DE1939187A1 - Verfahren zur Herstellung von Peptiden - Google Patents
Verfahren zur Herstellung von PeptidenInfo
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Description
FARBWERKE HOECHST AG., vormals Meister Lucius & Brüning
Aktenzeichen: P - Fw 6171
Datum: 30, Juli 1969
Dr.Hg/rei <
Dr.Hg/rei <
Verfahren zur Herstellung von Peptiden
Eines der bequemsten Verfahren zur Herstellung von Peptiden
besteht in der Verknüpfung einer N-Acylaminosäure oder
eines N-Acyl-peptids mit einem Aminosäure- oder Peptidester mittels Dic.yclohexylcarbodiimid (J.C. Sheehan und G.P. Hess,
J. Am.Chem.Soc. Jl (1955), Seite 1067). Der Nachteil dieser
Methode ist die nicht unerhebliche Racemisierung bei der Verknüpfung von Peptiden (F. Weygand, A.Prox u. ¥. König,
Chem. Ber. ,99 (1966), Seite' 1451-1460) und die Bildung
von N-Acyl-harnstoffen, die das Syntheseprodukt verunreinigen
und die Ausbeute reduzieren. (Siehe E. Schröder u.K. Lübke, The Petides, Vol. I, Seite 108-111, New York u. London 1965).
Zusätze von 1.1 bis 2 Äquivalenten N-Hydroxysuccinimid reduzieren in dem Racemisierungstest von F. Weygand et al.
(F. Weygand, D. Hoffmann, E. Wünsch, Z. Naturf.21 b (1966),
Seite 426-428) die Racemisierung bis unter 1 % D-Verbindung
und verhindern die N-Acylharnstoffbildung. In einem modifizierten
Racemisierungstest nach F. Weygand et al. (F. Weygand, D. Hoffmann, A. Prox, Z. Naturf. 25 b (1968),
Seite 279-281), der die oft erhebliche*mnderung bei der
Herstellung von Petiden berücksichtigt, konnte jedoch fest-*
gestellt werden, daß auch N-Hydroxysuccinimidzusätze starke Racemisierung nicht immer verhindern können (siehe Tabelle 3
und 4), Darüber hinaus geben die N-Hydroxysuccinimidzusätze
zur Bildung von Nebenprodukten Anlaß. So berichteten M. Low
und L. Kisfaludy (Acta Chim. Hung. 44 (1965), Seite 63-65),
daß N-Hydroxysuccinimid selbst mit Dicyclocarbodiimid reagiert und daß sterisch gehinderte N-Acylpeptid-N-hydroxy-'♦)
steri sehe
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succinimid-ester nicht herstellbar waren. Eine Verbindung
aus einem Mol Dicyclohexylcarbodiimid und drei Mol N-Hydroxy-' succinimid wurde später als Succinimidooxycarbonyl-ß-alanin-N-hydroxysuccinimidester
erkannt (H. Gross u. L. BiIk in E. Bricas: Peptides, North-Holland Publishing Comp. (1968),
Seite 156-157). Diese Verbindung reagiert mit Aminen glatt zu Harnstoffderivaten der ß-Alaninamide. Bestätigt wurde
dieser Befund von F. Weygand, W. Steglich und N. Chytil
(Z. Naturforsch. 23 b (1968), Seite 1391).
Es wurde nun überraschenderweise gefunden, daß bei der Di-"
cyclohexylcarbodiimid-Methode eine Zugabe von 3-Hydroxy-4-oxo-3.4-dihydro-1.2.3-benzotriazin
(HOOBT) ebenfalls die Racemisierung in dem Racemisierungstest von F. Weygand et al.
(Chem. Ber. %9 (1966), Seite 1451-1460 und Z. Naturf. 21 b
(1966), Seite 426-428) bis auf 1 % oder unter 1 % D-Verbindung senkt, (siehe Tabelle 1) und die N-Acylharnstoffbildung
verhindert. Darüber hinaus konnte auch in dem empfindlichen modifizierten Racemisierungstest nach F. Weygand et al.
(Z. Naturforsch. 23 b (1968), Seite 279-281) bei Zusatz von 3-Hydroxy-4-oxo-3.4-dihydro-1.2.3-benzotriazin keine Racemisierung
beobachtet werden, während mit N-Hydroxysuccinimid hier die Racemisierung nicht ganz verhindert werden kann.
Einen weiteren Vorteil zeigt 3-Hydroxy-4-oxo-3.4-dihydro-1.2.3-benzotriazin
gegenüber N-iydroxysuecinimid bei der
Aktivierung von N-geschützten Peptiden. Während man die N-Hydroxysuccinimidester nur unter teilweiser Racemisierung
derselben herstellen kann, gelingt die Herstellung von N-Acyl-peptid-3-hydroxy-4-oxo-3.4-dihydro-1.2.3-benzotriazinestern
ohne Racemisierung.(siehe Tabelle 2 und 4). Diese aktivierten Ester sind zur Peptidsynthese vorzüglich geeignet.
In der Regel ist ihre Isolierung bei der Peptidsynthese nicht notwendig. . · . ]■
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R -COOH + HO -
R-C-O-
(IR; 1810-1815 cm"1)
(RCOOH ■= N-geschützte Aminosäure bzw. Peptid)
Diese neuen aktivierten Ester reagieren mit den primären bzw. sekundären Aminogruppen der gegebenenfalls geschützten
Aminosäuren bzw. Peptide auch bei starker sterischer Hin_derung äußerst schnell.
Nebenprodukte entstehen nicht in dem Maß, wie es bei der Verwendung von N-Hydroxysuccinimid der Fall ist. Die Ausbeuten
sind daher mit,3-Hydroxy-4-oxo-3.4-dihydro-1.2.3-benzotriazin in der Regel höher und die isolierten Verbindungen fallen
in reinerer Form an.
Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Herstellung
von Peptiden, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man entweder
a) eine geschützte Aminosäure oder ein geschütztes Peptid, bei denen diejenige Carboxylgruppe, die in Reaktion
treten soll, frei ist, mit einem geschützten Aminosäurebzw. Peptidester oder deren Amiden, bei denen diejenige
Aminogruppe, die in Reaktion treten soll, frei ist, in einem in der Peptidchönie gebräuchlichen Lösungsmittel unter
Zusatz von 1-2, vorzugsweise einem Äquivalent 3-Hydroxy-4-oxo-3.4-dihydro-1.2.3-benzotriazin
und einem Carbodiimid umsetzt, oder
b) daß man eine geschützte Aminosäure oder ein geschütztes Peptid, bei denen diejenige Carboxylgruppe, die in
Reaktion treten soll, frei ist, mit 1-2 Äquivalenten, vorzugsweise einem Äquivalent 3-Hydroxy-4-oxo-3.4-dih.ydro-'
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■ - 4 -'
1.2.3-benzotriazin und einem Carbodiimid zu einem
aktivierten Derivat umsetzt und anschließend mit einer gegebenenfalls geschützten Aminosäure oder einem gegebenenfalls
geschützten Peptid bzw. deren Amiden, bei denen diejenige Aminogruppe, die in Reaktion treten
soll, frei ist, in einem in der Peptidchemie gebräuchlichen Lösungsmittel reagieren läßt und nach beendeter'
Reaktion und üblicher Reinigung gegebenenfalls die Schutzgruppen ganz oder teilweise abspaltet.
