die Auslöschung der erworbenen Ausweichreaktion (conditioned avoidance response) verhindern. Besonders das Peptid mit der Aminosäuresequenz 1-10 des ACTH erwies sich in dieser Beziehung als wirksam. Darüberhinaus hat es sich gezeigt, daß die erster, drei Aminosäuren (Ser-Tyr-Ser) sogar vollständig weggelassen werden konnten ohne eine wesentliche Einbuße an Aktivität. Der Artikel endet mit der Schlußfolgerung, daß ein Peptid mit der Aminosäuresequenz 4-10 des ACTH, nämlich H-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-OH, das kürzeste Peptid ist und möglicherweise die Schlüsselsequenz für die genannte Aktivität.

Das Peptid mit der Aminosäuresequenz 4-10 des ACTH zeigt jedoch nicht nur die oben erwähnte psychopharmalcologisehe Aktivität, sondern auch eine leichte MSH-Aktivität, wie sie bei derartigen Fragmenten von ACTH üblich ist. Obwohl die

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Wirkung einer geringen Dosis eines MSH-aktiven Peptids bei Menschen noch nicht bekannt ist, wurden Untersuchungen angestellt, um Peptide zu finden, die die gleiche psychopharmakologische Aktivität besitzen, aber keine oder wenigstens eine verminderte MSH-Aktivität.

In einem älteren Vorschlag (deutsche Patentanmeldung P 2J 08 362.7) wurde bereits beschrieben, daß die Aminosäure L-Met mit endständigem N des ursprünglichen 4-10 ACTH-Peptids, ohne daß ein Verlust der Aktivität auftritt, ersetzt werden kann durch D-Met, L- oder D-Met(—* 0), L- oder D-Met(—> O₂), Desamino-Met, Desamino-Met(—> 0), Desamino-Met(—> Op) oder die Gruppe H^N-B-CO-, in der B eine verzweigte oder nicht verzweigte Alkylengruppe mit 1-6 Kohlenstoffatomen, wie eine Glycyl-, Valyl-, Alanyl-, ß-Alanyl- oder oC-Methylalanylgruppe bedeutet.

Außerdem ist in einem älteren Vorschlag (deutsche Patentanmeldung ρ 23 11 099.8 ) angegeben, daß ein Ersatz des Peptidrestes -L-Trp-Gly-OH mit endständigem C-Atom des ursprünglichen 4-10 ACTH-Peptids durch die Gruppe L-Phe-OH, L-Phe-Gly-OH oder die Gruppe -NH- Alk-<g^^R( ϊΓ-Phenyl alkyl amino) zu einer wesentlichen Zunahme der psychopharmakologischen Aktivität führt. ·

Überraschenderweise hat es sich nun gezeigt,, daß eine weitere Zunahme der psychopharmakologischen Aktivität erzielt werden kann durch Ersatz der Aminosäure L-Arginin oder L-Lysin des ursprünglichen 4-10 .ACTH-Peptids oder eines der nach den oben angegebenen älteren Vorschlägen modifizierten Peptide durch die entsprechende D-Aminosäure. .

Die Erfindung betrifft daher Peptide und Peptidderivate der allgemeinen Formel

A-L-Glu(X)-L-His-L-Phe-p-Arg(oder D-Lys)-Y, (i) in der A: H-L-Met, H-D-Met, H-L-Met(—■} 0), H-D-Met(—} 0),

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-L-Met(—> O₂) , H-D-Met(--* O₂) , Desamino-Met, Desamino-Met(—> 0), Desamino-Met(—> 0_?) oder die Gruppe HgN-B-GO-, wobei B eine verzweigte oder nicht verzweigte Alkylengruppe mit 1-6 Kohlenstoffatomen ist,

Y" eine Hydroxylgruppe, die Gruppe L-Trp-OH, L-Phe-OH, L-^rJ}rp-Gly-OH, L-Phe-Gly-OH, eine (IT-Phenylalkyl)-aminogruppe der Formel -NH-AIk-^lI//' / in der Alk eine verzweigte oder nicht verzweigte Alkylengruppe mit 1-6 Kohlenstoffatomen und R ein Wasserstoff- oder Halogenatom, eine Hydroxy- oder niedere Alkyl- oder Alkoxygruppe ist oder eine (N-ß-Indolylalkyl)aminogruppe, wobei die Alkylgruppe 1-6 Kohlenstoff atome enthält ₍und

X eine Hydroxy- oder Aminogruppe bedeuten sowie deren funktioneile Derivate.

Durch Ersatz des Aminosäurerestes L-Arg oder L-Lys des ursprünglichen 4-10 AGTH-Peptids durch den entsprechenden D-Arg-oder D-Lys-Aminosäurerest, erhöht sich die beobachtete

,im allgemeinen, psychopharmakologische Aktivität/um den j?'aktor 10,

Diese Modifikation (L-Lys oder L-Arg in D-Lys oder D-Arg) führt bei den in den oben angegebenen älteren Vorschlägen erwähnten Peptiden zu einer weiteren Zunahme der Aktivität. «"

Besonders bevorzugt sind Peptide der allgemeinen Formel bei denen Y L-Phe-OH, L-Phe-Gly-OH, eine (H-ß-Indolylalkyl)amino-oder (N-Phenylalkyl)aminogruppe wie oben definiert, bedeutet und A die oben angegebene Bedeutung haben kann, aber vorzugsweise L-Met, L-Met(—> 0), L-Met(—>0₂), Desamino-Met, Desamino-Met(—} 0), Desamino-Met(—> O₂) oder ß-Ala bedeuten soll.

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Besonders hat es sich gezeigt, daß die folgenden Peptide eine sehr hohe psychopharmakologische Aktivität "besitzen:

H-L-Met-L-Glu-L-His-L-Phe-D-Arg(oder D-Lys)-L-Phe-OH und das entsprechende Sulfoxid oder Sulfon

H-L-Met-L-Glu-L-His-L-Phe-D-Arg(oder D-Lys)-L-Phe-Gly-OH und das entsprechende Sulfoxid oder Sulfon

H-L-Met-L-Glu-L-His-L-Phe-D-Arg(oder D-Lys)-Ira (Tra = Tryptamid), und das Sulfoxid oder Sulfon, .

Desamino-Met-L-Glu-L-His-L-Phe-D-Arg( oder D-Lys)-L-Phe-ÖH oder das entsprechende Sulfoxid oder Sulfon,

H-ß-Ala-L-Glu-L-His-L-Phe-D-ArgCoder D-Lys)-L-Phe-OH,

Desamino-Met-L-Glu-L-His-L-Phe-D-Lys( oder D-Arg)-Tra oder das entsprechende Sulfoxid oder Sulfon.

* < ■ ■

Aus synthetisch-chemischen Überlegungen sind die erfindungsgemäßen D-Lys-Peptide bevorzugt gegenüber den entsprechenden D-Arg-Peptiden. Im allgemeinen sind die lysinhaltigen Peptide leichter zu synthetisieren als die argininhaltigen Peptide.

Die erfindungsgemäßen Peptide und Peptidderivate werden hergestellt nach einem Verfahren, wie es üblicherweise in der Peptidchemie angewandt wird. Die Verfahren, wie sie üblicher-, weise zur Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen angewandt werden, können folgendermaßen zusammengefaßt werden:

1. Kondensation einer Verbindung (Aminosäure, Peptid) mit einer freien Carboxylgruppe und geschützten weiteren reaktionsfähigen Gruppen mit einer Verbindung (Aminosäure, Peptid oder Amin) mit einer freien Aminogruppe und geschützten anderen reaktionsfähigen Gruppen in Gegenwart eines Kondensationsmittels ;

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2. Kondensation einer Verbindung (Aminosäure, Peptid) mit einer aktivierten Carboxylgruppe und gegebenenfalls geschützten anderen reaktionsfähigen Gruppen mit einer Verbindung (Aminosäure, Peptid, Amin) mit einer freien NHp-Gruppe und gegebenenfalls geschützten anderen reaktionsfähigen Gruppen;

3. Kondensation einer Verbindung (Aminosäure, Peptid) mit einer freien Carboxylgruppe und gegebenenfalls geschützten anderen realcfcionsfähigen Gruppen mit einer Verbindung (Aminosäure, Peptid, Amin) mit einer aktivierten Aminogruppe und gegebenenfalls geschützten anderen reaktionsfähigen Gruppen,

woraufhin die Schutzgruppen, wenn nötig, entfernt v/erden.

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Die Aktivierung der Carboxylgruppe kann erreicht werden, \- z.U. durch Umwandlung der Carboxylgruppe in eine Säurehalo- , f;onid~, Azidy Anhydrid- oder Imidazolidgruppe oder eine ak- .. tivierte Estergruppe, wie die N-Hydroxysucciniiaidestergruppo und die p-Nitrophenylestergruppe. · .

Die Aminogruppe kann aktiviert werden durch Umwandlung in ein Phosphitamid oder nach der "Phosphor—azo "-Methode.

Die üblichen Verfahren für die oben angegebenen Eondenüationsreaktionen sind: Das Carbodiimidverfahren, das Azidverfahren, das gemischte Anhydridverfahren und das Verfahrender aktivierten Ester (E. Schröder und K. Lübke in "The Peptides", Bd. I, 1965 (Academic Press)). Ferner kann Herrifield¹s "Feste Phasenmethode" (J. Am. Chem. Soc. 85, 2149 (1963)) zur Herstellung der erfindungs gemäß en Peptide und Peptidderivate angexvandt werden. ■

Die reaktionsfähigen Gruppen, die nicht an der Kondensations reaktion teilnehmen sollen, werden wirksam geschützt durch die sogenannten S chut ζ gruppen, die leicht wieder entfernt werden können, z.B. durch Hydrolyse oder- Reduktion! So kann z. B. eine Carboxylgruppe wirksam geschützt werden durch Veresterung mit Methanol, Äthanol, tert.^-Butänol, Benzylalkohol oder p-iTitrobenzylalkohol oder durch Umwandlung in ein Amid. Diese zuletzt genannte Schutzgruppe kann jedoch nur seiifc? schwer entfernt werden, so daß es empfehlenswert ist, diese Gruppe nur zu verwenden, um die Carboxylgruppe der Amino säure mit endständigem C-Atom in dem letzten Peptid/zu schützen. Xn diesem Falle führt die Peptidsynthese direkt zu dem Amid des l'optids der allgemeinen Formel I.

Gruppen, die zum wirksamen Schutz einer Aminogruppe ge-'"iJ-Cnct sind, sind üblicherweise Säuregruppen z.B. eine Säuregruppe, die abgeleitet ist von einer aliphatischen, aromati-

°der die ^-Carboxylgruppe von Glutaminsäure

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■gehen, araliphatischen oder heterocyclischen Carbonsäure, wie dor Essigsäure,Benzoesäure, Pyridincarbonsäure oder eine Säuregruppe, die abgeleitet ist von Kohlensäure_/ wie eine Athoxycarbonyl·? Benzyloxycarbonyl-, tert. -Butylοxycarbonyl- oder p-Kothyloxybenzyloxycarbonylgruppe oder eine Säuregruppe, die abgeleitet ist von einer Sulfonsäure wie die p-Benzolsulfonyl- oder p-Toluolsulfonylgruppe. Ss können jedoch auch, andere Gruppen.angewandt v/erden wie substituierte oder unsubstituierte Aryl- oder Aralkylgruppen, z.B. Benzyl- und Triphenylmethylgruppen oder Gruppen wie die ortho-Nitro-phenylsulfenyl- oder 2-Benzoyl-l-methylvinylgruppe. ..

