DE1939187B2

DE1939187B2 - Verfahren zur herstellung von peptiden

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Publication number: DE1939187B2
Application number: DE19691939187
Authority: DE
Inventors: Wolfgang Dipl.-Chem. Dr. 6239 Langenhain; Wolf Erhard Dipl.-Chem. Dr. 6238 Hofheim; Geiger Rolf Dipl.-Chem. Dr. 6000 Frankfurt König
Original assignee: Farbwerke Hoechst AG, vormals Meister Lucius & Brüning, 6000 Frankfurt
Priority date: 1969-08-01
Filing date: 1969-08-01
Publication date: 1973-07-12
Also published as: HU163708B; CH550143A; NL166925B; NL7011083A; FI53124B; BE754343A; GB1318963A; NL166925C; IL35005A; DK140010B; FI53124C; NO129568B; AT297745B; DE1939187C3; CS168535B2; SE352343B; US3795666A; DK140010C; IL35005A0; FR2056506A5

Description

a) eine geschützte Aminosäure oder ein geschütztes Peptid, bei denen diejenige Carboxylgruppe, die in Reaktion treten soll, frei ist, mit einer in an sich bekannter Weise geschützten Aminosäure- bzw. Peptidester oder deren -amiden, bei denen diejenige Aminogruppe, die in Reaktion treten soll, frei ist, in einem in der Peptidchemie gebräuchlichen Lösungsmittel in Gegenwart eines Carbodiimids umgesetzt wird, oder

b) eine geschützte Aminosäure oder ein geschütztes Peptid bei denen diejenige Carboxylgruppe, die in Reaktion treten soll, frei ist mit einem Carbodiimid zu einem aktivierten Derivat umgesetzt wird und anschließend mit einem gegebenenfalls geschützten Peptid oder einer Aminosäure bzw. deren Amiden, bei denen diejenige Aminogruppe, die in Reaktion treten soll, frei ist, in einem in der Peptidchemie gebräuchlichen Lösungsmittel umgesetzt wird, wobei nach beendeter Reaktion und üblicher Reinigung gegebenenfalls die Schutzgruppen ganz oder teilweise in an sich bekannter Weise abgespaltet werden,

succinimid reduzieren in dem Racemisierungstest von F. W e y g a η d et al. (F. W e y g a η d, D. H ο f fmann, E. Wünsch, Z. Naturf. 21b [1966], S. 426 bis 428) die Racemisierung bis unter 1 °/₀ D-Verbindung und verhindern die N-Acylharnstoffbildung. In einem modifizierten Racemisierungstest nach F. Weygand et al. (F. Weygand, D. Ho ff mann, A. Prox, Z. Naturf. 23b [1968], S. 279 bis 281), der die oft erhebliche sterische Hinderung bei der Herstellung von Peptiden berücksichtigt, konnte jedoch festgestellt werden, daß auch N-Hydroxysuccinimidzusätze starke Racemisierung nicht immer verhindern können (s. Tabelle 3 und 4). Darüber hinaus geben die N-Hydroxysuccinimidzusätze zur Bildung von Nebenprodukten Anlaß. So berichteten M. L ö w und L. Kisfaludy (Acta Chim. Hung. 44 [1965], S. 63 bis 65), daß N-Hydroxysuccinimid selbst mit Dicyclocarbodiimid reagiert und daß sterisch gehinderte N-Acy lpeptid-N-hydroxysuccin-

ao imid-ester nicht herstellbar waren. Eine Verbindung aus 1 Mol Dicyclohexylcarbodiimid und 3 Mol N-Hydroxysuccinimid wurde später als Succinimidooxycarbonyl-/?-alanin-N-hydroxysuccinimidester erkannt (H. G r ο s s und L. B i 1 k in E. B r i c a s: Peptides,

»5 North-Holland Publishing Comp. [1968], S. 156 und 157). Diese Verbindung reagiert mit Aminen glatt zu Harnstoff derivaten der /β-Alaninamide. Bestätigt wurde dieser Befund von F. Weygand, W. Steglich und N. Chytil (Z. Naturforsch. 23b [1968],

S. 1391).

Es wurde nun überraschenderweise gefunden, daß bei der Dicyclohexylcarbodiimid-Methode eine Zugabe von 3-Hydroxy-4-oxo-3,4-dihydro-l,2,3-benzotriazin (HOOBT) ebenfalls die Racemisierung in dem Racemisierungstest von F. W e y g a η d et al. (Chem. Ber. 99 [1966], S. 1451 bis 1460, und Z. Naturf. 21b [1966], S. 426 bis 428) bis auf 1 °/₀ oder unter 1 % D-Verbindung senkt (s. Tabelle 1) und die N-Acylharnstoffbildung verhindert. Darüber hinaus konnte auch in dem empfindlichen modifizierten Racemisierungstest nach F. W e y g a η d et al. (Z. Naturforsch. 23 b [1968], S. 279 bis 281) bei Zusatz von 3 - Hydroxy - 4 - oxo - 3,4 - dihydro -1,2,3 - benzotriazin keine Racemisierung beobachtet werden, während mit N-Hydroxysuccinimid hier die Racemisierung nicht ganz verhindert werden kann. Einen weiteren Vorteil zeigt 3 - Hydroxy - 4 - oxo - 3,4 - dihydro -1,2,3 - benzotriazin gegenüber N-Hydroxysuccinimid bei der Aktivierung von N-geschützten Peptiden. Während man die N-Hydroxysuccinimidester nur unter teilweiser Racemisierung derselben herstellen kann, gelingt die Herstellung von N-Acyl-peptid-3-hydroxy-4-oxo-3,4-dihydro-1,2,3-benzotriazin-estern ohne Racemisierung (s. Tabelle 2 und 4). Diese aktivierten Ester sind zur Peptidsynthese vorzüglich geeignet. In der

35

55

Regel ist ihre Isolierung bei der Peptidsynthese nicht notwendig.

R — COOH + HO-N

i
N

DCC

R — C — O —N

Il I

O N

(IR: 1810 bis 1815 cm¹) (RCOOH = N-geschützte Aminosäure bzw. Peptid)

3 4

Diese neuen aktivierten Ester reagieren mit den kann. Dies ist bei einem Zusatz von N-Hydroxy-

primären bzw. sekundären Aminogruppen der ge- succinimid nicht möglich, da sich N-Hydroxysuccin-

gebenenfalls geschützten Aminosäuren bzw. Peptide imid auch in Säuren löst. Aus schwerlöslichen Peptiden

auch bei starker sterischer Hinderung äußerst schnell. kann man mit Isopropanol, Äthanol, Methanol,

Nebenprodukte entstehen nicht in dem Maß, wie 5 Tetrahydrofuran oder heißem Wasser das 3-Hydroxy-

es bei der Verwendung von N-Hydroxysuccinimid der 4-oxo-3,4-dihydro-l,2,3-benzotiiazin extrahieren.

