DE1939187A1 - Verfahren zur Herstellung von Peptiden - Google Patents

Verfahren zur Herstellung von Peptiden

Info

Publication number
DE1939187A1
DE1939187A1 DE19691939187 DE1939187A DE1939187A1 DE 1939187 A1 DE1939187 A1 DE 1939187A1 DE 19691939187 DE19691939187 DE 19691939187 DE 1939187 A DE1939187 A DE 1939187A DE 1939187 A1 DE1939187 A1 DE 1939187A1
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
mmol
hour
hydroxy
solution
boc
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
DE19691939187
Other languages
English (en)
Other versions
DE1939187C3 (de
DE1939187B2 (de
Inventor
Wolf Dipl-Chem Dr Erhard
Geiger Dipl-Chem Dr Rolf
Koenig Dipl-Chem Dr Wolfgang
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hoechst AG
Original Assignee
Hoechst AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority to BE754343D priority Critical patent/BE754343A/xx
Application filed by Hoechst AG filed Critical Hoechst AG
Priority to DE1939187A priority patent/DE1939187C3/de
Priority to NO702770A priority patent/NO129568B/no
Priority to FI2067/70A priority patent/FI53124C/fi
Priority to NL7011083.A priority patent/NL166925C/xx
Priority to IL35005A priority patent/IL35005A/en
Priority to US00059005A priority patent/US3795666A/en
Priority to CH1153970A priority patent/CH550143A/de
Priority to HUHO1314A priority patent/HU163708B/hu
Priority to DK397670AA priority patent/DK140010B/da
Priority to AT700170A priority patent/AT297745B/de
Priority to CS5388A priority patent/CS168535B2/cs
Priority to SE15527/70*A priority patent/SE352343B/xx
Priority to FR7028573A priority patent/FR2056506A5/fr
Priority to GB3732070A priority patent/GB1318963A/en
Publication of DE1939187A1 publication Critical patent/DE1939187A1/de
Publication of DE1939187B2 publication Critical patent/DE1939187B2/de
Application granted granted Critical
Publication of DE1939187C3 publication Critical patent/DE1939187C3/de
Expired legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D253/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having three nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D251/00
    • C07D253/08—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having three nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D251/00 condensed with carbocyclic rings or ring systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/10—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length using coupling agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/665—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans derived from pro-opiomelanocortin, pro-enkephalin or pro-dynorphin
    • C07K14/695—Corticotropin [ACTH]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06086—Dipeptides with the first amino acid being basic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Advancing Webs (AREA)

