DE2649146A1

DE2649146A1 - Nonapeptide

Info

Publication number: DE2649146A1
Application number: DE19762649146
Authority: DE
Inventors: Mildred Catherine Rebstock; Eugene Leroy Wittle
Original assignee: Parke Davis and Co LLC
Current assignee: Parke Davis and Co LLC
Priority date: 1975-10-29
Filing date: 1976-10-28
Publication date: 1977-05-12
Also published as: JPS5257177A; US4086219A; FR2329293A1; NL7611963A; GB1542703A; BE847762A

Description

Parke, Davis & Company Joseph Campau at the River, Detroit, Michigan 48232

betreffend:

Nonapeptide

Die Erfindung betrifft neue Peptidverbindungen, die geeignet sind, als Antagonisten für den das luteinisierende Hormon freisetzenden Faktor und Verfahren zu deren Herstellung. Die Erfindung betrifft besonders neue Nonapeptide der allgemeinen Formel

R₁ -Trp-Ser-Tyr-R.p-Leu-Arg-Pr 0-GIy-R₅ (I)

und deren Salze, wobei R. Z-GIn, Z-GIn (bzl), Bhoc-Gln, Boc-His (bzl), Z-His (bzl), Boc-Ser (bzl), Boc-Pro, Z-Leu, Boc-Leu, Z-Tyr (bzl), Z-IIe, Boc-Cys (bzl), Z-Phe oder Z-Ser (bzl), R₂ D-Phe, D-AIa, D-Leu, D-Trp, D-Tyr, D-Tyr (Me), D-Ser, D-Met, D-Arg, D-VaI, D-His, D-GIn, D-Phs, D-Thr, D-Pro oder D-Asn und R₅ NH₂, NH-(nieder Alkyl) oder N=(nieder Alkyl)₂ ist, wobei Verbindungen bevorzugt sind, bei denen R₅ NH₂ ist. Die Erfindung betrifft auch bestimmte Peptidzwischenprodukte und ihre Salze, die zur Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen angewandt werden. "¹In der Formel I werden die üblichen Symbole für Aminosäurereste von Peptidverbindungen und Schutzgruppen, die daran gebunden sind, angewandt, wobei die dort angegebenen Symbole im einzelnen die folgende Bedeutung haben:

*(LRF-Antagonisten)

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Trp = L-Tryptophyl; Ser = L-Seryl; Tyr = L-Tyrosyl; Leu = L-Leucyl; Arg = L-Arginyl; Pro = L-Prolyl, GIy = Glycin; Z-GIn = N^-Benzyloxycarbonyl-L-glutaminyl; Z-GIn (bzl) = N^Benzyl-N^a-benzyloxycarbonyl-L-glutaminyl; Bhoc-Gln = KF-Benzhydryloxycarbonyl-L-glutaminyl; Boc-His (bzl) = N^a-t-Butoxycarbonyl-N^im-benzyl-L-histidyl; Z-His (bzl) = N°-Benzyloxycarbonyl-N^im-benzyl-L-histidyl; Boc-Ser (bzl)= O-Benzyl-N^t-butoxycarbonyl-L-seryl; Boc-Pro = N^-t-Butoxycarbonyl-L-prolyl; Z-Leu = N^-Benzyloxycarbonyl-L-leucyl;· Boc-Leu = N^a-t-Butoxycarbonyl-L-leucyl; Z-Tyr (bzl) = 0-Benzyl-N°^-benzyloxycarbonyl-L-tyrosyl; Z-IIe = N^-Benzyloxycarbonyl-L-isoleucyl; Boc-Cys (bzl) = S-Benzyl-N^-tbutoxycarbonyl-L-cysteinyl; Z-Phe = N^-Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl; Z-Ser (bzl) = O-Benzyl-N^-benzyloxycarbonyl-L-seryl; D-Phe = D-Phenylalanyl; D-AIa = D-Alanyl; D-Leu = D-Leucyl; D-Trp = D-Tryptophyl; D-Tyr = D-Tyrosyl; D-Tyr(Me) = O-Methyl-D-tyrosyl; D-Ser = D-Seryl; D-Met = D-Methionyl; D-Arg = D-Arginyl; D-VaI = D-Valyl; D-His = D-Histidylj D-GIn = D-Glutaminyl; D-Phs = D-Phenylseryl(erythro oder threo); D-Thr = D-Threonyl; D-Pro = D-Prolyl; und D-Asn = . D-Asparaginyl. Außerdem bedeutet der Ausdruck "nieder Alkyl" eine grade, verzweigte oder cyclische gesättigte Kohlenwasserstoff gruppe mit bis zu 6 Kohlenstoffatomen, wie eine Methyl-, Äthyl-, Isopropyl- oder Cyclopropylgruppe. Die in der Formel I angewandten Symbole werden auch in den folgenden für andere Verbindungen angegebenen Formeln angewandt und haben dabei jeweils die oben angegebene Bedeutung.

Die Verbindungen der Formel I, und deren Säureadditionssalze können erfindungsgemäß hergestellt werden durch Umsetzung eines Azids der Formel

X-N₃ (II)

mit einer Verbindung der Formel

Y-Pro-Gly-R, (III)

in einem nicht reagierenden Lösungsmittel, vorzugsweise Dimethylformamid oder einem Dimethylformamid-Tetrahydrofuran-Gemisch, wobei X I^-Trp-Ser-Tyr, R

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z> —

oder I^-Trp-Ser-Tyr-R^-Leu, Y Arg, Leu-Arg oder iU-Leu-Arg ist und R₂ und R^ die oben angegebene Bedeutung haben. Die Verbindungen der Formeln II und III werden so für die Reaktion ausgewählt, daß das entstehende Produkt ein Nonapeptid der Formel I ist.

Das Azid der Formel II wird in situ hergestellt und angewandt, während die Verbindung der Formel III in der Form angewandt wird, in der die Arg-Gruppe in Form eines Säureadditionssalzes mit einer starken Säure, wie Salzsäure oder Trif'luoressigsäure, vorliegt. Die beiden Komponenten II und III werden im allgemeinen in ungefähr äquimolaren Mengen bei Temperaturen von ungefähr -30 bis ungefähr +30⁰C 16 bis 50 Stunden lang umgesetzt, obwohl Temperaturen von 30 bis 50⁰C unter Verkürzung der Reaktionszeit angewandt werden können.

Die Verbindungen der Formel I werden vorzugsweise in Form eines Säureadditionssalzes isoliert, können jedoch gegebenenfalls auch in Form der freien Base isoliert werden.

Die Peptidazidverbindungen der Formel II, die als Reaktionspartner bei dem oben angegebenen Verfahren angewandt werden, werden üblicherweise in situ hergestellt durch Umsetzung einer Peptidhydrazidverbindung der Formel

X-NHM₂ (IV)

in der X die oben angegebene Bedeutung hat,mit einem niederen Alkylnitrit, vorzugsweise Isoamylnitrit_; in Gegenwart einer Säure in einem inerten Lösungsmittel, wie Dimethylformamid,und das entstehende Azid wird weiter, wie oben angegeben,ohne vorherige Isolierung umgesetzt. Die bevorzugte Säure zur Azidherstellung ist eine Lösung von Chlorwasserstoff in Dimethylformamid oder Tetrahydrofuran, wobei zwischen 3 und 6 Äquivalent Säure pro Äquivalent Hydrazid der Formel IV angewandt werden. Die Herstellung des Azids wird bei einer Temperatur zwischen -60 und 10⁰C durchgeführt. Nach der in-situ-Bildung des Azids der Formel II und vor der weiteren Umsetzung des

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- if -

Peptidazids mit einer Verbindung der Formel III unter Bildung des Nonapeptids der Formel I, wird ein tertiäres Amin, wie Triäthylamin zu dem Reaktionsgemisch zugesetzt, um die angewandte Säure zu neutralisieren. Diese Azide fallen ebenfalls unter die Erfindung.

Die PeptidhydrazidverMndungen der Formel IV können nach verschiedenen Verfahren hergestellt werden. Bestimmte dieser Verbindungen können in Form von Säureadditionssalzen, wie als Hydrochloride, Sulfat-, Acetat-> Citrat-, Trifluoracetatsalze uswi,vorliegen,und diese Salze fallen ebenfalls unter die Erfindung. Das Hydrazid der Formel IV, bei dem X die oben angegebene Bedeutung hat, wird hergestellt durch Umsetzung eines Esters der Formel

X-OR₄ (V)

in der X die oben angegebene Bedeutung hat und R/ eine niedere Alkyl-, vorzugsweise Methylgruppe ist₍mit überschüssigem Hydrazin (1:1,1 bis 100), vorzugsweise in Form des Hydrats^n einem organischen Lösungsmittel, wie Dimethylformamid, Methanol, Äthanol usw. Die Reaktion wird im allgemeinen bei Raumtemperatur durchgeführt, obwohl Temperaturen von 5 bis 100⁰C und Zeiten von ungefähr 30 Minuten bis ungefähr 200 Stunden, vorzugsweise ungefähr 72 Stunden angewandt werden können.

Die Ester der Formel V werden hergestellt durch Umsetzung einer Verbindung der Formel

X^I-0R₄ (VI)

in der R, die oben angegebene Bedeutung hat und X¹ Trp-Ser-Tyr, Rp-Leu, Trp-Ser-Tyr-R₂, Trp-Ser-Tyr-R₂-Leu oder Leu ist, wobei R₂ die oben angegebene Bedeutung hat oder einem Salz der Verbindung VI, vorausgesetzt, daß in Rp ein basisches Zentrum vorhanden ist, mit einer Verbindung der Formel

X¹^-OH (VIl)

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wobei JT R₁, R^-Trp-Ser-Tyr oder R₁-TrP-SBr-TYr-R₂ bedeutet_/ in einem organischen Lösungsmittel, wie Dimethylformamid. Diese Kupplungsreaktion kann nach verschiedenen Verfahren erreicht werden. Zu Anfang kann sie durchgeführt werden bei einer Temperaturen von ungefähr -10⁰C innerhalb von 2 Stunden und anschließend ungefähr 24 Stunden bei Raumtemperatur unter Anwendung der Verbindung VII in Form des Pentachlorphenylesters und Triäthylamin. Ein zweites Verfahren, das wieder Dimethylformamid als Lösungsmittel anwendet und die ersten drei Stunden bei -10 bis O⁰C arbeitet und anschließend zwei Tage bei Raumtemperatur, beruht auf der Verwendung von 1-Hydroxybenztriazol und Dicyclohexylcarbodiimid zur Beschleunigung der Reaktion. Ein drittes Verfahren umfaßt die Umwandlung von Verbindungen der Formel VII in den Methylester nach üblichen Veresterungsverfahren oder der Ester kann direkt durch Synthese, wie in den folgenden Beispielen beschrieben, erhalten werden.

Der Methylester wird dann in das entsprechende Hydrazid umgewandelt,nach dem zur Herstellung der Hydrazide der Formel IV angegebenen Verfahren,und diese Substanz kann zu dem entsprechenden Azid nach dem zur Herstellung der Verbindungen der Formel II angegebenen Verfahren umgewandelt und an eine Verbindung der Formel VI gekuppelt werden, nach dem oben beschriebenen Azidkupplungsverfahren .

Bei Anwendung der oben angegebenen allgemeinen Verfahren in entsprechender Weise kann man irgendeinen der gewünschten Ester der Formel V herstellen.

Solche Ester der Formel VI, die nicht bereits in der Literatur angegeben sind, werden hergestellt nach dem gleichen Verfahren, wie es für die Herstellung von Verbindungen der Formel V angegeben ist, wobei eine Verbindung der Formel

X^I][I-OH

zusammengebracht wird mit einer Verbindung der Formel

X^IV-0R₄

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III

wobei X Trp, R₂ oder Trp-Ser-Tyr ist und wobei die endständige Aminogruppe durch eine Benzyloxycarbonyl-, Benhydryloxycarbonyl- oder t-Butoxycarbonylgruppe geschützt ist, X^IV R₂, Leu, R₂-LeU, Ser-Tyr oder Ser-Tyr-R₂~Leu bedeutet und R^ die oben angegebene Bedeutung hat₍und anschließende Entfernung der Benzyloxycarbonyl- oder Benzylhydryloxycarbonylgruppe durch Lösen des Produktes in Methanol und anschließende Behandlung mit Palladium-auf-Kohle in Gegenwart von molekularem Wasserstoff ungefähr 2,5 Stunden bei Raumtemperatur oder Entfernung der tert.-Butoxycarbonylgruppe durch Zersetzung mit einer schwachsauren Lösung unter Anwendung einer verdünnten wäßrigen Säure, wie Salzsäure oder Trifluoressigsäure.