Als Carbodiimide können die in der Peptidchemie üblichen
Verbindungen, wie Di.cyclohexylcarbodiimid, Diisopropylcarbodiimid und wasserlösliche Carbodiimide wie z.B. N-Cyclohexyl-N'
p-(diäthylaminacyclohexyl) -Carbodiimide oder N-Cyclohexyl-N'/δ-(N-methyl-morphol'inium)
-äthyl^Z-carbodiimid-p-toluolsulfonat
herangezogen werden. Als Schutzgruppen für diejenigen funktioneilen Gruppen der Aminosäuren und Peptide, die geschützt
werden sollen, eignen sich alle in der Peptidchemie üblichen Schutzgruppen. Auch polymere Harze, wie z.B. Hydroxymethylpolystyrol
können als Schutzgruppen herangezogen werden (E. Schröder, K. Lübke, The Peptides, Vol.I. Academic Press
New York u. London, 1965, Seite 108-111).
Geeignete in der Peptidchemie ,gebräuchliche Lösungsmittel
sind polare Lösungsmittel, beispielsweise Dimethylformamid,
Dimethylacetamid, Tetrahydrofuran, Dioxan, Pyridin, Dimethyls'ulfoxid,
Phösphorsäuretrisdiäthylamid oder Methylenchlorid und gegebenenfalls Mischungen dieser Lösungsmittel. Die
Reaktionstemperatur liegt vorteilhaft zwischen -20 und +400C,
bevorzugt bei etwa O0C.
Bei carboxylgeschützten, schwer in V/asser löslichen Peptiden
läßt sich das zugesetzte 3-Hydroxy-4-oxo-3.4-dihydro-1.2.3-benzotriazin
mit Natrium- oder Kaliumbicarbonatlösung oder mit Soda-Lösung vollständig ausschütteln. Ein besonderer
Vorteil dieser Methode ist, daß man durch Ansäurn dieser Natriumbicarbonat-Waschlösungen das eingesetzte 3-Hydroxy-4-oxo-3.4-dihydro-1.2.3-benzotriazin
wieder ausfällen kann.
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Dies ist z.B. bei einem Zusatz von N-Hydroxysuccinimid nicht möglich, da sich N-Hydroxysuccinimid auch in Säuren löst.
Aus schwerlöslichen Peptiden kann man mit Isopropanol, Äthanol,
Methanol, Tetrahydrofuran oder heißem Wasser das 3-Hydroxy-4-oxo-3.4-dihydro-1.2.3-benzotriazin
extrahieren.
In einzelnen Fällen wurden die neuen aktivierten Ester isoliert.
Hierbei ist von besonderem Vorteil, daß gerade die Ester von Z-Threonin und Z-Serin, von denen bisher nur wenige
kristallisierte aktivierte Ester bekannt sind, sich in guten Ausbeuten kristallin isolieren lassen; wobei darauf hinzuweisen
ist, daß Serin- und Threoninpeptide bisher meist über die Azidmethode hergestellt worden sind, die Azidmethode aber meist ■
nur mäßige Ausbeuten liefert. Auch entsteht z.B. aus Z-Serinazid über das Isoc.yanat das 4-Z-Amino-oxazolidinon~2 als Nebenprodukt.
Bei der alleinigen Verwendung von Dicyclohexylcarbodiimid entstehen als Nebenprodukte die entsprechenden N-Acylharnstoffe
(E., Schröder und K. Lübke, The Peptides, Vol. I, Academic Press, New York u. London, Seite 208 (1965)). Die
Möglichkeit, Z-Serin-3-hydroxy-4-oxo-3.4-dihydro-1.2.3-benzo-
-ester ~ J
triazin/herzustellen, beweist die hohe Stabilität der Ester gegen Alkoholyse.
Auch Tyrosinpeptide mit ungeschützter phenolischer Hydroxygruppe lassen sich nach der Diayclohexylcarbodiimidmethode
mit -Zusatz von 3-Hydroxy-4-oxo-3.4-dihydro-1.2.3-benzotriazin
gut herstellen.
Stellt man Glutaminyl- oder Asparaginylpeptide mittels Dicyclohexylcarbodiimid
her,so entstehen durch Dehydratisierung der Säureamidgruppe in beträchtlicher Menge die entsprechenden
Nitrile. Bei N-Acyl-asparagin ist auch eine Imidbildung möglich.
So können Asparaginylpeptide nur in Ausbeuten von 39-45 % hergestellt
werden (E. Schröder u. K. Lübke, The Peptides, VoI I, Academic Press, New York u. London, 1965, Seite 191 und 202-204).
Bei Zusatz von 3-Hydroxy-4-oxo-3.4-dihydro-1.2.3-benzo-
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triazin lassen sich dagegen Glutaminyl- und Asparaginylpeptide in guten Ausbeuten schnell und sauber darstellen.
Als Bausteine der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten
Peptide kommen alle in natürlich vorkommenden Peptiden anzutreffenden Aminosäuren in ihrer L- oder D-Form
infrage. Auch der Einsatz von ß-Aminosäuren, wie z.B. ß-Alanin
oder andere nur synthetisch oder halbsynthetisch zugänglicher Aminosäure^ ζ.B. rf -Methylalanin, oi -Methyl-3.4-dihydroxy-L-phenylalain
oder ß-Chloralanin ist möglich.
* Die Verfahrensprodukte können nach Abspaltung.der Schutzgruppen
als Therapeutica Vervrendung finden oder als Zwischenprodukte zur Herstellung anderer therapeutisch wertvoller Peptide, wie
z.B. Oxytocin, Vasopressin, Glucagon, ACTH, Secretin, Thyreo-, calcitonin oder Insulin eingesetzt werden.
In der Beschreibung und in den Beispielen werden die Aminosäuren nach den international gültigen Regeln abgekürzt.
Außerdem werden folgende Abkürzungen verwendet:
Z Carbobenzoxy-
Boc tert.-Butyloxycarbonyl-
TFA Trifluoracetyl-
OMe Methylester . ·
ONB p-Nitrobenzylester
OBu tert.-Butylester
OOBT 3~Hydroxy-4-oxo-3.4-dihyaro-1.2.3-benzotriazin-ester
HOOBT 3-Hydroxy-4-oxo-3.4-dihydro-1,2.3-benzotriazin
Mbh 4.4l-Dimethoxy-benzhydryl-
Trt Trityl- '·:'
MPCH 1-(p-Methoxy-phenyl)-cyclohexyl- :
DMF Dimethylformamid
THF Tetrahydrofuran ·
DCHA Dlcyclohexylamin ·
DCC Dicyclohexylcarbodiimid
DC Dünnschichtchromatographie
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Beschreibung der Versuche;
1. Herstellung von isolierten N-Acyl-aminosäure-3-hydroxy-4-oxo-^.4-dihydro-1.2.3-benzotriazin-estern
a) Z-Thr-OOBT ·
Zu einer Lösung von 12.75 g Z-Threonin (50 mMol) und 8.25 g
HOOBT (50 mMol) in 150 ml abs. Tetrahydrofuran gibt man bei O0C eine Lösung von 11 g DCC in eiskaltem Tetrahydrofuran.