Description

FARBWERKE HOECHST AG., vormals Meister Lucius & Brüning
Aktenzeichen: P - Fw 6171
Datum: 30, Juli 1969
Dr.Hg/rei <
Verfahren zur Herstellung von Peptiden
Eines der bequemsten Verfahren zur Herstellung von Peptiden besteht in der Verknüpfung einer N-Acylaminosäure oder eines N-Acyl-peptids mit einem Aminosäure- oder Peptidester mittels Dic.yclohexylcarbodiimid (J.C. Sheehan und G.P. Hess, J. Am.Chem.Soc. Jl (1955), Seite 1067). Der Nachteil dieser Methode ist die nicht unerhebliche Racemisierung bei der Verknüpfung von Peptiden (F. Weygand, A.Prox u. ¥. König, Chem. Ber. ,99 (1966), Seite' 1451-1460) und die Bildung von N-Acyl-harnstoffen, die das Syntheseprodukt verunreinigen und die Ausbeute reduzieren. (Siehe E. Schröder u.K. Lübke, The Petides, Vol. I, Seite 108-111, New York u. London 1965).
Zusätze von 1.1 bis 2 Äquivalenten N-Hydroxysuccinimid reduzieren in dem Racemisierungstest von F. Weygand et al. (F. Weygand, D. Hoffmann, E. Wünsch, Z. Naturf.21 b (1966), Seite 426-428) die Racemisierung bis unter 1 % D-Verbindung und verhindern die N-Acylharnstoffbildung. In einem modifizierten Racemisierungstest nach F. Weygand et al. (F. Weygand, D. Hoffmann, A. Prox, Z. Naturf. 25 b (1968), Seite 279-281), der die oft erhebliche*mnderung bei der Herstellung von Petiden berücksichtigt, konnte jedoch fest-* gestellt werden, daß auch N-Hydroxysuccinimidzusätze starke Racemisierung nicht immer verhindern können (siehe Tabelle 3 und 4), Darüber hinaus geben die N-Hydroxysuccinimidzusätze zur Bildung von Nebenprodukten Anlaß. So berichteten M. Low und L. Kisfaludy (Acta Chim. Hung. 44 (1965), Seite 63-65), daß N-Hydroxysuccinimid selbst mit Dicyclocarbodiimid reagiert und daß sterisch gehinderte N-Acylpeptid-N-hydroxy-'♦) steri sehe
009887/2192
succinimid-ester nicht herstellbar waren. Eine Verbindung aus einem Mol Dicyclohexylcarbodiimid und drei Mol N-Hydroxy-' succinimid wurde später als Succinimidooxycarbonyl-ß-alanin-N-hydroxysuccinimidester erkannt (H. Gross u. L. BiIk in E. Bricas: Peptides, North-Holland Publishing Comp. (1968), Seite 156-157). Diese Verbindung reagiert mit Aminen glatt zu Harnstoffderivaten der ß-Alaninamide. Bestätigt wurde dieser Befund von F. Weygand, W. Steglich und N. Chytil (Z. Naturforsch. 23 b (1968), Seite 1391).
Es wurde nun überraschenderweise gefunden, daß bei der Di-" cyclohexylcarbodiimid-Methode eine Zugabe von 3-Hydroxy-4-oxo-3.4-dihydro-1.2.3-benzotriazin (HOOBT) ebenfalls die Racemisierung in dem Racemisierungstest von F. Weygand et al. (Chem. Ber. %9 (1966), Seite 1451-1460 und Z. Naturf. 21 b (1966), Seite 426-428) bis auf 1 % oder unter 1 % D-Verbindung senkt, (siehe Tabelle 1) und die N-Acylharnstoffbildung verhindert. Darüber hinaus konnte auch in dem empfindlichen modifizierten Racemisierungstest nach F. Weygand et al. (Z. Naturforsch. 23 b (1968), Seite 279-281) bei Zusatz von 3-Hydroxy-4-oxo-3.4-dihydro-1.2.3-benzotriazin keine Racemisierung beobachtet werden, während mit N-Hydroxysuccinimid hier die Racemisierung nicht ganz verhindert werden kann. Einen weiteren Vorteil zeigt 3-Hydroxy-4-oxo-3.4-dihydro-1.2.3-benzotriazin gegenüber N-iydroxysuecinimid bei der Aktivierung von N-geschützten Peptiden. Während man die N-Hydroxysuccinimidester nur unter teilweiser Racemisierung derselben herstellen kann, gelingt die Herstellung von N-Acyl-peptid-3-hydroxy-4-oxo-3.4-dihydro-1.2.3-benzotriazinestern ohne Racemisierung.(siehe Tabelle 2 und 4). Diese aktivierten Ester sind zur Peptidsynthese vorzüglich geeignet. In der Regel ist ihre Isolierung bei der Peptidsynthese nicht notwendig. . · . ]■
009807/2192
R -COOH + HO -
R-C-O-
(IR; 1810-1815 cm"1)
(RCOOH ■= N-geschützte Aminosäure bzw. Peptid)
Diese neuen aktivierten Ester reagieren mit den primären bzw. sekundären Aminogruppen der gegebenenfalls geschützten Aminosäuren bzw. Peptide auch bei starker sterischer Hin_derung äußerst schnell.
Nebenprodukte entstehen nicht in dem Maß, wie es bei der Verwendung von N-Hydroxysuccinimid der Fall ist. Die Ausbeuten sind daher mit,3-Hydroxy-4-oxo-3.4-dihydro-1.2.3-benzotriazin in der Regel höher und die isolierten Verbindungen fallen in reinerer Form an.
Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Herstellung von Peptiden, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man entweder
a) eine geschützte Aminosäure oder ein geschütztes Peptid, bei denen diejenige Carboxylgruppe, die in Reaktion treten soll, frei ist, mit einem geschützten Aminosäurebzw. Peptidester oder deren Amiden, bei denen diejenige Aminogruppe, die in Reaktion treten soll, frei ist, in einem in der Peptidchönie gebräuchlichen Lösungsmittel unter Zusatz von 1-2, vorzugsweise einem Äquivalent 3-Hydroxy-4-oxo-3.4-dihydro-1.2.3-benzotriazin und einem Carbodiimid umsetzt, oder
b) daß man eine geschützte Aminosäure oder ein geschütztes Peptid, bei denen diejenige Carboxylgruppe, die in Reaktion treten soll, frei ist, mit 1-2 Äquivalenten, vorzugsweise einem Äquivalent 3-Hydroxy-4-oxo-3.4-dih.ydro-'
009887/2192
■ - 4 -'
1.2.3-benzotriazin und einem Carbodiimid zu einem aktivierten Derivat umsetzt und anschließend mit einer gegebenenfalls geschützten Aminosäure oder einem gegebenenfalls geschützten Peptid bzw. deren Amiden, bei denen diejenige Aminogruppe, die in Reaktion treten soll, frei ist, in einem in der Peptidchemie gebräuchlichen Lösungsmittel reagieren läßt und nach beendeter' Reaktion und üblicher Reinigung gegebenenfalls die Schutzgruppen ganz oder teilweise abspaltet.
Als Carbodiimide können die in der Peptidchemie üblichen Verbindungen, wie Di.cyclohexylcarbodiimid, Diisopropylcarbodiimid und wasserlösliche Carbodiimide wie z.B. N-Cyclohexyl-N' p-(diäthylaminacyclohexyl) -Carbodiimide oder N-Cyclohexyl-N'/δ-(N-methyl-morphol'inium) -äthyl^Z-carbodiimid-p-toluolsulfonat herangezogen werden. Als Schutzgruppen für diejenigen funktioneilen Gruppen der Aminosäuren und Peptide, die geschützt werden sollen, eignen sich alle in der Peptidchemie üblichen Schutzgruppen. Auch polymere Harze, wie z.B. Hydroxymethylpolystyrol können als Schutzgruppen herangezogen werden (E. Schröder, K. Lübke, The Peptides, Vol.I. Academic Press New York u. London, 1965, Seite 108-111).
Geeignete in der Peptidchemie ,gebräuchliche Lösungsmittel sind polare Lösungsmittel, beispielsweise Dimethylformamid, Dimethylacetamid, Tetrahydrofuran, Dioxan, Pyridin, Dimethyls'ulfoxid, Phösphorsäuretrisdiäthylamid oder Methylenchlorid und gegebenenfalls Mischungen dieser Lösungsmittel. Die Reaktionstemperatur liegt vorteilhaft zwischen -20 und +400C, bevorzugt bei etwa O0C.
Bei carboxylgeschützten, schwer in V/asser löslichen Peptiden läßt sich das zugesetzte 3-Hydroxy-4-oxo-3.4-dihydro-1.2.3-benzotriazin mit Natrium- oder Kaliumbicarbonatlösung oder mit Soda-Lösung vollständig ausschütteln. Ein besonderer Vorteil dieser Methode ist, daß man durch Ansäurn dieser Natriumbicarbonat-Waschlösungen das eingesetzte 3-Hydroxy-4-oxo-3.4-dihydro-1.2.3-benzotriazin wieder ausfällen kann.
00 9 887/219 2
Dies ist z.B. bei einem Zusatz von N-Hydroxysuccinimid nicht möglich, da sich N-Hydroxysuccinimid auch in Säuren löst. Aus schwerlöslichen Peptiden kann man mit Isopropanol, Äthanol, Methanol, Tetrahydrofuran oder heißem Wasser das 3-Hydroxy-4-oxo-3.4-dihydro-1.2.3-benzotriazin extrahieren.