Es ist sehr zu empfehlen, auch die Guanidingruppe des Arginine, die £-Aminogruppe des Lysins und die Iinidazolgruppe des Histidine zu schützen, obwohl dieser Schutz nicht unbedingt notwendig ist. Günstige Schutzgruppen in diesem Zusammenhang sind eine tert.-Butyloxycarbonyl- oder eine Toaylgruppe für die £-Aminogruppe des Lysins, eine Nitrogruppe für die Guanidingruppe des Arginins und. eine Benzyl—, Dinitrophenyl— oder eine Tritylgruppe für die Imidazolgruppe des Histidins.

Die Schutz gruppen können nach verschiedenen üblichen Verfahren abgespalten werden, je nach der Art der betreffenden Gruppe, z.B. mit Trifluoressigsäure oder durch milde Reduktion, z.B. mit Wasserstoff und einemKatalysator wie *" Palladium oder mit HBr in Eisessig.

Erfindungsgemäße Peptide, die als Gruppe mit endständigen Stickstoff eine Methionylsulfoxid- oder Besaminomethionylnulfoxidgruppe besitzen, können hergestellt werden aus dem entsprechenden Met- oder Desamino-Met-Peptid mit Hilfe eines an aich bokannten milden Oxidationsverfahrens, z.B. mit verdünntem Wasserstoffperoxid oder einer Persäure. Eine derartige

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Oxidation führt zu einem Gemisch des S- und R-Sulfoxids (= 1- oder d-Sulfoxid), das auf übliche Weise in die.einzelnen Diastereomere gespalten werden kann.

Bei Kupplung von S-^ oder E-SuIf oxid' (l- oder d-Sulfoxid) von Methionin oder Desaminomethionin mit dem Peptid H-GIu(X)-His-Phe-D-Arg(oder D-Lys)X, wobei X und Y die oben angegebene Bedeutung haben, können auch die einzelnen Enantiomere direkt erhalten werden.

Die erfindungsgemäßen Peptide, die als Rest mit endständigem Stickstoff eine Methionylsulfon (Met—* Op) oder Desaminomethionylsulfon (Desamino-Met-—? Oo)-Gruppe besitzen, können am bequemsten hergestellt werden durch eine an sich bekannte-Oxidation des entsprechenden Met- oder Desamino-Met-Peptids, z.B. mit HpOp oder einer Persäure.

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Unter funktionellen Derivaten der erfindungsgemäßen Peptide und Peptidderivate sind zu verstehen:

1. Pharmazeutisch geeignete Säureadditionssalze der Peptide und Peptidderivate;

2. Peptide oder Peptidderivate, "bei denen eine oder mehrere freie Aminogruppen substituiert sind durch eine Acylgruppe, die abgeleitet ist von einer aliphatischen Carbonsäure mit 1-6 Kohlenstoffatomen wie eine Acetylgruppe;·

3. unsubstituierte Amide oder mit Alkylgruppen mit 1-6 Kohlenstoffatomen substituierte Amide der erfindungsgeraäßen Peptide und Peptidderivate die eine freie Carboxylgruppe besitzen, wie eine N(CH^)₂ oder N(C₂H,-)₂-G-ruppe;

4· Ester der erfindungsgemäßen Peptide, die abgeleitet sind von aliphatischen oder araliphatischen Alkoholen mit 1-18 Kohlenstoffatomen, besonders niederen aliphatischen Alkoholen mit 1-6 C-Atomen, wie Methanol, Äthanol, Butanol, Pentanbl, oder Cyclohexanol, und niedere araliphatische Alkoholen mit 7-10 C-Atomen, wie Benzylalkohol, Phcnyläthy!alkohol, Phenylpropy!alkohol oder Cinnamylalkohol;

5· Metallkomplexe, die gebildet worden sind, indem man die Peptide oder Peptidderivate zusammenbringt mit einem wenig löslichen Salz, Hydroxid oder Oxid eines Metalls, vorzugsweise von Zink oder Zubereitungen, die hergestellt worden sind durch Zusammenbringen der erfindungsgemäßen Peptide mit organischen, meist polyneren Substanzen wie Gelantine, Polyphloretinphosphat oder Polyglutaminsäure, um eine verlangerte Wirksamkeit zu erreichen·

Die Säureadditionssalze werden erhalten durch Umsetzung der erfindungsgemäßen Verbindungen mit einer pharmazeutisch geeigneten organischen oder anorganischen Säure wie HCl Phosphorsäure, Essigsäure, Maleinsäure, Weinsäure oder Citronensäure.

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Wie oben schon kurz gesagt, besitzen die erfindiuigsgemäß en Peptid-Derivate und deren funktioneile Derivate wertvolle psychopharmakologische Aktivitäten. Die erfindungsgemäß .en Verbindungen hemmen die Auslöschung der erworbenen Ausweichreaktion. Das bedeutet, daß sie allgemein als anti-depressive Mittel angewandt werden können. Besonders -können sie angewandt werden zur Behandlung bestimmter Geistesstörungen, wobei eine Stimulation der geistigen Reaktion (mental perfomance) erwünscht ist, wie bei bestimmten Arten von Feurose und bei Altersschwäche (Senilität).

Die erfindungsgemäßen Peptide und die oben angegebenen Derivate können oral, parenteral, sublingual, rektal oder intranasal verabreicht werden. Vorzugsweise werden die Peptide zur parenteralen Verabreichung zubereitet, wofür sie in einer geeigneten Flüssigkeit gelöst, suspendiert oder emulgiert werden. Aber im Gemisch mit geeigneten Hilfsmitteln und/oder Füllstoffen können sie auch in einer Form hergestellt werden, die zur oralen, sublingualen, rektalen oder intranasalen Verabreichung geeignet ist.

Die erfindungsgemäßen Peptide oder Peptidderivate werden vorzugsweise parenteral in einer täglichen Dosis von 0,01 bis $0 yUg/kg Körpergewicht verabreicht, je nach der Aktivität des Peptids. Für die orale, sublinguale, rektale oder intranasale Verabreichung kann die tägliche Dosis wesentlich höher liegen, vorzugsweise 0,1 bis 50.mg/kg Körpergewicht.

Besonders günstige Zubereitungen werden erhalten, wenn die erfindungsgemässen Peptide in einer Form zubereitet werden, in der sie eine längere Wirksamkeit besitzen, z.B. eingebaut in Gelantine, Polypholoretinphosphat oder vorzugsweise in Form von Metallkomplexen. Diese Metallkomplexe können erhalten

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werden, indem man die Peptide mit schwer löslichen Metallsalzen, Metallhydroxiden oder Metalloxiden zusammen!)ringt. Als schwerlösliche Metallsalze werden üblicherweise die Metallphosphate, Metallpyrophosphate und Metallpolyphosphate verwendet.

Metalle, die für dieses Verfahren angewandt werden können, sind die Metalle, die zu den b-Gruppen des Periodensystems gehören, z.B. Kobalt, Nickel, Kupfer, Eisen und vorzugsweise Zink sowie die Metalle, die zu den Hauptgruppen des Periodensystems gehören und Komplexe bilden können, wie Magnesium " und Aluminium.

Die Herstellung dieser Metallkomplexe findet auf die übliche Weise statt. Sie können z.B. erhalten werden durch Zugabe des Peptids und eines schwerlöslichen Metallsalzes, Metall-hydroxids oder Metalloxids zu einem wässrigen Medium. Sie können auch erhalten werden durch Zugabe eines alkalischen Mediums zu einer wässrigen Lösung des Peptids und eines unlöslichen Metallsalzes, wobei ein unlöslicher Peptid-Metallhydroxid-Komplex entsteht. Außerdem können die Metallkomplexe erhalten werden durch Zugabe des Peptids, eines löslichen Metallsalzes und eines löslichen Salzes zu einem wässrigen, vorzugsweise alkalischen Medium, wobei man den unlöslichen Peptid-Metallsalz-Komplex in situ erhält.

Die Metallkomplexe können sofort als Suspensionen verwendet oder z.B. lyophilisiert und anschließend wieder suspendiert werden.

Biologische Wirksamkeit

a) Auslöschung der erworbenen Ausweichreaktion. Männliche weiße Ratten, mit einem Gewicht von ungefähr 150 g, wurden mit Hilfe des sogenannten Pol-Springtests

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konditioniert. Der konditionierte Stimulus war ein 5 Sekunden langes Licht über dem Käfig,, auf das der nicht konditionierte (unconditioned) Stimulus eines Schocks durch den Gitterboden des Käfigs folgte. An drei aufeinanderfolgenden Tagen wurden 10 Versuche pro Tag durchgeführt mit einem mittleren Abstand von 60 Sekunden. Am Tage nach dieser Lernperiode wurde die Auslöschung in Untersuchungen von 10 Einzelversuchen untersucht. Alle die Tiere, die bei dem ersten Auslöschungsversuch 8 oder mehrmals reagierten, wurden mit der zu untersuchenden Substanz oder einem Placebo behandelt. Anschließend wurden Auslöschungsuntersuchungen von jeweils 10 Einzelversuchen 2 und 4- Stunden nach der Behandlung der Tiere mit der zu untersuchenden Substanz durchgeführt.

In der folgenden Tabelle sind die Ergebnisse mit dem bekannten Peptid 4-10 ACTH verglichen mit einigen erfindungsgemäßen Peptiden.

Tabelle

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Peptid

Dosis 1. Un- 2. Un- *>· Un- errechnetes in /Ug tersu- tersu- tersu- Verhältnis
pro⁷Tier chung chung chung der Wirksams. c. Oh nach nach keit

2 h 4 h (4-10 ACTH=I)

H-Met-Glu-His-Phe-Arg- Trp-Gly-OH (4-10 ACTH)	100 30	1	8 9	8 7	7	1
-	10	0,1	9	6	3	>3
H-Met-Glu-His-Phe-D-Lys- OH	10 3	0,1 0,01 9841/1	9 9	8 7	6	>3
H-Met-Glu-His-Phe-D-Arg- OH	10 3	9 9	7 6	6 4	.>10
H-Met-Glu-His-Phe-D-Lys- Trp-OH	10	10 9	9 7	9 7	300
H-Met-Glu-His-Phe-D-Lys- Phe-OH	0,3	8 9	8 8	9 5	500
H-Met-Glu-His-Phe-D-Lys- Tra	0,3 0,1	9 9	9 8	OO O-	300
H-Met-Glu-His-Phe-D-Lys- Phe-Gly-OH	0,3 0,1	9 9	8 8	8 4	>1000
H-Met(—} O)-Glu-His-Phe- D-Lys-Phe-OH	0,03 7	9 9	8 7	8 5	500
H-ß-Ala-Glu-His-Phe-D-Lys-O,3 Phe-OH ₀ _Λ	8 9	9 8	8 7	100
H-Met-Glu-His-Phe-D-Lys- L-Amf	9 "9	9 8	7 4	1000
H-Met(—> O~)-Glu-His-Phe- D-Lys-Phe-OH	10 9	9 7	7 5	1000 - 14 -
Desamino-Met-Glu-His-Phe- D_Lys-Phe-OH 30!	8 10 9 164	8 10 6	8 7 2