Alle Verbindungen X -OH sind in nicht geschützter Form bekannt mit Ausnahme von Trp-Ser-Tyr-OH. Während die meisten der geschützten Verbindungen ebenfalls bekannt sind, können die nicht in der Literatur angegebenen hergestellt werden durch Umsetzung von Carbobenzoxychlorid oder Benzhydryloxycarbonylchlorid mit der entsprechenden Aminosäure in Gegenwart einer Base,nach dem in der Peptidchemie allgemein zur Einführung von Schutzgruppen angewandten Verfahren oder durch Umsetzung von tert.-Butoxycarbonylazid mit der entsprechenden Aminosäure,nach dem Verfahren das beschrieben ist in "Solid Phase Peptide Synthesis" von J.M. Steward und J₀D. Young, W.H. Freeman & Company, San Francisco (I969), Seite 28.

Das geschützte Tripeptid wird vorzugsweise erhalten durch das oben beschriebene Kupplungsverfahren unter Anwendung von geschütztem Trytophan mit Ser-Tyr-OR,, wobei R. die oben angegebene Bedeutung hat. Das Ser-Tyr-OR, wird erhalten durch Entfernung der Schutzgruppe des Carbobenzoxyderivats von Ser-Tyr-OR,

Die Verbindung der Formel X-OR^, in der X Leu ist, ist in der Literatur angegeben. Das Verfahren zur Herstel-

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lung von X -ORy₁, wobei X^IV Ser-Tyr ist, ist unmittelbar oben

IV
angegeben. Wenn X Ser-Tyr-R_o-Leu ist, wird die Verbindung

IV
X -OH hergestellt durch Kupplung von geschütztem Ser-Tyr-OH mit R^-Leu-OR^, wobei R₂ und R, die oben angegebene Bedeutung haben unter Anwendung des oben beschriebenen Verfahrens und eines Azidzwischenproduktes oder Kupplung der beiden Fragmente mit Hilfe von Dicyclohexylcarbodiimid in einem nicht polaren Lösungsmittel bei Raumtemperatur bis die Ausfällung von Dicyclohexylharnstoff vollständig ist und anschließende Entfernung der Schutzgruppe unter Anwendung der oben beschriebenen Verfahren zur Entfernung der Schutzgruppe. Die Verbindungen der Formel Rp-Leu-OR, werden hergestellt durch Kupplung der geschützten bekannten Verbindung Rp-OH mit bekanntem Leu-OR, unter Anwendung der oben angegebenen Azid- oder Dicyclohexylcarbodiimid-Verfahren und der oben angegeben Verfahren zur Entfernung der Schutzgruppe. Wenn X Rp ist, werden übliche Veresterungsverfahren angewandt.

Die Verbindungen der Formel VII, die nicht bereits in der Literatur angegeben oder in einem anderen Teil dieser Beschreibung beschrieben worden sind, werden im wesentlichen nach dem gleichen Verfahren hergestellt, wie es zur Herstellung von Verbindungen der Formel V angegeben ist. Eine Verbindung der Formel

X^V-0H
wird mit einer Verbindung der Formel

X^VI-0R₄

zusammengegeben, wobei X R^-Trp-Ser-Tyr und X R₂ ist,nach dem zur Herstellung von Verbindungen der Formel V angegebenen Verfahren. Die Hydrolyse der entstehenden Ester unter Verwendung von verdünntem Alkali in nur etwas größeren als äquimolaren Mengen, ergibt die freie Säure der Formel VII, oder der Ester kann über das Hydrazid-und Azidverfahren angewandt werden, wie an anderer Stelle beschrieben, zur direkten Herstellung der Verbindung der F_ormel VII.

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Die Verbindungen der Formel X¹¹OH, in der X¹¹ R₁ ist, sind alle bekannt mit der Ausnahme von Bhoc-Gln, das hergestellt wird aus Benzhydryloxycarbonylhydrazid, Natriumnitrit und L-Glutamin unter Verwendung von wäßriger Essigsäure als Lösungsmittel bei einer Temperatur von 5°C. Die Verbindungen der Formel X OH, bei denen X IL-Trp-Ser-Tyr ist, werden hergestellt durch Umsetzung einer bekannten R^-OH-Verbindung mit dem Tripeptid Trp-Ser-Tyr-OR^, nach dem zur Herstellung von Verbindungen der Formel V beschriebenen Verfahren und anschließende Hydrolyse des Esters,oder der Ester kann 'angewandt werden über das an anderer Stelle zur direkten Herstellung der Verbindung der Formel VII beschriebene Hydrazidkupplungsveriahren.

Die Verbindungen der Formel X OR/ werden hergestellt aus bekannten D-Aminosäuren nach Standardveresterungsverfahren.

Die Verbindungen der Formel III und ihre Säureadditionssalze, wie die Hydrochlorid-, Sulfat-, Acetat- Citrat-, Trifluoracetat-, Benzoatsalze usw.,können nach verschiedenen Verfahren hergestellt werden. Die neuen Verbindungen der Formel III ,und ihre Säureadditionssalze , die ebenfalls unter die Erfindung fallen, sind diejenigen, bei denen Y Y¹ ist und Y¹ definiert ist als Rp-Leu-Arg. Verbindungen der Formel III und ihre Säureadditionssalze, bei denen Y, Rp und R, die oben angegebene Bedeutung haben, werden hergestellt durch Reduktion (Abspaltung) der Schutzgruppe oder Entfernung einer Schutzgruppe durch saure Zersetzung aus einer Verbindung der Formel

y"-PrO-GIy-R₃ (VIII)

vorzugsweise in Form des Säureadditionssalzes, wobei R^ die oben angegebene Bedeutung hat und Y" Arg, Leu-Arg oder vorzugsweise R£-Leu-Arg ist, wobei die endständige Aminogruppe geschützt ist durch eine Gruppe, die leicht durch Reduktion abgespalten werden kann, wie eine Benzyl-

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oxycarbonyl- oder Benzhydryloxycarbonylgruppe, wobei die Verbindung in einem Lösungsmittel, wie einem niederen Alkylalkohol, vorzugsweise Methanol, gelöst ist und ein Edelmetallkatalysator, wie Palladium-auf-Kohle_/ in Gegenwart von molekularem Wasserstoff angewandt wird oder durch Spaltung, wenn die Schutzgruppe leicht durch saure Zersetzung entfernt werden kann, wie eine tert-Butoxycarbonylgruppe.unter Anwendung einer Säure, wie Trifluoressigsäure, Salzsäure, Bromwasserstoffsäure usw. in einem entsprechenden Lösungsmittel, wie Dioxan, Di chlorine than, Essigsäure usw. Die Reduktion oder Säurezersetzungsreaktion werden durchgeführt bei ungefähr 10 bis ungefähr 50°C, vorzugsweise bei Raumtemperatur, und zwar einige Minuten bis zu ungefähr 8 Stunden, vorzugsweise ungefähr 15 Minuten für die Säurezersetzung. Der pH-Wert kann so eingestellt werden, daß die Verbindung in die freie Base umgewandelt wird.

Die Salze der Verbindungen der Formel VIII werden hergestellt aus den Methylestern der Formel

Y"-Pro-Gly-OCH₃ .HCl (IX) .

in der Y" die oben angegebene Bedeutung hat. Diese Verbindung wird 'umgesetzt mit einer Verbindung aus der Gruppe von Ammoniak, niederen Alkylaminen oder Di-(niederen Alkyl)aminen. Die Reaktion wird bei Temperaturen von ungefähr 5 bis ungefähr 60°C einige Stunden bis zu ungefähr 10 Tagen durchgeführt. Wenn stark flüchtige Amine angewandt werden, wird die Reaktion in einem geschlossenen Druckgefäß durchgeführt .

Es ist auch häufig vorteilhaft, wenn R^H weniger reaktionsfähig ist, Verbindungen der Formel III herzustellen, ausgehend von P-PrO-GIy-R₇₅ (lila), wobei P eine geeignete Schutzgruppe ist, wie eine Benzyloxycarbonyl- oder tert.-Butyloxycarbonylgruppe. Nach Entfernung der Schutzgruppe von P-Pro-Gly-R^, nach den oben beschriebenen Verfahren, kann das entstehende Pro-Gly-R^, gekuppelt wer-

709819/1042 "^/Λ0

-'■*- 2649H6

an.Y^{1 1}OH . Λή~

den/nach Standardverfahren in der Peptidchemie wie mit Hilfe von Dicyclohexylcarbodiimid in tert.-Butanol. Die Entfernung der Schutzgruppe von dem entstehenden Υ''-Pro-Gly-it, ergibt dann die gewünschte Verbindung der Formel III (Y-Pro-Gly-R^).

Die Herstellung von P-Pro-Gly-R,, kann durch verschiedene Verfahren erreicht werden einschließlich der Umsetzung von RJH mit P-Pro-Gly-OH,nachdem die zuletzt genannte Verbindung umgewandelt worden ist in ein aktiviertes Zwischenprodukt über Dicyclohexylcarbodiimid, Dicyclohexylcarbodiimid in Kombination mit Pentachlorphenol, mit Diphenylphosphorylazid (Chem. Pharm. Bull. (Tokyo) 22, 859-863,1974) oder mit Hilfe des gemischten Anhydridverfahrens.

•Die Verbindungen der Formel IX werden hergestellt aus bekanntem Pro-Gly-OCH^.HCl, das gekuppelt wird an bekanntes geschütztes Arg-OH, geschütztes Leu-Arg-OH oder geschütäes Rp-Leu-Arg-OH, nach dem zur Herstellung von Verbindungen der Formel V angegebenen Verfahrm. Ein zweites Verfahren zur Herstellung bestimmter Verbindungen der Formel IX umfaßt die Kupplung von Arg-Pro-Gly-OCH^.HCl mit bekanntem geschützten Leu-OH oder geschütztem R^-Leu-OH.

Außerdem können die Verbindungen der Formel VIII hergestellt werden durch Umsetzung von geschütztem Pro-Gly-OR/ mit einem Amin der Formel RJH, wobei R^, die oben angegebene Bedeutung hat₍ unter Anwendung der zur Herstellung von Verbindungen der Formel VIII angegebenen Reaktionsbedingungen. Das entstehende Produkt, geschütztes Pro-Gly-R-,, wird nach den zur Entfernung einer Schutzgruppe von einer Verbindung der Formel VIII angegebenen Verfahren von der Schutzgruppe befreit. Die Verbindungen der Formel Pro-Gly-R^ werden entweder an bekanntes geschütztes Arg-OH oder geschütztes Leu-Arg-OH gekuppelt nach dem Verfahren, das angegeben ist zur Herstellung von Verbindungen der Formel V.

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Schließlich kann die Amidfunktion in eine freie Säure der Formel

Y"-Pro-Gly-OH

in der Y" die oben angegebene Bedeutung hat, eingeführt wer den unter Anwendung des Verfahrens, wie es allgemein beschrieben ist zur Herstellung bestimmter Verbindungen der Formel VIII,und die entstehende Verbindung der Formel

wird, wie oben bei der Herstellung von Verbindungen der Formel III angegeben, von der Schutzgruppe befreit.

Alternativ können Verbindungen der Formel III hergestellt werden durch stufenweise Kupplung und Entfernung der Schutzgruppe von einer Verbindung der Formel y'-Pro-R^ unter Verwendung von geschütztem Leu-OH, geschütztem Arg-OH, geschütztem Leu-Arg-OH, geschütztem Rp-OH in der entsprechenden Anzahl und Reihenfolge nach dem Verfahren, wie es angegeben ist zur Herstellung von Verbindungen der Formel V.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen bilden Säureadditionssalze mit einer Vielzahl von anorganischen und organischen Säuren. Pharmazeutisch geeignete Säureadditionssalze werden gebildet von solchen Säuren, wie Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Essigsäure, Bernsteinsäure, Citronensäure, Maleinsäure, Apfelsäure, Gluconsäure, Pamoasäure und verwandten Säuren. Die Erfindung umfaßt auch allgemein Säureadditionssalze, da ein toxisches Salz in die freie Base oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz umgewandelt werden kann. Die freie Base und die Säureadditionssalze sind durch Einstellung des pH-Wertes oder mit Hilfe von Ionenaustauscherharzen ineinander umwandelbar. Sie können sich in der Löslichkeit unterscheiden, sind jedoch, wie oben erwähnt, im übrigen für die erfindungsgemäßen Zwecke äquivalent.

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Außerdem können die erfindungsgemäßen Verbindungen und ihre Säureadditionssalze in wasserfreien sowie in solvatisierten einschließlich hydratisierten Formen vorliegen. Im allgemeinen sind die hydratisierten und mit pharmazeutisch geeigneten Lösungsmitteln solvatisierten Formen den wasserfreien oder nicht solvatisierten Formen für die erfindungsgemäßen Zwecke äquivalent. Typische Hydrate sind die obenerwähnten Hydrochloride oder Sulfate in Form ihrer Monohydrate.