In einzelnen Fällen wurden die neuen aktivierten Ester isoliert. Hierbei ist von besonderem Vorteil, daß gerade die Ester von Z-Threonin und Z-Serin, von denen bisher nur wenige kristallisierte aktivierte Ester bekannt sind, sich in guten Ausbeuten kristallin isolieren lassen; wobei darauf hinzuweisen ist, daß Serin- und Threoninpeptide bisher meist über die Azidmethode hergestellt worden sind, die Azidmethode aber meist ■ nur mäßige Ausbeuten liefert. Auch entsteht z.B. aus Z-Serinazid über das Isoc.yanat das 4-Z-Amino-oxazolidinon~2 als Nebenprodukt. Bei der alleinigen Verwendung von Dicyclohexylcarbodiimid entstehen als Nebenprodukte die entsprechenden N-Acylharnstoffe (E., Schröder und K. Lübke, The Peptides, Vol. I, Academic Press, New York u. London, Seite 208 (1965)). Die
Möglichkeit, Z-Serin-3-hydroxy-4-oxo-3.4-dihydro-1.2.3-benzo- -ester ~ J
triazin/herzustellen, beweist die hohe Stabilität der Ester gegen Alkoholyse.
Auch Tyrosinpeptide mit ungeschützter phenolischer Hydroxygruppe lassen sich nach der Diayclohexylcarbodiimidmethode mit -Zusatz von 3-Hydroxy-4-oxo-3.4-dihydro-1.2.3-benzotriazin gut herstellen.
Stellt man Glutaminyl- oder Asparaginylpeptide mittels Dicyclohexylcarbodiimid her,so entstehen durch Dehydratisierung der Säureamidgruppe in beträchtlicher Menge die entsprechenden Nitrile. Bei N-Acyl-asparagin ist auch eine Imidbildung möglich. So können Asparaginylpeptide nur in Ausbeuten von 39-45 % hergestellt werden (E. Schröder u. K. Lübke, The Peptides, VoI I, Academic Press, New York u. London, 1965, Seite 191 und 202-204). Bei Zusatz von 3-Hydroxy-4-oxo-3.4-dihydro-1.2.3-benzo-
009887/219 2
triazin lassen sich dagegen Glutaminyl- und Asparaginylpeptide in guten Ausbeuten schnell und sauber darstellen.
Als Bausteine der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Peptide kommen alle in natürlich vorkommenden Peptiden anzutreffenden Aminosäuren in ihrer L- oder D-Form infrage. Auch der Einsatz von ß-Aminosäuren, wie z.B. ß-Alanin oder andere nur synthetisch oder halbsynthetisch zugänglicher Aminosäure^ ζ.B. rf -Methylalanin, oi -Methyl-3.4-dihydroxy-L-phenylalain oder ß-Chloralanin ist möglich.
* Die Verfahrensprodukte können nach Abspaltung.der Schutzgruppen als Therapeutica Vervrendung finden oder als Zwischenprodukte zur Herstellung anderer therapeutisch wertvoller Peptide, wie z.B. Oxytocin, Vasopressin, Glucagon, ACTH, Secretin, Thyreo-, calcitonin oder Insulin eingesetzt werden.
In der Beschreibung und in den Beispielen werden die Aminosäuren nach den international gültigen Regeln abgekürzt. Außerdem werden folgende Abkürzungen verwendet:
Z Carbobenzoxy-
Boc tert.-Butyloxycarbonyl-
TFA Trifluoracetyl-
OMe Methylester . ·
ONB p-Nitrobenzylester
OBu tert.-Butylester
OOBT 3~Hydroxy-4-oxo-3.4-dihyaro-1.2.3-benzotriazin-ester
HOOBT 3-Hydroxy-4-oxo-3.4-dihydro-1,2.3-benzotriazin
Mbh 4.4l-Dimethoxy-benzhydryl-
Trt Trityl- '·:'
MPCH 1-(p-Methoxy-phenyl)-cyclohexyl- :
DMF Dimethylformamid
THF Tetrahydrofuran ·
DCHA Dlcyclohexylamin ·
DCC Dicyclohexylcarbodiimid
DC Dünnschichtchromatographie
009887/2192
1933187 - 7 -
Beschreibung der Versuche;
1. Herstellung von isolierten N-Acyl-aminosäure-3-hydroxy-4-oxo-^.4-dihydro-1.2.3-benzotriazin-estern
a) Z-Thr-OOBT ·
Zu einer Lösung von 12.75 g Z-Threonin (50 mMol) und 8.25 g HOOBT (50 mMol) in 150 ml abs. Tetrahydrofuran gibt man bei O0C eine Lösung von 11 g DCC in eiskaltem Tetrahydrofuran. Man läßt 1 Std. bei O0C und eine Stunde bei Raumtemperatur rühren, saugt anschließend den Niederschlag ab und engt das Filtrat im Vakuum ein. Der Rückstand wird mit Isopropanol verrieben und abgesaugt. Aus Tetrahydrofuran/Petroläther kann umkristallisiert werden. Ausbeute 16.57 g (84.5 % d.Th.), Schmelzpunkt 1700C, Z«_7D -26.6° (c«2, in Dimethylformamid)
C19H18N4O6 (398.4) Ber. C 57.28 H 4.55 N 14.07
Gef. 57.2 4.6 14.4
b) Z-Ser-OOBT
2.4 g Z-Serin (TO mMol) v/erden wie in Beispiel 1a mit 1.65 g HOOBT (10 mMol) umgesetzt. ß*JO -40.4 (cÄ2, in Dimethylformamid) Ausb. 3.25 g (84.7 % d.Th.), Schmp. 128-1300C
C18H16N4°6 <384·4> Ber. C 56. 25 H 4. 20 N 14, 58
Gef. 56. 1 4. 6 14. 9
c) Z-Asn(Mbh)-OOBT
4.9 g Z-Asnj(Mbh)-OH (10 mMol) werden wie in Beispiel 1a mit 1.65 g HOOBT (10 mMol) in Dimethylformamid als Lösungsmittel umgesetzt.
Ausb. 3.1 g (48.5 % d.Th), Schmp. 175-177°
C^H^Np-Oc, (637.65) Ber. C 64.05 H 4.90 N 10.98 ^+ 31 ? ö Gef. 64.2 5.1 11.1
009887/2192
Herstellung; von Z-Ser-Leu-OBu
a) Z-Ser~Leu-OBu (nach.der "Eintopfmethode" = Verfahrensweise a)
Zu einer Lösung von 24 g Z-Serin (0.1 Mol), 22.5 g H-Leu-ÖBu^HCl und 16.3 g HOOBT in 300 ml Dimethylformamid gibt man bei O0C 13 ml N_Äthylmorpholin und eine eiskalte Lösung von 22 g DCC in wenig Dimethylformamid. Man rührt je eine Stunde bei O0C und bei Raumtemperatur, saugt den Niederschlag ab, engt das Filtrat i.Vak.. ein und nimmt den Rückstand in Essigester auf. Die Essigesterlösung wird'mit ges. Natriumbicarbonatlösung, 2n Zitronensäure, ges. Natriumcärbonatlösung und Wasser gewaschen, mit Natriumsulfat getrocknet und i.Vak. eingeengt. Der Rückstand wird in Äther gelöst. Von Unlöslichem wird abfilizLert und der Äther abdestilliert. Der Rückstand kristallisiert aus Petroläther, dem etwas Essigester zugesetzt wurde. Ausb. 36.5 g (89.4 %), Schmp. 94-95°,/Öl7d -36.05 (c=2, in Methanol) C21H32N2O6 (408,5) Ber. C61.74 H 7.89 N 6.86
Gef. 61.7 8.2 7.0
b) Z-Ser-Leu-OBu* (mit Z-Ser-OOBT)
Zu einer Suspension von 1.15 g H-Leu-OB^.HCl (5 mMol) in Tetrahydrofuran gibt man bei 0°C 0.65 ml N-Äthylmorpholin (5 mMol) und 1.95 g Z-Ser-OOBT ( 5 mMol). Nun rührt man eine Stunde bei Raumtemperatur, engt die Reaktionsmischung ein, nimmt den Rückstand in Essigester auf und arbeitet wie bei 2a auf.
Ausb. 3.4 g (83.3 %-d.Th.)
Schmp. 93°
c) Herstellung von H-LeU-OBu1^HCl
112 g Z-Leu-OBu werden in Methanol mit Pd-Katalysator unter Zuhilfenahme eines Autotitrators bei pH 4.5 (Zugabe von 1n methanolischer JlCl) katalytisch hydriert. Nach beendeter Hydrierung wird der Katalysator abfiltriert und 009887/2192
das Filtrat i.Vak. eingeengt. Der Rückstand wird mit "-■ Äther verrieben. Ausb. 61.9 g, Schmp. 171°. Die Substanz enthält noch etwas Leucin. Nach Chromatographie über
neutrales Al0O^ in Methanol war die Substanz chromato-2 3
graphisch einheitlich.
Ausb.-56.8 g, Schmp. 172-173° "
3. Herstellung von Cys(Trt)-Ser-Leu
a) H-Ser-Leu-OBu^HCl
39.4 g Z-Ser-Leu-OBu werden in Methanol mit Pd-Ka talysator unter Zuhilfenahme eines Autotitrators bei pH • (Zugabe von 1n methanolischer HCl) katalytisch hydriert. Naciybeendigter Hydrierung wird der Katalysator abfiltriert und das Filtrat i.Vak. eingeengt. Der Rückstand wird mit Äther verrieben.
Ausb.■30 g (= 100 % d.Th.), Schmp. 196° Aus Methanol/Äther umkristallisiert Schmp. 205° DO V -35.3° (c=2, in Methanol)
C13H2^ClN2O4 (310.8) Ber. C 50.21 H 8.76 N 9.02
Gef. 50.0 9.0 9.1
b) Boc-Cvs(Trt)-Ser-Leu-OBufc
4.7 g Boc-Cys(Trt)-OH (10 mMol) werden in 30 ml abs. Tetrahydrofuran gelöst. Dazu gibt man bei 0° 1.65 g HOOBT (10 mMol), 3.1 g H-Ser-Leu-OBu^HCl (10 mMol), 1.3 ml N-Äthylmorpholin und zum Schluß unter Rühren eine Lösung von 2.2 g DCC in wenig Tetrahydrofuran. Man läßt 1 Std. bei 0° und 1 Std. bei Raumtemperatur rühren. Nun wird wie bei 2a aufgearbeitet. Der ölige Rückstand wird zur Reinigung in Tetrahydrofuran über basisches Al2O, (V/oelm, Aktivstufe I) Chromatograph!ert. Ausbeute 6.6 g (amorpher Schaum) (91.8 % d.Th) DCi einheitlich
C40H53Ii3O7S (719.95)
009887/2192
■ ■- ίο -
c) Cvs(Trt)-Ser-Leu