-■14 - 2315821 42 756

Fortsetzung; Tabelle

*) Dosis 1. Un- 2. Un- 3. Un- errechnetes Peptid in /Ug tersu- tersu- tersu- Verhältnis

pro Tier chung chung chung der Wirksams. c. Oh nach nach keit

2 h 4 η (4-10 ACTH=I)

Desamino-Met(—» Op)-GIu- 0,03 9 9 8

His-Phe-D-Lys-Phe-OH o,O1 9 7 5

0,003 8 6 3 >1000

Für die Beschreibung, die Beispiele und die Ansprüche gilt folgendes:

I. Wenn keine optische Konfiguration erwähnt ist, ist die L-Form gemeint.

II. Die folgenden Abkürzungen werden für die Schutzgruppen oder Aktivierungsgruppen verwendet.

Z	Benzyloxyc arb onyl
Boc	= t ert. -Butyl oxyc arb onyl
tBu	= tert.-Butyl
Me	Methyl
ONP	p-Nitro-phenyloxy
Su	= Succinimido

III. Für die Lösungsmittel und Eeagenzien werden die folgenden Abkürzungen verwendet.

Bz = Benzol 3098^1/1184

— Ί y —

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Et Ott	Äthanol
Bu	Butanol
Py	Pyridin
Ac oder
HAc	Essigsäure
Wa	Wasser
Am	Amylalkohol
iPro	Isopropanol
DMF	DImethy1fοrmamid
THF	Tetrahydrofuran
DCCI	Dicyclohexylcarbodiimid
DCHU	Dicyclohexylharnstoff
TAA	Triäthylamin
TlA	Trifluoressigsäure
To	Toluol
Fo	Ameisensäure

IV. Für die Äminosäurereste werden die folgenden Abkürzungen angewandt:

Met	Methionyl
Met(—->0)	= Methionylsulfoxid (Eacemat)
Met(d—> O)	= Methionyl(d)sulfoxid
Met(l—-> O)	= Methionyl(l)sulfoxid
Met(—} O₂)	= Methionylsulfon
GIu(X)	= Glutamyl (X = OH) = GIu
GIu-(X)	= Glutaminyl (X = NH₂) = GIn
His	= Histidyl
Phe	= Phenyl al anyl
Arg	= Arginyl
Lys	= Lysyl
GIy	= Glycyl
VaI	= Valyl
AIa	= Alanyl
ß-Ala	= ß-Alanyl
( oC -Me)AIa	<k -Methyl al anyl

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= Abkürzungen für andere Reste.

Amf = (N-I-Phenylisopropyl)aminogruppe

(abgeleitet von Amfetamin) Tra = (N-ß-Indolyläthyl)aminogruppe

(abgeleitet von Tryptamin) PEA = (N-Phenyläthyl)amino grupp e PPA = (N-Phenylpropyl)aminogruppe HPEA = (N-p -Hydroxy-phenyläthyl)aminogruppe Desamino-Met= Desamino-methionyl (oder Methylthiobutyryl)

Desamino- = Desamino-methionyl-sulfoxid Met(—y 0) ■ .

Desamino-Met

(—> Op) = Desamino-methionyl-suif on.

■ ■ - 17 -309841/116 4

Herstellung der Ausgangs sub stanz en

A. Herstellung von Boo-Met-Glu(OtBu)-HJs-NgH-

1) Boo-Met-Glu(OtBu)-His-OMe

10,52 g Boc-Met-N^H, in 75 cm⁵ DMF wurden auf O⁰C abgekühlt und anschließend 23,6 cm 3,4 η HGl in THP zugegeben und bei -20⁰C 5,85 cm⁵ (43,3 mMol) Isoamylnitrit. Das Gemisch wurde 7 min bei -20⁰C gerührt und dann zu einer Lösung von 17,05 g H-GIu(OtBu)-HiS-OMe.2 HCl in -50 cm³ Dimethylformamid gegeben. Dann x^rurde ausreichend Triäthylainin zugegeben, um den entstehenden pH-VJert des Gemisches auf 6,9 einzustellen. Das Gemisch wurde 3 Tage bei O⁰G gerührt. Das entstehende Triäthylamin.HCl wurde dann abfiltriert und das Filtrat zur Trockene eingedampft. Der Hückstand wurde in 150 cm Äthylacetat/Wasser gelöst. Die wässrige Schicht wurde abgetrennt und die Äthylacetatschicht zwei mal mit Wasser gewaschen. Dann wurden die wässrigen Schichten zusarnmengegeben und erneut mit Äthylacetat •ζ

( 2 χ 25 cm ) extrahiert. Die Athylacetatschichten wurden getrocknet und anschließend die Lösung auf etwa -100 cm eingedampft und bei O⁰C weggestellt.
Fp: 138 - 142⁰C.
Rf in Bu:Ac:Wa (4:1:1) = 0,59 auf SiO₂.

2) Boc-Met-Glu(OtBu)-HiS-NpH,

3,7 g des oben beschriebenen Methylesters wurden in 70 cm³ Methanol gelöst und anschließend 3,7 cnr Hydrazinhydrat zugegeben. Das Gemisch wurde 5 h bei Raumtemperatur gerührt. Die Lösung wurde zur Trockene eingedampft und mit Wasser gerührt und getrocknet.
Rf in Am:iPro:Wa (10:4:5) = 0,39 auf

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B. Herstellung von Boc-D-Met-

1) Boc-D-Met-Glu(OtBu)-HiS-OMe

10,52 g Boo-D-Met-NpH, in 75 cm³ DMi¹ wurden auf 0⁰C

3
abgekühlt und anschließend 23,6 cm 3,4 η Salzsäure in THF zugegeben und bei -20⁰G 5,85 cnr Isoamylnitrit. Das Gemisch wurde 7 min gerührt und anschließend 17,05 g H-G-Iu(OtBu)-His-OMe.2 HGl in 50 cm⁵ DMF zugegeben und der pH-Wert mit Triethylamin" auf 6,9 eingestellt. Das Gemisch-wurde 3 Tage bei O⁰C gerührt und filtriert und' das JTiltrat im Vakuum zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wurde in 150 cur Äthyl acetat/v/asser aufgenommen und mit Wasser gewaschen. Die

3 organische Phase wurde getrocknet und anschließend auf 100 cm eingedampft und bei O⁰G weggestellt.Die erhaltenen Kristalle wurden getrocknet.

Rf in Bu:Ac:Wa (4:1:1) = 0,63 auf SiO₂. ' '

Fp: 69 - 71⁰C.

2) Boc-D-Met-Glu(OtBu)-HiS-H₂H₃ .

3,2 g (5,45 mMol) des oben angegebenen Methylesters

3 3

wurden in 60 cm Methanol gelöst und anschließend 3,7 cm Hydrazinhydrat zugegeben. Das Gemisch wurde 5 h bei Raumtemperatur gerührt, anschließend das Methanol im Vakuum abdestilliert und der Rückstand mit Wasser gerührt. Nach dem Trocknen wurde das Hydrazid sofort weiterverarbeitet. _r Rf in Am:iPro:Wa (10:4:5) = 0,37 (SiO₂).

C. Herstellung von

1) Boc-Val-Glu(0tBu)-His-0Me

Boc-Val-OE . , 3,26 g (15 mMol)/wurden in 20 cnr Methylenchlorid

gelöst und anschließend 1,73 g N-Hydroxysuecinimid zugegeben. Das Gemisch wurde auf -20⁰C abgekühlt und anschließend 3,09 g DCCI in 20 cm gekühltem Methylenchlorid zugegeben und die

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entstehende Lösung 1 h hei -20⁰C und dann 20 h bei +2O⁰C gerührt.

Das entstehende DCHU wurde filtriert und anschließend das Filtrat zur Trockene eingedampft und der Rückstand in 30 cm DMF gelöst. Dann wurden 7,33 g Z-GIu(OtBu)-HiS-OMe (Kappler HeIv. 44, 1991, 1961) und 1,4 g 10$ Palladium auf Kohle zugegeben. Dann wurde Sauerstoff 5 h durch die Lösung durchgeleitet und anschließend die Lösung 1 Nacht gerührt, filtriert und das Filtrat zur Trockene eirigedampft.

Der Hückstand wurde in wässrigem Äthylacetat gelöst und mit Wasser, Natriumbicarbonat und V/asser gewaschen. Die organische Phase wurde getrocknet und anschließend das Äthylacetat im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wurde aus Äthylacetat/Petroläther umkristallisiert.

Ausbeute: 3,95 g; Fp: 117 - 119⁰O.

Rf in Bz:EtOH (8:2) - 0,55 (SiO₂).

2) BoC-VaI-GIu(OtBu)-HiS-N₂H₃ '

3,73 g des oben erwähnten Methylesters wurden in 85 cm' Methanol gelöst und anschließend 3,72 g Hydrazinhydrat zugegeben. Das Gemisch wurde 7 h bei Raumtemperatur gerührt, anschließend die Lösung zur Trockene eingedampft und der Rückstand mit Äther verrieben.
Rf in Am:iPro:Wa (10:4:5) = 0,33 auf

D. Herstellung von

1) Boc-ß-Ala-Glu(OtBu)-His-OMe

3,78 g ßoc-ß-Ala-OH wurden in Methylenchlorid gelöst. Die Lösung wurde auf O⁰C abgekühlt und anschließend 2,3 g N-Hydroxysuccinimid zugegeben. Das Gemisch wurde weiter auf

- - 18 309 8 4 17 1 164

2315829^{42 756}

-22⁰C abgekühlt und anschließend 4,12 g DCGI zugegeben. Das Gemisch wurde 30 min bei -22⁰C, 3 h bei O⁰C und 12 h bei Raumtemperatur gerührt. Der entstehende Niederschlag (DCHU) wurde abfiltriert, das FiItrat zur Trockene eingedampft und der Huckstand in Dimethylformamid aufgenommen. Zu diesem Gemisch wurden 9,77 g Z-GIu(OtBu)-KiS-^-OMe zugegeben und ebenso 1., 5 g Palladium (10/0) auf Kohle als Katalysator. Dann wurde Wasserstoffgas 6 h durch das Gemisch geleitet und das Gemisch anschließend 12h gerührt* Der Katalysator wurde abfiltriert und das FiItrat.zur Trockene eingedampft. Der .Rückstand wurde in Äthylacetat aufgenommen und die Lösung nacheinander mit Natriumbicarhonatlösung (57°) und Wasser gewaschen. Die .Äthylacetatphase wurde getrocknet und anschließend die Lösung zur Trockene eingedampft und der Rückstand aus Äthylacetat/Petroläther (1:1) umkristallisiert.
Fp: 93-95°C. .
Rf in Bz:ETtOH (8:2) = 0,25 auf SiO₂-

2) Boo-ß-Ala-Glu(OtBu)-HiS-N₂H₃

3 g des unter 1) erhaltenen Methylesters wurden in

3 3

60 cm Methanol gelöst und-anschließend 3 cm Ilydrazinhydrat zugegeben. Das Gemisch wurde 6,5 h bei Raumtemperatur gerührt, anschließend die Lösung zur Trockene eingedampft und der Rückstand mit trockenem Äther verrieben. Die Substanz wurde unmittelbar für weitere Umsetzungen verwendet. Rf inAm:iPro:V/a (10:4:5) = 0,42 auf SiO₂.