Fall ist. Die Ausbeuten sind daher mit 3-Hydroxy- In einzelnen Fällen wurden die neuen aktivierten

4-oxo-3,4-dihydro-l,2,3-benzotriazin in der Regel Ester isoliert. Hierbei ist von besonderem Vorteil,

höher, und die isolierten Verbindungen fallen in daß gerade die Ester von Z-Threonin und Z-Serin,

reinerer Form an. io von denen bisher nur wenige kristallisierte aktivierte

Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren Ester bekannt sind, sich in guten Ausbeuten kristallin

zur Herstellung von Peptiden bei welchem entweder isolieren lassen, wobei darauf hinzuweisen ist, daß

. . , . ... , . ... Serin- und Threoninpeptide bisher meist über die

a) eine geschützte Aminosäure oder em geschütztes _Azidmethode hergestellt worden sind, die Azid-Peptid bei denen diejenige Carboxylgruppe, die _{methode aber meist nur mäßi Ausbeuten liefert} in Reaktion treten soll, frei ist, mit einem ge- _{Auch entsteht z B aus z}._{Serinazid über das Iso}. schützten Aminosäure- bzw. Peptides!« oder _{t das 4}-Z-Amino-oxazolidinon-2 als Nebenderen Amiden, bei denen diejenige Aminogruppe, _produlct. _{Bei der a}ii_eini_gen Verwendung von Dicyclodie in Reaktion treten soll frei ist, memem in der _hexylcarbodiimid entstehen als Nebenprodukte die Peptidchem.e gebräuchlichen Losungsmittel in _{20 entsprechendetl} N-Acylharnstoffe (E.Schröder Gegenwart eines Carbodiimids umgesetzt wird, _{und K}._{Lübke>
The Pe}p_tideS) Vol. I, Academic

,. °· u« * · ·· λ u·· ^Press> ^{New York und} London, S. 208 [1965]). Die

b) eine geschützte Aminosäure oder ein geschütztes _{Möglichkeit) Z}-Serin-3-hydroxy-4-oxo-3,4-dihydro-PepUd bei denen diejenige Carboxylgruppe die i,₂₍₃ - benzotriazin - ester herzustellen, beweist die in Reaktion treten soll, frei ist, mit einem Carbodi- _{25 hohe Stabilität der Ester ge A}lkoholyse.

imid zu einem aktivierten Derivat umgesetzt Auch Tyrosinpeptide mit ungeschützter phenolischer

wird und anschließend mit einer gegebenen as _Hydroxygrup_pe i_assen sich nach der Dicyclohexyl-

geschutzten Aminosäure odereinemgegebenenfalls _carbodiimidmethode mit Zusatz von 3-Hydroxy-4-oxo-

geschutzten Peptid bzw. derenAmiden, bei denen ₃₎4._dlhyclro-l,2,3-benzotriazin gut herstellen.

diejenige Aminogruppe, die in Reaktion treten _{30 Ste},_{k man Glutaminyl}. _oder Asparaginylpeptide

soll, frei ist, in einem in der Peptidchemie ge- _mittek Djcyciohexylcarbodiimid her, so entstehen

brauchlichen Losungsmittel umgesetzt wird, wo- _durch Dehydratisierung der Säureamidgruppe in

bei nach beendeter Reaktion und üblicher Reim- beträchtlicher Menge die entsprechenden Nitrile. Bei

gung gegebenenfalls die Schutzgruppen ganz oder _N._Acyl._{asparagin ist auch eine} imidbildung möglich.

teilweise abgespaltet werden, _{35 So können} Asparaginylpeptide nur in Ausbeuten von

das dadurch gekennzeichnet ist, daß man die Umset- 39 bis 45°/₀ hergestellt werden (E. Schröder und

zung unter Zusatz von 1 bis 2 Äquivalenten 3-Hydroxy- K. Lübke, The Peptides, Voll, Academic Press,

4 - oxo - 3,4 - dihydro -1,2,3 - benzotriazin durchführt. New York und London, 1965, S. 191 und 202 bis 204).

Als Carbodiimide können die in der Peptidchemie Bei Zusatz von 3 - Hydroxy - 4 - oxo - 3,4 - dihydro-

üblichen Verbindungen, wie Dicyclohexylcarbodiimid, 40 1,2,3-benzotriazin Iassen sich dagegen Glutaminyl-

Diisopropylcarbodiimid und wasserlösliche Carbodi- und Asparaginylpeptide in guten Ausbeuten schnell

imide wie N-Cyclohexyl-N'-p-(diäthylaminocyclo- und sauber darstellen.

hexyl)-Carbodiimide oder N-Cyclohexyl-N'-[/?-(N-me- Als Bausteine der nach dem erfindungsgemäßen

thy) - morpholinium) - äthyl] - carbodiimid - ρ - toluol- Verfahren hergestellten Peptide kommen alle in natür-

sulfonat herangezogen werden. Als Schutzgruppen für 45 Hch vorkommenden Peptiden anzutreffenden Amino-

diejenigen funktionellen Gruppen der Aminosäuren säuren in ihrer L- oder D-Form in Frage. Auch der

und Peptide, die geschützt werden sollen, eignen sich Einsatz von ^-Aminosäuren, wie z. B. /5-Alanin oder

alle in der Peptidchemie üblichen Schutzgruppen. Auch andere nur synthetisch oder halbsynthetisch zugäng-

polymere Harze, wie Hydroxymethylpolystyrol können licher Aminosäuren, z. B. «-Methylalanin, a-Methyl-

als Schutzgruppen herangezogen werden (E. Sehr ö- 5° 3,4-dihydroxy-L-phenylalain oder /5-Chloralanin, ist

der, K. Lübke, The Peptides, Vol. I. Academic möglich.

Press, New York und London, 1965, S. 108 bis 111). Die Verfahrensprodukte können nach Abspaltung

Geeignete, in der Peptidchemie gebräuchliche der Schutzgruppen als Therapeutica Verwendung

Lösungsmittel sind polare Lösungsmittel, beispiels- finden oder als Zwischenprodukte zur Herstellung

weise Dimethylformamid, Dimethylacetamid, Te- 55 anderer therapeutisch wertvoller Peptide, wie z. B.

trahydrofuran, Dioxan, Pyridin, Dimethylsulfoxid, Oxytocin, Vasopressin, Glucagon, ACTH, Secretin,

Phosphorsäuretrisdiäthylamid oder Methylenchlorid Thyreocalcitonin oder Insulin, eingesetzt werden,

und gegebenenfalls Mischungen dieser Lösungsmittel. In der Beschreibung und in den Beispielen werden

Die Reaktionstemperatur liegt vorteilhaft zwischen die Aminosäuren nach den international gültigen

—20 und+40⁰C, bevorzugt bei etwa O⁰C. 60 Regeln abgekürzt. Außerdem werden folgende Ab-

Bei carboxylgeschützten, schwer in Wasser löslichen kürzungen verwendet:
Peptiden läßt sich das zugesetzte 3-Hydroxy-4-oxo-3,4-dihydro-1,2,3-benzotriazin mit Natrium- oder
Kaliumbicarbonatlösung oder mit Sodalösung vollständig ausschütteln. Ein besonderer Vorteil dieser 65
Methode ist, daß man durch Ansäuern dieser Natriumbicarbonat-Waschlösungen das eingesetzte 3-Hydroxy-4-oxo-3,4-dihydro-l,2,3-benzotriazin wieder ausfällen

Z	= Carbobenzoxy-
Boc	= tert.-Butyloxycarbonyl-
TFA	= Trifluoracetyl-
OMe	= Methylester
ONB	= p-Nitrobenzylester
OBu'	= tert.-Butylester