Die erfindungsgemäßen Nonapeptide wurden auf ihre LRF-Antagonisten-Wirkung in vitro untersucht, wobei Zellkulturen von Hypophysen-Vorderlappen von Ratten (rat anterior pituitary cell cultures) angewandt wurden (VaIe et al Endocrinology, 91, 562 (1972)). Db Hemmung der durch LRF-induzierten Freisetzung von luteinizierendem Hormon (LH) in das Zellkulturmedium wird als Endpunkt dieser in-vitro-Bestimmung angesehen. Aktive Peptide wurden dann in vivo nach dem von Humphrey et al (Endocrinology, 92, 1515, (1972)) angegebenen Verfahren untersucht. Die Antagonistenwirkung wurde bestimmt durch die Hemmung der durch LRF-induzierten LH-Freisetzung bei der weiblichen Ratte und der LRF-induzierten Ovulation bei Kaninchen.

Im folgenden sind die Ergebnisse der oben angegebenen in-vitro-Tests für bestimmte bevorzugte Verbindungen angegeben.

../Tabelle

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Aktivität bei in-vitro-Tests an Zellkulturen von Eypophysen-Vorderlappen von Ratten

Verbindung

Molkonzentration LH-Wert prozentuale

(ng/ml) Hemmung der

LH-Freisetzung

N^a-Benzyloxycarbonyl-0- 6x10
benzyl-L-seryl-L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-D-phenylalanyl-L-leucy1-L-arginyl-L-prolylglycinamid'-hydro chlor id

3,5XlO 2xlO"9 lxlo"^y 6x10"^l

2x10' _n ^L0 1x10" ¹^

Vergleich LRF 3_r5x10

Vergleich Salzlösung

"¹⁰ _f59 6 96 9 8l·

17 85

18 J 89 23,09

28,^7

3^,50

32,11

6,76

109 99 88 56 52 36 Ik 0

N^a-Benzyloxycarbonyl-L-glutaminyl-L-tryptoptiyl-L-seryl-L-tyrosyl-D-phenylalany1-L-leucy 1-L-arginyl-L-prolyl-glycinamidessigsäure-salz

Vergleich LRF
Vergleich Salzlösung

Ν^α-t-Butoxycarbony1-0-benzyl-L-seryl-L-tryptophyl-L-aeryl-L-tyrosyl-D-tryptophy1-L-ieucy1-L-arginyl-L-prolyl-glycinamid*- hydrochlorid'-

Vergleich LRF
Vergleich Salzlösung

7x10

-8 -8

2xl0"⁸

1,2x10"

7x10"9

4x10-9

2xl0"9

3,5x10

-10

6xl0"⁸

1x10-8

6xl0"⁹

2,5xlo"

1x10-9

²'^5xlo-io

3,5x10 9,49 9,79

10,07

I3

18.60 20_r76 22,43 26.23 8 24

7,80

8.95

8.96

10^64

18,85

21 44

25,53 29,05 4o_r92 10^7

93

91

90

71

42 30 21

108 104 104

99 72 64 50 39

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Es ist bekannt, daß der das luteinisierende Hormon freisetzende Faktor (LRF) in dem Hypothalmus von Säuretieren gebildet wird, von wo er freigesetzt und über das Hypothalmus-Hypophysen-System (hypothalamic-hypophyseal portal system) zu dem vorderen Hypophysenlappen (anteroir pituitary) transportiert wird, wo er die Sekretion des luteinisierenden Hormons stimuliert. Die Sekretion des luteinisierenden Hormons von dem Hypophysen-Vorderlappen führt wiederum zur Ovulation bei Versuchstieren. So kann LRF angewandt werden, um die Ovulation bei Säugetieren einzuleiten. (Ein Bericht über die Struktur von LRF, das auch als luteinisierendes Hormon freisetztendes Hormon oder LH-RH bezeichnet wird,und

findet sich in '

seine biologische Aktivität Science, Band 174, Nr. 4008, Oktober 1971, Seiten 511-512.) Die erfindungsgemäßen Nonapeptide sind geeignet zur Steuerung der Ovulation und zur Einschränkung der Fruchtbarkeit.

Die Erfindung wird, durch die folgenden Beispiele näher erläutert.

Beispiel 1 N^-Benzyloxycarbonyl-O-benzyl-L-seryl-L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-D-phenylalanyl-L-leucyl-L-arginyl-L-prolyl-glycinamid-hydrochlorid

a) N^w-Benzyloxycarbonyl-L-tryptophyl-L-serin-methyl·ester

5 g L-Serin-methyl-ester-hydrochlorid wurden in 75 ml Dimethylformamid gelöst und die Lösung im Eisbad gekühlt. 4,9 ml Triäthylamin wurden zugegeben und dann 11,9 g N^-Benzyloxycarbonyl-L-tryptophan, 5,25 g 1-Hydroxybenztriazol und schließlich 8,0 g Dicyclohexylcarbodiimid. Das Reaktionsgemisch wurde unter Kühlung im Eisbad über Nacht gerührt und die Temperatur anschließend auf Raumtemperatur erhöht und anschließend weitere 24 Stunden gerührt. Das Gemisch wurde filtriert und der Feststoff mit Dimethylformamid gewaschen. Das Filtrat wurde unter vermindertem Druck eingedampft und der Rückstand in Äthylacetat gelöst, mit verdünnter Salzsäure,gesättigter Salzlösung, drei Mal mit 5-%iger Natriumbicarbonatlösung,gesättigter ' Salzlösung und schließlich mit Wasser gewaschen.

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vfc.

Die Äthylacetatlösung wurde dann über Magnesiumsulfat getrocknet und eingedampft. Der Rückstand wurde aus 250 ml Benzol umkristallisiert und anschließend aus Äthylacetat und Petroläther. Man erhielt 12,5 g; Fp. 133-135°C; ^ -12,4° (c 2, Methanol); UV-Spektrum in Methanol ²⁹° ^E1 ¹¹⁵' \ax ^{281 E}1 ¹³¹J ληβχ ^{274 E}1

b) N^a-Benzyloxycarbonyl-L-tryptophyl-L-seryl-hydrazid

12,3 g des Methylesters wurden in 180 ml Methanol gelöst und mit 8 ml Hydrazinhydrat behandelt. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur stehengelassen und filtriert. Das feste Produkt wurde mit kaltem Methanol gewaschen, mit 400 ml Methanol zum Sieden erhitzt und heiß filtriert. Man erhielt 8,33 g; Fp. 176-178⁰C; £q<J^³ -18°

(c 2,2, DMF); UV-Spektrum in Methanol "λ _nv 290 eJ 117; * λ . max ι

281 *\ 134; ^_ax 274 Ε} 125.

c) N^-Benzyloxycarbonyl-L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosinmethyl-ester

9,9 g (22,5 mMol) N^-Benzyloxycarbonyl-L-tryptophyl-L-seryl-hydrazid wurden in 150 ml Dimethylformamid für spektroskopische Zwecke gelöst und auf· -20⁰C gekühlt. Die kalte Lösung wurde mit 51 ml 2,34n Chlorwasserstoff in Tetrahydrofuran und mit 4,7 ml Isopentylnitrit (90 %) behandelt und eine halbe Stunde bei -20⁰C gerührt. Die Lösung wurde dann auf -25°C abgekühlt und mit 20,45 ml Triäthylamin und 5,74 g L-Tyrosin-methyl-ester-hydrochlorid behandelt. Das Reaktionsgemisch wurde eine halbe Stunde bei -20°C_f15 Minuten bei -20 bis -10⁰C und drei Stunden bei 0⁰C gerührt.und anschließend über Nacht bei 0 bis 5°C stehengelassen und filtriert. Die Lösungsmittel wurden unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde in Äthylacetat gelöst und mit 0,1n Salzsäure,gesättigter Salzlösung, 5-%iger Natriumbicarbonatlösung und wieder gesättigter Salzlösung gewaschen. Das Äthylacetat wurde ge-

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trocknet und abgedampft. Der Rückstand wurde in Äthanol auf genommen und durch Abkühlen und Ankratzen innerhalb von Stunden zur Reaktion gebracht. Das Produkt wurde auf einem Filter abgetrennt und mit Äthanol gewaschen. Man erhielt ⁸ S₁IAJv⁵ -5>⁸° (° ¹»⁰⁴» ^DMF); UV-Spektrum in Methanol \nax 290 E^ 94,4; Ä_fflax 279 *] 124. Die äthanolischen Lösungen ergaben eine zweite Ausbeute von 1,95 g.

d) N^-Benzyloxycarbonyl-L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosylhydrazid »

4,5 g des Methylesters wurden in 50 ml Methanol gelöst und mit 4,5 ml Hydrazinhydrat behandelt. Das Reaktionsgemisch wurde 48 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen. Das ausgefallene Produkt wurde abfiltriert und mit Methanol gewaschen. Der feuchte Feststoff wurde in 150 ml Äther 2 Stunden suspendiert und filtriert. Man erhielt 4,18 g; Fp. 226-229⁰C; piJj? -15,6° (c 1,01, DMF); UV-Spektrum in Methanol V _v 289,5 b3 92,6; V_n _nv 280 E^j 122.

max I ΊηαΛ. I

e) N^-Benzyloxycarbonyl-D-phenylalanyl-L-leucin-methylester

■v

Eine Lösung von 6,65 g (0,022 Mol) NVßenzyloxycarbonyl-D-phenylalanin und 4,38 g (0,022 Mol) L-Leucin-methyl-esterhydrochlorid in 60 ml Dimethylformamid zur Spektroskopie wurde im Eis gekühlt und mit 3,0 ml (2,24 g) Triäthylamin behandelt. 3,3 g 1-Hydroxybenztriazol und 5 g Dicyclohexylcarbodiimid wurden zugegeben und das Reaktionsgemisch über Nacht unter Erwärmen auf Raumtemperatur und weitere 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Gemisch wurde filtriert und das Lösungsmittel unter vermindertem Druck abgedampft. Der Rückstand wurde in 200 ml Äthylacetat gelöst und mit 0,1n Salzsäure, gesättigter Salzlösung, 5-%iger Ifetriumbicarbonatlösung, gesättigter Salzlösung und Wasser gewaschen. Die Äthylacetatlösung wurde über Magnesiumsulfat

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getrocknet, filtriert und zu einem kristallinen Rückstand eingedampft. Das Produkt wurde zwei Mal aus Äthylacetat und Petroläther umkristallisiert. Man erhielt 7,3 g; Fp. 125-126⁰C; ßtj²^ -20,3° (c 1,02 Methanol).

f) D-Phenylalanyl-L-leucin-methyl-e ster-hydrochlorid

Eine Lösung von 7 g (0,016 Mol) N^-Benzyloxycarbonyl-D-phenylalanyl-L-leucin-methyl-ester in120 ml Methanol wurde mit 6,12 ml 2,68n Chlorwasserstoff in Methanol behandelt und mit Wasserstoff und 500 mg 10-%igem Palladium-auf-Kohle bei Atmosphärendruck reduziert. Die Reaktion wurde durch Dünnschichtchromatographie überwacht. Das Gemisch wurde filtriert, um den Katalysator abzutrennen und die Lösung eingedampft.

·. Man erhielt 5,4 g eines glasartigen Produktes DO²Q -82,5° (c 1,02, Methanol).

g) N^-Benzyloxycarbonyl-L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-D-phenylalanyl-L-leucin-methyl-ester

Eine Lösung von 8,5 g (0,014 Mol) N<*-Benzyloxycarbonyl-L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-hydrazid in 150 ml Dimethylformamid wurde auf -20 C gekühlt und mit 34,4 ml 2,56n Chlorwasserstoff in Tetrahydrofuran und anschließend mit 2,68 ml Isopentylnitrit behandelt. Das Gemisch wurde eine halbe Stunde bei -20⁰C gerührt, auf -25⁰C abgekühlt, mit 13,73 ml Triäthylamirf uncT%,90 g D-Phenylalanyl-L-leucinmethyl-ester-hydrochlorid zugegeben. Das Gemisch wurde 30 Minuten bei -20°C,15 Minuten bei -20 bis -10°C 3 Stunden in einem Salz-Eis-Gemisch und über Nacht bei 0 bis 5°C gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde über Sinterglas filtriert und das Piltrat unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wurde in Äthylacetat gelöst und mit 0,5n Salzsäure, gesättigter Salzlösung, 5-%iger Natriumbicarbonatlösung, gesättigter Salzlösung und schließlich mit Wasser gewaschen.