54.6 g Boc-Cys(Trt)-Ser-Leu-OBu werden bei Zimmertemperatur in Trifluoressigsäure (wasserfrei) gelöst. Man läßt die Lösung T Std. bei Raumtemperatur stehen und engt bei 25° Badtemperatur i.Vak. ein. Mit Äther wird 3 mal nachdestilliert und"der Rückstand i. Hochvak. getrocknet. Der Rückstand wird dann in Äther angelöst und mit gesättigter Natriumacetatlösung geschüttelt. Der. ausfallende Niederschlag wird abgesaugt und mit Wasser gewaschen und getrocknet. Das amorphe Pulver wird in Tetrahydrofuran gelöst. Von unlöslichen Bestand-" teilen wird filtriert und mit Petroläther, das Peptid wieder gefällt.
Ausb. 36.6 g (82.6 % d.Th), amorph DC: ninhydrinpositive Verunreinigung DÜv + 9·95° (c=2, in Eisessig)
C31H57N3Q5S.1 H2O (581.7) Ber. C 64.00 H 6.76 N 7.23 S 5.51
Gef. 63.9 6.8 7.6
4. Herstellung von Glv-Val-Cvs(Trt)-Ser-Leu
a) Boc-Glv-Val-OH
Zu einer Suspension von 8.75 g Boc-Glycin (50 mMol), ) 8.25 g HOOBT (50 mMol) und 8.5 g H-VaI-OMe.HCl (50 mMol) in 150 ml Tetrahydrofuran gibt man bei 0° unter Rühren 6.5 ml N-Äthylmorpholin (50 mMol) und zum Schluß eine Lösung von 11 g DCC in wenig Tetrahydrofuran. Man läßt 1 Std. bei 0° und 1 Std. bei Zimmertemperatur rühren, saugt den Niederschlag ab und engt das Piltrat ein. Nun wird wie in Beispiel 2a aufgearbeitet. Ausb. 10.6g (ölig). Zur Reinigung wird in Essigester über basisches Al2O3 (Woelm, Aktivst. I) chromatographiert. Ausb. 8.7 g (ölig)
Die erhaltenen 8.7 g Boc-Gly-VaI-OMe werden in 32 ml Dioxan gelöst. Man versetzt die Dioxanlösung zunächst mit 4 ml V/asser und dann innerhalb von 1-2 Std· mit
009887/2192
30.2 ml 1n NaOH. Nach 2 Std. wird mlt'2h Zitronensäure neutralisiert und die Reaktionsmischung i.Vak. eingeengt. Der Rückstand wird bei 0° zwischen Essigester und 2n Zitronensäure verteilt. Die Essigesterphase v/ird noch einmal mit 2n Zitronensäure und einmal mit Wasser ausgeschüttelt,.mit Natriumsulfat getrocknet und eingeengt. Ausb.» 7.85 g. Nach Umkristallisation aus Essiges ter/Petroläther: Ausb. 6.5 g, Schmp. 98-101°, 1\7Ώ +4.33 (c=2, in Methanol)
C12H22N2O5 (274.3) Ber. C 52.52 H 8.08 N 10.22
Gef. 52.8 8.1 10.1
b) Boc-Glv-Val-Cvs(Trt)-Ser-Leu-OH
Eine Lösung von 3.14 g Boc-Gly-Val-OH (11 mMol) und 1.82 g HOOBT (11 raMol) in 45 ml Tetrahydrofuran wird bei 0° mit 2.27 g DCC (11 mMol) versetzt. Man läßt 1 Std. bei 0° und*tys(Trt)-Ser-Leu.1 H£0 (10 mMol) zu und läßt noch 1 Std. bei Raumtemperatur rühren. Der Niederschlag wird abgesaugt und das FiItrat eingeengt. Der Rückstand wird mit Äther verrieben. Es entsteht ein amorphes Produkt, das zur Reinigung aus Tetrahydrofuran/Petroläther umgefällt wird.
Ausb. 7.8 g (93.1 % d.Th)
l4jB -11.55° (c=2, Dimethylformamid) DC: einheitlich
C43H57N5O9S.1 H2O (838.0) Ber. C 61.63 H 7.10 N 8.36 S 3.83
Gef. 61.5 7.1 8.3
c) Gly-Val-Cys(Trt)~Ser-Leu
7.3 g Boc-Gly-Val-Cys(Trt)-Ser-Leu-OH werden bei Zimmertemperatur in wasserfreie Trifluoressigsäure gelöst. Man läßt 30 Min. bei Raumtemperatur stehen und engt an- schließend bei 25° Badtemperatur i.Vak. ein. Der Rückstand v/ird mit Äther verrieben und abgesaugt. Das amorphe Produkt wird in Dioxan/YJasser (6:4) gelöst und mit Natriumacetatlösung gefällt. Es v/ird gekühlt, abgesaugt und *)1 Std. bei Raumtemperatur rühren und gibt dann 5.8 g
009887/2192
mit Wasser gewaschen.
Ausb. 6.75 g (86.6 % d.Th) ß(JO -25.6° (c=1, 90-proz. Essigsäure) '
DC: Nur durch Spuren ninhydrinpositive Substanzen verunreinigt. ' C38H49N5O7S,2 Na-acetat, 0.5 H2O (894.99) Ber. C 56.35 H 6.31 N 7.83 S.3.58 Na 5.14 Gef.· 56.2 6.4 7.4 3.3 4.6
Hefstellung von Boc-CysiTrtJ-CystMPCHj-Ala-Gly-Val-Cvs(Trt)~Seri-Leu-OH
a) Boc-Cvs(Trt)-Cvs(MPCH)-Ala-ONB
Zu einer Suspension von 23.7 g Boc-Cys(MPCH)-OH (57.9 mMol), 23.1 g H-AIa-ONB-tosylat (58.2 mMol). und 9.55 g HOOBT (58.5 mMol) in 230 ml Tetrahydrofuran gibt man bei 0° unter Rühren 7.5 ml N-Äthylmorpholin (58.5 mMol) und nach 5 Min. Rühren 12.7 g DCC (61.3 mMol), gelöst in wenig Tetrahydrofuran. Man läßt eine Std. bei 0° und : eine Std. bei Raumtemperatur rühren, saugt den Niederschlag ab und engt das Filtrat ein. Der Rückstand wird wie in Beispiel 2a aufgearbeitet und anschließend zur weiteren Mnigung in Essigester über basisches Al2O, Woelm, Aktivst. I) Chromatograph!ert. Ausb..31.9 g (89.5 % d.Th) amorphe Substanz. Die gewonnenen 31.9 g Boc-Cys(MPCH)-AIa-ONB (51.8mMi) werden in 100 ml Eisessig gelöst. Dazu gibt man 100 ml 1n HCl/ Eisessig und läßt 1 Std. bei Raumtemperatur stehen. Anschließend wird im Hochvakuum eingeengt und mit Äther nachdestilliert. Der Rückstand wird öfters mi-tether veirLeben, wobei der Äther jeweils vom Rückstand abdekantiert wird. Zum Schluß wird der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Es bleiben 24.3 g eines amorphen Schaums zurück. Das entspricht einer Ausbeute von 85 % d.Th. bezogen auf BoC-CyS(MPCH)-AIa-ONB. Die oben gewonnenen 24.3 g H-Cys(MPCH)-AIa-ONB.HCl (44.1 mMol) werden, in wenig Tetrahydrofuran gelöst, zu
009887/219 2
einer Reaktionsmischung von 23.2 g Boc-Cys(Trt)-OH (50 mMol), 7.3 g HOOBT (45 mMol) und 9.3 g DCC (45 mMol) in 100 ml Tetrahydrofuran, die bereits 1 Std. "bei 0° und 1 Std. bei Raumtemperatur rührte, gegeben. Man läßt nun noch 5.8 ml N-Ä'thylmorpholin (45 mMol) zutropfen und rührt eine weitere Stunde bei Zimmertemperatur. Der Niederschlag wird abgesaugt, das Filtrat im Vakuum eingeengt und der Rückstand wie in Beispiel 2a aufgearbeitet. Zur Reinigung wird in Essigester über basisches Al2O, (Woelm, Aktivst. I) chromatographiert, Ausb. 40.9 g amorpher Schaum (96.4 % d.Th. bezogen auf H-Cys (MPCH)-Ala-ONB.HCl). DC: einheitlich.
C53H60N4°9S2 (961.2)
b) Boc-Cvs(Trt)-Cvs(MPCH)-Alä-OH
40.9 g Boc-Cys(Trt)-Cys(MPCH)-Ala*ONB (42.5 mMol) werden in 125 ml Dioxan gelöst. Unter Rühren setzt man 25 ml Wasser zu und titriert mit 43 ml 1n NaOH gegen Thymolphthalein. Nach beendigter Verseifung wird mit 2n Zitronensäure neutHJLisiert und die Reaktionsmischung i.Vak. eingeengt. Der Rückstand wird zwischen Essigester und 2n Zitronensäure bei 0° verteilt. Die EsslgesterJLösung wird mit 2n Zitronensäure und Wasser gewaschen, mit Natriumsulfat getrocknet und i.Vak. eingeengt. Um den p-Nitrobenzylalkohol abzutrennen wird in wenig Äther: gelöst und mit einer größeren Menge Petroläther schnell ein öl ausgefäll^. Vom ausgefallenen Öl wird rasch dekantiert. Diese Reinigungsprozedur wird noch zwei-mal wiederholt. Bei der letzten Umfällung fällt die Substanz als amorphes Pulver an. Ausb. 22.6 g (64.4 % d.Th.), DC: einheitlich C46H55N3°7S2 (826·1>
c) Boc-Cvs(Trt)-Cvs(MPCH)-Ala-Glv-Val-Cvs(Trt)-Ser-Leu-OH
Zu einer Lösung von 6.98 g Boc-Cys(Trt)-Cys(MPCH)-Ala-OH (8.45 mMol) und 1.15 g HOOBT (8.45 mMol) in 30 ml Dimethylformamid gibt man bei 0° eine ebenfalls auf 0° ab-
009887/2192
gekühlte Lösung von 1.75 g DCC (8.45 mMol) in wenig Dimethylformamid. Man läßt 1 Std. bei O0 und t Std. bei Raumtemperatur rühren und gibt dann 5.8 g GIy-VaI-Cys(Trt)-Ser-Leu, 2 Na-acetat, 0.5 H2O (&5 mMol) zu. Man läßt eine weitere Stunde bei Zimmertemperatur rühren, saugt den Niederschlag ab, engt im Hochvakuum ein und verreibt den Rückstand mit Äther. Das dabei entstehende amorphe Pulver wird abgesaugt und aus Eisessig/Wasser umgefällt. Ausbeute: 9.8 g (97.7 % d.Th.). Die Substanz hat keinen scharfen Schmelzpunkt. DC: einheitlich Ä-7D -14· 3° (c»2, in Dimethylformamid)
C84H1cA013S3·1 H2° (1^6) Ber. C 65.27 tt 6.78 N 7.24 S 6.23 ■·--■' . Gef. 65.1 6.9 7.1
Herstellung von Z-Val-Glu(OBut)-Gln(Mbh)-OMe a) Z-Glu(OBut)-Gln(Mbh)-OMe