OOBT = 3-Hydroxy-4-oxo-3,4-dihydro-1,2,3-benzotriazin-ester

HOOBT = 3-Hydroxy-4-oxo-3,4-dihydro-1,2,3-benzotriazin

Mbh = 4,4'-Dimethoxy-benzhydryl-

Trt = Trityl-

MPCH = l-(p-Methoxy-phenyl)-cyclohexyl-DMF = Dimethylformamid THF = Tetrahydrofuran DCHA = Dicyclohexylamin DCC = Dicyclohexylcarbodiimid

DC = Dünnschichtchromatographie

Beschreibung der Versuche 1. Herstellung von isolierten N-Acyl-aminosäure-

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triazin-estern

a) Z-Thr-OOBT _ao

Zu einer Lösung von 12,75 g Z-Threonin (50 mMol) und 8,25 g HOOBT (5OmMoI) in 150 ml abs. Tetrahydrofuran gibt man bei O⁰C eine Lösung von 11 g DCC in eiskaltem Tetrahydrofuran. Man läßt 1 Stunde bei O⁰C und 1 Stunde bei Raumtemperatur rühren, saugt anschließend den Niederschlag ab und engt das Filtrat im Vakuum ein. Der Rückstand wird mit Isopropanol verrieben und abgesaugt. Aus Tetrahydrofuran/Petroläther kann umkristallisiert werden. Ausbeute 16,57 g (84,5 % der Theorie), Schmelzpunkt 170⁰C, [<x]d -26,6° (c = 2, in Dimethylformamid).

C₁₉H₁₈N₄O₆ (398,4):

Berechnet ... C57,28, H4,55, N 14,07%; gefunden ... C57,2, H4,6, N 14,4%.

b) Z-Ser-OOBT

2,4 g Z-Serin (10 mMol) werden wie im Beispiel 1 a mit 1,65 g HOOBT (10 mMol) umgesetzt. [<χ]τ> —40,4 (c = 2, in Dimethylformamid). Ausbeute 3,25 g (84,7% der Theorie), Schmp. 128 bis 130⁰C.

C₁₈H₁₆N₄O₆ (384,4):

Berechnet ... C56,25, H4,20, N 14,58%; gefunden ... C56,1, H4,6, N 14,9%.

c) Z-Asn(Mbh)-OOBT

4,9 g Z-Asn(Mbh)-OH (10 mMol) werden wie im Beispiel la mit 1,65 g HOOBT (10 mMol) in Dimethylformamid als Lösungsmittel umgesetzt. Ausbeute 3,1 g (48,5% der Theorie), Schmp. 175 bis 177⁰C.

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60

C₃₄H₃₁N₅O₈ (637,65):

Berechnet ... C64,05, H4,90, N 10,98%; gefunden ... C 64,2, H 5,1, N 11,1%.

2. Herstellung von Z-Ser-Leu-OBu'

a) Z-Ser-Leu-OBu* (nach der »Eintopfmethode« = Verfahrensweise a)

Zu einer Lösung von 24 g Z-Serin (0,1 Mol), 22,5 g H-Leu-OBu« · HCl und 16,3 g HOOBT in 300 ml Dimethylformamid gibt man bei 0°C 13 ml N-Äthylmorpholin und eine eiskalte Lösung von 22 g DCC in wenig Dimethylformamid. Man rührt je 1 Stunde bei O⁰C und bei Raumtemperatur, saugt den Niederschlag ab, engt das Filtrat im Vakuum ein und nimmt den Rückstand in Essigester auf. Die Essigesterlösung wird mit ges. Natriumbicarbonatlösung, 2n-Zitronensäure, ges. Natriumcarbonatlösung und Wasser gewaschen, mit Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird in Äther gelöst. Von Unlöslichem wird abfiltriert und der Äther abdestilliert. Der Rückstand kristallisiert aus Petroläther, dem etwas Essigester zugesetzt wurde. Ausbeute 36,5 g (89,4%), Schmp. 94 bis 95°C, [*]_D -36,05 (c = 2, in Methanol).

C₂₁H₃₂N₂O₆ (408,5):

Berechnet ... C 61,74, H 7,89, N 6,86%;
gefunden ... C 61,7, H 8,2, N 7,0%.

b) Z-Ser-Leu-OBu« (mit Z-Ser-OOBT)

Zu einer Suspension von 1,15 g H-Leu-OBu* · HCl (5 mMol) in Tetrahydrofuran gibt man bei O⁰C 0,65 ml N-Äthylmorpholin (5 mMol) und 1,95 g Z-Ser-OOBT (5 mMol). Nun rührt man 1 Stunde bei Raumtemperatur, engt die Reaktionsmischung ein, nimmt den Rückstand in Essigester auf und arbeitet wie bei 2 a auf. Ausbeute 3,4 g (83,3% der Theorie), Schmp. 93° C.

c) Herstellung von H-Leu-OBu* · HCl

112 g Z-Leu-OBu* werden in Methanol mit Pd-Katalysator unter Zuhilfenahme eines Autotitrators bei pH 4,5 (Zugabe von In methanolischer HCl) katalytisch hydriert. Nach beendeter Hydrierung wird der Katalysator abfiltriert und das Filtrat im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird mit Äther verrieben. Ausbeute 61,9 g, Schmp. 171°C. Die Substanz enthält noch etwas Leucin. Nach Chromatographie über neutrales Al₂O₃ in Methanol war die Substanz chromatographisch einheitlich. Ausbeute 56,8 g, Schmp. 172 bis 173⁰C.

3. Herstellung von Cys(Trt)-Ser-Leu

a) H-Ser-Leu-OBu« · HCl

39,4 g Z-Ser-Leu-OBu' werden in Methanol mit Pd-Katalysator unter Zuhilfenahme eines Autotitrators bei pH 4,5 (Zugabe von 1 η methanolischer HCl) katalytisch hydriert. Nach beendeter Hydrierung wird der Katalysator abfiltriert und das Filtrat im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird mit Äther verrieben. Ausbeute 30 g (== 100% der Theorie), Schmp. 196°C. Aus Methanol/Äther umkristallisiert, Schmp. 205⁰C. [*)d -35,3° (c = 2, in Methanol)

C₁₃H₂₇ClN₂O₄ (310,8):
Berechnet ... C 50,21, H 8,76, N 9,02%;
gefunden ... C 50,0, H 9,0, N 9,1%.

b) Boc-CysfTrO-Ser-Leu-OBu'

4,7 g BoC-CyS(Tn)-OH (10 mMol) werden in 30 ml abs. Tetrahydrofuran gelöst. Dazu gibt man bei 0⁰C 1,65 g HOOBT (10 mMol), 3,1g H-Ser-Leu-OBu* · HCl (10 mMol), 1,3 ml N-Äthylmorpholin und zum Schluß unter Rühren eine Lösung von 2,2 g DCC in wenig Tetrahydrofuran. Man läßt 1 Stunde bei 0° C und 1 Stunde bei Raumtemperatur rühren. Nun wird wie bei 2a aufgearbeitet. Der ölige Rückstand wird zur Reinigung in Tetrahydrofuran über basisches Al₂O₃ (Woelm, Aktivstufe I) chromato-

graphiert. Ausbeute 6,6 g (amorpher Schaum) (91.8 °/₀ der Theorie), DC: einheitlich.