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264814$

Die Lösung wurde über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und das Lösungsmittel eingedampft. Der Rückstand wurde aus 125 ml Methanol umkristallisiert. Das Produkt wurde in 200 ml Äther 2 Stunden suspendiert, filtriert und getrocknet. Man

⁰C /"ÖJ³ 21°

erhielt 6,25 g; Fp. 221-223⁰C, /"ÖJq³ -21° (c 1,01, DMF); UV-Spektrum in Methanol A_mov 289,5 E^ 66,5; X._ov 280 E^ 86,5.

h) L-Tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-D-phenylalanyl-L-leucin-methyl-ester

6,0 g N^-iBenzyloxycarbonyl-L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-D-phenylalanyl-L-leucin-methyl-ester wurden in 140 ml abs. Methanol gelöst und 800 mg 20-%iges Palladiumauf-Kohle zugegeben. Das Gemisch v/urde unter Wasserstoffatmosphäre reduziert, wobei die Reduktion durch Dünnschicht chromatographie überwacht wurde. Der Katalysator wurde mit Hilfe von Filterhilfe (Super-Gel) abfiltriert. Das Lösungsmittel wurde abgedampft, wobei ein Feststoff zurückblieb, der unter vermindertem Druck getrocknet und ohne weitere Reinigung verwendet wurde_o

i) N^-Benzyloxycarbonyl-O-benzyl-L-seryl-L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-D-phenylalanyl-L-leucin-methylester

1>53 g L-Tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-D-phenylalanyl-L-leucyl-methyl-ester wurden in 35 ml Dimethylformamid gelöst und die Lösung in Eis gekühlt. Dann wurden 691 mg N^Benzyloxycarbonyl-O-benzyl-L-serin zusammen mit 311 mg 1-Hydroxybenztriazol und 475 mg Dicyclohexylcarbodiimid zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur und 24 weitere Stunden bei Raumtemperatur gerührt, anschließend filtriert und das Filtrat unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wurde in 500 ml Äthylacetat gelöst und mit 0,5n Salzsäure,gesättig-

../19

70 9 819/1042

ter Salzlösung, 5-%iger Natriumbicarbonatlösung, gesättigter Salzlösung und schließlich mit Wasser gewaschen." Die Lösung wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und eingedampft. Der Rückstand wurde unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhielt 1,92 g; Z"«.7d³-13,2⁰ (c 1,03, DMF); UV-Spektrum in Methanol \^ 289,5 E^j 52,5; \_aK 280 έ\ 69.

j) N &-Benzyloxycarbonyl-O-benzyl-L-seryl-L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-D-phenylalanyl-L-leucyl-hydrazid

1,75 g N^-Benzyloxycarbonyl-O-benzyl-L-seryl-L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-D-phenylalanyl-L-leucinmethyl-ester wurden in 40 ml Dimethylformamid gelöst und mit 2,5 ml Hydrazinhydrat behandelt. Nach 2,5 Stunden bei Raumtemperatur wurden 15 ml Methanol zugegeben und die Reaktion über Nacht bei Raumtemperatur fortgeführt. Das Methanol wurde durch Abdampfen entfernt und die Lösung mit 80 ml Isopropanol verdünnt. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur stehengelassen und der Niederschlag abfiltriert, mit Äther verrieben und unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhielt 1,3 g; Fp. 240-242⁰C 2ars.; /Zx7n³ -31,2° (c 0,895, DMF); UV-Spektrum in Methanol λ _v 290 E₁ ¹ 52,5; \_ax 280 E^ 68,7.

k) N^-Benzyloxycarbonvl-L-prolYl-glycihamid

64,2 g N^-Benzyloxycarbonyl-L-prolin wurden in 350 ml Dichlormethan gelöst, auf -10⁰C abgekühlt und mit 41,2 ml Triäthylamin und dann mit 32,4 g Äthylchlorformt unter Rühren behandelt. Nach 20 Minuten bei -10°C wurde eine Lösung von 42 g Glycinäthylesterhydrochlorid und 41,2 ml Triäthylamin in 250 ml Dichlormethan bei -10⁰C zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 1 Stunde bei -10°C, 1 Stunde bei -5⁰C, ,1 Stunde bei +5°C und 20 Stunden bei 25⁰C gerührt. Dann wurden 100 ml Wasser zugegeben und das Dichlormethan abgetrennt, 2-mal mit 5-%iger Natriumbicarbonatlösung (je 100 ml), mit 100 ml Wasser,2-mal mit je 30 ml verdünnter Salzsäure und mit 100 ml Wasser gewaschen und über

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Magnesiumsulfat getrocknet. Die Lösung wurde filtriert und bei 50⁰C unter vermindertem Druck zu einem Öl eingedampft. Das Öl wurde in 100 ml Methanol gelöst, bei 0 bis 10°C zu 500 ml mit Ammoniak gesättigtem Methanol von 1O⁰C gegeben und 20 Stunden bei O⁰C,6 Stunden bei 25°C und wieder 20 Stunden bei O⁰C stehengelassen. Die Lösung wurde unter vermindertem Druck zu einem kleinen Volumen eingedampft, wobei Kristallisation eintrat. Während der Feststoff noch methanolfeucht war, wurden 100 ml Tetrahydrofuran zugegeben und das Gemisch leicht erwärmt, um den Feststoff teilweise zu lösen. Das Gemisch wurde im Eis gekühlt und nach 4 Stunden filtriert und der Feststoff an der Luft getrocknet. Man erhielt 59 g; Fp. 142-145⁰C; ψ ~32,1° (c. 2, DMF).

l) L-Prolyl-glycinamid

Eine Lösung von 15,3 g N^-Benzyloxycarbonyl-L-prolylglycinamid in 150 ml Methanol wurde mit 150 mg 2O-?6igem Palladium-auf-Kohle unter Wasserstoff unter einem Druck von 3 Atmosphären 45 Minuten geschüttelt. Der Katalysator wurde über Filterhilfe abfiltriert und mit Methanol gespült. Das Filtrat wurde bei 40 C unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. Der verbleibende kristalline Feststoff wurde bei 45 C unter_λvermindertem Druck
ohne weitere Reinigung verwendet.

bei 45 C unter_λvermindertem Druck weiter getrocknet und

m) N^Benzyloxycarbonyl-L-arginyl-L-prolyl-glycinamidhydrochlorid

L-Prolyl-glycinamid (erhalten durch Entfernen der Schutzgruppe von 15,3 g N^-Benzyloxycarbonyl-L-prolylglycinamid), 15,4 g N^ö-Benzyloxycarbonyl-L-arginin, 7,4 g 1-Hydroxybenztriazol und 200 ml Dimethylformamid wurden gerührt und auf -10⁰C gekühlt. 19,4 ml 2,58n Chlorwasserstoff in Tetrahydrofuran wurde zugegeben und das Gemisch bei —10 bis 40⁰C gerührt bis vollständige Lösung eintrat.

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Die Lösung wurde auf -3O⁰C abgekühlt und 11g N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid und 20 ml Dimethylformamid zugegeben. Die Lösung wurde 3 Stunden bei -20 bis O⁰C, 16 Stunden bei 20⁰C und 1 Stunde bei 45⁰C gerührt. Die Lösung wurde auf 20°C gekühlt, filtriert, der Feststoff mit 20 ml Methanol gespült und das Filtrat bei 40°C unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde in 200 ml V/asser von 30⁰C gerührt, dann im Eisbad gekühlt und der unlösliche Feststoff abfiltriert und 2^-mal mit je 10 ml Waser gewaschen. Das Filtrat wurde auf eine 2,5 x 40 cm-Säule, enthaltend Dowex 1x2 Ionehaustauscherharz in Chloridform,gegeben, um 1-Hydroxybenztriazol zu entfernen und das Eluat zu einem schäumform!gen Produkt lyophilisiert. Das schaumförmige Produkt wurde in 35 ml Methanol und 70 ml Chloroform gelöst und über eine 3,7 x 70 cm-Säule mit 350 g Silicagel chromatographiert und mit einem 2:1-Gemisch von Chloroform und Methanol eluiert. Die gewünschten Fraktionen, die durch die Dünnschichtchromatographie bestimmt wurden, wurden zusammengegeben und erneut über eine Säule mit 150 g Silicagel und Eluieren mit Chloroform und Methanol (2:1) chromatographiert. Die Fraktionen, die das gewünschte Produkt enthielten, wurden zusammengegeben und bei 40°C unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft und der Rückstand wieder in 75 ml Wasser gelöst, filtriert und lyophilisiert. Das Produkt enthielt noch 0,1 % 1-Hydroxybenztriazol und wurde erneut über eine Säule von Dowex 1x2 Ionenaustauscherharz in Chloridform in wäßriger Lösung gegeben und das Eluat lyophilisiert, wobei man 6,95 g N^-Benzyloxycarbonyl-L-arginyl-L-prolyl-glycinamid-hydrochlorid erhielt; £^J\? -61,5° (c 1,02, 1 % Essigsäure in Wasser); UV-Spektrum in Methanol + KOH λ 257 EJ 4,1. Das Produkt wurde aus 25 ml Methanol, Äthylacetat (bis zur beginnenden Trübung), 5 ml Chloroform, trockenem Diäthyläther (bis zur beginnenden Trübung) und Kühlen über Nacht kristallin erhalten.

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-vT- 2849146 •13-

Beim Umkristallisieren aus 17 ml Methanol und 40 ml Äthylacetat erhielt man 5,9 g, schmilzt bei 140 bis 145°C zu einem Schaum; /&_7_D -62° (c 1,02, 1 % Essigsäure in Wasser); UV-Spektrum in Methanol "+ KOH, >„_ 257,5 E> 4,05.

max

η) N^Benzyloxycarbonyl-O-benzyl-L-seryl-L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-D-phenylalanyl-L-leucyl-L-arginyl-L-prolyl-glycinamid-hydrochlorid

1,4g N^-Benzyloxycarbonyl-L-arginyl-L-prolyl-glycinamid-hydrochlorid wurden in 60 ml abs. Methanol gelöst, 400 mg 10-%iges₄ Palladium-auf-Kohle zugegeben und der Kolben mit Stickstoff gespült. Die Atmosphäre wurde durch Wasserstoff ersetzt und das Gemisch 45 Minuten mit Wasserstoff gerührt. Die vollständige Reaktion konnte durch Dünnschichtchromatographie gezeigt werden. Der Kolben wurde mit Stickstoff gespült und der Katalysator abfiltriert. Das Filtrat wurde zu 900 mg einer glasartigen Substanz eingedampft und ohne weitere Reinigung verwendet.

2,12 g Ntt-Benzyloxycarbonyl-O-benzyl-L-seryl-L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-D-phenylalanyl-L-leucylhydrazid wurden in 80 ml Dimethylformamid gelöst und unter Rühren auf -20°C gekühlt. Die Lösung wurde mit 4,93 ml (6 Äquivalent) ^Λ2,42η Chlorwasserstoff in Tetrahydrofuran behandelt und dann mit 0,42 ml Isopentylnitrit. Das Gemisch vmrde 30 Minuten bei -20⁰C gerührt, auf -25°C gekühlt und mit 1,66 ml Triäthylamin (6 Äquivalent) behandelt. Das oben erhaltene L-Arginyl-L-prolyl-glycinamid-hydrochlorid wurde zugegeben und das Reaktionsgemisch 30 Minuten bei -20⁰C_/3 Stunden bei 0 bis 5°C (Eisbad) gerührt und dann über Nacht bei 0 bis 5°C im Kühlschrank stehengelassen. Das Gemisch wurde filtriert und die Lösung eingedampft. Der Rückstand wurde mit Tetrahydrofuran verrieben, dekantiert und der Rückstand in 20 ml Methanol aufgenommen und zu 250 ml Äthylacetat unter Rühren zugetropft. Das Gemisch wurde über Nacht im Kühlschrank stehengelassen und filtriert und unter vermindertem Druck

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getrocknet. M.an erhielt 1,45 g. Das Produkt wurde durch Chromatographie über Silicagel und Eluieren mit Chloroform-Methanol (60:45) gereinigt .. Die Fraktionen 6 bis 10 wurden aufgrund der Ergebnisse der Dünnschichtchromatographie zusammengegeben und eingedampft. Der Rückstand wurde in Methanol und Wasser aufgenommen, mit Hilfe von Salzsäure auf einen pH-Wert von 4 gebracht und das Produkt durch Lyophilisieren erhalten. Man erhielt 720 mg N°i-Benzyloxycarbonyl-0-benzyl-L-seryl-L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-D-phenylalanyl-L-leucyl-L-arginyl-L-prolyl-glycinamid-hydrochlorid; /öfTn -23,4° (c 1,0, DMF); UV-Spektrum in Methanol λ _v 289,5 B₁ ¹ 39,1; λ _v 280 E{ 51,0.