Man läßt 1 Std. bei O0C und eine Stunde bei Raumtemperatur
rühren, saugt anschließend den Niederschlag ab und engt das Filtrat im Vakuum ein. Der Rückstand wird mit Isopropanol
verrieben und abgesaugt. Aus Tetrahydrofuran/Petroläther kann umkristallisiert werden. Ausbeute 16.57 g (84.5 %
d.Th.), Schmelzpunkt 1700C, Z«_7D -26.6° (c«2, in Dimethylformamid)
C19H18N4O6 (398.4) Ber. C 57.28 H 4.55 N 14.07
Gef. 57.2 4.6 14.4
b) Z-Ser-OOBT
2.4 g Z-Serin (TO mMol) v/erden wie in Beispiel 1a mit
1.65 g HOOBT (10 mMol) umgesetzt. ß*JO -40.4 (cÄ2, in
Dimethylformamid) Ausb. 3.25 g (84.7 % d.Th.), Schmp. 128-1300C
C18H16N4°6 <384·4> | Ber. | C | 56. | 25 | H | 4. | 20 | N | 14, | 58 |
Gef. | 56. | 1 | 4. | 6 | 14. | 9 | ||||
c) Z-Asn(Mbh)-OOBT |
4.9 g Z-Asnj(Mbh)-OH (10 mMol) werden wie in Beispiel 1a
mit 1.65 g HOOBT (10 mMol) in Dimethylformamid als Lösungsmittel umgesetzt.
Ausb. 3.1 g (48.5 % d.Th), Schmp. 175-177°
Ausb. 3.1 g (48.5 % d.Th), Schmp. 175-177°
C^H^Np-Oc, (637.65) Ber. C 64.05 H 4.90 N 10.98
^+ 31 ? ö Gef. 64.2 5.1 11.1
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a) Z-Ser~Leu-OBu (nach.der "Eintopfmethode" =
Verfahrensweise a)
Zu einer Lösung von 24 g Z-Serin (0.1 Mol), 22.5 g
H-Leu-ÖBu^HCl und 16.3 g HOOBT in 300 ml Dimethylformamid
gibt man bei O0C 13 ml N_Äthylmorpholin und
eine eiskalte Lösung von 22 g DCC in wenig Dimethylformamid. Man rührt je eine Stunde bei O0C und bei Raumtemperatur,
saugt den Niederschlag ab, engt das Filtrat i.Vak.. ein und nimmt den Rückstand in Essigester auf.
Die Essigesterlösung wird'mit ges. Natriumbicarbonatlösung, 2n Zitronensäure, ges. Natriumcärbonatlösung und
Wasser gewaschen, mit Natriumsulfat getrocknet und i.Vak. eingeengt. Der Rückstand wird in Äther gelöst. Von Unlöslichem
wird abfilizLert und der Äther abdestilliert. Der Rückstand kristallisiert aus Petroläther, dem etwas
Essigester zugesetzt wurde. Ausb. 36.5 g (89.4 %),
Schmp. 94-95°,/Öl7d -36.05 (c=2, in Methanol)
C21H32N2O6 (408,5) Ber. C61.74 H 7.89 N 6.86
Gef. 61.7 8.2 7.0
b) Z-Ser-Leu-OBu* (mit Z-Ser-OOBT)
Zu einer Suspension von 1.15 g H-Leu-OB^.HCl (5 mMol) in
Tetrahydrofuran gibt man bei 0°C 0.65 ml N-Äthylmorpholin
(5 mMol) und 1.95 g Z-Ser-OOBT ( 5 mMol). Nun rührt man eine Stunde bei Raumtemperatur, engt die Reaktionsmischung
ein, nimmt den Rückstand in Essigester auf und arbeitet wie bei 2a auf.
Ausb. 3.4 g (83.3 %-d.Th.)
Schmp. 93°
Ausb. 3.4 g (83.3 %-d.Th.)
Schmp. 93°
c) Herstellung von H-LeU-OBu1^HCl
112 g Z-Leu-OBu werden in Methanol mit Pd-Katalysator
unter Zuhilfenahme eines Autotitrators bei pH 4.5 (Zugabe
von 1n methanolischer JlCl) katalytisch hydriert. Nach beendeter
Hydrierung wird der Katalysator abfiltriert und 009887/2192
das Filtrat i.Vak. eingeengt. Der Rückstand wird mit "-■ Äther verrieben. Ausb. 61.9 g, Schmp. 171°. Die Substanz
enthält noch etwas Leucin. Nach Chromatographie über
neutrales Al0O^ in Methanol war die Substanz chromato-2
3
graphisch einheitlich.
Ausb.-56.8 g, Schmp. 172-173° "
3. Herstellung von Cys(Trt)-Ser-Leu
a) H-Ser-Leu-OBu^HCl
39.4 g Z-Ser-Leu-OBu werden in Methanol mit Pd-Ka talysator
unter Zuhilfenahme eines Autotitrators bei pH • (Zugabe von 1n methanolischer HCl) katalytisch hydriert.
Naciybeendigter Hydrierung wird der Katalysator abfiltriert
und das Filtrat i.Vak. eingeengt. Der Rückstand wird mit Äther verrieben.
Ausb.■30 g (= 100 % d.Th.), Schmp. 196°
Aus Methanol/Äther umkristallisiert Schmp. 205° DO V -35.3° (c=2, in Methanol)
C13H2^ClN2O4 (310.8) Ber. C 50.21 H 8.76 N 9.02
Gef. 50.0 9.0 9.1
b) Boc-Cvs(Trt)-Ser-Leu-OBufc
4.7 g Boc-Cys(Trt)-OH (10 mMol) werden in 30 ml abs.
Tetrahydrofuran gelöst. Dazu gibt man bei 0° 1.65 g HOOBT (10 mMol), 3.1 g H-Ser-Leu-OBu^HCl (10 mMol),
1.3 ml N-Äthylmorpholin und zum Schluß unter Rühren
eine Lösung von 2.2 g DCC in wenig Tetrahydrofuran. Man läßt 1 Std. bei 0° und 1 Std. bei Raumtemperatur
rühren. Nun wird wie bei 2a aufgearbeitet. Der ölige Rückstand wird zur Reinigung in Tetrahydrofuran über
basisches Al2O, (V/oelm, Aktivstufe I) Chromatograph!ert.
Ausbeute 6.6 g (amorpher Schaum) (91.8 % d.Th) DCi einheitlich
C40H53Ii3O7S (719.95)
C40H53Ii3O7S (719.95)
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■ ■- ίο -
c) Cvs(Trt)-Ser-Leu
54.6 g Boc-Cys(Trt)-Ser-Leu-OBu werden bei Zimmertemperatur
in Trifluoressigsäure (wasserfrei) gelöst. Man läßt die Lösung T Std. bei Raumtemperatur stehen
und engt bei 25° Badtemperatur i.Vak. ein. Mit Äther wird 3 mal nachdestilliert und"der Rückstand i. Hochvak.
getrocknet. Der Rückstand wird dann in Äther angelöst und mit gesättigter Natriumacetatlösung geschüttelt.