C₄₀H₅₃N₃O₇S (719,95).

c) Cys(Trt)-Ser-Leu

54,6 g Boc - Cys(Trt) - Ser - Leu - OBu' werden bei Zimmertemperatur in Trifluoressigsäure (wasserfrei) gelöst. Man läßt die Lösung 1 Stunde bei Raumtemperatur stehen und ejigt bei 25° C Badtemperatur im Vakuum ein. Mit Äther wird 3mal nachdestilliert und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Der Rückstand wird dann in Äther angelöst und mit gesättigter Natriumacetatlösung geschüttelt. Der ausfallende Niederschlag wird abgesaugt und mit Wasser gewaschen und getrocknet. Das amorphe Pulver wird in Tetrahydrofuran gelöst. Von unlöslichen Bestandteilen wird filtriert und mit Petroläther das Peptid wieder gefällt. Ausbeute 36,6 g (82,6°/₀ der Theorie), amorph, DC: ninhydrinpositive Verunreinigung Md + 9,95° (c = 2, in Eisessig).

C₃₁H₃₇N₃O₅S -IH₂O (581,7):

Berechnet ... C 64,00, H 6,76, N 7,23, S5,51°/_O; gefunden ... C 63,9, H 6,8, N 7,6, S 5,5%.

4. Herstellung von Gly-Val-Cys(Trt)-Ser-Leu
a) Boc-Gly-VaI-OH

Zu einer Suspension von 8,75 g Boc - Glycin (5OmMoI), 8,25 g HOOBT (5OmMoI) und 8,5 g H-VaI-OMe- HCi (5OmMo!) in 150 ml Tetrahydrofuran gibt man bei O⁰C unter Rühren 6,5 ml N-Athylmorpholin (50 mMol) und zum Schluß eine Lösung von 11 g DCC in wenig Tetrahydrofuran. Man läßt 1 Stunde bei O⁰C und 1 Stunde bei Zimmertemperatur rühren, saugt den Niederschlag ab und engt das Filtrat ein. Nun wird wie im Beispiel 2a aufgearbeitet. Ausbeute 10,6 g (ölig). Zur Reinigung wird in Essigester über basisches Al₂O₃ (Woelm, Aktivstufe I) chromatographiert. Ausbeute 8,7 g (ölig).

Die erhaltenen 8,7 g Boc-Gly-VaI-OMe werden in 32 ml Dioxan gelöst. Man versetzt die Dioxanlo.sung zunächst mit 4 ml Wasser und dann innerhalb von 1 bis 2 Stunden mit 30,2 ml 1 n-NaOH. Nach 2 Stunden wird mit 2n-Zitronensäure neutralisiert und die Reaktionsmischung im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird bei O⁰C zwischen Essigester und 2n-Zitronensäure verteilt. Die Essigesterphase wird noch einmal mit 2n-Zitronensäure und einmal mit Wasser ausgeschüttelt, mit Natriumsulfat getrocknet und eingeengt. Ausbeute 7,85 g. Nach Umkristallisation aus Essigester/Petroläther: Ausbeute 6,5 g, Schmy>. 98 bis 101⁰C, |>]d +4,33 (c = 2, in Methanol).

C₁₂H₂₂N₂O₅ (274,3):
Berechnet ... C 52,52, H 8,08, N 10,22⁰Z₀;

gefunden ... C 52,8, H 8,1, N 10,1 %.

b) Boc-Gly-Val-Cys(Trt)-Ser-Leu-OH

Eine Lösung von 3,14 g Boc-Gly-VaI-OH (Il mMol) und 1,82 g HOOBT (11 mMol) in 45 ml Tetrahydrofuran wird bei O⁰C mit 2,27 g DCC (11 mMol) versetzt. Man läßt 1 Stunde bei 0⁰C und 1 Stunde bei Raumtemperatur rühren und gibt dann 5,8 g Cys(Trt)-Ser-Leu · 1H₂O (10 mMol) zu und läßt noch I Stunde bei Raumtemperatur rühren. Der Niederschlag wird abgesaugt und das Filtrat eingeengt. Der Rückstand wird mit Äther verrieben. Es entsteht ein amorphes Produkt, das zur Reinigung aus Tetrahydrofuran/ Petroläther umgefällt wird. Ausbeute 7,8 g (93,1 °/₀ der Theorie), [a]_D —11,55° (c = 2, Dimethylformamid), DC: einheitlich.

C₄₃H₅₇N₅O₉S -IH₂O (838,0):
Berechnet ... C 61,63, H 7,10, N 8,36, S 3,83%; gefunden ... C 61,5, H 7,1, N 8,3, S 4,0%.

c) Gly-VaI-Cys(Trt)-Ser-Leu

7,3 g Boc-Gly-Val-Cys(Trt)-Ser-Leu-OH werden bei Zimmertemperatur in wasserfreie Trifluoressigsäure gelöst. Man läßt 30 Minuten bei Raumtemperatür stehen und engt anschließend bei 25° C Badtemperatur im Vakuum ein. Der Rückstand wird mit Äther verrieben und abgesaugt. Das amorphe Produkt wird in Dioxan/Wasser (6:4) gelöst und mit Natriumacetatlösung gefällt. Es wird gekühlt, abgesaugt und mit Wasser gewaschen. Ausbeute 6,75 g (86,6% der Theorie), [a]_d -25,6° (c = 1, 80%ige Essigsäure), DC: Nur durch Spuren ninhydrinpositive Substanzen verunreinigt.

C₃₈H₄₉N₅O₇S · 2Na-acetat, 0,5 H₂O (894,99):

Berechnet: C 56,35, H 6,31, N 7,83, S 3,58,
Na 5,14%;

gefunden: C 56,2, H 6,4, N 7,4, S 3,3,
Na 4,6%.

5. Herstellung von 3oc-Cys(Trt)-Cys(MPCH)-AIa-GIy-Val-Cys(Trt)-Ser-Leu-OH

a) Boc-Cys(Trt)-Cys(MPCH)-Ala-ONB

Zu einer Suspension von 23,7 g Boc-Cys(MPCH)-OH (57,9 mMol), 23,1g H - AIa - ONB - tosylat (58,2 mMol) und 9,55 g HOOBT (58,5 mMol) in 230 ml Tetrahydrofuran gibt man bei O⁰C unter

Rühren 7,5 ml N-Äthylmorpholin (58,5 mMol) und nach 5 Minuten Rühren 12,7 g DCC (61,3 mMol), gelöst in wenig Tetrahydrofuran. Man läßt 1 Stunde bei O⁰C und 1 Stunde bei Raumtemperatur rühren, saugt den Niederschlag ab und engt das Filtrat ein.