E. Herstellung von BOc-GIy-GIu(OtBu)-HiS-N ₀Hv

¹ ' '■ C.—J :

1) BOC-GIy-GIu(OtBu)-HiS-OMe

Auf die gleiche Weise wie unter C.1) beschrieben wurde Boc-Gly-Glu(OtBu)-His-OMe hergestellt durch Umsetzung von Boc-Gly-OH mit H-GIu(OtBu)-HiS-OMe.
Fp: 103-10e°C. Rf in Bz:EtOH (8:2) = 0,43 auf SiOg.

309841/1164 - 19 -

2315828

2) BoC-GIy-GIu(OtBu)-HiS-K₉H,

Durch Umsetzung dieser Substanz mit Hydrazinhydrat, wie unter A.2) beschrieben, wurde BoC-GIy-GIu(OtBu)-HiS-N₂H, hergestellt.
Rf in Am:iPro:Wa (10:4:5) = 0,32 auf

¹. Auf die gleiche Weise wie unter C. und D. beschrieben wurden hergestellt:

1) BoC-AIa-GIu(OtBu)-HiS-N₂H₃;

Rf = 0,33 (Am:iPro:Wa = 10:4:5)

2) Boc-(öC-Me)AIa-GIu(OtBu)-HiS-N₂H₃; Rf = 0,31 (Am:iPro:Wa = 10:4:5)

3) Desamino-Met-Glu(OtBu)-HiS-N₂H₃; Rf = 0,52 (Ber.:Ac:Va = 4:1:1).

G. Herstellung von Boc-Met-Gln-His-NpH^

Auf die gleiche Weise wie unter C.1) beschrieben wurde das Aminosäurederivat Boc-Met-OH an H-GIn-His-OMe gekuppelt, das aus dem entsprechenden Z-geschützten Peptid (HeIv. 44, 476, 1961) durch Hydrierung mit 10 % Palladium auf Kohle erhalten worden war. Man erhielt den geschützten Peptidester Boc-Met-Gln-His-OMe, der nach dem unter C.2) beschriebenen Verfahren unmittelbar in das entsprechende Hydrazid umgewandelt wurde. Rf in Am:iPro:Wa (10:4:5) = 0,28 auf SiO₂.

H. Synthese von H-Phe-D-Arg-OH

1) Z-Phe-D-Arg(NO₂)-OMe

Eine Lösung von 12,8 g H-D-Arg(N0₂)-0Me.HCl in 200 cm^ DMF wurde auf + 5°C abgekühlt und anschließend 4,8 g TAA zugegeben.

309841/116^ -22-

■-22- 2315525 42756

Das entstehende Triäthylamin.HCl wurde abfiltriert und anschließend 20 g Z-Phe-ONP zugegeben. Das Gemisch wurde 4- Tage bei Raumtemperatur gerührt, anschließend ein Teil des DMF abdestilliert und der Rückstand mit 400 cm-' Äthylacetat/Wasser verdünnt. Die organische Phase wurde mit Zitronensäure,. Ατητηο-niumhydroxid und Wasser gewaschen und anschließend die Äthyl-acetatschicht getrocknet und eingedampft. Nach dem Umkristallisieren aus Ithylacetat/Petroläther Ep 89-93°C. Rf in Bz:EtOH (8:2)= 0,62 (SiO₂). . \ -

2) Z-Phe-D-Arg(liO₂)-OH

5 g des oben angegebenen Dipeptide wurden in Dioxan gelöst und dann mit 1,1 Äquivalent Natriumhydroxid verseift. Diese Lösung wurde 2 h gerührt und dann mit 1 η Salzsäure (pH = 2) angesäuert und mit der 10-fachen Menge. Wasser verdünnt. Der entstehende Niederschlag wurde 3 h bei 0° gerührt und abfiltriert.

Ausbeute 3,1 g. Fp: 118-121°C (Zers.). Rf in BzrEtOH (8:2) = 0,11 (SiO₂).

3) H-Phe-D-Arg-OH-Acetat

1 g Z-Phe-D-Arg(N0₂)-0H entsprechend 2) wurde in 20 cnr⁵ 90 %-iger Essigsäure gelöst und anschließend, 100 mg Palladium 10 % auf Kohle zugegeben. Es wurde 2 Tage lang Wasserstoff durch das Gemisch geleitet und anschließend das schwarze,Reaktionsgemisch über Hyf Io filtriert, das Filtrat zur Trockne eingedampft und der Rückstand in tert.-Butanol/Wasser (1:1) gelöst und lyophilisiert.

Ausbeute 0,4 g Dipeptidacetat. . '..

Rf in Bu:Py:Ac:Wa (4:3/4:1/4:1) = 0,21

4) Auf die unter 3) beschriebene Weise wurde das Z-Phe-D-Arg(N0₂)-0Me (1) umgewandelt in das H-Phe-D-Arg-OMe-Acetate . Rf in Bu:Py:Ac:Wa (4:3/4:1/4:1) = 0,40 (

309841/1164 - 23 -

2*15929

K. Synthese von H-

1) Z-Phe-D-Lys(Boc)-OBzl

Ausgehend von 17,7 6 H-D-LyS(BoC)-OBzI.HCl wurde das Dipeptid Z-Phe-D-Lys(Boc)-OBzl auf die in Beispiel H 1) beschriebene Weise hergestellt.

Ausbeute nach Umkristallisieren aus Äthylacetat/Äther: 72 % (ÖL). Rf in Bz:EtOH (9:1) = 0,54-

2) H-Phe-D-Lys(Boc)-OH

2 g Z~Phe-Lys(Boc)-OBzl wurden in 50 cnr Methanol gelöst und anschließend 0,2 g 10 % Palladium auf Kohle zugegeben und Wasserstoff 5 h- durch das Gemisch geleitet. Dann wurde das Gemisch filtriert und das Filtrat zur Trockne eingedampft. Ef in Bu:Py:Ac:Wa (4:3/4:1/4:1) = 0,31 (SiO₂).

L. Synthese von H-Phe-D-Lys(Boc)-Trp-OH und Derivaten

1) Z-Phe-D-Lys(Boc)-Trp-OH

4,6 g Z-Phe-ONP wurden in 60 enr DIiF gelöst. Dann wurden 4,4 g H-D-Lys(Boe)-Trp-OMe zugegeben und das Gemisch 20 h bei 20°C gerührt und anschließend 0,2 g 2-Dimethylaminoäthylamin zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde weitere 2 h gerührt, anschließend das Lösungsmittel abgedampft und der Rückstand *" in 250 cnr Äthylacetat/Wasser gelöst. Diese Losung wurde nacheinander mit einer Lösung von 5 % Kaliumcarbonat in Wasser, 0,5 & Salzsäure und Wasser gewaschen und anschließend die organische Phase über Natriumsulfat getrocknet.

Nach dem Filtrieren wurde das Filtrat zur Trockne eingedampft und der ölige Rückstand verseift. Zu diesem Zweck wurden 6,54 g des Esters in 100 cnr Dioxan gelöst und anschließend

309841/1 164

- 24 -

231582a

- 24 - 42 756

Τ. -

11,8 cnr 1,5n NaOH zugegeben. Das Gemisch wurde 2 h gerührt und anschließend das erhaltene Re akti ons gemisch mit 1',5 η Salzsäure auf"einen pH-Wert von 7 angesäuert und das Dioxan im Vakuum abgedampft. Zu dem Rückstand wurde Äthylacetat/Wasser zugegeben und die wässrige Schicht mit verdünnter Salzsäure auf einen pH-Wert von 2 gebracht, ohne die Schichten zu trennen. Die organische Phase wurde mit Wasser gewaschen und getrocknet. Beim Abdestillieren des Äthylacetats im Vakuum erhielt man ein öl, das nach Rühren mit Äther fest wurde. Rf in Am:Py:Wa (5:3:2) = 0,81 (SiO₂). Fp 85°C (Zers.).

2) H-Phe-D-Lys(Boc)-Trp-OH.HCl

1,85 g der Dipeptidsäure entsprechend 1) wurden in 4-0 cnr DMF und 1 Äquivalent Salzsäure gelöst. Dann wurden $50mg 10% Palladium auf Kohle zugegeben und anschließend 6 h lang Wasserstoff durch das Gemisch geleitet. Nach der Reduktion wurde der Katalysator abfiltriert und das Filtrat sofort weiterverarbeitet.
Rf in Am:Py:Wa (5:3:2) = 0,70 (SiO₂).

3) Z-Phe-D-Lys(Boc)-Trp-NH₂ oder Z-Phe-D-Lys(Boc)-Trp~N-(CH₃)₂ ."*..·

2 g des r.ohen Esters (erhalten nach dem unter 1) beschriebenen Verfahren) wurden zu 25 cur einer-10 η Ammoniaklösung oder Dimethylaminlösung in Methanol zugegeben. Das Gemisch wurde dann 2 Tage geruht, anschließend zur Trockne eingedampft und der Rückstand aus. Methanol umkristallisiert. Rf in Bz:EtOH (8:2) = 0,35 (SiO₂) für das Amid und'0,41 für das Dimethylamid.

4) Z-yP₁₁₂₅

3,6 g Z-Phe-D-Lys(Boc)-Trp-OH entsprechend 1) wurden in 45 cnr DMF gelöst und anschließend 1,35 g Undecylbromid und

309841/1164 - 25 -

1,0 g Dicyclohexylamin zugegeben. Das Gemisch wurde 48 h bei 35⁰O und 2 Ii bei 0° gerührt und anschließend das entstandene Dicyclohexylammoniumbromid abfiltriert und das Filtrat im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde in Xthylacetat aufgenommen, mit 0,1 η HCl Wasser, einer 10 /oigen Bicarbonatlösung und Wasser gewaschen. Die organische Phase wurde kurze Zeit über Natriumsulfat getrocknet, dann im Vakuum teilweise eingedampft und durch Zugabe von η-Hexan auskristallisiert. Ausbeute 3»2 g.
Rf in Bz:EtOH (8:2) = 0,45 (SiO₂).

5) Entfernung der Gruppe Z

Auf die gleiche V/eise wie unter 2) beschrieben, wurde 1 g der entsprechend 3) und 4-) hergestellten peptide mit Wasserstoff in Gegenwart von Palladium auf Kohle hydriert. Man erhielt die HCl-Salze der folgenden Peptide:

1. H-Phe-D-Lys(Boc)-Trp-NH₂ Rf* =0,73 auf

2. H-Phe-D-Lys(Boc)-Trp-N(CH₃)₂ Rf* = 0,7? auf

3. H-PhB-D-LyS(BoC)-TrP-OG₁₁H₂₃ Rf* = 0,78 auf

*Rf in Am:Py:Wa (5:3:2).
M. Synthese von H-Phe-D-Lys(Boc)-Tra ^

1) Z-Phe-D-Lys(Boc)-Tra

Ausgehend von Z-Phe-ONP und H-D-Lys(Boc)-Tra (Öl; Rf in Am:Fo:Wa (7:2:1) = 0,70) wurde das Peptid Z-Phe-D-Lys(Boc)-Tra auf die in Beispiel L 1) beschriebene Weise hergestellt.