Der. ausfallende Niederschlag wird abgesaugt und mit Wasser gewaschen und getrocknet. Das amorphe Pulver
wird in Tetrahydrofuran gelöst. Von unlöslichen Bestand-"
teilen wird filtriert und mit Petroläther, das Peptid
wieder gefällt.
Ausb. 36.6 g (82.6 % d.Th), amorph DC: ninhydrinpositive Verunreinigung
DÜv + 9·95° (c=2, in Eisessig)
C31H57N3Q5S.1 H2O (581.7) Ber. C 64.00 H 6.76 N 7.23 S 5.51
Gef. 63.9 6.8 7.6
4. Herstellung von Glv-Val-Cvs(Trt)-Ser-Leu
a) Boc-Glv-Val-OH
Zu einer Suspension von 8.75 g Boc-Glycin (50 mMol), ) 8.25 g HOOBT (50 mMol) und 8.5 g H-VaI-OMe.HCl (50 mMol)
in 150 ml Tetrahydrofuran gibt man bei 0° unter Rühren
6.5 ml N-Äthylmorpholin (50 mMol) und zum Schluß eine
Lösung von 11 g DCC in wenig Tetrahydrofuran. Man läßt 1 Std. bei 0° und 1 Std. bei Zimmertemperatur rühren,
saugt den Niederschlag ab und engt das Piltrat ein.
Nun wird wie in Beispiel 2a aufgearbeitet. Ausb. 10.6g (ölig). Zur Reinigung wird in Essigester über basisches
Al2O3 (Woelm, Aktivst. I) chromatographiert.
Ausb. 8.7 g (ölig)
Die erhaltenen 8.7 g Boc-Gly-VaI-OMe werden in 32 ml
Dioxan gelöst. Man versetzt die Dioxanlösung zunächst mit 4 ml V/asser und dann innerhalb von 1-2 Std· mit
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30.2 ml 1n NaOH. Nach 2 Std. wird mlt'2h Zitronensäure
neutralisiert und die Reaktionsmischung i.Vak. eingeengt. Der Rückstand wird bei 0° zwischen Essigester und
2n Zitronensäure verteilt. Die Essigesterphase v/ird noch einmal mit 2n Zitronensäure und einmal mit Wasser
ausgeschüttelt,.mit Natriumsulfat getrocknet und eingeengt.
Ausb.» 7.85 g. Nach Umkristallisation aus Essiges ter/Petroläther: Ausb. 6.5 g, Schmp. 98-101°, 1\7Ώ +4.33
(c=2, in Methanol)
C12H22N2O5 (274.3) Ber. C 52.52 H 8.08 N 10.22
Gef. 52.8 8.1 10.1
b) Boc-Glv-Val-Cvs(Trt)-Ser-Leu-OH
Eine Lösung von 3.14 g Boc-Gly-Val-OH (11 mMol) und
1.82 g HOOBT (11 raMol) in 45 ml Tetrahydrofuran wird
bei 0° mit 2.27 g DCC (11 mMol) versetzt. Man läßt 1 Std. bei 0° und*tys(Trt)-Ser-Leu.1 H£0 (10 mMol) zu und läßt
noch 1 Std. bei Raumtemperatur rühren. Der Niederschlag wird abgesaugt und das FiItrat eingeengt. Der Rückstand
wird mit Äther verrieben. Es entsteht ein amorphes Produkt, das zur Reinigung aus Tetrahydrofuran/Petroläther
umgefällt wird.
Ausb. 7.8 g (93.1 % d.Th)
l4jB -11.55° (c=2, Dimethylformamid) DC: einheitlich
Ausb. 7.8 g (93.1 % d.Th)
l4jB -11.55° (c=2, Dimethylformamid) DC: einheitlich
C43H57N5O9S.1 H2O (838.0) Ber. C 61.63 H 7.10 N 8.36 S 3.83
Gef. 61.5 7.1 8.3
c) Gly-Val-Cys(Trt)~Ser-Leu
7.3 g Boc-Gly-Val-Cys(Trt)-Ser-Leu-OH werden bei Zimmertemperatur
in wasserfreie Trifluoressigsäure gelöst. Man läßt 30 Min. bei Raumtemperatur stehen und engt an- schließend
bei 25° Badtemperatur i.Vak. ein. Der Rückstand v/ird mit Äther verrieben und abgesaugt. Das amorphe Produkt
wird in Dioxan/YJasser (6:4) gelöst und mit Natriumacetatlösung
gefällt. Es v/ird gekühlt, abgesaugt und *)1 Std. bei Raumtemperatur rühren und gibt dann 5.8 g
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mit Wasser gewaschen.
Ausb. 6.75 g (86.6 % d.Th) ß(JO -25.6° (c=1, 90-proz.
Essigsäure) '
DC: Nur durch Spuren ninhydrinpositive Substanzen verunreinigt.
' C38H49N5O7S,2 Na-acetat, 0.5 H2O (894.99)
Ber. C 56.35 H 6.31 N 7.83 S.3.58 Na 5.14
Gef.· 56.2 6.4 7.4 3.3 4.6
Hefstellung von Boc-CysiTrtJ-CystMPCHj-Ala-Gly-Val-Cvs(Trt)~Seri-Leu-OH
a) Boc-Cvs(Trt)-Cvs(MPCH)-Ala-ONB
Zu einer Suspension von 23.7 g Boc-Cys(MPCH)-OH (57.9 mMol),
23.1 g H-AIa-ONB-tosylat (58.2 mMol). und 9.55 g HOOBT
(58.5 mMol) in 230 ml Tetrahydrofuran gibt man bei 0° unter Rühren 7.5 ml N-Äthylmorpholin (58.5 mMol) und
nach 5 Min. Rühren 12.7 g DCC (61.3 mMol), gelöst in
wenig Tetrahydrofuran. Man läßt eine Std. bei 0° und :
eine Std. bei Raumtemperatur rühren, saugt den Niederschlag ab und engt das Filtrat ein. Der Rückstand wird
wie in Beispiel 2a aufgearbeitet und anschließend zur weiteren Mnigung in Essigester über basisches Al2O,
Woelm, Aktivst. I) Chromatograph!ert. Ausb..31.9 g
(89.5 % d.Th) amorphe Substanz. Die gewonnenen 31.9 g Boc-Cys(MPCH)-AIa-ONB (51.8mMi) werden in 100 ml Eisessig
gelöst. Dazu gibt man 100 ml 1n HCl/ Eisessig und läßt 1 Std. bei Raumtemperatur stehen. Anschließend wird
im Hochvakuum eingeengt und mit Äther nachdestilliert. Der Rückstand wird öfters mi-tether veirLeben, wobei der Äther
jeweils vom Rückstand abdekantiert wird. Zum Schluß wird der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Es bleiben 24.3 g
eines amorphen Schaums zurück. Das entspricht einer Ausbeute von 85 % d.Th. bezogen auf BoC-CyS(MPCH)-AIa-ONB.