Der Rückstand wird wie im Beispiel 2a aufgearbeitet und anschließend zur writeren Reinigung in Essigester über basisches Al₂O₃ (Woelm, Aktivstufe I) Chromatographien. Ausbeute 31,9 g (89,5% der Theorie) amorphe Substanz. Die gewonnenen 31,9 g Boc-Cys(MPCH)-AIa-ON B (51,8 mMol) werden in 100 ml Eisessig gelöst. Dazu gibt man 100 ml In-HCI-Eisessig und läßt 1 Stunde bei Raumtemperatur stehen. Anschließend wird im Hochvakuum eingeengt und mit Äther nachdestilliert. Der Rückstand wird öfter mit Äther verrieben, wobei der Äther jeweils vom Rückstand abdekantiert wird. Zum Schluß wird der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Es bleiben 24,3 g eines amorphen Schaums zurück. Das entspricht einer Ausbeute von 85 % der Theorie, bezogen auf Boc-Cys(MPCH)-Ala-ONB. Die oben gewonnenen 24,3g H-Cys(MPCH)-Ala-ONB HCI (44,1 mMol) werden, in wenig Tetrahydrofuran gelöst, zu einer Reaktionsmischling von 23,2 g Boc-Cys(Trt)-OH (50 mMol), 7,3 g HOOBT (45 mMol) und 9,3 g DCC (45 mMol) in 100 ml Tetrahydrofuran, die bereits 1 Stunde bei O⁰C und 1 Stunde bei Raumtemperatur rührte, gegeben. Man läßt nun noch 5,8 ml N-Äthylmorpholin (45 mMol) zutropfen und rührt eine

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weitere Stunde bei Zimmertemperatur. Der Niederschlag wird abgesaugt, das Filtrat im Vakuum eingeengt und der Rückstand wie im Beispiel 2a aufgearbeitet. Zur Reinigung wird in Essigester über basisches Al₂O₃ (W ο elm, Aktivstufe 1) Chromatographien. Ausbeute 40,9 g amorpher Schaum (96,4 °/₀ der Theorie, bezogen auf H-Cys (MPCH)-AIa-ONB · HCl). DC: einheitlich.

C₅₃H₆₀N₄O₉S₂ (961,2)

b) BoC-CyS(Tn)-CyS(MPCH)-AIa-OH

40,9 g Boc - Cys(Trt) - Cys(MPCH) - Ala - ONB (42,5 mMol) werden in 125 ml Dioxan gelöst. Unter Rühren setzt man 25 ml Wasser zu und titriert mit 43 ml 1 n-NaOH gegen Thymolphthalein. Nach beendigter Verseifung wird mit 2n-Zitronensäure neutralisiert und die Reaktionsmischung im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird zwischen Essigester und 2n-Zitronensäure bei O⁰C verteilt. Die Essigesterlösung wird mit 2n-Zitronensäure und Wasser gewaschen, mit Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum eingeengt. Um den p-Nitrobenzylalkohol abzutrennen, wird in wenig Äther gelöst und mit einer größeren Menge Petroläther schnell ein Öl ausgefällt. Vom ausgefallenen öl wird rasch dekantiert. Diese Reinigungsprozedur wird noch zweimal wiederholt. Bei der letzten Umfällung fällt die Substanz als amorphes Pulver an. Ausbeute 22,6 g (64,4% der Theorie), DC: einheitlich.

C₄₆H₅₅N₃O₇S₂ (826,1).

c)Boc-Cys(Trt)-Cys(MPCH)-Ala-Gly-Val-Cys(Trt)-Ser-Leu-OH

Zu einer Lösung von 6,98 g Boc-Cys(Trt)-Cys(MPCH)-Ala-OH (8,45 mMol) und 1,15 g HOOBT (8,45 mMol) in 30 ml Dimethylformamid gibt man bei O⁰C eine ebenfalls auf O⁰C abgekühlte Lösung von 1,75 g DCC (8,45 mMol) in wenig Dimethylformamid. Man läßt 1 Stunde bei O⁰C und 1 Stunde bei Raumtemperatur rühren und gibt dann 5,8 g Gly-Val-Cys(Trt)-Ser-Leu, 2Na-acetat, 0,5 H₂O (6,5 mMol) zu. Man läßt eine weitere Stunde bei Zimmertemperatur rühren, saugt den Niederschlag ab, engt im Hochvakuum ein und verreibt den Rückstand mit Äther. Das dabei entstehende amorphe Pulver wird abgesaugt und aus Eisessig/Wasser umgefällt. Ausbeute: 9,8 g (97,7 % der Theorie). Die Substanz hat keinen scharfen Schmelzpunkt. DC: einheitlich [x]_D —14,3° (c = 2, in Dimethylformamid).

C₈₄H₁₀₂N₈O₁₃S₃ -IH₂O (1546):

Berechnet ... C 65,27, H 6,78, N 7,24, S 6,23%: gefunden ... C 65,1, H 6,9, N 7,1, S 6,6%.

6. Herstellung von Z-VaI-Glu(OBu')-Gln(Mbh)-OMe a) Z-Glu(OBu')-Gln(Mbh)-OMe

5,2 g Z-Glu(OBu')-OH-DCHA (10 mMol) und 4,25 g H-Gln(Mbh)-OMeHCl (10 mMol) werden getrennt in je 20 ml Dimethylformamid gelöst und dann zusammengegeben. Man kühlt gut ab, saugt den ausgefallenen Niederschlag ab und versetzt das Filtrat mit 1,65 g HOOBT (10 mMol). Bei O⁰C versetzt man die Lösung mit einer Lösung von 2,2 g DCC in Dimethylformamid, rührt 1 Stunde bei O⁰C und 1 Stunde bei Raumtemperatur, saugt den Niederschlag ab und versetzt das Filtrat mit Wasser. Der nun ausfallende Niederschlag wird in Essigester gelöst und wie im Beispiel 2a ausgeschüttelt. Der Rückstand wird mit Petroläther verrieben. Ausbeute: 5,5 g (78% der Theorie) Schmp. 171 bis 173°C. [λ]_ο -6,49° (c = 2, in Dimethylformamid).

C₃₈H₄₇N₃O₁₀ (705,8):

Berechnet ... C 64,66, H 6,71, N 5.96%;
gefunden ... C 64,2, H 6,9, N 6,1%.

b) Z-Val-Glu(OBu<)-Gln(Mbh)-OMe

4 g Z-Glu(OBu')-Gln(Mbh)-OMe werden in einer Methanol/Dimethylformamid-Mischung mit Pd-Katalysator unter Zuhilfenahme eines Autotitrators bei pH 4,5 (Zugabe von 1 n-methanolischer HCl) katalytisch hydriert. Nach beendigter Hydrierung wird der Katalysator abfiltriert und das Filtrat im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird mit Petroläther und Äther verrieben und am Hochvakuum getrocknet. Der Rückstand wird zusammen mit 1,4 g Z-Valin und 0,92 g HOOBT in 17 ml Dimethylformamid gelöst

und bei O⁰C unter Rühren mit 0,73 ml N-Äthylmorpholin und einer kalten Lösung von 1,25 g DCC in Dimethylformamid versetzt. Man läßt 1 Stunde bei O⁰C und 1 Stunde bei Raumtemperatur rühren, saugt den Niederschlag ab und engt das Filtrat ein.

Der Rückstand wird 2mal mit Natriumbicarbonatlösung verrieben und mit Wasser gewaschen. Ausbeute 4,35 g (95,3% der Theorie), Schmp. 189 bis 190⁰C.
Zur Reinigung wurde mit Alkohol aufgekocht und gekühlt: Ausbeute 3,85 g (84,4% der Theorie), Schmp. 200 bis 204⁰C [*]_D -9,45° (c = 2, in Dimethylformamid).

C₄₃H₅₆N₄O₁₁ (804,95):

Berechnet ... C 64,16, H 7,01, N 6,96%;
gefunden ... C 64,0, H 7,0, N 6,9%.