5.2 g Z-GIu(OBu*)-OH.DCHA (10 mMol) und 4.25 g H-GlnjMbh)-OMe.HCl (1OmMoI) werden getrennt in je 20 ml Dimethylformamid gelöst und dann zusammengegeben. Man kühlt gut ab, saugt den ausgefallenen Niederschlag ab und versetzt das Filtrat mit 1.65 g HOOBT (10 mMol). Bei 0° versetzt man die Lösung mit einer Lösung von 2.2 g DCC in Dimethylformamid, rührt 1 Std. bei 0° und 1 Std. bei Raumtemperatur, saugt den Niederschlag ab und versetzt das Filtrat mit Wasser. Der nun ausfallende Niederschlag wird in Essigester gelöst und wie in Beispiel 2a ausgeschüttelt. Der Rückstand wird mit Petroläther verrieben. Ausbeute: 5.5 g (7ß% d.Th) Schmp. 171-173°. DQ rD -6-49° fc=2» *n Dimethylformamid) . ,
CH-7N,O.n (705.8) Ber. C 6466 H 6.71 N 5.96 47 3 10 Gef# 6Z}^ 6#9 6#1
b) Z-Val-Glu(OBut)-Gln(Mbh)-OMe · 4 g Z-Glu(OBu^)-Gln(Mbh)-OMe werden in einer Methanol/ Dirnethylformamid-Mischung mit Pd-Katalysator unter Zuhilfenahme eines Autotitrators bei pH 4.5 (Zugabe von 1n
009887/2192
methanolischer HCl) katalytisch hydriert. Nach beendigter . Hydrierung wird der Katalysator abfiltriert und das Filtrat i.Vak. eingeengt. Der Rückstand wird vi* mit Petroläther und Äther verrieben und am Hochvakuum
if ·. ik
i-> getrocknet. Der Rückstand wird zusammen mit 1.4 g Z-Valin und 0.92 g HOOBT. in 17 ml Dimethylformamid gelöst und bei 0° unter Rühren mit 0.73 ml N-Äthylmorpholin und einer kalten Lösung von 1.25 g DCC in Dimethylformamid versetzt. Man läßt eine Stunde bei 0° und eine Stunde bei Raumtemperatur rühren, saugt den Niederschlag ab und engt das Filtrat ein. Der Rückstand wird 2 mal mit Natriumbicarbonatlösung verrieben und mit Wasser gewaschen.
Ausb. 4.35 g (95.3 % d.Th), Schmp. 189-190° Zur Reinigung wurde mit Alkohol aufgekocht und gekühlt: Ausb. 3.85 g (84.4 % d.Th,), Schmp. 200-204° JjQ^0 -9*45° (c=2, in Dimethylformamid)
0/.,H^Ni1O4,- (804,95) Ber. C 64.16 H 7.01 N 6.96 ^ 5D ^ ΊΊ Gef. 64.0 7.0 6.9
7. Herstellung von Z-Pro-Lvs(Boc)-Glv-NH-Mbh
a) Z-Lvs(Boc)-Glv-NH-Mbh =
56.2 g Z-Lys(Boc)-OH.DCHA (0.1 Mol) und 34 g H-Gly-NH-Hbh.HCl (0.1 Mol) werden getrennt in je 200 ml Dimethylformamid gelöst und dann zusammengegeben. Man kühlt ab, saugt den ausgefallenen Niederschlag ab und versetzt das Filtrat mit ,16.3 g HOOBT (0.1 Mol). Bei 0° versetzt man die Lösung mit einer Lösung von 22 g DCC in Dimethylformamid, rührt eine Std. bei 0° und eine Std. bei Raumtemperatur, saugt den Niederschlag ab und engt das Filtrat i. Hochvakuum ein. Der Rückstand wird zwischen warmen Essigester und Natriumbicarbonatlösung verteilt. Die Essigesterphase wird mit 2n Zitronensäure, Natriumbicarbonatlösung und Wasser gewaschen, über "Natriumsulfat getrocknet und eingeengt. Der Rückstand wird aus Essig-
009887/2192
ester/Petroläther umkristallisiert. Ausbeute 54.2 g (82 % d.Th.)i Schmp. 125-127°, /ÄL7D + 5..40 (c=2, in Methanol)
.Oo (662.8) Ber. C 65.24 H 7.00 N 8.45
4b 6 6
b) H-Lys ( Boc) -Gly-NH-Mbh»-HCl
54.2' g Z-Lys(Boc)-Gly-NH-Mbh werden in Methanol suspendiert, mit Palladium-Katalysator versetzt und unter Zutropfen von 1n methanolischer Salzsäure (Autrotitrator, pH 5) katalytisch hydriert. Der Katalysator wird abgesaugt und die Lösung eingeengt. Der Rückstand wird mit Äther verrieben. Ausb. 45.1 g (97.5 % d.Th.), Schmp. 196°, ßUv + 16.75° (c=2, in Methanol) C28H41ClN4O6 (565.1)
c) Z-Pro-Lys(Boc)-Gly-NH-Mbh
Zu einer Lösung von 2.5 g Z-Prolin (10 mMol) und 1.63 g HOOBT (10 mMol) in 30 ml Dimethylformamid gibt man bei 0° eine ebenfalls auf 0° abgekühlte Lösung von 2.2 g DCC in wenig Dimethylformamid. Man läßt 1 Std. bei 0° und 1 Std. bei Raumtemperatur stehen und gibt dann 5.65 g fein zerriebenes H-Lys(Boc)-Gly-NH-Mbh.HCl (10 mMol) und 1,3 ml N-Äthylmorpholin (10 mMol) zu, läßt 1 Std. bei Zimmertemperatur rühren, saugt den gebildeten Niederschlag ab und engt das FiItrat ein. Nun wird wie bei 7a aufgearbeitet. Ausb. 7.2 g (98 % d.Th.), Schmp. 180-183° 1\7Ώ -25° (c=2, in Dimethylformamid)
d) H-Gly-NH-Mbh.HCl
44.7 g Z-Gly-NH-Mbh werden in einer Mischung aus 300 ml Methanol und 300 ml Eisessig suspendiert und mit Palladium-Katalysator katalytisch hydriert. Der Katalysator wird abgesaugt und das Filtrat eingeengt. Der Rückstand wird in Methanol gelöst und gegen Thymolblau mit metha-
009887/2192
■ - 17 -
nolischer Salzsäure titriert. Nun wird noch einmal eingeengt und der Rückstand mit Äther verrieben. Ausbeute 33.9 g ( 98 % d.Th.). Umkristallisiert aus Methanol/Äther:<31.7 g (91.6 % d.Th.) Schmp. 202-204°
. C17H^ClN0O, (336.8) Ber. C 60.61 H 6.28 N 8.32 lf ^ ά * ■ Gef. 60.3 6.5 8.4
8. Z-Gln-Ala-OBu*
a) nach der "Eintopf-Methode" (Verfahrensweise a)
Zu einer Lösung von 2.8 g Z-GIn-OH (10 mMol), 1.8 g H-AIa-OBu"1. HCl (10 mMol) und 1.63 g HOOBT (10 mMol) in Di-' methylformamid gibt man bei 0° 1.28 ml N-Äthylmorpholin (10 mMol) und zum Schluß eine kalte Lösung von 2.1 g DCC in wenig Dimethylformamid. Man lässt 1 Std. bei 0° und 1 Std. bei Zimmertemperatur rühren, saugt den Niederschlag ab und versetzt das Filtrat mit Wasser. Man läßt über Nacht im Eisschrank stehen und saugt anderntags den Niederschlag ab, der mit Natriumbicarbonatlösung verrieben und mit Wasser gewaschen wird. Über Phosphorpentoxid wird getrocknet. Ausb. 2.8 g (69 % d.Th.), Schmp. 158-160°
b) mit Voraktivierung
Zu einer Lösung von 2.8 g Z-GIn-OH (10 mMol) und 1.63 g HOOBT (10 mMol) in 20 ml Dimethylformaid gibt man bei 0° eine kalte Lösung von 2.1 g DCC in wenig Dimethylformamid. Man läßt 1 Std. bei 0° und 1 Std. bei Raumtemperatur rühren und gibt dann 1.8 g H-AIa-OBu*.HCl (10 mMol) und 1.28 ml N-Äthylmorpholin zu. Man läßt eine weitere Stunde bei Zimmertemperatur rühren und arbeitet wie bei 8a auf. Ausb. 2.6 g (63 %d.Th.), Schmp. 158-161°.
009867/2192
9. Z=TvT-TyT-OMe
Zu einer Suspension von 3.15 g Z-Tyr-0H(10 mMol), 2.30 g (10 mMol) H-Tyr-OMe.HCl und 1.63 "g HOOBT (10 mMol) in 30 ml Methylenchlorid gibt man bei O0 unter Rühren 1.3 ml N-Äthyl^jnorpholin und eine Lösung aus 2.2 g DCC in 5 ml Methylenchlorid. Man läßt 1 Std. bei 0° und 1 Std. bei Raumtemperatur rühren, saugt den Niederschlag ab, engt das Filtrat ein und arbeitet wie bei 2a weiter auf. Ausb. 4.55 g (92.4 % d.Th), Schmp. 174-175°
10. Z-Thr-Phe-OMe
Zu einer Lösung von 4 g Z-Thr-QOBT (10 mMol) in 30 ml Tetrahydrofuran gibt man bei Raumtemperatur 2.2 g H-Phe-OMe.HCl und unter Rühren 1.3 ml N-Äthylmorpholin. Bei Zimmertemperatur wird eine Stunde nachgerührt. Die Lösung wird dann i.Vak. eingeengt und der Rückstand zwischen Essigester und Wasser verteilt. Die Essigesterphase wird wie bei 2a ausgeschüttelt, mit Natriumsulfat getrocknet, eingeengt und der Rückstand mit Petroläther verrieben.
Ausb. 3.75 g (90.5 % d.Th.), Schmp. 103-105°
11. Herstellung von Z-Val-Val-OMe
a) Mit nicht isoliertem Z-VaI-OOBT
2.5 g Z-VaI-OH (10 mMol) und 1.63 g HOOBT (10 mMol) werden in 20 ml absolutem Tetrahydrofuran gelöst und bei 0° mit · einer kalten Lösung von 2.2g DCC in absolutem Tetrahydrofuran versetzt. Man läßt Ί Stunde bei 0° und eine Stunde bei Raumtemperatur stehen, fügt 1.7 g H-VaI-OHe.HCl; (10 mMol) und 1.28 ml N-Äthylmorpholin (10 mMol) zu und I läßt 1 Stunde bei Zimmertemperatur rühren. Aufarbeitung wie bei 2a*
Ausb. 2.9 g (80 % d.Th.), Schmp. 107-109°
009887/2192
b) Mit nicht isoliertem Z-Val-OSu
Ansatz wie bei Beispiel·11a. Statt HOOBT setzt man 1.25 g N-Hydroxysuccinimid (11 mMol) zu.
Ausb. 81.96, Schmp. 82-86°
12. Synthese von Boc-Leu-Phe-VaI-OBu (gaschromatographischer Racemisierungstest nach F. Weygand et al.)
(F. Weygand, A. Prox u. W. König. Chem. Ber. 22 (1966), Seite 1451-1460)
Der Test wurde dahingehend abgeändert, daß statt Z-Leu-Phe-OH Boc-Leu-Phe-OH eingesetzt wurde, was den Vorteil hat, daß das entstehende völlig geschützte Peptid Boc-Leu-L.D-Phe-VaI-OBu ohne vorherige Schutzgruppenabspaltung hydrolysiert werden kann.
a) Prüfung auf Racemisierung bei der Eintopf-Methode