Beim Umkristallisieren aus Methanol-Äther-Petroläther erhielt man nach einigen Tagen eine kristalline Substanz. Fp: 159-162⁰C.
R? in Bz:EtOH (8:2) = 0,73 (SiO₀). 309841/1164 -26-

_ 26 -

2) H-Phe-D-Lys(Boc)-Tra ■

Beim Hydrieren des Dipeptidamids entsprechend 1) in Methanol mit 10 % Palladium auf Kohle als Katalysator erhielt man H-Phe-D-Lys(Boc)-Tra. Ausbeute 92 %. - " Ef in Am:Py:Va (5:3:2) =0,75 auf
Rf in. Bu:Ac:Va (4:1:1) =0,80 auf ₂

N. Synthese' von H-Phe-D-Arg-Tra

1) Z-Phe-D-Arg(lT0₂)-Tra

2,1 g Z-Phe-ONP wurden in 20 cm^ DMF gelöst und anschliessend die hellgelbe Lösung auf -5°C abgekühlt. Dann wurde eine gekühlte Lösung von 1,81 g H-D~Arg(NOp)-Tra, erhalten aus Boc-D-Arg(N0₂)-Tra (Fp 114° Zers.) "zugegeben. Das Gemisch wurde 20 h bei 0° und 5 h bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde zur Trockne eingedampft und der Rückstand 3 ^mal ^mi-t Äther gerührt. Der hellgelbe Niederschlag wurde einige Male aus Äthanol/Äther umkristallisiert. Rf in Bz:EtOH (8:2) = 0,41 auf

2) H-Phe-D-Arg-Tra-Acetat

1,5 g des oben angegebenen Peptids wurde in 20 cmr 90 %iger Essigsäure, gelöst und anschließend 150 mg 10_: % Palladium auf Kohle zugegeben. Dann wurde 2 Tage lang Wasserstoff durch das Gemisch geleitet und anschließend das Re akti ons gemisch über Hyflo filtriert, das Filtrat zur Trockne eingedampft'und der Rückstand in tert.-Butanol/Wasser (1:1) gelöst und lyophilisiert.
Rf in Bu:Py:Ac:Va (4:3/4:1/4:1) = 0,26 auf

Synthese von H-Piie-D-ArK-Trp-Gly-OH-Acetat

1) Boc-D-Arg(N0₂)-Trp-Gly-0H . .

5,76 g Boc-D-Arg(N0₂)-0H wurden in 70 cm⁵ DHF und 2,52 cm?

30984 1 / 1 1 6 4 - ^V

TAA gelöst. Diese Lösung wurde auf - 1O⁰C abgekühlt, anschliessend 2,38 cm^ Isobutylchlorformiat zugegeben und das Gemisch 10 min bei -10°C gerührt.

Eine Lösung von 4,7 g H-Trp-Gly-OH in 40 cm^ DMF und 2,0 cur Triäthylamin wurde auf -5⁰C abgekühlt und zu dem gemischten Anhydrid gegeben und anschließend der pH-Wert mit TAA auf 7,2 eingestellt. Das Gemisch wurde 2 "h bei 0° und 20 h bei Raumtemperatur gerührt und anschließend der Niederschlag abfiltriert und das Filtrat zur Trockne eingedampft. Dann wurde der Rückstand .in wässrigem Äthylacetat gelöst. Die organische Phase wurde mit Zitronensäure gewaschen und anschließend mit salzhaltigem Wasser und dann getrocknet.

Nach dem Filtrieren wurde ein Teil des Äthylacetats auf ein Volumen von ungefähr 100 cnr abgedampft und anschließend ausreichend Äther zugegeben, bis eine Trübung entstand. Das Gemisch wurde einige Zeit stehengelassen und anschließend der auf diese Weise erhaltene Niederschlag abfiltriert. Rf in Bz:EtOH (8:2) = 0,65 auf SiO₂.

2) H-D-Arg(N0₂)-Trp-Gly-0H.HCl

6 g des Tripeptide wurden in Methylenchlorid suspendiert und anschließend trockener Chlorwasserstoff 30 min lang durchgeleitet. Nach einiger Zeit begann das HCl-SaIz des Tripeptids auszufallen. Das Gemisch wurde nach 2-stündigem Rühren bei 20°C filtriert. Der Rückstand wurde 3 mal mit trockenem Äther gewaschen und über festem Natriumhydroxid getrocknet. Rf in Am:Py:Wa (5:3:2) = 0,54 auf

3) Ausgehend von dem Tripeptid H-D-Arg(N0₂)-Trp-Gly-0H.HCl entsprechend 2) wurdß das Tetrapeptid durch Kondensation mit Z-Phe-ONP auf die in Beispiel N 1) beschriebene Weise hergestellt. Ausbeute an Z-Phe-D-Arg(N0₂)-Trp-Gly-0H: 63 %.

Rf in Bz:EtOH (8:2) = 0,12 auf SiO₀.

^d - 28 -

3098 41/1164

2315821

- 28 - - -■ - - 42 756

.4) H-Phe-D-Arg-Trp-Gly-OH-Acetat

1,5 g des Peptids nach 3) wurden auf die in Beispiel N 2) beschriebene Weise hydriert.
Ef in Bu:Py:Ac:Wa (4:3/4:1/4:1) =.0,21,auf SiO₂.

P. Synthese von H-Phe--D-Lys(Boc)-Phe-OtBu

1) Z-D-Lys(Boc)-Phe-OtBu

10,03 g Z-D-Lys(Boc)-ONP wurden in 50 ca? DMF gelöst. Diese Lösung wurde auf -20°C abgekühlt und anschließend zu einer , Lösung von 4,1 g ü-Phe-OtBu in 75 cm^ DMF gegeben. Das Gemisch wurde 1. h bei 0° und 20 h bei 20⁰C gerührt und anschließend das Beaktionsgemisch zur Trockne eingedampft. Der gelbe Bückstand wurde in Äthyläcetat/Wasser gelöst und mit 5 % Kaliumcarbonat, Wasser, 5 % Zitronensäure und Wasser gewaschen. Die organische Phase wurde getrocknet und zur Trockne eingedampft. Der Bückstand wurde in Äthylacetat gelöst und anschließend ausreichend Petroläther 40:60 zugegeben, bis eine Trübung entstand. Der entstehende Niederschlag wurde abfiltriert. Ef in Bz:EtOH (9:1) = 0,64 auf

2) H-D-Lys(Boc)-Phe-OtBu

3 g des Dipeptide wurden in 60 ctqP Methanol gelöst. Dann wurde 10 % Palladium auf Kohle zugegeben und anschließend Wasserstoff durch das Gemisch geleitet, bis kein COp mehr entwich (2 h). Nach Filtrieren wurde das Filtrat zur Trockne eingedampft, wobei man einen Schaum erhielt. Ef in To:EtOH (9:1) = 0,21 auf SiO₂, _

3) Z-Phe-D-Lys(Boc)-Phe-OtBu

2,18 g Z-Phe-ONP wurden in 15 cm^ DMl gelöst» Dann wurde eine Lösung von 2,24 g-H-D-Lys(Boc)-Phe-OtBü entsprechend 2) in 30 cm"" DMF zugegeben und anschließend das Gemisch 15 h

- - 29 -

: ■ 309841/1164 r ,.-._;

bei 20°C gerührt.

Nach, dem Eindampfen der gelben Lösung wurde der Rückstand in 15 cnr Athylacetat gelöst und anschließend 50 cnr Petroläther zugegeben. Dann wurde das Gemisch 3 h bei 0 C stehengelassen und der entstandene Niederschlag abfiltriert. Fp 135-138⁰C. .

Ef in To:EtOH (8:2) = 0,60 auf

4) H~Phe~D-Lys(Boc)-Phe-OtBu

2,5 g des Tripeptide nach 3) wurden auf die unter 2) be schriebene Weise hydriert.
Ef in To:EtOH (8:2) = 0,43 auf

Q. Synthese von H-Phe-D-Lys(Boc)-Phe~Gly-OtBu

1) Z-D-Lys(Boc)-Phe-Gly-OtBu

10,03 g Z-D-Lys(Boc)-ONP wurden mit einer Lösung von 5,1 S H-Phe-Gly-OtBu in 20 cm^ DMT auf die in Beispiel P 1) beschrie bene Weise kondensiert und dann eingedampft. Der erhaltene Eückstand v/urd,e in Athylacetat auf die beschriebene V/eise gelöst, gewaschen und zur Trockne eingedampft. Der Eückstand wurde unmittelbar weiterverarbeitet.
Rf in To:EtOH (9:1) = 0,63 auf

2) H-D-Lys(Boc)-Phe-Gly-OtBu

Hydrierung entsprechend Beispiel P 2) ergab das Tripeptid als Schaum in praktisch quantitativer Ausbeute. Rf in To:EtOH (9:1) = 0,24 auf

3) Z-Phe-D-Lys(Boc)-Phe-Gly-OtBu

Bei Umsetzung von 2,18 g Z-Phe-ONP mit 2,6 g H-D-Lys(Boc)-Phe-Gly-OtBu in 30 cm^ DMF auf die in Beispiel P 3) beschrie-

309841/1164 -30-

bene Weise erhielt man innerhalb von.24 h das Tetrapeptid in 75 %iger Ausbeute nach Umkristallisieren aus Äthylacetat/Petroläther. Vor dem Kristallisieren wurde die Äthylacetatschicht mit Zitronensäure gewaschen. Fp: 78-80°C. Ef in To:EtOH (8:2) = 0,85 auf

4) H-Phe-D-Lys(Boc)-Phe-Gly-OtBu

Beim. Hydrieren des entsprechend 3) erhaltenen Tetrapeptide entsprechend Beispiel P 2) erhielt man H-Phe-D-Lys(Boc)-Phe~ GIy-OtBu als Schaum.
Rf in Bu:Py:Ac:Wa (4:3/4:1/4:1) = 0,57 auf SiO₅.

R. Synthese von H-Phe-D-Lys(Boc)-(N-Phenylalkyl)aBiid-Derivaten

1) Z-D-Lys(Boc)-PPA

10,33 g Z-D-Lys(Boc)-ONP- wurden in 80 cnr⁵ Methyl enchl ο rid gelöst. Die Lösung wurde auf O⁰C abgekühlt und anschließend 2,7 g 3-Phenylpropylamin zugegeben und das Gemisch 30 min bei 0°0 und 20 h bei 20°C gerührt. Das Re akti ons gemisch wurde zur ' Trockne eingedampft und der Rückstand in Äthylacetat aufgenommen. Die organische Phase wurde nacheinander mit Wasser, Zitronensäure, Wasser, 5 % JTatriumbi carbon at und Wasser gewaschen und anschließend getrocknet. Daraufhin wurde das Äthylacetat im Vakuum abgedampft und der Rückstand aus Äthylacetat/ Äther umkristallisiert.
Rf in Bz:EtOH (9:1) = 0,53 auf SiO₂- '^

2) H-D-Lys(Boc)-PPA ■ .