7. Herstellung von Z-Pro-Lys(Boc)-Gly-NH-Mbh
a) Z-Lys(Boc)-Gly-NH-Mbh

56,2 g Z - Lys(Boc) - OH · DCHA (0,1 Mol) und 34 g H-Gly-NH-Mbh-HCl (0,1 Mol) werden getrennt in je 200 ml Dimethylformamid gelöst und dann zusammengegeben. Man kühlt ab, saugt den ausgefallenen Niederschlag ab und versetzt das Filtrat mit 16,3 g HOOBT (0,1 Mol). Bei 0°C versetzt man die Lösung mit einer Lösung von 22 g DCC in Dimethylformamid, rührt 1 Stunde bei 0⁰C und 1 Stunde bei Raumtemperatur, saugt den Niederschlag ab und engt das Filtrat im Hochvakuum ein. Der Rückstand wird zwischen warmen Essigester und Natriumbicarbonatlösung verteilt. Die Essigesterphase wird mit 2n-Zitronensäure, Natriumbicarbonatlösung und Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und eingeengt. Der Rückstand wird aus Essigester/Petroläther umkristallisiert. Ausbeute 54,2 g (82% der Theorie), Schmp. 125 bis 127⁰C, [^]_n +5,4° (c = 2, in Methanol).

C₃₆H₄₆N₄O₆ (662,8):

Berechnet ... C 65,24, H 7,00, N 8,45%;
gefunden ... C 65,1, H 6,8, N 8,2%.

11 12

b) H-Lys(Boc)-GIy-NH-Mbh· HCl gibt dann 1,8 g H-AIa-OBu'· HCI (10 mMol) und

1,28 ml N-Äthylmorpholin zu. Man läßt eine weitere

54,2 g Z - Lys(Boc) - GIy - NH-Mbh werden in Stunde bei Zimmertemperatur rühren und arbeitet

Methanol suspendiert, mit Palladium-Katalysator wie bei 8a auf. Ausbeute 2,6g (63°/₀ der Theorie),

versetzt und unter Zutropfen von 1 n-methanolischer 5 Schmp. 158 bis 161⁰C.
Salzsäure (Autrotitrator, pH 5) katalytisch hydriert.

Der Katalysator wird abgesaugt und die Lösung ein- ^y· ^z"^Tvr"lyr-OMe

geengt. Der Rückstand wird mit Äther verrieben. Zu einer Suspension von 3,15g Z-Tyr-OH( 10 mMol),

Ausbeute 45,1 g(97,5°/, der Theorie), Schmp. 196°C, 2,30 g (10 mMol) H-Tyr-OMe · HCl und 1,63 g

[a]_d +16,75° (c = 2, in Methanol). to HOOBT (10 mMol) in 30 ml Methylenchlorid gibt

υ /~ίμ r\ is&< ^man k^e' ®°^ ^unter Rühren 1,3 ml N-Äthylmorpholin

L₂₈H₄₁LlN₄U₆ (36M). _{und eine} Lösung aus 2,2 g DCC in 5 ml Methylen-

, τ r. r ,_n , ^i κ,is k^uu chlorid. Man läßt 1 Stunde bei O⁰C und 1 Stunde bei

c) Z-Pro-Lys(Boc)-Gly-NH-Mbh Raumtemperatur rühren, saugt den Niederschlag ab,

Zu einer Lösung von 2,5 g Z-Prolin (10 mMol) 15 engt das Filtrat ein und arbeitet wie bei 2a weiter und 1,63 g HOOBT (10 mMol) in 30 ml Dimethyl- auf. Ausbeute 4,55 g (92,4% der Theorie), Schmp. formamid gibt man bei 0⁰C eine ebenfalls auf 0⁰C 174 bis 175°C.
abgekühlte Lösung von 2,2 g DCC in wenig Di-

methylformamid. Man läßt 1 Stunde bei O⁰C und 10. Z-lnr-Hie-OMe

1 Stunde bei Raumtemperatur stehen und gibt dann 20 Zu einer Lösung von 4 g Z-Thr-OOBT (10 mMol) 5,65g fein zerriebenes H-Lys(Boc)-Gly-NH-Mbh·HCl in 30 ml Tetrahydrofuran gibt man bei Raumtem-(10 mMol) und 1,3 ml N-Äthylmorpholin (10 mMol) peratur 2,2 g H-Phe-OMe · HCl und unter Rühren zu, läßt 1 Stunde bei Zimmertemperatur rühren, saugt 1,3 ml N-Äthylmorpholin. Bei Zimmertemperatur den gebildeten Niederschlag ab und engt das Filtrat wird eine Stunde nachgerührt. Die Lösung wird dann ein. Nun wird wie bei 7a aufgearbeitet. Ausbeute 25 im Vakuum eingeengt und der Rückstand zwischen 7,2 g (98°/o der Theorie), Schmp. 180 bis 183° C, Essigester und Wasser verteilt. Die Essigesterphase [<\]d —25° (c = 2, in Dimethylformamid). wird wie bei 2a ausgeschüttelt, mit Natriumsulfat

a\ u ,-1 Kiu inuu LJ/-I getrocknet, eingeengt und der Rückstand mit Petrol-

d) H-GIy-N H-Mbh · HCI _{äther verrieben}. Ausbeute 3,75 g (90,5 °/₀ der Theorie),

44,7 g Z-Gly-NH-Mbh werden in einer Mischung 30 Schmp. 103 bis 105⁰C.
aus 300 ml Methanol und 300 ml Eisessig suspendiert

und mit Palladium-Katalysator katalytisch hydrieit. 11. Herstellung von Z-VaI-VaI-OMe

Der Katalysator wird abgesaugt und das Filtrat ein- ^ ... ..... _ ,, , _ΛΛ__

geengt. Der Rückstand wird in Methanol gelöst und ^a> ^{Mlt nicht} «s°»»ertem Z-VaI-OOBT

gegen Thymolblau mit methanolischer Salzsäure 35 2,5 g Z-VaI-OH (10 mMol) und 1,63 g HOOBT titriert. Nun wird noch einmal eingeengt und der (10 mMol) werden in 20 ml absolutem Tetrahydro-Rückstand mit Äther verrieben. Ausbeute 33,9 g furan gelöst und bei O⁰C mit einer kalten Lösung von (98 % der Theorie). Umkristallisiert aus Methanol/ 2,2 g DCC in absolutem Tetrahydrofuran versetzt. Äther: 31,7 g (91,6% der Theorie), Schmp. 202 bis Man läßt 1 Stunde bei 0°C und 1 Stunde bei Raum-204°C. 40 temperatur stehen, fügt 1,7 g H-VaI-OMe · HCl

,,. (10 mMol) und 1,28 ml N-Äthylmorpholin (10 mMol)

C₁₇H₂₁CIN₂O₃ (336,8): _{zu und [äßt 1} s_tun{j_e bei Zimmertemperatur rühren.

Berechnet ... C 60,61, H 6,28, N 8,32%,; Aufarbeitung wie bei 2a. Ausbeute 2,9 g (80°/₀ der

gefunden ... C 60,3, H 6,5, N 8,4%· Theorie), Schmp. 107 bis 109⁰C.

8 Z Gin Ala OBu' ^) ^'^{l n}'^cn^ isoliertem Z-VaI-OSu

, , . . ,, , , · Ansatz wie bei Beispiel lla. Statt HOOBT setzt

a) nach der »E.ntopf-Methode« (Verfahrensweise a) _{man U5 g} N-Hydroxysuccinimid (11 mMol) zu.