Beispiel 2 N^-Benzyloxycarbonyl-L-glutaminyl-L-tryptophyl

L-Seryl-L-Tyrosyl-D-phenylalanyl-L-leucyl-L-arginyl-L-prolyl-glycinamid

a) L-Seryl-L-tyrosin-methyl-ester-hydrochlorid

70 ml Methanol, enthaltend 6,67 ml 3n-Chlorwasserstoff in Tetrahydrofuran,wurden zu einem Gemisch von 8,328 g N°^-Benzyloxycarbonyl-L-seryl-L-tyrosin-methyl-ester (Fischer i*id Whetstone, J.Am.Chem.Soc., 76, 5076 (1954)} und 500 mg 20-%igem Palladium-auf-Kohle gegeben und das entstehende Gemisch 3 Stunden, unter Wasserstoff bei einem Druck von 2,54 cm Wassersäule gerührt. Das Gemisch wurde zur Entfernung des Katalysators filtriert und das Filtrat unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. Man erhielt einen Rückstand von L-Seryl-L-tyrosin-methyl-ester-hydrochlorid, das ohne weitere Reinigung verwendet wurde.

b) N^-Benzyloxycarbonyl-L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosinmethyl-ester

L-Seryl-L-tyrosin-methyl-ester-hydrochlorid (a) und 11,7g Nöf-Benzyl-oxycarbonyl-L-tryptophan-pentachlorphenylester (Kovacs et al., J.Org.Chem. 32, 3696 (1967)) wurden in 60 ml Dimethylformamid gelöst, unter Rühren auf -10⁰C gekühlt und mit 28 ml Triäthylamin behandelt. Das Reaktions-

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gemisch wurde 1,5 Stunden bei -10°C gerührt und unter Rühren über Nacht auf Raumtemperatur erwärmt. Das Gemisch wurde filtriert und das Filtrat bei 5O⁰C unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wurde 2-mal in Äthanol gelöst und das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde dann erneut in 30 ml Methanol aufgenommen und durch Zugabe von 300 ml Äther und 100 ml Petroläther ausgefällt. Das abgeschiedene Öl wurde erhalten durch Abkühlen und Ausfällen durch Zugabe von Äther und Petroläther. Es wurde weiter gereinigt durch wiederholtes Ausfällen aus Methanol mit Petroläther. Die überstehende Flüssigkeit wurde abdekantiert und das Öl unter vermindertem Druck bei 50⁰C getrocknet. Man erhielt ein lohfarbenes schaumartiges Produkt, das aus Methanol, Äther und Petroläther durch Animpfen umkristallisiert wurde.Fp. 149-152°C /PJ^ -1,8°

(c 1,00, Methanol); UV-Spektrum in Methanol, \ 289,5

max

ti\ 92, ?\_max 280 B) 122.

c) L-Tryptophyl-L-seryl-L-tyrosin-methyl-ester-hydrochlorid

75 ml Methanol, enthaltend 1,7 ml 3n Chlorwasserstoff in Tetrahydrofuran, wurden zu einem Gemisch von 3,1 g N^t-Benzyloxycarbonyl-L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosin-methylester und 200 mg 20 % Palladium-auf-Kohle gegeben und das Reaktionsgemisch unter Wasserstoffatmosphäre 2,5 Stunden gerührt. Das Gemisch wurde zur Entfernung des Katalysators filtriert und das Filtrat unter vermindertem Druck eingedampft. Man erhielt einen Rückstand von L-Tryptophyl-L-seryl-L-tyrosin-methyl-ester-hydrochlorid, das ohne weitere Reinigung verwendet wurde

d) N^Benzyloxycarbonyl-L-glutaminyl-L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosin-methyl-ester

Ein Gemisch aus dem Produkt nach c), 1,4 g N^-Benzyloxycarbonyl-L-glutamin, 670 mg 1-Hydroxybenz-triazol und

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50 ml Dimethylformamid wurde gerührt und auf -10⁰C abgekühlt und 0,7 ml Triäthylamin zugegeben. Nach 15 Minuten wurde es mit 1,2 g Dicyclohexylcarbodiimid behandelt und einige Stunden bei -10⁰C gerührt und anschließend 2 Tage bei Raumtemperatur und schließlich weitere 3 Tage stehengelassen. Die Lösung wurde filtriert und das Filtrat unter vermindertem Druck bei 5O⁰C eingedampft. Der Rückstand wurde aus Methanol mit Wasser ausgefällt und dann 3-mal aus Methanol umkristallisiert. Fp. 245-248⁰C; fOiJ^ -4,4° (c 1, DMF); UV-Spektrum in Methanol, \_&χ 290 E{ 75,7; \^ 280 EJ 100.

e) N^-Benzyloxycarbonyl-L-glutaminyl-L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-hydrazid

Eine Lösung von 1,6 g N^-Benzyloxycarbonyl-L-glutaminyl-L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosin-methyl-ester in 17 ml Dimethylformamid wurde auf 30⁰C gekühlt und mit 3 ml Hydrazinhydrat behandelt. Das Reaktionsgemisch wurde eine halbe Stunde auf 30⁰C gehalten, die Lösung filtriert und das Filtrat 10 Minuten auf 50 bis 60⁰C erwärint und über Nacht bei 25⁰C stehengelassen. Der Feststoff wurde abfiltriert und mit Methanol gewaschen. Der nasse Feststoff wurde in 25 ml Methanol zum Sieden erhitzt, abgekühlt, filtriert und mit Methanol und Äther gewaschen. Das Produkt wurde bei 50°C unter vermindertem Druck getrocknet; Fp. 260-270⁰C; β<3χ? -10,0° (c 1, DMF); UV-Spektrum in Methanol 7v_ 289,7 EJ 77,2; λ _v 279 EJ 102.

f) L-Arginyl-L-p rοlyl-glycinamid-hydrοchlorid

Eine Lösung von 21,2 g Ntf-Benzyloxycarbonyl-L-arginyl-L-prolyl-glycinamid-hydrochlorid (Beispiel 1, Teil m)) in 200 ml Methanol wurde mit 1,0 g 20-%igem Palladium-auf-Kohle unter Wasser.stoffgas 4 Stunden gerührt und über Nacht stehengelassen. Die Lösung wurde filtriert und das Filtrat bei 40 C unter vermindertem Druck zu einem weißen schaumartigen Produkt eingedampft, das ohne weitere Reinigung verwendet wurde.

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g) N⁰^- Benzyioxycarbonyl-L-leucyl-L-arginyl-L-prolylglycinamid-hydrοchlorid

Eine Lösung von L-Arginyl-L-prolyl-glycinamid-hydrochlorid (erhalten durch. Entfernen der Schutzgruppe von 21,2g Ntf-Benzyloxycarbonyl-L-arginyl-L-prolyl-glycinamidhydroChlorid), 17 g N^-Benzyloxycarbonyl-L-leucin-p-nitrophenyl-ester und 85 ml Dimethylformamid wurde 48 Stunden bei 25°C stehengelassen, 10 Minuten auf 50⁰C erhitzt und dann 6 Stunden bei 25⁰C stehengelassen. Die Lösung wurde langsam in 800 ml trockenen Diäthyläther unter Rühren eingegossen. Der klebrige Feststoff wurde durch Abdekantieren abgetrennt, in 50 ml Methanol unter Erwärmen gelöst und die Lösung unter Rühren in 500 ml Äther gegossen. Der Feststoff wurde abgetrennt und bei 40°C unter vermindertem Druck getrocknet. Er wurde in 50 ml Methanol und 450 ml Chloroform gelöst und über eine Säule von 170 g Silicagel (;mbereitet in. 10 % Methanol in Chloroform) chromatographiert und mit 10 bis 20 % Methanol in Chloroform eluiert. Die gewünschten Fraktionen, die mit Hilfe der Dünnschichtchromatographie festgestellt wurden, wurden zusammengegeben und bei 40 C unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft und der Rückstand in 50 ml Methanol und 25 ml Äthylacetat gelöst und die Lösung langsam zu 350 ml trockenem Äther unter Rühren zugetropft. Der Feststoff wurde abgetrennt und bei 40⁰C unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhielt 11,6 g N^-Benzyloxycarbonyl-L-leucyl-L-arginyl-L-prolyl-glycinamid-hydrochlorid; ^ -51,6° (c 1,0, Methanol); UV-Spektrum in Methanol

\nax^257E1
h) L-Leucyl-L-arginvl-L-prolyl-glvcinamid-hvdrochlorid

Eine Lösung von 6,43 g N^Benzyloxycarbonyl-L-leucyl-L-arginyl-L-prolyl-glycinamid-hydrochlorid in 200 ml Methanol wurde mit 250 mg 20-%igem Palladium-auf-Kohle unter Wasser-' stoffgas 3 Stunden gerührt, der Katalysator abfiltriert und

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~ ar- 2649H6

das Filtrat bei 45°C unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. Der getrocknete Rückstand war ein schaumartiges Produkt, das ohne weitere Reinigung verwendet wurde.

i) N^-Benzyloxycarbonyl-D-phenylalanyl-L-leucyl-L-arginyl-L-prolyl-glycinamid-hydrochlorid

Das durch Entfernung der Schutzgruppe von 6,43 g N^-Benzyloxycarbonyl-L-leucyl-L-arginyl-L-prolyl-glycinamid-hydrochlorid erhaltene L-Leucyl-L-arginyl-L-prolylglycinamid-hydrochlorid, 4,3 g N^-Benzyloxycarbonyl-D-phenylalanin-p-ttitrophenyl-ester (hergestellt wie das L-Isomer, J.Org.Chem. 27, 3409 (1962)) und 30 ml Dimethylformamid wurden bis zur vollständigen Lösung gerührt. Die Lösung wurde 24 Stunden bei 25°C stehengelassen, eine kleine Menge eines feinen Feststoffs abfiltriert und das Filtrat wieder 24 Stunden bei 25⁰C stehengelassen. Die Lösung v/urde bei 40°C unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde in 40 ml Methanol und 30 ml Äthylacetat gelöst und in 300 ml trockenen Diäthyläther unter Rühren getropft. Der körnige Feststoff, der ausfiel, wurde abgetrennt durch Dekantieren und die Ausfällung wiederholt. Der Feststoff wurde abgetrennt und bei 45°C unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhielt 6,5 g eines Produktes, das ohne weitere Reinigung verwendet werden konnte, aber im UV-Spektrum eine Absorption entsprechend 0,37 % p-Nitrophenol zeigte; ß*3^§ -5^*6° (c 1,0, Methanol); UV-Spektrum in Methanol ^_x 257 E^j 5,8_O

j) D-Phenylalanyl-L-leucyl-L-arginyl-L-prolyl-glycinamidhydrochlorid

Eine Lösung von 3,9 g ΓΓ^-Benzyloxycarbonyl-D-phenylalanyl-L—leucyl-L-arginyl-L-prolyl-glycinamid-hydrochlorid in 100 ml Methanol wurde mit 500 mg 20-%igem Palladium-auf-Kohle unter Wasserstoffgas bei etwas erhöhtem Druck 4 Stunden gerührt. Die Lösung wurde filtriert und das Filtrat bei 40⁰C unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. Man

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-*r- 2649U6

erhielt ein weißes schaumartiges Produkt, das ohne weitere Reinigung verwendet wurde.

k) N^-Benzyloxycarbonyl-L-glutaminyl-L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-D-phenylalanyl-L-leucyl-L-arginyl-L-prolylglycinamid

Eine Lösung von 3»68 g N°<-Benzyloxycarbonyl-L-glutaininyl-L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-hydrazid in 90 ml Dimethylformamid wurde auf 0°C abgekühlt und mit 8,8 ml 3,4n Chlorwasserstoff in Tetrahydrofuran unter Rühren behandelt. Bei 10⁰C war das Hydrazid vollständig innerhalb einer halben Stunde gelöst,und die Lösung wurde auf -20⁰C abgekühlt und 0,84 ml Isopentylnitrit zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 3 Stunden bei -40⁰C bis +15°C gerührt und 4,2 mlTt'iäthylamin zugegeben und anschließend eine Lösung von D-Phenylalanyl-L-leucyl-L-arginyl-L-prolyl-glycinamid-hydrochlorid (erhalten durch Entfernung der Schutzgruppe von 3,9 g N^Benzyloxycarbonyl-D-phenyl-alanyl-L-leucyl-L-arginyl-L-prolyl-glycinamid-hydrochlorid) in 30 ml Dimethylformamid. Das Reaktionsgemisch wurde 2 Stunden bei -20⁰C gerührt, innerhalb einer Stunde auf 20°C erwärmt und 20 Stunden gerührt. Die Lösung wurde filtriert und das Filtrat unter vermindertem Druck bei 45⁰C eingedampft. Der Rückstand wurde in 50 ml Methanol gelöst und die Lösung zu 100 ml Äthylacetat unter Rühren zugetropft. Der sich abscheidende lohfarbene Feststoff wurde abfiltriert,in30 ml warmem Methanol, gelöst und 20 ml Äthylacetat und 50 ml Chloroform langsam zu der warmen Lösung zugegeben. Die Lösung wurde 1 Stunde im Eisbad gekühlt und der Feststoff abfiltriert, mit Äthylacetat gewaschen und bei 40⁰C unter vermindertem Druck eingedampft. Man erhielt 6,3 g. 600 mg dieses Produktes wurden mit 10 ml warmem Methanol gerührt und die Lösung abgekühlt und filtriert. Der sich abscheidende Feststoff wurde mit 5 ml Methanol gewaschen. Das Filtrat (15 ml) wurde mit 15 ml Chloroform verdünnt und über eine 1,2 χ 12 cm große Säule, enthaltend 6 g Silicagel( zubereitet in Chloroform) chromatographiert und die Säule mit zunehmenden Konzentrationen an Methanol (5 bis 20 %) in Chloroform eluiert. Die Fraktionen,' die das gewünschte Produkt enthielten, wie durch Dünnschicht-

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Chromatographie gezeigt werden konnte, wurden zusammengegeben und bei 40 C unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft und der Rückstand in 5 ml Methanol gelöst und stehengelassen und langsam eingedampft. Der sich abscheidende Feststoff wurde abfiltriert, mit Äther gewaschen und bei 50°C unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhielt 120 mg N^-Benzyloxycarbo^l-L-glutaminyl-L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-D-phenylalanyl-L-leucyl-L-arginyl-L-prolyl-glycinamid-hydrochlorid; ßxj^* -60,5° (c 1,0, Methanol); UV-Spektrum in Methanol ^_x 289,5 E^J 42,6; ^_x 280 E^J 55,8.