378.5 mg Boc-Leu-Phe-OH (1 mMol) und 209.7 mg H-VaI-OBu^HCl (1 mMol) werden in 2 ml absolutem Dimethylformamid oder einem anderen Lösungsmittel gelöst oder suspendiert. Dazu gibt man 0.12 ml N-Äthylmorpholin (1 mMol) und kühlt im Eisbad ab. Danach gibt man die Zusätze (N-Hydroxysuccinimid oder 3-Hydroxy-4-oxo-3.4-dihydro-1.2.3-benzotriazin) und zum Schluß eine auf 0° abgekühlte Lösung von 207 mg DCC (1 mMol) in 1 ml absolutem Lösungsmittel zu. Man läßt die Ansätze 1 Std. bei 0° und 1 Std. bei Raumtemperatur stehen, verdünnt mit etwa 30 ml Essigester, filtriert den ausgefallenen Niederschlag ab, schüttelt das Filtrat mit gesättigter Natriumbicarbonatlösung, 2h Zitronensäure, gesättigter Natriumbicarbonatlösung und Wasser aus, trocknet mit Natriumsulfat, engt ein und chromatographiert den Rückstand in Essigester über 3 g basisches Aluminiumoxid (Voelm, Aktivstufe I). Das Eluat (etwa 40 ml) wird eingeengt und der Rückstand in etwa 5 ml 8-9 η methanolischer Salzsäure gelöst und im Bombenrohr 24 Std. auf 70° erhitzt. Die methanolische Salzsäure'
009887/2192
wird eingeengt und der Rückstand wie bei F. Weygand et al. weiter verarbeitet. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 1 zusammengefaßt:
Tabelle 1
Racemisierungsuntersuchungen bei der Dicyclohexylcarbodiimid-Methode mit Zusätzen von 3-Hydroxy~4-oxo-3. 4r-dihydro-1.2. 3^benzotriazin bzw. N-HydroxysuocLnimid (Eintopf-Methode)
Äquiv. Zusatz Lösungsmittel % D-Phe-L-VaI 1.15
O kein DMF 14.3 14.9
O kein THF 8.1 1.5
1 N-Hydroxysuec inimid DMF 1.0 19.2
2 N-Hydroxysuccinimid DMF < 1.0
1 HOOBT DMF < 1.0
2 HOOBT DMF 1.3
1 HOOBT THF < 1.0
1 HOOBT Dimethylacetamid£1.0
1 HOOBT Methylenchlorid <1.0
1 HOOBT DMSO
O kein DMSO
1 HOOBT Pyridin
O kein Pyridin
b) Prüfung auf Racemisierung bei der Voraktivierung von Peptiden mit Dicyclohexylcarbodiimid und 3-Hydroxy-4-oxo-3.4-dihydro-1.2.3-benzotriazin bzw. N-Hydroxysuccininid
378.5 mg Boc-Leu-Phe-OH (ImI4IoI) und Zusatz (3-Hydroxy-4-oxo-3.4-dihydro-1.2.3-benzotriazin bzw. N-Hydroxysuccinimid) werden in 2 ml Lösungsmittel gelöst bzw. suspendiert. Man kühlt auf 0° ab, gibt unter Rühren eine auf 0° abgekühlte Lösung von 207 mg DCC (1 mMol) in 1 ml abs. Lösungsmittel dazu und läßt 1 Std. bei 0° und 1 Std. bei Raumtemperatur
009887/2192
rühren. Dann gibt man 209,7 mg H-VaI-OBu*.HCl ( 1 mi-Ιοί) und 0.12 ml N-Äthylmorpholin (1 mMol) zu, läßt nochmals 1 Stunde bei Raumtemperatur stehen oder rühren und arbeitet wie bei 12 a auf.
Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 2 .zusammengefaßt:
Tabelle 2
Racemisierungsuntersuchungen bei der Voraktivierung von Peptiden mit Dicyclohexylcarbodiimid und 3-Hydroxy-4-oxo-3..4-dihydro-1.2.3-benzotriazin bzw. N-Hydroxysuccinimid
Äquiv. Zusatz . ., ' Lösungsmittel % D-Phe-L-Val
1 N-Hydroxysuccinimid DMF 2.3
2 N-Hydroxysuccinimid DMF 1.65
1 N-Hydroxysuccinimid Pyridin 6.1
2 N-Hydroxysuccinimid Pyridin 8.1 1 HOOBT . EMF <1.0 1 HOOBT Dirnethylacetamid <1.0 1 HOOBT THF <1.0 1 HOOBT ■ Methylenchlorid O.O 1 HOOBT Pyridin 1.65
13. Synthese von TFA-Pro-Val-Pro-OBu (gaschromatographischer Racemisierungstest nach F. Weygand et al.)
(F.Weygand, D. Hoffmann u. A. Prox, Z. Naturforsch. 23 b (1968), Seiten 279-281)
Der Test wurde dahingehend abgeändert, daß statt H-Pro-OMe der stabilere und leichter zu handhabende H-Pro-OBu eingesetzt wurde. Ein weiterer Vorteil dieser Anordnung ist die größere Empfindlichkeit des Racemisierungstestes.
009887/2192
Für die gaschromatographische Trennung wird das entstehende TFA-PrO-VaI-PrO-OBu* in das TFA-Pro-Val-Pro-OMe umgewandelt.
a) Prüfung auf Racemisierung bei der Eintopf-Methode
Zu einer Lösung von 309.3 mg TFA-Pro-Val-OH (1 mMol) und 171 mg H-Pro-OBu (1 mMol) in 3 ml Dimethylformamid gibt man den Zusatz (3-Hydroxy-4-oxo-3.4-dihydro-1.2.3-benzotriazin bzw. N-Hydroxysuccinimid) und bei 0° eine ebenfalls auf 0° abgekühlte Lösung von 207 mg DCC (1 mMol) in Dimethylformamid. Man läßt 1 Std. bei 0° und 1 Std. bei Raumtemperatur stehen, verdünnt die Ansätze mit etwa 30 ml Essigester,, filtriert den ausgefallenen Niederschlag ab, schüttelt das Filtrat mit gesättigter Natrium-" bicarbonatlösung, 2 η Zitronensäure, gesättigter Natriumbicarbonatlösung und Wasser aus, trocknet mit Natriumsulfat, engt ein und chromatographiert den Rückstand in Essigester über 3 g basisches Aluminiumoxid (Woelm, Aktivstufe I). Das Eluat (etwa 40 ml) wird eingeengt und der Rückstand in etwa 2 ml Trifluoressigsäure (90-proz.) gelöst. Man läßt 1 Std. bei Raumtemperatur stehen, engt ein, löst den Rückstand in Essigester und versetzt bis zur bleibenden Gelbfärbung mit einer ätherischen Lösung von Diazomethan. Die Lösung wird konzentriert und wie bei F. Weygand et al. gaschromatographiert.
Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 3 zusammengefaßt: ·
009897/2192
-- 23 -
Tabelle 3
Racemisierungsuntersuchungen bei der Dicyclohexylcarbodiimid-Methode mit Zusätzen von 3-Hydroxy-4-oxo-3.4-dihydro~1.2.3-benzotriazin bzw. N-Hydroxysuccinimid (Eintopfmethode)
Äquiv. Zusatz Lösungsmittel % D-VaI im
Tripeptid
O kein DMF 67.0
1 N-Hydroxysue c in-
imid		 DMF 28.0
2 N-Hydroxysuccin
imid		 DMF 15.0
1 HOOBT DMF <1.0
2 HOOBT DMF /1.0
b) Prüfung auf Racemisierung bei der Voraktivierung von Peptiden mit Dicyclohexylcarbodiimid und 3-Hydroxy-4-oxo-3.4-dihydro-1.2.3-benzotriazin bzw. N-Hydroxysuccinimid
309.3 mg TFA-Pro-Val-OH (1 mMol) und Zusatz (3-Hydroxy-4-oxo-3.4-dihydro-1.2.3-benzotriazin bzw. N-Hydroxysuccinimid) werden in 2 ml Dimethylformamid gelöst. Man kühlt auf 0° ab, gibt eine auf 0° abgekühlte Lösung von 207 mg DCC ( 1· mMol) in 1 ml Dimethylformamid dazu und laßt 1 Std. bei 0° und 1 Std. bei Raumtemperatur stehen. Dann gibt man eine Lösung von 171 mg H-Pro-OBu (1 mMol) in 1 ml DimethylformsnLÖ. zu, läßt nochmals eine Stunde bei Zimmertemperatur stehen und arbeitet wie bei 13 a auf.
Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 4 zusammengefaßt:
009887/2192
1933187
Tabelle 4
Racemisierungsuntersuchungen bei der Voraktivierung von TFA-Pro-Val-OH mit Dicyclohexylcarbodiimid und 3-Hydroxy-4-oxo-3.4-dihydro-1.2.3-benzotriazin bzw, N-Hydroxysuccinimid ^ .
Äquiv. Zusatz Lösungsmittel % D-VaI im
Tripeptid
1.2 N-Hydroxysucciniraid DMF 18.0 2 N-Hydroxysuccinimid DMF 17.0 . 1 HOOBT DMF 1.0
14. Corticotropin- (1-23)-trikosipe-ptid-am,d
7.5 g Boc-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu(OBut)-His-Phe-Arg-Trp-GIy-OH (5 mMol), hergestellt nach Chem.Ber. £6, (1963), Seite 1080, werden in 100 ecm Dimethylformamid mit 815mg (5 mMol) 3-Hydrcxy-4-oxo-3.4-dihydro-1.2.3-benzotriazin und 1.03 (5 mMol) 3-Dicyclohexyl-carbodiimid 1 Std. bei -5° und 1 Std. bei Raumtemperatur gerührt. Dann gibt man 1.1 g H-Lys(Boc)-Pro-Val-Gly-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg-Arg-Pro-Val-Lys(Boc)-Val-Tyr-liH2"'triace'fca't""ne:x:aiiy^ra'fc (5 mMol), hergestellt nach Chem.Ber. £7 (1964), Seite 1197, das vorher i. Hochvakuum bei 60° 1 Std. über PpOc getrocknet v/orden war, zu und läßt bei Raumtemperatur, stehen. Nach 4 Std. fällt man das rohe Reaktionsprodukt mit Äther aus. Ausb. 19.7 g. Man reinigt das Peptid durch Auskochen mit peroxydfreiem Tetrahydrofuran. Ausb. 17.2 g. Die Schutzgruppen werden in bekannter Weise durch einstündiges Behandeln mit 90-proz. Trifluoressigsäure abgespalten, das rohe Trikosipeptid wird mit Äther ausgefällt und mit Äther gewaschen. Ausb, 17.0 g Trifluoracetat. Zur weiteren Reinigung wird in ebenfalls bekannter Weise an Carboxymethylcellulose chroma tographiert. 00988 7/2192