Zu einer Lösung von 2,8 g Z-GIn-OH (10 mMol), Ausbeute 81%, Schmp. 82 bis 86⁰C.
1,8 g H-AIa-OBu' · HCI (10 mMol) und 1,63 g HOOBT 50

(10 mMol) in Dimethylformamid gibt man bei 0⁰C 12. Synthese von Boc-Leu-Phe-Val-OBu¹

1,28 ml N-Äthylmorpholin (10 mMol) und zum Schluß (gaschromatographischer Racemisierungstest

eine kalte Lösung von 2,1 g DCC in wenig Dimethyl- _nach p. Weygand et al.)

formamid. Man läßt 1 Stunde bei 0⁰C und 1 Stunde (F Weygand A. ProxundW. König,

bei Zimmertemperatur rühren, saugt den Niederschlag 55 Chem. Ber. 99 [1966], S. 1451 bis 1460)

ab und versetzt das Filtrat mit Wasser. Man läßt

über Nacht im Eisschrank stehen und saugt anderntags Der Test wurde dahingehend abgeändert, daß

den Niederschlag ab, der mit Natriumbicarbonat- statt Z-Leu-Phe-OH Boc-Leu-Phe-Oh eingesetzt lösung verrieben und mit Wasser gewaschen wird. wurde, was den Vorteil hat, daß das entstehende Über Phosphorpentoxid wird getrocknet. Ausbeute 60 völlig geschützte Peptid Boc-Leu-l · D-Phe-Val-OBu* 2,8 g (69% der Theorie), Schmp. 158 bis 160° C. ohne vorherige Schutzgruppenabspaltung hydrolysiert

. ,, ... werden kann,

b) mit Voraktivierung

Zu einer Lösung von 2,8 g Z-GIn-OH (10 mMol) a) Prüfung auf Racemisierung bei der

und 1,63 g HOOBT (10 mMol) in 20 ml Dimethyl- 65 .

formamid gibt man bei O⁰C eine kalte Lösung von 2,1 g bintopt-Metnoae

DCC in wenig Dimethylformamid. Man läßt 1 Stunde 378,5 mg Boc-Leu-Phe-OH (1 mMol) und 209,7mg

bei 0⁰C und 1 Stunde bei Raumtemperatur rühren und H-VaI-OBu* · HCl (ImMoI) werden in 2 ml ab-

solutem Dimethylformamid oder einem anderen Lösungsmittel gelöst oder suspendiert. Dazu gibt man 0,12 ml N-Äthylmorpholin (1 mMol) und kühlt im Eisbad ab. Danach gibt man die Zusätze (N-Hydroxysuccinimid oder 3-Hydroxy-4-oxo-3,4-dihydro-1,2,3-benzo-triazin) und zum Schluß eine auf 0⁰C abgekühlte Lösung von 207 mg DCC (1 mMol) in 1 ml absolutem Lösungsmittel zu. Man läßt die Ansätze 1 Stunde bei 0° C und 1 Stunde bei Raumtemperatur stehen, verdünnt mit etwa 30 ml Essigester, filtriert den ausgefallenen Niederschlag ab, schüttelt das Filtrat mit gesättigter Natriumbicarbonatlösung, 2n-Zitronensäure, gesättigter Natriumbicarbonatlösung und Wasser aus, trocknet mit Natriumsulfat, engt ein und chromatographiert den Rückstand in Essigester über 3 g basisches Aluminiumoxid (Woe Im, Aktivstufe I). Das Eluat (etwa 40 ml) wird eingeengt und der Rückstand in etwa 5 ml 8 bis 9 n-methanoHscher Salzsäure gelöst und im Bombenrohr 24 Stunden auf 7O⁰C erhitzt. Die methanolische Salzsäure wird eingeengt und der Rückstand wie bei F. W e y g a η d et al. weiter verarbeitet. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 1 zusammengefaßt.

Tabelle 1

Racemisierungsuntersuchungen bei der

Dicyclohexylcarbodiimid-Methode mit

Zusätzen von 3-Hydroxy-4-oxo-3,4-dihydro-

1,2,3-benzotriazin bzw. N-Hydroxysuccinimid

(Eintopf-Methode)

	Zusatz	Losungsmittel	Vo
Äquivalent	kein	DMF	D-Phe- L-VaI
0	kein	THF	14,3
0	N-Hydroxy-	DMF	8,1
1	succinimid		1,0
	desgl.	DMF
2	HOOBT	DMF	<l,0
1	HOOBT	DMF	<l,0
2	HOOBT	THF	1,3
1	HOOBT	Dimethyl-	<l,0
1		acetamid	<l,0
	HOOBT	Methylen
1		chlorid	<l,0
	HOOBT	DMSO
1	kein	DMSO	1,15
0	HOOBT	Pyridin	14,9
1	kein	Pyridin	1,5
0		19,2

b) Prüfung auf Racemisierung bei der

Voraktivierung von Peptiden mit Dicyclohexyl-

carbodiimid und 3-Hydroxy-4-oxo-3,4-dihydro-

1,2,3-benzotriazin bzw. N-Hydroxysuccinimid

378,5 mg Boc-Leu-Phe-OH (ImMoI) und Zusatz (3 - Hydroxy - 4 - oxo - 3,4 - dihydro -1,2,3 - benzotriazin bzw. N-Hydroxysuccinimid) werden in 2 ml Lösungsmittel gelöst bzw. suspendiert. Man kühlt auf O⁰C ab, gibt unter Rühren eine auf O⁰C abgekühlte Lösung von 207 mg DCC (1 mMol) in 1 ml abs. Lösungsmittel dazu und läßt 1 Stunde bei O⁰C und 1 Stunde bei Raumtemperatur rühren. Dann gibt man 209,7 mg H-Val-OBu'HCl (ImMoI) und 0,12 ml N-Äthylmorpholin (1 mMol) zu, läßt nochmals 1 Stunde bei Raumtemperatur stehen oder rühren und arbeitet wie bei 12 a auf.

Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 2 zusammengefaßt.

Tabelle 2

Racemisierungsuntersuchungen bei der

Voraktivierung von Peptiden mit Dicyclo-

hexylcarbodiimid und 3-Hydroxy-4-oxo-

3,4-dihydro-l ,2,3-benzotriazin bzw.

N-Hydroxysucci η imid

	Zusatz	Lösungsmittel	7»
Äquivalent			D-Phe-
	N-Hydroxy	DMF	L-VaI
1	succinimid		2,3
	desgl.	DMF
2	desgl.	Pyridin	1,65
1	desgl.	Pyridin	6,1
2	HOOBT	DMF	8,1
1	HOOBT	Dimethyl-	<l,0
1		acetamid	<l,0
	HOOBT	THF
1	HOOBT	Methylen	<l,0
1		chlorid	<l,0
	HOOBT	Pyridin
1		1,65

13. Synthese von TFA-Pro-Val-Pro-OBu*

(gaschromatographischer Racemisierungstest
nach F. Weygand et al.)

(F. Weygand, D. Hoffmann und

A. Pr ox, Z. Naturforsch. 23b [1968],

S. 279 bis 281)

Der Test wurde dahingehend abgeändert, daß statt H-Pro-OMe der stabilere und leichter zu handhabende H-Pro-OBu* eingesetzt wurde. Ein weiterer Vorteil dieser Anordnung ist die größere Empfindlichkeit des Racemisierungstestes.