Die oben gewonnenen 24.3 g H-Cys(MPCH)-AIa-ONB.HCl
(44.1 mMol) werden, in wenig Tetrahydrofuran gelöst, zu
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einer Reaktionsmischung von 23.2 g Boc-Cys(Trt)-OH (50 mMol),
7.3 g HOOBT (45 mMol) und 9.3 g DCC (45 mMol) in 100 ml
Tetrahydrofuran, die bereits 1 Std. "bei 0° und 1 Std.
bei Raumtemperatur rührte, gegeben. Man läßt nun noch
5.8 ml N-Ä'thylmorpholin (45 mMol) zutropfen und rührt
eine weitere Stunde bei Zimmertemperatur. Der Niederschlag wird abgesaugt, das Filtrat im Vakuum eingeengt
und der Rückstand wie in Beispiel 2a aufgearbeitet. Zur Reinigung wird in Essigester über basisches Al2O,
(Woelm, Aktivst. I) chromatographiert, Ausb. 40.9 g
amorpher Schaum (96.4 % d.Th. bezogen auf H-Cys (MPCH)-Ala-ONB.HCl).
DC: einheitlich.
C53H60N4°9S2 (961.2)
b) Boc-Cvs(Trt)-Cvs(MPCH)-Alä-OH
40.9 g Boc-Cys(Trt)-Cys(MPCH)-Ala*ONB (42.5 mMol) werden
in 125 ml Dioxan gelöst. Unter Rühren setzt man 25 ml Wasser zu und titriert mit 43 ml 1n NaOH gegen Thymolphthalein.
Nach beendigter Verseifung wird mit 2n Zitronensäure neutHJLisiert und die Reaktionsmischung i.Vak. eingeengt.
Der Rückstand wird zwischen Essigester und 2n Zitronensäure bei 0° verteilt. Die EsslgesterJLösung wird mit 2n
Zitronensäure und Wasser gewaschen, mit Natriumsulfat getrocknet und i.Vak. eingeengt. Um den p-Nitrobenzylalkohol
abzutrennen wird in wenig Äther: gelöst und mit einer größeren Menge Petroläther schnell ein öl ausgefäll^.
Vom ausgefallenen Öl wird rasch dekantiert. Diese Reinigungsprozedur wird noch zwei-mal wiederholt. Bei
der letzten Umfällung fällt die Substanz als amorphes Pulver an. Ausb. 22.6 g (64.4 % d.Th.), DC: einheitlich
C46H55N3°7S2 (826·1>
c) Boc-Cvs(Trt)-Cvs(MPCH)-Ala-Glv-Val-Cvs(Trt)-Ser-Leu-OH
Zu einer Lösung von 6.98 g Boc-Cys(Trt)-Cys(MPCH)-Ala-OH
(8.45 mMol) und 1.15 g HOOBT (8.45 mMol) in 30 ml Dimethylformamid
gibt man bei 0° eine ebenfalls auf 0° ab-
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gekühlte Lösung von 1.75 g DCC (8.45 mMol) in wenig
Dimethylformamid. Man läßt 1 Std. bei O0 und t Std.
bei Raumtemperatur rühren und gibt dann 5.8 g GIy-VaI-Cys(Trt)-Ser-Leu,
2 Na-acetat, 0.5 H2O (&5 mMol) zu.
Man läßt eine weitere Stunde bei Zimmertemperatur rühren, saugt den Niederschlag ab, engt im Hochvakuum ein und
verreibt den Rückstand mit Äther. Das dabei entstehende amorphe Pulver wird abgesaugt und aus Eisessig/Wasser
umgefällt. Ausbeute: 9.8 g (97.7 % d.Th.). Die Substanz hat keinen scharfen Schmelzpunkt. DC: einheitlich
Ä-7D -14· 3° (c»2, in Dimethylformamid)
C84H1cA013S3·1 H2° (1^6) Ber. C 65.27 tt 6.78 N 7.24 S 6.23
■·--■' . Gef. 65.1 6.9 7.1
Herstellung von Z-Val-Glu(OBut)-Gln(Mbh)-OMe
a)
Z-Glu(OBut)-Gln(Mbh)-OMe
5.2 g Z-GIu(OBu*)-OH.DCHA (10 mMol) und 4.25 g H-GlnjMbh)-OMe.HCl
(1OmMoI) werden getrennt in je 20 ml Dimethylformamid
gelöst und dann zusammengegeben. Man kühlt gut ab, saugt den ausgefallenen Niederschlag ab und versetzt
das Filtrat mit 1.65 g HOOBT (10 mMol). Bei 0° versetzt man die Lösung mit einer Lösung von 2.2 g DCC in Dimethylformamid,
rührt 1 Std. bei 0° und 1 Std. bei Raumtemperatur, saugt den Niederschlag ab und versetzt das
Filtrat mit Wasser. Der nun ausfallende Niederschlag wird
in Essigester gelöst und wie in Beispiel 2a ausgeschüttelt. Der Rückstand wird mit Petroläther verrieben.
Ausbeute: 5.5 g (7ß% d.Th) Schmp. 171-173°. DQ rD -6-49° fc=2» *n Dimethylformamid) . ,
CH-7N,O.n (705.8) Ber. C 6466 H 6.71 N 5.96
47 3 10 Gef# 6Z}^ 6#9 6#1
b) Z-Val-Glu(OBut)-Gln(Mbh)-OMe ·
4 g Z-Glu(OBu^)-Gln(Mbh)-OMe werden in einer Methanol/
Dirnethylformamid-Mischung mit Pd-Katalysator unter Zuhilfenahme
eines Autotitrators bei pH 4.5 (Zugabe von 1n
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methanolischer HCl) katalytisch hydriert. Nach beendigter . Hydrierung wird der Katalysator abfiltriert
und das Filtrat i.Vak. eingeengt. Der Rückstand wird vi* mit Petroläther und Äther verrieben und am Hochvakuum
if ·. ik
i-> getrocknet. Der Rückstand wird zusammen mit 1.4 g
Z-Valin und 0.92 g HOOBT. in 17 ml Dimethylformamid gelöst
und bei 0° unter Rühren mit 0.73 ml N-Äthylmorpholin
und einer kalten Lösung von 1.25 g DCC in Dimethylformamid versetzt. Man läßt eine Stunde bei 0° und eine
Stunde bei Raumtemperatur rühren, saugt den Niederschlag ab und engt das Filtrat ein. Der Rückstand wird 2 mal
mit Natriumbicarbonatlösung verrieben und mit Wasser
gewaschen.