8,75 g des Amids nach 1) wurden in 120 cur Methanol gelöst und anschließend 10 % Palladium auf Kohle zugegeben. Dann wurde 4 h Wasserstoff durch das Gemisch geleitet und anschließend das Gemisch filtriert. Das Filtrat wurde dann zur Trockne eingedampft und der Rückstand (Öl) sofort weiterverai'beitet.
Rf in Am:Fo:Wa (7:2:1) = 0,58 auf

309841 /1164

■5) Z-Phe-D-Lys(Boc)~PPA

6,39 g des Amids-nach 2) wurden in 68,5 cm* DMF gelöst und anschließend 7,61 g Z-Phe-ONP in 20 cnr DMF zugegeben. Das Gemisch wurde 20 h bei Raumtemperatur gerührt und anschließend das Lösungsmittel im "Vakuum abgedampft. Der Rückstand wurde in 170 cmr Äthylacetat gelöst und die Äthylacetatphase, wie unter 1) beschrieben, gewaschen und getrocknet. Der Rückstand wurde in einer möglichst kleinen Menge Äthylacetat gelöst und bei O⁰C weggestellt. Nach 3 Tagen wurde der Niederschlag abfiltriert.
Rf in Bz:EtOH (8:2) = 0,72 (SiO₂).

4) H-Phe-D-Lys(Boc)-PPA.HCl

9,07 g des Dipeptidamids nach 3) wurden in 300 cur DMF gelöst und anschließend 4 cm^ 4 η HCl und 1,5 g 10 % Palladium auf Kohle zugegeben. Dann wurde 4 h unter Rühren Wasserstoff durch das Gemisch geleitet und anschließend der Katalysator abfiltriert und das Filtrat zur trockne eingedampft. Das verbleibende öl wurde mit Äther gerührt. Rf in Bu:Ac:Wa (4:1:1) = 0,65 (SiO₂).

5) Auf gleiche Weise wurden hergestellt:

H-Phe-D-Lys(Boc)-Amf Rf =0,39 auf

H-Phe-D-Lys(Boc)-PEA Rf =0,34 auf

H-Phe-D-Lys(Boc)-HPEA Rf* = 0,29 auf ₂

*Rf in To:EtOH (8:2).

Beispiel 1 H-Met-Glu-His-Phe-D-Arg-QH und die entsprechenden Methylester

1. Boc-Met-Glu(OtBu)-His-Phe-D-Arg-OH

1,17 g Boc-Met-GIu(OtBu)-HiS-N₂H₅ (A. 2) wurden in 20 cm⁵ DMF gelöst. Diese Losung wurde auf 0° abgekühlt und anschlies-

309841/1164 -32-

2315328 42 756

send 3 cm^ 2 η HCl/THF zugegeben und dann "bei -20°C 0,27 cm⁵ Isoamylnitrit. Das Gemisch wurde 7 min bei -20⁰C gerührt und anschließend zu.einer Lösung von 0,76 g H-Phe-D-Arg-OH-Acetat (H 3) gegeben.und der pH-Wert mit TAA .auf 7?2 eingestellt. Das Gemisch.wurde 70 h bei O⁰C gerührt und anschließend das DMF im Vakuum abdestilliert und der Rückstand in wässrigem Äthylacetat aufgenommen und 3 mal mit salzhaltigem Wasser gewaschen. -

Das Äthylacetat wurde abdestilliert und der Rückstand aus trockenem Äthylacetat/Petroläther umkristallisiert. Ausbeutet,2 g. Rf in Bu:Py:Ac:Wa (2:3/4:1/4:1) ="0,56.

2. Entfernung der Schutzgruppen

1 g des Peptids wurde in 10 cnr 90 %iger Trifluoressig-'säure gelöst und anschließend die Lösung 30 min gerührt. Dann wurde das Reaktionsgemisch zu peroxidfreiem Äther getropft. Der entstandene Niederschlag wurde abfiltriert und mit Äther verrieben. Der Rückstand wurde über festem KOH getrocknet. Die Substanz wurde in 25 cirr tert.-Butanol/Wasser gelöst und anschließend Dowex X-8 in der Acetatform zugegeben, um die Trifluoracetatgruppe durch die Acetatgruppe zu ersetzen (EndpH-Wert 4-5). Der Ionenaustauscher wurde abfiltriert und anschließend das Filtrat lyophilisiert. Rf in Bu:Py:Ac:Wa (2:3/4:1/4:1) = 0,18 (SiO₂).

3. Auf die unter 1. und 2. beschriebene Weise wurde das Peptid Boc-Met-Glu(OtBu)-HiS-N₂H₃ (A.2.) gekuppelt mit H-Phe-D-Arg-OMe (H.4), wobei man nach Entfernung der Schutzgruppen H-Met-Glu-His-Phe-D-Arg-OMe-Acetat erhielt. Rf in Bu:Py:Ac:Wa (4:3/4:1/4:1) = 0,22 auf

Beispiel 2 H-Ket-Glu-His-Phe-D-Lys-OH

309841/116 4 - 33 -

- 33 - 42 756

1. Boc-Met-Glu(OtBu)-His-Phe-D-Lys(Boc)~OH -

1,17 e Boc-Met-Glu(OtBu)-HiS-NpH, (A.2) wurden in 20 cm⁵ DMF gelöst und anschließend bei 0 3 cm^2n HGl in THP zugegeben und bei -20 C 0,27 cnr Isoamylnitrit. Das Gemisch wurde 7 min gerührt und anschließend zu einer Lösung von 0,9 g H-Phe-D-Lys(Boc)-OH (K.2) in 10 cm^ DIlB¹ gegeben und der entstehende pH-Wert mit TAA auf 7₅2 eingestellt. Das Gemisch wurde 70 h bei 0° gerührt und anschließend das DMF abdestilliert und der Rückstand in wässrigem Äthylacetat aufgenommen..

Die organische Phase wurde mit salzhaltigem Wasser anschließend mit Wasser gewaschen und dann getrocknet und eingedampft. Der Rückstand wurde aus Äthylacetat/Petroläther umkristallisiert .
Rf in To:EtOH (8:2) = 0,27 auf SiO₂.

2. Entfernung der Schutzgruppen

Die Entfernung wurde auf die in Beispiel 1.2 beschriebene Weise durchgeführt, aber es wurde 1 h mit 90 %iger Trifluoressigsäure gerührt.
Rf in Bu:Py:Ac:Wa (4:3/4:1/4:1) = 0,19 auf SiO₃.

3. Auf gleiche Weise wurden hergestellt

Rf in

Bu:Py:Ac:Wa

(4:3/4:1/4:1)

H-D-Met-Glu-His-Phe-D-Lys-OH ausgehend von B.2 0,18

und K.2

H-ß-Ala-Glu-His-Phe-D-Lys-OH ausgehend von D.2 0,16

und K.2

H-Val-Glu-His-Phe-D-Lys-OH ausgehend von C.2 0,18

und K.2

309841/1164 - 34 -

231582$ _{42 755}

Desamino-Met-Glu-His-Phe-D-Lys-OH ausgehend von 0,26

F.3 und K.2

Η-Met-Gln-His-Phe-D-Lys-OH ausgehend von 0,25

G und K.2

Beispiel 3 A-Glu-His-Phe-D-Lys-Trp-Y

1. Boc-Ala-Glu(OtBu)-His-Phe-D-Lys(Boc)-Trp-OH ;

Ausgehend von 1,05 (2 mMol) BoC-AIa-GIu(OtBu)-HiS-IT₂H₃ (F.1) wurde das Azid nachdem in Beispiel 2.1 beschriebenen Verfahren hergestellt. Dieses Azid wurde zu 1,23 g H-. Phe-D-Lys(Boc)-Trp-OH.HCl (Beispiel L.2) in 10 cur⁵ DMF zugegeben und anschließend der pH-Wert mit TAA auf 7?3 eingestellt. Das Reaktionsgemisch wurde 70 k gerührt und anschließend zur Trockne eingedampft und der Rückstand mit wässrigem Äthylacetat gerührt. ■

Das Äthylacetät wurde 2 mal mit Wasser gewaschen und dann zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde aus A.lkohol peroxidfreiem Äther (1:1) umkristallisiert. Fp:173° (Zers. Rf in Bz:EtOH (8:2) = 0,27 auf

2. Boc-¥al-Glu(OtBu)-His-Phe-D-Lys(Boc)-Trp-HH₂

Ausgehend von 1,11 g Boc-Val-Glu(OtBu)-HiS-N₂H₇ (C.2) und 1,22 g H-Phe-D-Lys(Boc)-TrP-NH₂.HCl (L.5.1«) wurde das oben^ angegebene Peptidamid auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise erhalten. Beim Eingießen des Reaktionsgemisches in die 10-fache Menge Wasser erhielt man einen Niederschlag. Dieser Niederschlag wurde mit Äthylacetat/Petroläther gerührt, wobei man 1j3 6 des Peptids erhielt»
Rf in Am:Py:Wa (5:3:2) = 0_s84 auf

3. Auf die gleiche Weise wie unter 1 oder 2 beschrieben erhielt man:

309841/1164 - 35 -

Boc-Ala-Glu(OtBu)-His-Phe-D-Lys(Bbc)-Trp-

OC (aus F.1 und L.5.3.)

₃
Boc-Val-Glu(OtBu)-His-Phe-D-Lys(Boc)-Trp-0H(aus C.2. und L.2)

Boc-Val-Glu(OtBu)-His-Phe-D-Lys(Boc)-Trp-

N(CH₃)₂ (aus C.2 und L.5.2.)

Boc-Val-Glu(OtBu)-His-Phe-D-Lys(Boc)-Trp-

0O₁₁H₂₅ (aus C.2 und L.5.3.)

Boc-Met-Glu(OtBu)-His-Phe-D-Lys(Boc)-Trp-

OH (aus A.2 und L.2)

Desamino-Met-Glu(OtBu)-His-Phe-D-Lys(Boc)-

a}rp-0H (aus F.3 und L.2).

4. Entfernung der Schutzgruppen

1-stündige Behandlung der unter 1, 2 und 3 erhaltenen Peptide in 90 %iger Trifluoressigsäure, wie in Beispiel Ί.2 beschrieben, ergab die folgenden Hexapeptide als Acetate:

H-Ala-Glu-His-Phe-D-Lys-Trp-OH H-Val-Glu-His-Phe-D-Lys-Trp-NH₂ H-AIa-G .Iu-HiS-PhB-D-LyS-TrP-OC₁₁ H-Val-Glu-His-Phe-D-Lys-Trp-OH H-Val-Glu-His-Phe-D-Lys-Trp-1T(CH₃)₂

Rf	*	SiOp
0,23	auf	SiO₂
0,31	auf	SiO₂
0,38	auf	SiO₂
0,26	auf	SiO₂
0,33	auf	SiO₂
0,40	auf	SiO₂
0,25	auf	SiO₂
0,29	auf

H-Met-Glu-His-Phe-D-Lys-Trp-OH Desamino-Met-Glu-His-Phe-D-Lys-Trp-OH

* Ef in Bu:Py:Ac:¥a (4:3/4:1/4:1).