Für die gaschromatographische Trennung wird das entstehende TFA-Pro-Val-Pro-OBu« in das TFA-Pro-Val-Pro-OMe umgewandelt.

a) Prüfung auf Racemisierung bei der
Eintopf-Methode

Zu einer Lösung von 309,3 mg TFA-Pro-VaI-OH (1 mMol) und 171 mg H-Pro-OBu« (1 mMol) in 3 ml Dimethylformamid gibt man den Zusatz (3-Hydroxy - 4 - oxo - 3,4 - dihydro -1,2,3 - benzotriazin bzw. N-Hydroxysuccinimid) und bei 0⁰C eine ebenfalls auf 0⁰C abgekühlte Lösung von 207 mg DCC (1 mMol) in Dimethylformamid. Man läßt 1 Stunde bei O⁰C und 1 Stunde bei Raumtemperatur stehen, verdünnt die Ansätze mit etwa 30 ml Essigester, filtriert den ausgefallenen Niederschlag ab, schüttelt das Filtrat mit gesättigter Natriumbicarbonatlösung, 2 n-Zitronensäure, gesättigter Natriumbicarbonatlösung und Wasser aus, trocknet mit Natriumsulfat, engt ein und chromatographiert den Rückstand in Essigester über 3 g basisches Aluminiumoxid (Wo elm, Aktivstufe I). Das Eluat (etwa 40 ml) wird eingeengt und der Rückstand in etwa 2 ml Trifluoressigsäure (90°/₀ig) gelöst. Man läßt 1 Stunde bei Raumtemperatur

stehen, engt ein, löst den Rückstand in Essigester und versetzt bis zur bleibenden Gelbfärbung mit einer ätherischen Lösung von Diazomethan. Die Lösung wird konzentriert und wie bei F. W e y g a η d et al. gasch romatograph iert.

Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 3 zusammengefaßt.

Tabelle 3

Racemisierungsuntersuchungen bei der
Dicyclohexylcarbodiimid-Methode mit
Zusätzen von 3-Hydroxy-4-oxo-3,4-dihydro-1,2,3-benzotriazin bzw. N-Hydroxysuccinimid
(Eintopfmethode)

Äqui valent	Zusatz	Losungs mittel	Vo D-VaI im Tripeptid
0 1 2 1 2	kein N-Hydroxysuccinimid N-Hydroxysuccinimid HOOBT HOOBT	DMF DMF DMF DMF DMF	67,0 28,0 15,0 <i,o <l,0

b) Prüfung auf Racemisierung bei der

Voraktivierung von Peptiden mit Dicyclo-

hexylcarbodiimid und 3-Hydroxy-4-oxo-

3,4-dihydro-l,2,3-benzotriazin bzw.

N-Hydroxysuccinimid

309,3 mg TFA-Pro-Val-OH (1 mMol) und Zusatz (3 - Hydroxy - 4 - oxo - 3,4 - dihydro -1,2,3 - benzotriazin bzw. N-Hydroxysuccinimid) werden in 2 ml Dimethylformamid gelöst. Man kühlt auf 0⁰C ab, gibt eine auf 0⁰C abgekühlte Lösung von 207 mg DCC (1 mMol) in 1 ml Dimethylformamid dazu und läßt 1 Stunde bei O⁰C und 1 Stunde bei Raumtemperatur stehen. Dann gibt man eine Lösung von 171 mg H-Pro-OBu* (1 mMol) in 1 ml Dimethylformamid zu, läßt nochmals 1 Stunde bei Zimmertemperatur stehen und

arbeitet wie bei 13a auf. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 4 zusammengefaßt.

Tabelle 4

Racemisierungsuntersuchungen bei der

Voraktivierung von TFA-Pro-Val-OH mit

Dicyclohexylcarbodiimid und 3-Hydroxy-

4-oxo-3,4-dihydro-l,2,3-benzotriazin bzw.

N-Hydroxysuccinimid

Äqui valent	Zusatz	Lösungs mittel	/ti D-VaI im Tn peptid
»5 1,2 2 1	N-Hydroxysuccinimid N-Hydroxysuccinimid HOOBT	DMF DMF DMF	18,0 17,0 1,0

14. Corticotropin-(l-23)-trikosipeptid-amid

7,5g Boc-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu(OBu«)-His-Phe-Arg-Trp-Gly-OH (5 mMol). hergestellt nach Chem. Ber. 96, (1963), S. 1080, werden in 100 ecm Dimethylformamid mit 815 mg (5 mMol) 3-Hydroxy-4-oxo-3,4-dihydro-1,2,3-benzotriazin und 1,03 (5 mMol) 3-Dicyclohexyl-carbodiimid 1 Stunde bei —5°C und 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Dann gibt man 1,1g H - Lys(Boc)-Pro - VaI - GIy-Lys(Boc)-Lys(Boc) - Arg - Arg - Pro - VaI - Lys(Boc) - VaI - Tyr-NHj-triacetat-hexahydrat (5 mMol), hergestellt nach Chem. Ber. 97 (1964), S. 1197, das vorher im Hochvakuum bei 60⁰C 1 Stunde über P₂O₅ getrocknet worden war, zu und läßt bei Raumtemperatur stehen. Nach 4 Stunden fällt man das rohe Reaktionsprodukt

mit Äther aus. Ausbeute 19,7 g. Man reinigt das Peptid durch Auskochen mit peroxydfreiem Tetrahydrofuran. Ausbeute 17,2 g. Die Schutzgruppen werden in bekannter Weise durch einstündiges Behandeln mit 90°/₀iger Trifluoressigsäure abgespalten, das rohe

Trikosipeptid wird mit Äther ausgefällt und mit Äther gewaschen. Ausbeute 17,0 g Trifluoracetat. Zur weiteren Reinigung wird in ebenfalls bekannter Weise an Carboxymethylcellulose chromatographiert.

309528/538

Claims

dadurch gekennzeichnet, daß man die Umsetzung unter Zusatz von 1 bis 2 Äquivalenten 3-Hydroxy-4-oxo-3,4-dihydro-l,2,3-benzotriazin durchfühlt.

Eines der bequemsten Verfahren zur Herstellung von Peptiden besteht in der Verknüpfung einer N-Acylaminosäure oder eines N-Acyl-peptids mit einem Aminosäure- oder Peptidester mittels Dicyclohexylcarbodiimid (J. C. Sheehan und G.P.Hess, J. Am. Chem. Soc. 77 [1955], S. 1067). Der Nachteil dieser Methode ist die nicht unerhebliche Racemisierung bei der Verknüpfung von Peptiden (F. Weygand, A. Prox und W. K öη ig, Chem. Ber. 99 [1966], S. 1451 bis 1460) und die Bildung von N-Acylharnstoffen, die das Syntheseprodukt verunreinigen und die Ausbeute reduzieren (s. E. S c h r ö d e r und K. L ü b k e, The Petides, Vol. I, S. 108 bis 111, Academic Press, New York und London, 1965).

Zusätze von 1,1 bis 2 Äquivalenten N-Hydroxy-

15

Patentanspruch:

Verfahren zur Herstellung von Peptiden bei welchem entweder