Ausb. 4.35 g (95.3 % d.Th), Schmp. 189-190° Zur Reinigung wurde mit Alkohol aufgekocht und gekühlt:
Ausb. 3.85 g (84.4 % d.Th,), Schmp. 200-204° JjQ^0 -9*45° (c=2, in Dimethylformamid)
0/.,H^Ni1O4,- (804,95) Ber. C 64.16 H 7.01 N 6.96
^ 5D ^ ΊΊ Gef. 64.0 7.0 6.9
7. Herstellung von Z-Pro-Lvs(Boc)-Glv-NH-Mbh
a) Z-Lvs(Boc)-Glv-NH-Mbh =
56.2 g Z-Lys(Boc)-OH.DCHA (0.1 Mol) und 34 g H-Gly-NH-Hbh.HCl
(0.1 Mol) werden getrennt in je 200 ml Dimethylformamid
gelöst und dann zusammengegeben. Man kühlt ab, saugt den ausgefallenen Niederschlag ab und versetzt das Filtrat
mit ,16.3 g HOOBT (0.1 Mol). Bei 0° versetzt man die Lösung mit einer Lösung von 22 g DCC in Dimethylformamid,
rührt eine Std. bei 0° und eine Std. bei Raumtemperatur, saugt den Niederschlag ab und engt das Filtrat i. Hochvakuum
ein. Der Rückstand wird zwischen warmen Essigester und Natriumbicarbonatlösung verteilt. Die Essigesterphase
wird mit 2n Zitronensäure, Natriumbicarbonatlösung und Wasser gewaschen, über "Natriumsulfat getrocknet
und eingeengt. Der Rückstand wird aus Essig-
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ester/Petroläther umkristallisiert. Ausbeute 54.2 g
(82 % d.Th.)i Schmp. 125-127°, /ÄL7D + 5..40 (c=2,
in Methanol)
.Oo (662.8) Ber. C 65.24 H 7.00 N 8.45
4b 6 6
b) H-Lys ( Boc) -Gly-NH-Mbh»-HCl
54.2' g Z-Lys(Boc)-Gly-NH-Mbh werden in Methanol suspendiert, mit Palladium-Katalysator versetzt und unter
Zutropfen von 1n methanolischer Salzsäure (Autrotitrator,
pH 5) katalytisch hydriert. Der Katalysator wird abgesaugt und die Lösung eingeengt. Der Rückstand wird mit
Äther verrieben. Ausb. 45.1 g (97.5 % d.Th.), Schmp. 196°, ßUv + 16.75° (c=2, in Methanol)
C28H41ClN4O6 (565.1)
c) Z-Pro-Lys(Boc)-Gly-NH-Mbh
Zu einer Lösung von 2.5 g Z-Prolin (10 mMol) und 1.63 g
HOOBT (10 mMol) in 30 ml Dimethylformamid gibt man bei 0° eine ebenfalls auf 0° abgekühlte Lösung von 2.2 g
DCC in wenig Dimethylformamid. Man läßt 1 Std. bei 0° und 1 Std. bei Raumtemperatur stehen und gibt dann
5.65 g fein zerriebenes H-Lys(Boc)-Gly-NH-Mbh.HCl
(10 mMol) und 1,3 ml N-Äthylmorpholin (10 mMol) zu,
läßt 1 Std. bei Zimmertemperatur rühren, saugt den gebildeten Niederschlag ab und engt das FiItrat ein. Nun wird
wie bei 7a aufgearbeitet. Ausb. 7.2 g (98 % d.Th.), Schmp. 180-183° 1\7Ώ -25° (c=2, in Dimethylformamid)
d) H-Gly-NH-Mbh.HCl
44.7 g Z-Gly-NH-Mbh werden in einer Mischung aus 300 ml
Methanol und 300 ml Eisessig suspendiert und mit Palladium-Katalysator katalytisch hydriert. Der Katalysator
wird abgesaugt und das Filtrat eingeengt. Der Rückstand wird in Methanol gelöst und gegen Thymolblau mit metha-
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■ - 17 -
nolischer Salzsäure titriert. Nun wird noch einmal eingeengt und der Rückstand mit Äther verrieben. Ausbeute
33.9 g ( 98 % d.Th.). Umkristallisiert aus
Methanol/Äther:<31.7 g (91.6 % d.Th.)
Schmp. 202-204°
. C17H^ClN0O, (336.8) Ber. C 60.61 H 6.28 N 8.32
lf ^ ά * ■ Gef. 60.3 6.5 8.4
8. Z-Gln-Ala-OBu*
a) nach der "Eintopf-Methode" (Verfahrensweise a)
Zu einer Lösung von 2.8 g Z-GIn-OH (10 mMol), 1.8 g H-AIa-OBu"1.
HCl (10 mMol) und 1.63 g HOOBT (10 mMol) in Di-' methylformamid gibt man bei 0° 1.28 ml N-Äthylmorpholin
(10 mMol) und zum Schluß eine kalte Lösung von 2.1 g DCC in wenig Dimethylformamid. Man lässt 1 Std. bei 0° und
1 Std. bei Zimmertemperatur rühren, saugt den Niederschlag ab und versetzt das Filtrat mit Wasser. Man läßt
über Nacht im Eisschrank stehen und saugt anderntags den Niederschlag ab, der mit Natriumbicarbonatlösung
verrieben und mit Wasser gewaschen wird. Über Phosphorpentoxid wird getrocknet. Ausb. 2.8 g (69 % d.Th.),
Schmp. 158-160°
b) mit Voraktivierung
Zu einer Lösung von 2.8 g Z-GIn-OH (10 mMol) und 1.63 g
HOOBT (10 mMol) in 20 ml Dimethylformaid gibt man bei 0° eine kalte Lösung von 2.1 g DCC in wenig Dimethylformamid.
Man läßt 1 Std. bei 0° und 1 Std. bei Raumtemperatur rühren und gibt dann 1.8 g H-AIa-OBu*.HCl (10 mMol) und
1.28 ml N-Äthylmorpholin zu. Man läßt eine weitere Stunde bei Zimmertemperatur rühren und arbeitet wie bei 8a auf.
Ausb. 2.6 g (63 %d.Th.), Schmp. 158-161°.
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9. Z=TvT-TyT-OMe
Zu einer Suspension von 3.15 g Z-Tyr-0H(10 mMol), 2.30 g (10 mMol) H-Tyr-OMe.HCl und 1.63 "g HOOBT (10 mMol)
in 30 ml Methylenchlorid gibt man bei O0 unter Rühren 1.3 ml N-Äthyl^jnorpholin und eine Lösung aus 2.2 g
DCC in 5 ml Methylenchlorid. Man läßt 1 Std. bei 0° und
1 Std. bei Raumtemperatur rühren, saugt den Niederschlag ab, engt das Filtrat ein und arbeitet wie bei 2a weiter
auf. Ausb. 4.55 g (92.4 % d.Th), Schmp. 174-175°
10. Z-Thr-Phe-OMe
Zu einer Lösung von 4 g Z-Thr-QOBT (10 mMol) in 30 ml
Tetrahydrofuran gibt man bei Raumtemperatur 2.2 g H-Phe-OMe.HCl und unter Rühren 1.3 ml N-Äthylmorpholin. Bei
Zimmertemperatur wird eine Stunde nachgerührt. Die Lösung wird dann i.Vak. eingeengt und der Rückstand
zwischen Essigester und Wasser verteilt. Die Essigesterphase wird wie bei 2a ausgeschüttelt, mit Natriumsulfat
getrocknet, eingeengt und der Rückstand mit Petroläther verrieben.