Beispiel 4 H-Gly-Glu-His-Phe-D-Arg-Tra

1. Boc-Gly-Glu(OtBu)-His-Phe-D-Arg-Tra

2 mMol BoC-GIy-GIu(OtBu)-HiS-N₂H₃ (E.2) wurden nacbjiem im Beispiel 1 beschriebenen Verfahren in das Azid umgewandelt und

- 36 309841/1164

- 36- 2315828 4-2 756

■ mit 2 mMol des oben beschriebenen Peptids H-Phe-D-Arg-Tra-Acetat (N.2) gekuppelt. Der entstehende pH-Wert wurde mit TAA auf 7,1 eingestellt. Nach 70-stündigem Rühren bei 0°c' wurde die DKF-Losung mit Äthylacetat verdünnt und diese Phase mit Wasser und einer Natriumbicarbonatlösung (5 %) gewaschen. Die Phase wurde erneut mit Wasser gewaschen und anschließend das

. Äthylacetat abdestilliert. -

Ef in Bz:EtOH (8:2) = 0,39 auf SiO₂. ' '

2. Entfernung der Schutzgruppen

1 g der Substanz wurde in 20 cm-^ 90 $iger TFA unter leichtem Erhitzen gelöst und weiter wie oben beschrieben (Beispiel 1.2) behandelt. Yor dem Abfiltrieren des Dowex wurde die Substanz leicht erhitzt.

Acetat von H-Gly-Glu-His-Phe-D-Arg-Tra:

Ef in Bu:Py:Ac:Wa (4:3/4:1/4:1) = 0,19 auf SiO₂-

Beispiel 5 A-Glu-Eis-Phe-D-Arg-Tra und A-Glu-His-Phe-D-Lys-Tra

1. Boc-Met-Glu(OtBu)-His-Phe-D-Arg-Tra '

2 mMol H-Phe—D-Arg-Tra-Acetat (N.2) wurden zu dem entsprechend Beispiel 1.1 hergestellten Azid gegeben und ausreichend TAA zugegeben, um den pH-Wert auf 7₅2 einzustellen.

Dieses Gemisch wurde 70 h gerührt und anschließend das Eeakti ons gemisch filtriert und das Filtrat zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde 3 mal mit trockenem Äthylacetat gerührt und anschließend der Bückstand in Alkohol gelöst und zu trockenem Äthylacetat getropft, wobei man einen Niederschlag erhielt, der abfiltriert vmrde.
Ef in Bz:EtOH (8:2) = 0,25 auf

- 37 309841/1164 '

2. .Boc-Met-Glu(OtBu)-His-Phe-D-Lys(Boc)-Tra

2 mMol H~Phe~D-Lys(Boc)-Tra (M.2) wurden zu dem entsprechend Beispiel 1 erhaltenen Azid gegeben und ausreichend TAA, um einen pH-Wert von 7*2 zu erhalten.

Das Reaktionsgemisch wurde .zur Trockne eingedampft und anschließend in wässriges Äthylacetat gegeben, wobei das Peptid auskristallisiert. Nach 3-stündigem Rühren bei +5⁰G wurde filtriert. Ausbeute 1,2 g.
Rf in Bz:EtOH (8:2) = 0,37 auf

Auf die gleiche Weise wurden: Boc-D-Met-Glu(OtBu)-His-Phe-D-Lys(Boc)-Tra, Boc-ß-Ala-Glu(OtBu)-His-Phe-D-Lys(Boc)-Tra und Desamino-Met-Glu(OtBu)-His-Phe-D-Lys(Boc)-Tra hergestellt.

3. Entfernung der Schutzgruppen der Peptide 1 und 2.

Die oben erwähnten Peptide wurden auf die oben angegebene Weise behandelt. Vor dem Lyophxlisxeren wurde zusätzliche Essigsäure zugegeben, um die Löslichkeit zu erhöhen.

Auf die Weise erhielt man die Acetate von:

* Rf

H-Met-Glu-His-Phe-D-Arg-Tra ^: 0,18 auf

H-Met-Glu-His-Phe-D-Lys-Tra .. 0,23 auf

H-D-Met-Glu-His-Phe-D-Lys-Tra 0,20 auf

H-ß-Ala-Glu-His-Phe-D-Lys-Tra 0,19 auf

Desamino~Met-Glu-His-Phe-D-Lys-Tra 0,26 auf ₂

*Rf -in Bu:Py:Ac:Wa (4:3/4:1/4:1)

Beispiel 6 A-Glu-His-Phe-D-Arg-Trp-GIy-OH

1. Boc-Val-Glu(OtBu)-His-Phe-D-Arg-Trp-Gly-OH

_ 38 -309841/1164

- 38 - 42 756

Ausgehend von BoC-VaI-GIu(OtBu)-HiS-IT₂H₅ (C.2) und dem Acetat von H-Phe-D-Arg-Trp-Gly-OH (0.4) wurde das oben erwähnte Heptapeptid in einer Menge von 2 mMol nach dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren hergestellt. Das Gemisch wurde 70 h bei O⁰C gerührt und anschließend das Eeaktionsgemisch in Wasser gegossen und weitere 3 h gerührt. Dann wurde der Niederschlag abfiltriert.
Rf in Bu:Py:Ac:Va (4:3/4:1/4:1) = 0,57. auf

2. Entfernung der Schutzgruppen.

Bei Behandlung des Peptids wie in Beispiel 1.2 beschrieben, erhielt man H-Val-Glu-His-Phe-D-Arg-Trp-Gly-OH-Acetat. Ef in Bu:Py:Ac:Wa (4:3/4:1/4:1) =0,21 auf

3. Auf die gleiche Weise erhielt man die Acetate von:

Ef (in Bu:Py:Ac:Wa 4:3/4:1/4:

H-Met-Glu-His-Phe-D-Arg-Trp-Gly-OH 0,17 auf

H-B-Ala-Glu-His-Phe-D-Arg-Trp-Gly-OH ' 0,14 auf Desamino-Met-Glu-His-Phe-D-Arg-Trp-Gly-OH 0,22 auf

Beispiel 7 . '

A-Glu-His-Phe-D-Lys-Phe-OH

1. Boc-ß-Ala-Glu(OtBu)-His-Phe-D-Lys(Boc)-Phe-OtBu

4 mMol BoC-B-AIa-GIu(OtBu)-HiS-N₂H₅ (D.2) wurden in 25 DMP gelöst. Diese Lösung wurde auf -5 C abgekühlt und anschließend 4 cm⁵ 3 n'HC1/THF zugegeben und bei -20⁰G 0,55 Isoamylnitrit. Das Gemisch wurde 7 min bei -20°C gerührt und anschließend die Hälfte dieser Azidlösung zu einer Lösung von 1,2 g H-Phe-D-Lys(Boc)-Phe-OtBu (P.4) in 10 cm⁵ DME¹, die auf -1O⁰G vorgekühlt war, gegeben. Der pH-Wert des Gemisches wurde mit TAA auf 7»3 eingestellt und anschließend das Eeaktionsge-

309841 /M δ 4 - 39 -

-39- 231582a

misch 71 h bei 0° gerührt -und anschließend in Wasser gegossen.

Beim Abfiltrieren des entstehenden Niederschlags erhielt man das rohe Peptid in 62 %iger Ausbeute, das 3 mal aus Äthylacetat/Petroläther umkristallisiert wurde.

Fp:193° Zers.

Ef in To:EtOH (8:2) = 0,51 auf.

2. Behandlung des oben erwähnten Peptids nach dem in Beispiel 1.2 beschriebenen Verfahren , ergab das Acetat von H-ß-Ala-Glu-His-Phe-D-Lys-Phe-OH in 75 %iger Ausbeute. Rf in Bu:Py:Ac:Wa (4:3/4:1/4:1) = 0,21 auf

3. Auf die gleiche Weise wurden die Acetate der folgenden Peptide hergestellt:

Peptid Bf Ausgangsprodukte

H-Met-Glu-His-Phe-D-Lys-Phe-OH 0,38* A.2 + P.4 H-Val-Glu-His-Phe-D-Lys-Phe-OH 0,35* C.2 + P.4

Desamino-Met-Glu-His-Phe-D-Lys-Phe- * *

OH 0,24 F.3 + P.4

H-Met-Gln-His-Phe-D-Lys-Phe-OH 0,25* G + P.4

*Ef in Bu:Py:Ac:Wa (2:3/4:1/4:1) auf **Ef in Bu:Py:Ac:Wa (4:3/4:1/4:1) auf

Beispiel 8 H-ß-Ala-Glu-His-Phe-D-Lys-Phe-Gly-OH

1. Boc-ß-Ala-Glu(OtBu)-His-Phe-D-Lys(Boc)-Phe-Gly-OtBu

Ausgehend von der anderen Hälfte der in Beispiel 7·1 her gestellten Azidlösung wurde das oben erwähnte Heptapeptid durch Kondensation auf die gleiche Weise mit 2nMol H-Phe-D-Lys(Boc)-Phe-Gly-OtBu (Q.4) erhalten und isoliert. Ef in Bz:EtOH (8:2) = 0,53 auf

₂
309Ö41/1164 -40-

.,ο- 2315825 _{42 ?55}

2. Entfernung der Schutζgruppen. " ·

Bei Behandlung dieses Peptids auf die in Beispiel 1.1 beschriebene We'ise erhielt man das Acetat von:

H-ß-Ala-Glu-His-Phe-D-Lys-Phe-Gly-OH ' Ef in Bu:Py:Ac:Wa (4:3/4:1/4:1) = 0,19 auf SiO₂.

3. Auf die gleiche Weise wurden die Acetate der folgenden Peptide hergestellt:

H-Met-Glu-His-Phe-D-Lys-Phe-Gly-OH Rf* = 0,23 H-(oC_Me)Ala-Glu-His-Phe-D-Lys-Phe-Gly-OH Ef* =0,26 Desamino-Met-Glu-His-Phe-D-Lys-Phe-Gly-OH Ef =0,31

*Ef in Bu:Py:Ac:Wa (2:3/4:1/4:1) auf i

Beispiel 9

H-( aC -Me)Ala-Glu-His~Phe-D-Lys-Phenylalkylamid

1. Boc(cC-Me)Ala-Glu(OtBu)-His-Phe-D-Lys(Boc)-PPA

0,96 g Boc-(0C-Me)AIa-GIu(OtBu)-HiS-N₀H, (Fe2) wurden in

7. c-0 -z

10 cm^ DMF gelöst und anschließend das Hydrazid mit 3 cm^y 1 η HC1/THF und 0,13 cm^ Isoamylnitrit auf die übliche Weise in das Azid übergeführt. Dieses Azid wurde zu 1 mMol H-Phe-D-Lys(Boc)-PPA.HCl (E.4) gegeben und anschließend der pH-Wert mit TAA auf 7₅3 eingestellt.

Das Eeaktionsgemisch wurde 75 ii gerührt und anschließend eingedampft und der Eückstand mit Wasser (3 mal) gerührt. Der unlösliche Anteil wurde durch Lösen in Äthylacetat und Eingießen in die gleiche Menge Petroläther zum Ausfällen des Peptids weiter gereinigt«
Ef in Bz:EtOH (8:2) = 0,31 (SiO₂).

309841/ 1164

- 41 -

2315828 42 756

2. Entfernung der Schutzgruppen.

Bei Behandlung mit Trifluoressigsaure,wie in Beispiel beschrieben, erhielt man das Trifluoracetat, das mit Hilfe von Dowex X-8 in der Acetatform umgewandelt wurde in das entsprechende Acetat

H-(oC-MeHla-Glu-His-Phe-D-Lys-PPA. Ef in Bu:Py:Ac:Wa (2:3/4-: 1/4:1) = 0,34- auf

3. Auf die gleiche weise wurden die Acetate der folgenden Peptide hergestellt:

H-(0C-Me)Ala-Glu-His-Phe-D-Lys-Amf " Ef* = 0,33

H-(oC-Me)Ala-Glu-His-Phe-D-Lys-PEA Ef* = 0,35

H-ß-Ala-Glu-His-Phe-D-Lys-PPA Ef* =0,30

Desamino-Met-Glu-His-Phe-D-Lys-Amf Ef = 0,4-5

*Ef in Bu:Py:Ac:Wa (2:3/4-:1/4-:i) auf SiO₃.