Der Rest des Produktes (5,7 g) wurde in 25 ml Methanol bei 50°C gerührt, abgekühlt und bei 20⁰C stehengelassen und der Feststoff abfiltriert und mit wenig kaltem Methanol gewaschen. Dieses Verfahren wurde mit 30 ml Methanol wiederholt und der Feststoff abfiltriert und mit kaltem Methanol und trockenem Äther gewaschen und bei 35°C unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhielt 3,7 g. Der Feststoff wurde in 300 ml heißem Methanol unter Rühren gelöst, die Lösung filtriert und das Filtrat auf eine 2,4 χ 25 cm-Säule, enthaltend 50 g Dowex 1x2 Ionenaustauscherharz (Acetatform), gegeben und das Produkt mit Methanol eluiert. Die Fraktionen, die das gewünschte Produkt enthielten, wie durch Dünnschichtchromatographie gezeigt werden konnte, wurden zusammengegeben und filtriert,, Das Filtrat wurde mit Hilfe eines Stromes warmer filtrierter Luft auf 75 ml eingeengt und die Lösung über Nacht stehengelassen. Das Lösungsmittel wurde von dem Gel abpipettiert, das ausfiel, und das Gel mit 5 ml Methanol 2-mal gewaschen und das Lösungsmittel abpipettiert. Das Gel wurde 1 Stunde mit I50 ml trockenem äther gerührt, filtriert und der Feststoff mit Äther gewaschen und bei 50 C unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhielt 3,24 g N^-Benzyloxycarbonyl-L-glutaminyl-L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-D-phenylalanyl-L-leucyl-L-arginyl-L-prolyl-glycinamid-essigsäure-salz; JJxJ²Q -63° (c 1,007, Methanol); UV-Spektrum in Methanol X_ffiax 289,5 E^ 41,9; ^_x 280 ε} 54,5.

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Beispiel 3 N^-tert.-Butoxycarbonyl-O-benzyl-L-seryl-L-

tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-D-tryptophyl-L-leucyl-L-arginyl-L-prolyl-glycinamid

a ) N°<-tert. -Butoxycarbonyl-O-benzyl-I^seryl-L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-hydrazid

Eine Lösung von N&<-Benzyloxycarbonyl-L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosin-methyl-ester (Beispiel 2, Teil b) in 100 ml Methanol wurde mit 300 mg 20-%igem Palladium-auf-Kohle 2,5 Stunden unter Wasserstoffgas gerührt und die Lösung von dem Katalysator abfiltriert. Dann wurden 2,1 g N°<-tert.-Butoxycarbonyl-O-benzyl-L-serin zu dem Filtrat zugegeben und die Lösung bei 50 C unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde in ^O ml Dimethylformamid unter Zugabe von 950 mg 1-Hydroxybenztriazol gelöst. Nach vollständiger Lösung wurde das Reaktionsgemisch auf -10 abgekühlt und unter Rühren mit 1,6 g N,N^I-Dicyclohexylcarbodiimid behandelt. Das Reaktionsgemisch wurde 1,5 Stunden bei -10°C gerührt, auf 20⁰C erwärmt und 20 Stunden gerührt. Die Lösung wurde filtriert und das Filtrat unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde in 250 ml Äthylacetat gelöst, und die Lösung mit 100 ml 7-%iger Natriumbicarbonatlösung in drei Anteilen mit 20 ml Wasser, mit 20 ml verdünnter Salzsäure und mit gesättigter Salzlösung gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet und bei 40°C unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde *in 50 ml heißem Methanol gelöst, gekühlt und die Lösung filtriert und 3,5 ml Hydrazinhydrat unter gutem Mischen zugegeben. Nach 20 Stunden wurde die Lösung im Eisbad gekühlt und der Feststoff abgetrennt und mit etwas kaltem Methanol gewaschen. Der Feststoff wurde mit warmem Methanol gerührt und nach einigem Stehen in Eis gekühlt, filtriert und der Feststoff mit kaltem Methanol und dann mit trockenem Äther gewaschen und getrocknet. Man erhielt 3»5 g N^-tert.-Butoxycarbonyl-O-benzyl-L-seryl-L-tryptophyl-L-tyrosyl-hydrazid; Fp. 195-20O⁰C; ßxj^? -13,7° "{c/1,0 Methanol); UV-Spektrum in Methanol X_max 289,5 ^\ 73,5; \_ax ²⁸⁰ ^Έ] 96,5.

*in Methanol gelöst und wieder zur Trockne eingedampft, wieder

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b) N^-tert.-Butoxycarbonyl-D-tryptophyl-L-leucyl-L-arginyl-L-prolyl-glycinamid-hydrochlorid

L-Leucyl-L-arginyl-L-prolyl-glycinamid-hydrochlorid (Beispiel 2, Teil h)) aus 5,13 g N°t-Benzyloxycarbonyl-L-leucyl-L-arginyl-L-prolyl-glycinainid-hydrochlorid, 2,43 g N^-tert.-Butoxycarbonyl-D-tryptophan (hergestellt wie das L-Isomer, J.Chem.Soc., 1964, 6130), 100 ml Dimethylformamid und 1,1 g 1-Hydroxybenztriazol wurden zusammen gerührt bis vollständige Lösung eintrat und die Lösung wurde dann auf -10⁰C gekühlt land 1,9 g NjN'-Dicyclohexylcarbodiimid zugegebene Die Lösung wurde langsam auf 25°C erwärmt und 48 Stunden bei 25⁰C gerührt. Die Lösung wurde filtriert und das Filtrat bei 50⁰C unter verminde-rtem Druck zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde in 35 ml warmem Methanol gelöst, 25 ml Äthylacetat zugegeben und die Lösung filtriert. Das Filtrat wurde zu 300 ml trockenem Äther unter Rühren zugetropft, wobei ein Feststoff ausfiel. Der Feststoff wurde abgetrennt und 25 ml Methanol und 15 ml Äthylacetat gelöst und erneut mit trocknem Äther ausgefällt. Der Feststoff wurde mit Äther gewaschen und bei 40 C unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhielt 6,2 g I^-tert.-Butoxycarbonyl-D-tryptophyl-L-leucyl-L-arginyl-L-prolyl-glycinamid-hydrochlorid; /ÖcJJp -54,2° (c 1,035 Methanol); UV-Spektrum in

Methanol Cx^?290E1⁶³' >tnax ^{281 E}1' ⁷¹' \iax ^{2?4 E}1 ⁶^⁶'

c) D-Tryptophyl-L-leucyl-L-arginyl-L-prolyl-glycinamiddihydrοchiοrid

Eine Lösung von 1,69 g N^-tert.-Butoxycarbonyl-D-tryptophyl-L-leucyl-L-arginyl-L-prolyl-glycinamid-hydrochlorid in 20 ml Methanol und 10 ml 3n Chlorwasserstoff in 10 ml Tetrahydrofuran wurde 1 Stunde stehengelassen und dann unter(vermindertem Druck bei 30⁰C zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde 2-mal in 20 ml Methanol gelöst und das Lösungsmittel abgedampft. Er wurde dann bei 45⁰C unter vermindertem Druck getrocknet. Das Produkt wurde ohne weitere Reinigung verwendet.

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d) Ntt-tert.-Butoxycarbonyl-O-benzyl-L-seryl-L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-D-tryptophyl-L-leucyl-L-arginyl-L-prolylglycinamid

2,66. ml.3n Chlorwasserstoff in Tetrahydrofuran wurden zu einer Lösung von 1,51 g NQ^-tert.-Butoxycarbonyl-O-benzyl-L-seryl-L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-hydrazid in 30 ml Dimethylformamid bei -35⁰C gegeben und anschließend 0,35 ml Isopentylnitrit. Die Lösung v/urde 50 Minuten bei -16 bis -23°C gerührt, auf -40°C abgekühlt und 1,4 ml Triäthylamin zugegeben und anschließend eine Lösung von D-Tryptophyl-L-leucyl-L-arginyl-L-prolyl-glycina'mid-dihydrochlorid in 20 ml Dimethylformamid. Nach 1,5-stündigem Rühren bei -15 bis -20⁰C wurden 0,28 ml Triäthylamin zugegeben und die Lösung 0,5 Stunden bei -10 bis O⁰C, 1 Stunde bei 0 bis 20°C und 20 Stunden bei 20⁰C gerührt. Die Lösung wurde filtriert und das Filtrat unter vermindertem Druck bei 40⁰C zur Trockne eingedampft. Der Rückstand v/urde in 25 ml warmem Methanol gelöst, 20 ml Äthylacetat zugegeben und die Lösung in 300 ml trockenen Diäthyläther unter Rühren getropft. Der lohfarbene Feststoff wurde abfiltriert und getrocknet. Man erhielt 3,25 g. Der Feststoff wurde in 20 ml Methanol und 20 ml Äthylacetat gelöst, 0,5 ml 3n Chlorwasserstoff in Tetrahydrofuran zugegeben und die Lösung unter Rühren in-250 ml trockenen Äther getropft. Der lohfarbene Fes/trstoff wurde abfiltriert,- in 20 ml Methanol und 50 ml Chloroform gelöst und über eine 1,4 χ 35 cm-Säule von 30 g Silicagel,zubereitet in Chloroform,chromatographiert und mit Chloroform und einem Gemisch von 5 bis 15 % Methanol in Chloroform eluiert. Die gewünschten Fraktionen, die durch Dünnschichtchromatographie bestimmt wurden, wurden zusammengegeben, eingeengt und das Produkt durch Zugabe von Äthylacetat ausgefällt. Der Feststoff wurde abgetrennt, mit Äthylacetat gewaschen und bei 50°C unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhielt NÖ-teit-Butoxycarbonyl-O-benzyl-L-seryl-L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-D-tryptophyl-L-leucyl-L-arginyl-L-prolyl-glycinamid-hydrochlorid; JSkJj) -4-1 »⁸ (c 1,0₍ Methanol); UV-Spektrum in Methanol ^^ 289,5 E^j 71,8;

*max'^280E1 ⁸⁶'⁸·

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•3?.