Ausb. 3.75 g (90.5 % d.Th.), Schmp. 103-105°
Ausb. 3.75 g (90.5 % d.Th.), Schmp. 103-105°
11. Herstellung von Z-Val-Val-OMe
a) Mit nicht isoliertem Z-VaI-OOBT
2.5 g Z-VaI-OH (10 mMol) und 1.63 g HOOBT (10 mMol) werden
in 20 ml absolutem Tetrahydrofuran gelöst und bei 0° mit · einer kalten Lösung von 2.2g DCC in absolutem Tetrahydrofuran
versetzt. Man läßt Ί Stunde bei 0° und eine Stunde bei Raumtemperatur stehen, fügt 1.7 g H-VaI-OHe.HCl;
(10 mMol) und 1.28 ml N-Äthylmorpholin (10 mMol) zu und I läßt 1 Stunde bei Zimmertemperatur rühren. Aufarbeitung
wie bei 2a*
Ausb. 2.9 g (80 % d.Th.), Schmp. 107-109°
Ausb. 2.9 g (80 % d.Th.), Schmp. 107-109°
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b) Mit nicht isoliertem Z-Val-OSu
Ansatz wie bei Beispiel·11a. Statt HOOBT setzt man 1.25 g
N-Hydroxysuccinimid (11 mMol) zu.
Ausb. 81.96, Schmp. 82-86°
Ausb. 81.96, Schmp. 82-86°
12. Synthese von Boc-Leu-Phe-VaI-OBu (gaschromatographischer
Racemisierungstest nach F. Weygand et al.)
(F. Weygand, A. Prox u. W. König. Chem. Ber. 22 (1966),
Seite 1451-1460)
Der Test wurde dahingehend abgeändert, daß statt Z-Leu-Phe-OH
Boc-Leu-Phe-OH eingesetzt wurde, was den Vorteil hat, daß das entstehende völlig geschützte Peptid Boc-Leu-L.D-Phe-VaI-OBu
ohne vorherige Schutzgruppenabspaltung hydrolysiert werden kann.
a) Prüfung auf Racemisierung bei der Eintopf-Methode
378.5 mg Boc-Leu-Phe-OH (1 mMol) und 209.7 mg H-VaI-OBu^HCl
(1 mMol) werden in 2 ml absolutem Dimethylformamid oder einem anderen Lösungsmittel gelöst oder suspendiert.
Dazu gibt man 0.12 ml N-Äthylmorpholin (1 mMol) und kühlt
im Eisbad ab. Danach gibt man die Zusätze (N-Hydroxysuccinimid oder 3-Hydroxy-4-oxo-3.4-dihydro-1.2.3-benzotriazin)
und zum Schluß eine auf 0° abgekühlte Lösung von 207 mg DCC (1 mMol) in 1 ml absolutem Lösungsmittel zu.
Man läßt die Ansätze 1 Std. bei 0° und 1 Std. bei Raumtemperatur stehen, verdünnt mit etwa 30 ml Essigester,
filtriert den ausgefallenen Niederschlag ab, schüttelt das Filtrat mit gesättigter Natriumbicarbonatlösung, 2h
Zitronensäure, gesättigter Natriumbicarbonatlösung und Wasser aus, trocknet mit Natriumsulfat, engt ein und
chromatographiert den Rückstand in Essigester über 3 g basisches Aluminiumoxid (Voelm, Aktivstufe I). Das Eluat
(etwa 40 ml) wird eingeengt und der Rückstand in etwa 5 ml 8-9 η methanolischer Salzsäure gelöst und im Bombenrohr
24 Std. auf 70° erhitzt. Die methanolische Salzsäure'
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wird eingeengt und der Rückstand wie bei F. Weygand
et al. weiter verarbeitet. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 1 zusammengefaßt:
Racemisierungsuntersuchungen bei der Dicyclohexylcarbodiimid-Methode
mit Zusätzen von 3-Hydroxy~4-oxo-3. 4r-dihydro-1.2. 3^benzotriazin bzw. N-HydroxysuocLnimid
(Eintopf-Methode)
Äquiv. | Zusatz | Lösungsmittel | % D-Phe-L-VaI | 1.15 |
O | kein | DMF | 14.3 | 14.9 |
O | kein | THF | 8.1 | 1.5 |
1 | N-Hydroxysuec inimid | DMF | 1.0 | 19.2 |
2 | N-Hydroxysuccinimid | DMF | < 1.0 | |
1 | HOOBT | DMF | < 1.0 | |
2 | HOOBT | DMF | 1.3 | |
1 | HOOBT | THF | < 1.0 | |
1 | HOOBT | Dimethylacetamid£1.0 | ||
1 | HOOBT | Methylenchlorid <1.0 | ||
1 | HOOBT | DMSO | ||
O | kein | DMSO | ||
1 | HOOBT | Pyridin | ||
O | kein | Pyridin |
b) Prüfung auf Racemisierung bei der Voraktivierung von
Peptiden mit Dicyclohexylcarbodiimid und 3-Hydroxy-4-oxo-3.4-dihydro-1.2.3-benzotriazin bzw. N-Hydroxysuccininid
378.5 mg Boc-Leu-Phe-OH (ImI4IoI) und Zusatz (3-Hydroxy-4-oxo-3.4-dihydro-1.2.3-benzotriazin
bzw. N-Hydroxysuccinimid) werden in 2 ml Lösungsmittel gelöst bzw. suspendiert. Man
kühlt auf 0° ab, gibt unter Rühren eine auf 0° abgekühlte Lösung von 207 mg DCC (1 mMol) in 1 ml abs. Lösungsmittel
dazu und läßt 1 Std. bei 0° und 1 Std. bei Raumtemperatur
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rühren. Dann gibt man 209,7 mg H-VaI-OBu*.HCl ( 1 mi-Ιοί)
und 0.12 ml N-Äthylmorpholin (1 mMol) zu, läßt nochmals
1 Stunde bei Raumtemperatur stehen oder rühren und arbeitet wie bei 12 a auf.
Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 2 .zusammengefaßt:
Racemisierungsuntersuchungen bei der Voraktivierung
von Peptiden mit Dicyclohexylcarbodiimid und 3-Hydroxy-4-oxo-3..4-dihydro-1.2.3-benzotriazin
bzw. N-Hydroxysuccinimid
Äquiv. Zusatz . ., ' Lösungsmittel % D-Phe-L-Val
1 N-Hydroxysuccinimid DMF 2.3
2 N-Hydroxysuccinimid DMF 1.65
1 N-Hydroxysuccinimid Pyridin 6.1
2 N-Hydroxysuccinimid Pyridin 8.1 1 HOOBT . EMF <1.0 1 HOOBT Dirnethylacetamid <1.0
1 HOOBT THF <1.0 1 HOOBT ■ Methylenchlorid O.O
1 HOOBT Pyridin 1.65
13. Synthese von TFA-Pro-Val-Pro-OBu (gaschromatographischer
Racemisierungstest nach F. Weygand et al.)
(F.Weygand, D. Hoffmann u. A. Prox, Z. Naturforsch. 23 b
(1968), Seiten 279-281)
Der Test wurde dahingehend abgeändert, daß statt H-Pro-OMe der stabilere und leichter zu handhabende H-Pro-OBu
eingesetzt wurde. Ein weiterer Vorteil dieser Anordnung ist die größere Empfindlichkeit des Racemisierungstestes.