Beispiel 10 H-Met-Glu-His-Phe-D-Lys -PhenyJalkyl amide

Auf die in Beispiel 9 beschriebene Weise wurden durch Kondensation mit Boc-Met-Glu(OtBu)-His-N-7 (erhalten durch Behandlung des Hydrazids nach A.2 mit Isoamylnitrit auf die übliche Weise) mit einem der Dipeptidamidderivate entsprechend E.4 und E.5 und anschließende Entfernung der Schutzgruppen der daraus erhaltenen Peptide, die Acetate der folgenden Peptide erhalten:

H-Met-Glu-His-Phe-D-Lys-PPA Ef* = 0,39

H-Met-Glu-His-Phe-D-Lys-PEA Ef* =0,38

H-Met-Glu-His-Phe-D-Lys-Amf Ef* = 0,4-2

H-Met-Glu-His-Phe-D-Lys-HPEA Ef* =0,35

*Ef in Bu:Py:Ac:Wa (2:3/4:1/4:1) auf SiO₃.

- 42 309841/1164

Beispiel 11 Sulfonevon Met- oder Desamino-Met-haltigen Peptiden

1. 175 mg des Peptide H-Met-GIu-His-Phe-D-Lys-Phe-OH wurden in einem Gemisch von 0,5 cnr Wasser, 0,1 cm* 4 η " Perdü. or-

τ,
säure, 0,02 cnr, 0,5 m Ammoniummolybdat gelöst und anschlies-

send 0,06 cur 30 !feiges H₂O₂ zugegeben. Das Gemisch wurde 2 h bei einer Temperatur von ungefähr 10⁰C gerührt und anschliessend mit 25 cnr tert.-Butanol/Wasser verdünnt und anschliessend Dowex in der Acetatform zugegeben. M"ach 30-minütigem Rühren wurde der Ionenaustauscher abfiltriert und das Filtrat lyophilisiert. Man erhielt H-Met(—> 0₂)-Glu-His-Phe-D-Lys-Phe-0H. Ef in Bu:Ac:Wa (4:1:1) =0,25 auf

2. Auf die gleiche V/eise erhielt man die folgenden Sulfone:

Peptide ' Ef auf SiO₂

(Bu:Ac:Wa 4:1:1)

H-Met(—* 0_o)-Glu-His-Phe~D-Lys-Phe-Gly-

OH ^ 0,23

H-Met(—^ 0₂)-Glu-His-Phe-D-Lys-PPA 0,32

Desamino-Met(—} O₉)-Glu-His-Phe-D-Lys-

Phe-OH ^ 0,33

Desamino-Met(—^ 0₂)-Glu-His-Phe-D-Lys-Tra 0,37

Desamino-Met(—> O₂)-GIu-His-Phe-D-Lys-Amf 0,42 Desamino-Met(—> 0₂)-Glu-His-Phe-D-Arg-Trp-

GIy-OH . 0,27

H-Met(—> 0₂)-Gln-His-Phe-D-Lys-Phe-0H . 0,29.

Beispiel 12

Sulfoxide-von Met- und Desamino-Met-Peptiden

50 mg des zu oxidierenden Peptids wurden in 5 cm . Essigsäure gelöst und anschließend 15 /il JO ^iges Wasserstoffperoxid zugegeben.

30-9841/ 11 Ö4 - 43 -

Das Gemisch wurde 1 h bei 20°C gerührt und anschließend eine Suspension von 40 mg Platinschwarz in Eisessig zugegeben und das Gemisch 30 min gerührt.

Nach dem Filtrieren wurde die Essigsäure im Vakuum abgedampft.

Der entstehende Rückstand wurde in einem Gemisch aus tert.-Butanol/Wasser (1:1) gelöst und lyophilisiert.

Auf diese Weise erhielt man die folgenden Sulfoxide:

Peptide - Ef auf SiO,-,

Η-Met(—-> O)-Glu-His-Phe-D-Arg-OH 0,16

H-Met(—-» O)-Glu-His-Phe-D-Lys-OH 0,20

H-Met(—> O)-Glu-His-Phe-D-Lys-Trp-OH 0,19 H-Met(—-> O)-Glu-His-Phe-D-Arg-Trp-Gly-OH 0,17

H-Met(—> O)-Glu-His-Phe-D-Lys-Phe-OH 0,19

H-Met(—^ O)-Glu-His-Phe-D-Lys-PPA 0,24

H-Met(—^ O)-Glu-His-Phe-D-Lys-Tra 0,17

Desamino-Het(—> O)-Glu-His-Phe-D~Lys-Phe-

OH 0,23

Desamino-Met(—^ O)-Glu-His-Phe-D-Lys-Tra 0,22 Desamino-Met(—?· O)-Glu-His-Phe-D-Lys-PPA 0,26 *Ef in Bu:Py:Ac:Wa (4:3/4:1/4:1).

Beispiel 13

Herstellung von H-Met(l,—» O)-Glu-His-Phe-D-Lys-?he-OH

Boc-L-Met(l,—> O)-OH wurde hergestellt durch Umsetzung von Boc-azid mit H-L-Met(l,—) O)-OH, (J. Biol. Chem. 169, (1947).

Boc-L-Het(l,—* O)-OH: Fp 68°C; [oC] ^⁰ = -58° (c = 1, DI-IF).

3 0 9 8 Λ 1 / 1 1 6 4 _ 44

Diese am Stickstoffatom geschützte Aminosäure wurde in den entsprechenden N-Hydroxy-succinimidoester umgewandelt durch Behandlung mit DCGI und HOSu. Der erhaltene aktive Ester wurde sofort für eine Kupplungsreaktion mit H-Glu(OtBu)-His-Phe-D-Lys(Boc)-Phe-OH (erhalten durch Kondensation von Z-GIu(OtBu)-His-azid mit H-Phe-D-Lys(Boc)-Phe-OH und anschließende Hydrie-• rung der Gruppe Z in Gegenwart von N-Äthylmorpholin verwendet. Das entstehende Peptid-Derivat Boc-L-Met(l,-—* O)-GIu(OtBu)-His-Phe-D-Lys(Boc)-Phe-OH, Rf in Bu:Ac:Wa (4:1:1) = 0,45 auf SiOp wurde auf die oben beschriebene Weise mit Hilfe von TFA von den Schutzgruppen befreit und in das Acetat umgewandelt: H-L-Met(1,—* O)-Glu-His-Phe-D-Lys-Phe-OH-Acetat: Ef in Bu:Py:Ac:Wa (2:3/4:1/4:1) = 0,23«

Auf die gleiche Weise wurde das Peptidsulfoxid H-L-Met(d,—> Glu-His-Phe-D-Lys-Phe-OH-Acetat hergestellt ausgehend von Boc-L-Met(d,— > O)-OH, Fp 135°C.

Beispiel 14 Zinkkomplexe

Von einer Lösung von Zinkchlorid enthaltend 50 mg Zink/cm^ wurden 1,5 cm-⁵ zu einer Lösung von 31₅ 5 mg Na₂HPO^. 2H₂O in 30 cm^ destilliertem Wasser gegeben= .Der entstehende Fiederschlag von Zinkphosphat wurde erneut durch Zugabe von 4 η HCl gelöst. Dann wurden 175 mg NaCl und 0,5 g Benzylalkohol zu dem Gemisch gegeben. Anschließend wurden 1,5 mg des Hexapeptids H-L-Met-L-Glu-L-His-L-Phe-D-Lys-L-Phe-OH in diesem Gemisch gelöst und anschließend ausreichend 1 η Natriumhydroxid zugegeben, um' den pH-Wert des Gemisches auf 8,5 einzustellen«, Anschließend wurde das Volumen mit destilliertem Wasser auf 50 cm-⁵ aufgefüllt.

1 cnr der Suspension enthielt:

309841/1184 . -. - - 45 -

2315828

/Ug Hexapeptxd

1,5 mg Zink

0,63 mg Na₂HPO₄.2H₂O

3,5 mg NaGl

mg Benzylalkohol.

Pat ent anSprüche

309841/1164

Claims

s Ji*-Onίΐίικί- ου SC-IIIVIs-IO-EItSVHASSH -' iKX 5 24 070 ΤΕΙ,ΚΙΙΙΙΛΜΜΙ?! 1»HOTKCT 1'ΛΤKNT M ÜNC·IIKX - 46 - 1Α-42 756 Patentansprüche

1. Peptide der allgemeinen Formel:

A-L-GIu(X)-L-His-L-Phe-D-Lys(oder D-Arg)-Y ' ' -

in der A

H-L-Met-, H-D-Met, H-L-Met (—* O)-, H-D-Met(—> O) , H-L-Met(—* Op) , H-D-Met(—} O₂), Desamino-Met, Desamino-Met(—) O), Desamino-Met(—* O₂) oder die Gruppe H₂IT-B

in der B eine verzweigte oder nicht verzweigte Alkylengruppe mit 1-6 Kohlenstoffatomen ist,

X die Gruppe -OH oder -NHp und

Y eine Hydroxygruppe oder die Gruppe -L-Trp-OH, - L-Phe-OH, -L-Trp-Gly-OH, -L-Phe-Gly-OH, eine (Itf-Phenylalkyl)aminogruppe der Formel: -NH-AIk ~~v_y oder eine (N-ß-Indolylalkyl) amino gruppe, wobei Alk eine verzweigte oder nicht verzweigte Alkylengruppe mit 1-6 Kohlenstoffatomen und '

E ein Wasserstoff- oder' Halogenatom oder eine Hydroxy- oder niedere Alkyl- oder Alkoxygruppe mit-1-4 Kohlenstoffatomen ist,

bedeutet, sowie die funktioneilen Derivate dieser Peptide und Peptidderivate.

2. Peptide nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Y die Gruppe -L-Phe-OH" oder -Tra bedeutet.

3. Peptidenach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet , daß A die Gruppe H-L-Met-, H-L-Met(—* O), H-L-Met(—»Op), Desamino-Met, Desamino-Met(—>0), Desamino-Het-(—* Op) oder ß-Ala bedeutet.

309841/1164 - ¹^ -

4. Peptide nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet , daß A die Gruppe L-Methionylsulfpn oder Desamino-methionyl-sulfon bedeutet.

5. Peptide nach Anspruch 1 bis 4-, dadurch gekennzeichnet , daß sie in Form eines Metallkomplexes vorliegen.

5. Verfahren zur Herstellung der Peptide nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man die entsprechenden Peptidfragmente in der richtigen Reihenfolge aneinanderkuppelt und anschließend,soweit vorhanden, Schutzgruppen entfernt und/oder die so erhaltenen Peptide in die funktionellen Derivate umwandelt und/oder in die entsprechender Peptidsulfoxide oder Peptidsulfone oxidiert, das letzte soweit der Rest A mit endständigem Stickstoff Met oder Desamino-Met bedeutet.

62XXV 309841/T164