Beispiel 4 N^-Benzyloxycarbonyl-L-glutaminyl-L-tryptophyl-

L-seryl-L-tyrosyl-D-tryptophyl-L-leucyl-L-arginyl-L-prolyl-glycinamid

Eine Lösung von 1,46 g N^-Benzyloxycarbonyl-L-glutaminyl-L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-hydrazid (Bespiel 2, Teil e)) in 35 ml Dimethylformamid wurde unter Rühren auf 10°C gekühlt und mit 4 ml 3n Chlorwasserstoff in Tetrahydrofuran behandelt. Nachdem das Hydrazid vollständig gelöst war, wurde die Lösung auf -20 C gekühlt und 0,36 ml Isopentylnitrit zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 3 Stunden bei -20°C gerührt, auf -30°C abgekühlt und mit 1,96 ml Triäthylamin behandelt. D-Tryptophyl-L-leucyl-L-arginyl-L-prolyl-glycinamid-dihydrochlorid, hergestellt aus 1,69 g N^-tert.-Butoxycarbonyl-D-tryptophyl-L-leucyl-L-arginyl-L-prolyl-glycin-amid-hydrochlorid, (dieses geschützte Material wurde entsprechend Beispiel 3, Teil b) hergestellt), wurde in 20 ml Dimethylformamid gelöst und zu dem Reaktionsgemisch zugegeben. Die Lösung wurde 3 Stunden bei -30 bis+13⁰C gerührt, auf 2O⁰C erwärmt und 20 Stunden gerührt. 0,6 ml Triäthylamin wurden zugegeben und weitere 24 Stunden bei 20°C gerührt. Dann wurden 1,4 ml 3n Chlorwasserstoff in Tetrahydrofuran zugegeben und das Reaktionsgemisch 3 Stunden gerührt. Die Lösung wurde filtriert und das Filtrat bei 40⁰C unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde mit Methanol gerührt und das Lösungsmittel erneut abgedampft. Der Rückstand wurde in 25 ml Methanol gelöst und langsam mit Äthylacetat behandelt bis nah an den Ausfällpunkt. Die Lösung wurde stehengelassen. Der unlösliche gelartige Feststoff, der sich abschied, wurde abfiltriert und mit wenig eines Methanol-Äthylacetat-Gemisches gewaschen. Der Feststoff wurde in einer kleinen Menge Methanol gelöst und durch Eintropfen der Lösung in einen Überschuß von trockenem Äther (150 ml) unter Rühren ausgefällt. Das Gel wurde durch ein dichtes (feinporiges) Filterpapier filtriert, mit trockenem Äther gewaschen und bei 50°C unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhielt 170 mg N^-Benzyloxycarbonyl-L-

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glutaminyl-L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-D-tryptophyl-L-leucyl-L-arginyl-L-prolyl-glycinamid-hydrochlorid;

-59° ( c 1,0, Methanol); UV-Spektrum in Methanol 290 E₁ ¹ 73; \_ax281 Ε,¹ 88.

Weiteres Prodiakt konnte erhalten werden aus dem Filtrat des ersten gelartigen Feststoffes durch Ausfällung mit überschüssigem trockenen Äther. Es wurde durch fraktioniertes Ausfällen aus einer Methanollösung mit zunehmenden Zusätzen von Äthylacetat gereinigt. Die Fraktionen wurden durch Dünnschichtchromatographie untersucht, zusammengegeben und über eine Silicagelsäule chromatographiert. So wurden 850 mg Feststoff in 30 ml Methanol und 50 ml Chloroform über eine 1,8 χ 23 cm-Säule mit 30 g Silicagel chromatographiert und mit 10 bis 20 % Methanol in Chloroform eluiert. Die Fraktionen, die durch Dünnschichtchromatographie ausgewählt worden waren, wurden zusammengegeben, zu einem kleinen Volumen eingeengt und bei 20⁰C stehengelassen. Der ausfallende Feststoff wurde abgetrennt, mit einer kleinen Menge Methanol und dann mit Äther gewaschen und unter vermindertem Druck bei 50⁰C getrocknet. Man erhielt 160 mg; ßxj^ -52,8° (c 1,0, Methanol); UV-Spektrum in Methanol A_max 289,5 %\ 75,2; A_n^_x 280 E^ 91,1.

Beispiel 5 N^Benzyloxycarbonyl-O-benzyl-L-tyrosyl-L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-D-leucyl-L-1eucyl-L-arginyl-L-prolyl-glycinamid

a) N^Benzyloxycarbonyl-D-leucyl-L-leucin-methyl-ester

Eine Lösung von 2,65 g N^-Benzyloxycarbonyl-D-leucin (hergestellt nach dem Verfahren von Grassman und Wünsch, Ber. 91, 462 (1968) fürDL-Leucin und für L-Leucin s. Losse und Demuth, Ber. 94, 1762 (1961). Das Material ist ein Öl wie für das N^Benzyloxycarbonyl-L-leucin-Enantiomer angegeben. Siehe auch Farthing, J. Chem. Soc. 1950, 3213 und Bergmann, J. Biöl. Chem., 115, 593 (1936)) in 50 ml Dimethylformamid^ wurde mit 1,98 g L-Leucin-methyl-esterhydrochlorid behandelt und im Eisbad abgekühlt. Die Lö-

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siong wurde mit 1,4 ml Triäthylamin und dann mit 1,5 g 1-Hydroxybenztriazol und schließlich mit 2,26 g Dicyclohexylcarbodiimid behandelt. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht anfangs unter Eiskühlung und nach und nach unter Erwärmung auf Raumtemperatur gerührt und dann weitere 24 Stunden bei Raumtemperatur. Das Gemisch wurde filtriert und das Filtrat eingedampft. Der Rückstand wurde in Äthylacetat gelöst und die Lösung mit 1n Salzsäure, gesättigter Natriumchloridlösung, 5-?oiger Katriumbicarbonatlösung und wieder mit gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen. Die Athylacetatlösung wurde abgetrennt, über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und eingedampft. Der Rückstand kristallisierte aus und wurde aus Isopropyläther umkristallisiert; /&7^ -5,3° (c 2,06, Methanol) Fp. 80-82

b) N^-Benzyloxycarbonyl-L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-D-leucyl-L-leucin-methyl-ester

1f95 g iP^-Benzyloxycarbonyl-D-leucyl-L-leucin-methylester wurden in 50 ml abs. Methanol gelöst, mit 2,33 nil 2,i45n Chlorwasserstoff in Methanol und 250 mg 10-%igem Palladium-auf-Kohle behandelt und wie in den früheren Beispielen angegeben reduziert. Man erhielt 1,4 g D-Leucyl L-leucin-methyl-ester-hydrochlorid.

2,4 g N°^Benzyloxycarbonyl-L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-hydrazid wurden in 80 ml Dimethylformamid gelöst und auf -20⁰C gekühlt. Die Lösung wurde mit 9,87 ml 2,42n Chlorwasserstoff in Tetrahydrofuran und dann mit 0,756 ml Isopentylnitrit behandelt. Das Reaktionsgemisch wurde 30 Minuten bei -20°C gerührt, auf -25⁰C abgekühlt und mit 3,9 ml,Triäthylamin behandelt. 1,3 g des oben angegebenen D-Leucyl-L-leucin-methyl-ester-hydrochlorids wurden zugegeben und das Reaktionsgemisch 30 Minuten bei -20⁰C, 30 Minuten bei -20 bis -5°C und 3 Stunden bei O⁰C gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei 0 C stehengelassen, filtriert und das Filtrat unter vermindertem Druck

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eingedampft. Der Rückstand wurde in 600 ml Äthylacetat und 20 ml Wasser suspendiert und mit 30 ml 0,5η. Salzsäure behandelt. Das Äthylacetat wurde abgetrennt und mit gesättigter Salzlösung,Natriumbicarbonatlösung und wieder mit gesättigter Salzlösung gewaschen. Das Äthylacetat wurde filtriert und auf ungefähr 50 ml eingedampft. Das Produkt wurde einen Tag bei 0⁰C stehengelassen, mit Äther zur Unterstützung der Ausfällung behandelt, filtriert und der Feststoff unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhielt 2,35 g N^-Benzyloxycarbonyl-L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-D-leucyl-L-leuci'n-methyl-ester.

c) N^-Benzyloxycarbonyl-O-benzyl-L-tyrosyl-L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-D-leucyl-L-leucin-methyl-ester

2,3 g N^-Benzyloxycarbonyl-L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-D-leucyl-L-leucin-methyl-ester wurden in 70 ml abs. Methanol gelöst und mit 500 mg 20-%igem Palladium-auf-Kohle behandelt. Der Kolben wurde mit Stickstoff und dann mit Wasserstoff.gespült und die Hydrierung 45 Minuten durchgeführt. Die Vollständigkeit der Reaktion wurde durch Dünnschichtchromatographie geprüft. Der Kolben wurde wieder mit Stickstoff gespült, der Katalysator abfiltriert und das Filtrat eingedampft. Das Produkt wurde unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhielt 2,0 g.

2,0 g des oben angegebenen Produktes L-Tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-D-leucyl-L-leucin-raethyl-ester v/urden in 70 ml Dimethylformamid gelöst und im Eisbad gekühlt. 970 mg N^-Benzyloxycarbonyl-O-benzyl-L-tyrosin, 355 mg 1-Hydroxybenztriazol und 545 mg Dicyclohexylcarbodiimid wurden zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde einige Stunden im Eisbad gerührt, dann auf Raumtemperatur erwärmt und 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Gemisch wurde filtriert und das Filtrat unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wurde in 400 ml Äthylacetat, 20 ml Wasser und 20 ml 0,5n Salzsäure gelöst. Das Äthylacetat wurde abgetrennt, mit gesättigter Salzlösung,mit 0,5n Natriumbicarbonatlösung und

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wieder mi"t gesättigter Salzlösung gewaschen und zu einem festen Rückstand eingedampft. Man erhielt 2,81 g.

d) ii^-Benzyloxycarbonyl-O-benzyl-L-tyro syl-L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-D-leucyl-hydrazid

2,81 g NiX-Benzyloxycarbonyl-O-benzyl-L-tyrosyl-L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-D-leucyl-L-leucin-methylester wurdeain 20 ml Dimethylformamid und 30 ml Methanol gelöst. Die Lösung wurde mit 3 ml Hydrazinhydrat behandelt und bei Raumtemperatur 3 Tage stehengelassen. Die Lösung wurde filtriert und das Filtrat zur Entfernung von Methanol eingedampft. Die verbleibende DimethyI-formamidlösung wurde mit 200 ml Isopropanol verdünnt und 1 Stunde bei Raumtemperatur und über Nacht bei 0⁰C stehengelassen. Das Gemisch wurde filtriert, wobei ein Niederschlag ausfiel. Der Niederschlag wurde 2 Stunden mit Äther verrieben, dann abgetrennt und unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhielt 1,8 g. Das Filtrat ergab einen weiteren kleinen Anteil beim Eindampfen und Behandlung mit Isopropanol; /ÖJp⁵ -13° (c 1,0, DMF); UV-Spektrum in Methanol ^_3x 289 B^j 54,4; >^_ax 282,5

A ⁸⁰>⁴; \ax^278E1 ⁸¹-

e) Ntf-Benzyloxycarbonyl-O-benzyl-L-tyrosyl-L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-D-leucyl-L-leucyl-L-arginyl-L-prolyl-glycinamid

1,2 g N^-Benzyloxycarbonyl-L-arginyl-L-prolylglycinamid-hydrochlorid (Beispiel 1, Teil m)) wurden in 60 ml abs. Methanol gelöst, mit 380 mg 10-%igem Palladiumauf-Kohle behandelt und der Kolben mit Stickstoff und dann mit Wasserstoff gespült und die Reduktion 40 Minuten durch geführt. Die Vollständigkeit der Reduktion wurde durch Dünnschichtchromatographie nachgewiesen. Das Gemisch wurde filtriert, um den Katalysator abzutrennen, das Filtrat ein gedampft und unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhielt L-Arginyl-L-prolyl-glycinamid-hydrochlorid.

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2649U6 .33.

1,9 g N^-Benzyloxycarbonyl-O-benzyl-L-tyrosyl-L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-D-leucyl-L-leucyl-hydrazid vmrden in 80 ml Dimethylformamid gelöst und auf -20°C abgekühlt. Die Lösung wurde mit 3,84 ml Z₁TkXi Chlorwasserstoff in Tetrahydrofuran und dann mit 0,37 ml (1O-?oiger Überschuß) Isopentylnitrit behandelt. Das Gemisch v/urde 30 Minuten bei -20°C gerührt, auf -25⁰C abgekühlt, mit 1,46 ml destilliertem Triäthylamin und' dann mit 700 mg des oben angegebenen L-Arginyl-L-prolylglycinamid-hydrochlorid-3behandelt. Das Reaktionsgemisch wurde 30 Minuten bei -20°C, 15 Minuten bei -20 bis -10⁰C und 3 Stunden bei der Temperatur des Eisbades gerührt. Es wurde dann über Nacht bei 0 bis 5°C aufbewahrt. Das Gemisch wurde filtriert und das Filtrat unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand v/urde 3 Stunden in der Kälte mit Tetrahydrofuran verrieben, dekantiert und der Rückstand in 20 ml Methanol gelöst und zu 250 ml Äthylacetat zugetropft. Das Gemisch wurde 3 Stunden stehengelassen, dann filtriert und der Feststoff unter vermindertem Druck getrocknet.

Das Produkt wurde gereinigt durch Chromatographie über Silicagel und Eluieren mit Chloroform-Methanol (60:45). Die Fraktionen 7 bis 10 wurden aufgrund der Dünnschichtchromatographie zusammengegeben und eingedampft. Der Rückstand wurde in 200 ml Wasser gelöst, mit Salzsäure auf einen pH-Wert von eingestellt und lyophilisiert. Man erhielt 860 mg NÖi-Benzyloxy carbonyl-O-benzyl-L-tyroByl-L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-D-leucyl-L-leucyl-L-arginyl-L-prolyl-glycinamid-hydrochlorid; /Of 7^ -33,2° (c 1,O = DMF); UV-Spektrum in Methanol λ 289,5 Ej 40,4; JN^_x 282,5 %\ 59,4; ^_x 278 E₁ ¹ 60,2.