Claims (1)

  1. Patentanspruch
    Verfahren zur Herstellung von Peptiden, dadurch gekennzeichnet, daß man entweder
    a) eine geschützte Aminosäure oder ein geschütztes Peptid, bei denen diejenige Carboxylgruppe, die in Reaktion treten soll, frei ist, mit einer in·
    • an sich bekannter Weise geschützten Aminosäure- bzw. Peptidester oder deren-amiden, bei denen diejenige Aminogruppe, die in Reaktion treten soll, frei ist, in einem in der Peptidcheiaie gebräuchlichen Lösungsmittel unter Zusatz von 1-2 Äquivalenten, vorzugsweise einem Äquivalent 3-Hydroxy-4-oxo-3.4-dihydro-1.2.3-benzotriazin und einem Carbodiimid umsetzt, oder
    b) eine geschützte Aminosäure oder ein geschütztes Peptid bei denen diejenige Carboxylgruppe, die in Reaktion treten soll, frei ist mit 1-2 Äquivalten, vorzugsweise mit einem Äquival^en:b 3-Hydroxy-4-oxo-3.4-dihydro-1.2.3-benzotriazin und einem Carbodiimid zu einem aktivierten Derivat umsetzt und anschließend
    . mit einem gegebenenfalls geschützten Peptid oder einer Aminosäure bzw. deren Amiden, bei denen diejenige Aminogruppe, die in Reaktion treten soll, frei ist, in einem in der Peptidchemie gebräuchlichen Lösungsmittel reagieren läßt und nach beendeter Reaktion und üblicher Reinigung gegebenenfalls die Schutzgruppen ganz oder teilweise in an sich bekannter Weise abspaltet.
    Q09887/2192
DE1939187A 1969-08-01 1969-08-01 Verfahren zur Herstellung von Peptiden Expired DE1939187C3 (de)

Priority Applications (15)

Application Number Priority Date Filing Date Title
BE754343D BE754343A (fr) 1969-08-01 Procede de preparation de peptides
DE1939187A DE1939187C3 (de) 1969-08-01 1969-08-01 Verfahren zur Herstellung von Peptiden
NO702770A NO129568B (de) 1969-08-01 1970-07-15
FI2067/70A FI53124C (de) 1969-08-01 1970-07-24
NL7011083.A NL166925C (nl) 1969-08-01 1970-07-27 Werkwijze voor het bereiden van peptiden.
IL35005A IL35005A (en) 1969-08-01 1970-07-27 Process for the manufacture of peptides
US00059005A US3795666A (en) 1969-08-01 1970-07-28 Method of synthesizing peptides in the presence of a carbodiimide and of 3-hydroxy-4-oxo-3,4-dihydro-1,2,3-benzotriazine
CH1153970A CH550143A (de) 1969-08-01 1970-07-30 Verfahren zur herstellung von peptiden.
HUHO1314A HU163708B (de) 1969-08-01 1970-07-31
DK397670AA DK140010B (da) 1969-08-01 1970-07-31 Fremgangsmåde til fremstilling af peptider.
AT700170A AT297745B (de) 1969-08-01 1970-07-31 Verfahren zur Herstellung von Peptiden
CS5388A CS168535B2 (de) 1969-08-01 1970-07-31
SE15527/70*A SE352343B (de) 1969-08-01 1970-07-31
FR7028573A FR2056506A5 (de) 1969-08-01 1970-08-03
GB3732070A GB1318963A (en) 1969-08-01 1970-08-03 Process for the manufacture of peptides

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE1939187A DE1939187C3 (de) 1969-08-01 1969-08-01 Verfahren zur Herstellung von Peptiden

Publications (3)

Publication Number Publication Date
DE1939187A1 true DE1939187A1 (de) 1971-02-11
DE1939187B2 DE1939187B2 (de) 1973-07-12
DE1939187C3 DE1939187C3 (de) 1974-02-21

Family

ID=5741632

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE1939187A Expired DE1939187C3 (de) 1969-08-01 1969-08-01 Verfahren zur Herstellung von Peptiden

Country Status (15)

Country Link
US (1) US3795666A (de)
AT (1) AT297745B (de)
BE (1) BE754343A (de)
CH (1) CH550143A (de)
CS (1) CS168535B2 (de)
DE (1) DE1939187C3 (de)
DK (1) DK140010B (de)
FI (1) FI53124C (de)
FR (1) FR2056506A5 (de)
GB (1) GB1318963A (de)
HU (1) HU163708B (de)
IL (1) IL35005A (de)
NL (1) NL166925C (de)
NO (1) NO129568B (de)
SE (1) SE352343B (de)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0064714A1 (de) * 1981-05-07 1982-11-17 Hoechst Aktiengesellschaft Verfahren zur Phlegmatisierung von Hydroxy-benzotriazolen und Hydroxy-oxo-dihydro-benzotriazinen
EP0247573A2 (de) * 1986-05-30 1987-12-02 Hoechst Aktiengesellschaft Aminosäure-Benzotriazinylester, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3984417A (en) * 1971-12-27 1976-10-05 Ajinomoto Co., Inc. Method of producing active amino acid esters
DE2343035C2 (de) * 1973-08-25 1982-04-01 Hoechst Ag, 6000 Frankfurt Pyroglutamyl-histidyl-prolinamide, Verfahren zu deren Herstellung und diese Verbindungen enthaltende Arzneimittel
US4087283A (en) * 1976-03-01 1978-05-02 Gaf Corporation Composition for hardening photographic hydrophilic binder and photographic element containing the same
US4487715A (en) * 1982-07-09 1984-12-11 The Regents Of The University Of California Method of conjugating oligopeptides
GB2187461A (en) * 1986-02-03 1987-09-09 Medical Res Council Monitoring method for the synthesis of a linear of amino acid residues

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0064714A1 (de) * 1981-05-07 1982-11-17 Hoechst Aktiengesellschaft Verfahren zur Phlegmatisierung von Hydroxy-benzotriazolen und Hydroxy-oxo-dihydro-benzotriazinen
EP0247573A2 (de) * 1986-05-30 1987-12-02 Hoechst Aktiengesellschaft Aminosäure-Benzotriazinylester, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung
EP0247573A3 (de) * 1986-05-30 1988-09-21 Hoechst Aktiengesellschaft Aminosäure-Benzotriazinylester, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung

Also Published As

Publication number Publication date
GB1318963A (en) 1973-05-31
DK140010C (de) 1979-11-05
FI53124C (de) 1978-02-10
NL166925C (nl) 1981-10-15
NL7011083A (de) 1971-02-03
CS168535B2 (de) 1976-06-29
FR2056506A5 (de) 1971-05-14
IL35005A0 (en) 1970-09-17
DK140010B (da) 1979-06-05
DE1939187C3 (de) 1974-02-21
HU163708B (de) 1973-10-27
BE754343A (fr) 1971-02-03
DE1939187B2 (de) 1973-07-12
IL35005A (en) 1973-06-29
AT297745B (de) 1972-04-10
FI53124B (de) 1977-10-31
NL166925B (nl) 1981-05-15
CH550143A (de) 1974-06-14
NO129568B (de) 1974-04-29
SE352343B (de) 1972-12-27
US3795666A (en) 1974-03-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP0019115B1 (de) Pankreozymin-Cholezystokinin aktive Peptide, Verfahren zu ihrer Herstellung und sie enthaltende Arzneimittel
DE2720245A1 (de) Polypeptide
DE4009506A1 (de) Hydantoinderivate
DE2544348C3 (de) L-Leucin-13-Motilin, Verfahren zu dessen Herstellung und dasselbe enthaltendes Mittel
DE69615155T2 (de) Basische oxazolinamid-derivate von ge2270 und ge2270-änlichen antibiotika
DE1939187A1 (de) Verfahren zur Herstellung von Peptiden
DE69600244T2 (de) Basische prolinamid derivate von ge2270 und ge2270-ahnlichten antibiotika
DE2945239A1 (de) Oligopeptide, verfahren zu ihrer herstellung sowie ihre verwendung in arzneimitteln
DE1931081A1 (de) Verfahren zur Herstellung neuer heterocyclischer Verbindungen
DE2718718A1 (de) Somatostatinanaloge und zwischenprodukte hierzu
DE2226782A1 (de) Nonapeptide und Verfahren zu deren Herstellung
CH639941A5 (en) Polypeptides, process for their preparation and their use
DE2917603C2 (de)
DE2347151A1 (de) Neue zwischenprodukte fuer die synthese von lrf und verfahren zur herstellung von lrf
AT313488B (de) Verfahren zur herstellung von gegebenenfalls geschuetzten peptiden
EP0424670B1 (de) Neue ZNS-aktive Hexapeptide mit antiamnestischer Wirkung
DE2307010C2 (de) Verfahren zur Herstellung von LH- und FSH-Releasing Hormon, hierbei eingesetzte Zwischenprodukte und Verfahren zu deren Herstellung
DE2727048C2 (de) 8-Norleucyl-ceruletide
DE1295565B (de) Verfahren zur Herstellung von einen Histidinrest enthaltenden Peptiden
DE2016703C3 (de) Verfahren zur Herstellung von Peptiden
DE1917690C3 (de) Verfahren zur Herstellung von Peptiden
DE1246747B (de) Verfahren zur Herstellung neuer adrenocorticotrop wirksamer Peptide
DE1965101A1 (de) Pentadekapeptide mit adrenocorticotroper Wirkung und Verfahren zu ihrer Herstellung
AT360186B (de) Verfahren zur herstellung von neuen dipeptid- -derivaten
DE602004001590T2 (de) Verbessertes Verfahren zur Synthese von Diamidderivaten des Tripeptids KPV

Legal Events

Date Code Title Description
C3 Grant after two publication steps (3rd publication)
E77 Valid patent as to the heymanns-index 1977