Beispiel 6 N°<-Benzyloxycarbonyl-L-leucyl-L-tryptophyl-

L-seryl-L-tyrosyl-D-asparaginyl-L-leucyl-L-arginyl-L-prolyl-glycinamid

a) N^-Benzyloxvcarbonyl-D-asparagin

50 g D-Asparagin wurden in 500 ml Wasser von 60⁰C gelöst und 70 g Natriumbicarbonat zugegeben und auf 20⁰C gekühlt. Die Lösung wurde mit 68 g Benzylchlorformiat 1 Stunde

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•Solang unter Rühren behandelt und weitere 2,5 Stunden gerührt. Die Lösung wurde 3-mal mit Äther extrahiert und die wäßrige Lösung mit kalter konz. Salzsäure angesäuert. Das weiße feste Produkt wurde abgetrennt, mit Wasser gewaschen und getrocknet. Man erhielt 77 g; Fp. 165-166°C; βθψ +7,4° (c 2,0Z

b) N^-Benzyloxycarbonyl-D-asparaginyl-L-leucin-methylester

5,325 g N^-Benzyloxycarbonyl-D-asparagin und 3,814 g Leucin-methyl-eister-hydrοchlorid v/urden in 50 ml Dimethylformamid gelöst. Die Lösung wurde auf 5°C gekühlt und langsam mit 3,0 ml Diphenylphosphorylazid in 10 ml Dimethylformamid und 5,9 ml Triäthylamin in 10 ml Dimethylformamid behandelt. Das Reaktionsgemisch wurde unter Eiskühlung 2,5 Stunden gerührt und 3 Tage bei Raumtemperatur. Das Gemisch wurde filtriert und das Filtrat unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde aus Äthylacetat umkristallisiert. Man erhielt 2,5 g; Fp. 191-193°C; £Ρθψ -14,4° · (c 1,015, DMF). Eine weitere Menge von 1,25 g konnte aus der Mutterlauge der Kristallisation erhalten werden.

c) D-Asparaginyl-L-leucin-methyl-ester-hydrochlorid

2,4 g N^-Benzyloxycarbonyl-D-asparaginyl-L-leucinmethyl-ester wurden in 70 ml abs. Methanol gelöst und mit 3,1 ml 1,97n Chlorwasserstoff in Methanol und 250 mg 10-%igem Palladium-auf-Kohle behandelt. Der Kolben wurde mit Stickstoff gespült und Wasserstoff eingeleitet und der Kolben 40 Minuten geschüttelt. Die Dünnschichtchromatographie zeigte, daß die Reaktion innerhalb von 15· Minuten vollständig war. Der Katalysator wurde abfiltriert und das Filtrat eingedampft. Der Rückstand wurde bei vermindertem Druck getrocknet. Man erhielt 1,84 g.

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d) N -Benzyloxycarbonyl-L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-D-asparaginyl-L-leucin-methyl-ester

2,96 g N^-Benzyloxycarbonyl-L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-hydrazid (Beispiel 1, Teil d) wurden in 80 ml Dimethylformamid gelöst, auf -20°C abgekühlt und mit 13,08ml 2,788n Chlorwasserstoff in Tetrahydrofuran (6 Äquivalent) behandelt und dann mit 1,3 ml Isopentylnitrit (90 %), Das Reaktionsgemisch wurde 30 Minuten bei -20⁰C gerührt, auf -25⁰C abgekühlt und mit 5,92 ml Triäthylamin (7 Äquivalent) behandelt. Dann wurden 1,SgD-Asparaginyl-L-leucin-methylester-hydrochlorid zugegeben, das Reaktionsgemisch .30 Minuten bei -20⁰C, 15 Minuten bei -2Ö°C bis -10⁰C und 3 Stunden bei O⁰C gerührt. Das Gemisch wurde über Wacht bei O⁰C stehengelassen, filtriert und das Lösungsmittel unter vermindertem Druck abgedampft. Der Rückstand wurde in 400 ml Äthylacetat, 20 ml Wasser und 20 ml 0,5n Salzsäure gelöst. Die Äthylacetatiösung wurde mit gesättigter Salzlösung, 5-/oiger Natriumbicarbonatlösung und wieder mit gesättigter Salzlösung gewaschen. Das während des Waschvorgangs ausfallende Produkt wurde abfiltriert. Ein zweiter Anteil wurde erhalten durch Eindampfen des Äthylacetats auf ungefähr 50 ml und 2-stündiges Kühlen. Man erhielt 3>81 g.

e) L-Tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-D-asparaginyl-L-leucin-methyl-ester

3,75 g N^-Benzyloxycarbonyl-L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-D-asparaginyl-L-leucin-methyl-ester wurden in 200 ml abs. Methanol gelöst, 375 mg 20-^igea Palladiumauf-Kohle .zugegeben und die Substanz mit Wasserstoff 50 Minuten reduziert. Der Katalysator wurde abfiltriert und das Filtrat unter vermindertem Druck eingedampft. Man erhielt 1,83 g. Der Katalysator wurde mit 400 ml siedendem Methanol extrahiert, abfiltriert und das Filtrat zur Trockne eingedampft. Man erhielt weitere 1,22 g.

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f ) N^Benzyloxycarbonyl-L-leucyl-L-tryptophyl-L-s eryl-L-tyrosyl-D-asparaginyl-L-leucin-methyl-ester

3,05 g L-Tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-D-asparaginyl-L-leucin-methyl-ester wurden in 100 ml Dimethylformamid gelöst, im Eisbad gekühlt und mit 683 mg (iO-%iger Überschuß) 1-Hydroxybenztriazol und 1,22 g N^-Benzyloxycarbonyl-L-leucin behandelt. Dann wurden 1,04 g (iO-%iger Überschuß) Dicyclohexylcarbodiimid zugegeben und das Reaktionsgemisch über Nacht gerührt,unter Schmelzen des Eises auf Raumtemperatur erwärmt. Das Gemisch wurde dann weitere

24 Stunden beiRaumtemperatur gerührt, anschließend filtriert und das Lösungsmittel unter vermindertem Druck abgedampft. Der Rückstand wurde mit 650 ml Äthylacetat,

25 ml Wasser und 20 ml 0,5n Salzsäure geschüttelt und filtriert, wobei 1,05 g eines unlöslichen Produktes abgetrennt wurden. Die Äthylacetatlösung wurde mit gesättigter Natriumchloridlösung, mit 5-/6iger Natriumbicarbonatlösung und wieder mit gesättigter Salzlösung gewaschen. Die Äthylacetatlösung wurde auf die Hälfte des Volumens eingedampft und im Kühlschrank aufbewahrt. Das Produkt wurde dann abfiltriert und unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhielt 2,3 g; ßxjj? -30,6° (c 1,02,

DMF); UV-Spektrum in Methanol λ _v 289,5 ^l 59,8; \^_v λ max ι max

280 E^ 76,8.

g) N^-Benzyloxycarbonyl-L-leucyl-L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-D-asparaginyl-L-leucyl-hydrazid

3,3 g N^-Benzyloxycarbonyl-L-leucyl-L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-D-asparaginyl-L-leucin-methyl-ester wurden in 20 ml Dimethylformamid, 35 ml abs. Methanol und 3,0 ml Hydrazinhydrat gelöst und über Nacht stehengelassen. Dann wurden 50 ml Isopropanol zugegeben und dasGemisch erneut über Nacht stehengelassen, anschließend filtriert, der Feststoff in 250 ml Äther suspendiert und bei Raum-

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temperatur 3 Stunden verrieben. Das Produkt wurde abfiltriert und unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhielt 2,78 g eines weißen Feststoffes; Fp. 227-229°C; £qj^⁵ -21,5° (c 1,05, DI-IF), UV-Spektrum in Methanol A_mQV 289,5 E^ 51,4;

\ax^{280 E}

y, max

h) N^-Benzyloxycarbonyl-L-leucyl-L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-D-asparaginyl-L-leucyl-L-arginyl-L-prolylglycinamid

1,9g N^-Benzyloxycarbnnyl-L-arginyl-L-prolyl-glycinamidhydrochlorid (Bdispiel 1, Teil m) wurden in 75 ml abs. Methanol gelöst und 550 mg 1O-9oiges Palladium-auf-Kohle zugegeben. Der Kolben wurde mit Stickstoff und dann mit Wasserstoff gespült und das Gemisch unter Wasserstoffatmosphäre 45 Minuten gerührt. Die Dünnschichtchromatographie zeigte, daß die Reaktion innerhalb von ungefähr 20 Minuten vollständig war. Der Katalysator wurde abfiltriert und das Filtrat eingedampft und der Rückstand unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhielt 1,35 g.

2,6 g N^Benzyloxycarbonyl-L-leucyl-L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-D-asparaginyl-L-leucyl-hydrazid wurden in 80 ml Dimethylformamid gelöst und die Lösung auf -20⁰C gekühlt, mit 5,85 ml 2,722n Chlorwasserstoff in Tetrahydrofuran behandelt und anschließend mit 0,55 nil Isopentylnitrit. Das Reaktionsgemisch wurde 30 Minuten bei -20⁰C gerührt, auf -25°C abgekühlt und mit 2,22 ml Triäthylamin behandelt. 1,1 g L-Arginyl-L-prolyl-glycinamid-hydrochlorid wurden zugegeben und das Gemisch 30 Minuten bei -20°C, 15 Minuten bei -20 bis -10⁰C und 3 Stunden bei ungefähr O⁰C gerührt. Das Gemisch wurde über Macht bei 0 bis 5°C gerührt, filtriert und das Lösungsmittel unter vermindertem Druck abgedampft. Der Rückstand 'wurde mit Tetrahydrofuran verrieben, über Nacht im Kühlschrank aufbewahrt und der Feststoff durch Dekantieren

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erhalten. Das Produkt wurde in 25 ml Methanol gelöst und zu 250 ml Äthylacetat unter Rühren zugetropft. Das Gemisch wurde einige Stunden gekühlt und zur Abtrennung von 3,1 g des Produktes in Form des Hydrochlorids filtriert.

Das Produkt wurde gereinigt durch Chromatographie über Silicagel und Eluieren mit einem Chloroform-Methanol-Gemisch (60:45). Die Fraktionen 11 bis 18 wurden aufgrund der Ergebnisse der Dünnschichtchromatographie zusammengegeben und eingedampft. Der Rückstand wurde in 100 ml Wasser gelöst, mit verdünnter Salzsäure auf einen pH-Wert von 4 eingestellt und lyophilisiert. Man erhielt 1,73 g N^Benzyloxycarbonyl-L-leucyl-L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-D-asparaginyl-L-leucyl-L-arginyl-L-prolyl-glycinamid-hydrochlorid; ß*J^ -36,4^c(c 1,0, DMF), UV-Spektrum in Methanol ^_x 239,5 %] 42,5, 7^_ax 280 E^j 55,5.

../Patentansprüche

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Claims

Patentansprüche

Nonapeptid der Formel

-Tyr-Rg-Leu-Arg-Pro-Gly-R,

und dessen Salze, wobei R^ Z-GIn, Z-GIn (bzl), Bhoc-Gln, Boc-His (bzl), »Z-His (bzl), Boc-Ser (bzl), Boc-Pro, Z-Leu, Boc-Leu, Z-Tyr (bzl), Z-IIe, Boc-Cys (bzl), Z-Phe oder Z-Ser (bzl), R₂ D-Phe, D-AIa, D-Leu, D-Trp, D-Tyr, D-Tyr(Me) D-Ser, D-Met, D-Arg, D-VaI, D-His, D-GIn, D-Phs, D-Thr, D-Pro oder D-Asn und R, NH₂, NH-(nieder Alkyl) oder N=(nieder Alkyl) ist.
2.

Peptide nach Anspruch 1, dadurch g e k e η η -

zeichnet

daß R, NH₂ ist.
3. Verfahren zur Herstellung der Peptide nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet , daß man

ein Azid der Formel

X-N,
3

in einem nicht reagierenden Lösungsmittel umsetzt mit einer Verbindung der Formel

Y-PrO-GIy-R₃

wobei X R^Trp-Ser-Tyr-, R₁-Trp-Ser-Tyr-R₂ oder R^Trp-Ser-Tyr-R₂-Leu und Y Arg, Leu-Arg oder R₂-LeU-Arg bedeuten und R₁, R₂ und R^ die oben angegebene Bedeutung haben unter der Voraussetzung, daß Arg in Form eines Salzes oder einer starken Säure vorliegt_; und das Produkt in Form der freien Base oder eines Salzes isoliert.

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