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Für die gaschromatographische Trennung wird das entstehende TFA-PrO-VaI-PrO-OBu* in das TFA-Pro-Val-Pro-OMe
umgewandelt.
a) Prüfung auf Racemisierung bei der Eintopf-Methode
Zu einer Lösung von 309.3 mg TFA-Pro-Val-OH (1 mMol)
und 171 mg H-Pro-OBu (1 mMol) in 3 ml Dimethylformamid
gibt man den Zusatz (3-Hydroxy-4-oxo-3.4-dihydro-1.2.3-benzotriazin
bzw. N-Hydroxysuccinimid) und bei 0° eine ebenfalls auf 0° abgekühlte Lösung von 207 mg DCC (1 mMol)
in Dimethylformamid. Man läßt 1 Std. bei 0° und 1 Std. bei Raumtemperatur stehen, verdünnt die Ansätze mit etwa
30 ml Essigester,, filtriert den ausgefallenen Niederschlag
ab, schüttelt das Filtrat mit gesättigter Natrium-" bicarbonatlösung, 2 η Zitronensäure, gesättigter Natriumbicarbonatlösung
und Wasser aus, trocknet mit Natriumsulfat, engt ein und chromatographiert den Rückstand in Essigester
über 3 g basisches Aluminiumoxid (Woelm, Aktivstufe I). Das Eluat (etwa 40 ml) wird eingeengt und der Rückstand
in etwa 2 ml Trifluoressigsäure (90-proz.) gelöst. Man läßt 1 Std. bei Raumtemperatur stehen, engt ein, löst
den Rückstand in Essigester und versetzt bis zur bleibenden Gelbfärbung mit einer ätherischen Lösung von Diazomethan.
Die Lösung wird konzentriert und wie bei F. Weygand et al. gaschromatographiert.
Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 3 zusammengefaßt:
·
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-- 23 -
Tabelle 3
Racemisierungsuntersuchungen bei der Dicyclohexylcarbodiimid-Methode
mit Zusätzen von 3-Hydroxy-4-oxo-3.4-dihydro~1.2.3-benzotriazin
bzw. N-Hydroxysuccinimid (Eintopfmethode)
Äquiv. Zusatz Lösungsmittel % D-VaI im
Tripeptid
O | kein | DMF | 67.0 |
1 | N-Hydroxysue c in- imid |
DMF | 28.0 |
2 | N-Hydroxysuccin imid |
DMF | 15.0 |
1 | HOOBT | DMF | <1.0 |
2 | HOOBT | DMF | /1.0 |
b) Prüfung auf Racemisierung bei der Voraktivierung von Peptiden mit Dicyclohexylcarbodiimid und 3-Hydroxy-4-oxo-3.4-dihydro-1.2.3-benzotriazin
bzw. N-Hydroxysuccinimid
309.3 mg TFA-Pro-Val-OH (1 mMol) und Zusatz (3-Hydroxy-4-oxo-3.4-dihydro-1.2.3-benzotriazin
bzw. N-Hydroxysuccinimid) werden in 2 ml Dimethylformamid gelöst. Man kühlt auf 0° ab, gibt eine auf 0° abgekühlte Lösung von
207 mg DCC ( 1· mMol) in 1 ml Dimethylformamid dazu und laßt 1 Std. bei 0° und 1 Std. bei Raumtemperatur stehen.
Dann gibt man eine Lösung von 171 mg H-Pro-OBu (1 mMol) in 1 ml DimethylformsnLÖ. zu, läßt nochmals eine Stunde
bei Zimmertemperatur stehen und arbeitet wie bei 13 a auf.
Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 4 zusammengefaßt:
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1933187
Tabelle 4
Racemisierungsuntersuchungen bei der Voraktivierung
von TFA-Pro-Val-OH mit Dicyclohexylcarbodiimid und
3-Hydroxy-4-oxo-3.4-dihydro-1.2.3-benzotriazin bzw,
N-Hydroxysuccinimid ^ .
Äquiv. Zusatz Lösungsmittel % D-VaI im
Tripeptid
1.2 N-Hydroxysucciniraid DMF 18.0
2 N-Hydroxysuccinimid DMF 17.0 . 1 HOOBT DMF 1.0
14. Corticotropin- (1-23)-trikosipe-ptid-am,d
7.5 g Boc-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu(OBut)-His-Phe-Arg-Trp-GIy-OH
(5 mMol), hergestellt nach Chem.Ber. £6, (1963),
Seite 1080, werden in 100 ecm Dimethylformamid mit 815mg (5 mMol) 3-Hydrcxy-4-oxo-3.4-dihydro-1.2.3-benzotriazin
und 1.03 (5 mMol) 3-Dicyclohexyl-carbodiimid 1 Std. bei -5° und 1 Std. bei Raumtemperatur gerührt. Dann
gibt man 1.1 g H-Lys(Boc)-Pro-Val-Gly-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg-Arg-Pro-Val-Lys(Boc)-Val-Tyr-liH2"'triace'fca't""ne:x:aiiy^ra'fc
(5 mMol), hergestellt nach Chem.Ber. £7 (1964), Seite
1197, das vorher i. Hochvakuum bei 60° 1 Std. über PpOc getrocknet v/orden war, zu und läßt bei Raumtemperatur,
stehen. Nach 4 Std. fällt man das rohe Reaktionsprodukt mit Äther aus. Ausb. 19.7 g. Man reinigt das
Peptid durch Auskochen mit peroxydfreiem Tetrahydrofuran. Ausb. 17.2 g. Die Schutzgruppen werden in bekannter
Weise durch einstündiges Behandeln mit 90-proz. Trifluoressigsäure
abgespalten, das rohe Trikosipeptid wird mit Äther ausgefällt und mit Äther gewaschen. Ausb,
17.0 g Trifluoracetat. Zur weiteren Reinigung wird in ebenfalls bekannter Weise an Carboxymethylcellulose
chroma tographiert. 00988 7/2192
Claims (1)
- PatentanspruchVerfahren zur Herstellung von Peptiden, dadurch gekennzeichnet, daß man entwedera) eine geschützte Aminosäure oder ein geschütztes Peptid, bei denen diejenige Carboxylgruppe, die in Reaktion treten soll, frei ist, mit einer in·• an sich bekannter Weise geschützten Aminosäure- bzw. Peptidester oder deren-amiden, bei denen diejenige Aminogruppe, die in Reaktion treten soll, frei ist, in einem in der Peptidcheiaie gebräuchlichen Lösungsmittel unter Zusatz von 1-2 Äquivalenten, vorzugsweise einem Äquivalent 3-Hydroxy-4-oxo-3.4-dihydro-1.2.3-benzotriazin und einem Carbodiimid umsetzt, oderb) eine geschützte Aminosäure oder ein geschütztes Peptid bei denen diejenige Carboxylgruppe, die in Reaktion treten soll, frei ist mit 1-2 Äquivalten, vorzugsweise mit einem Äquival^en:b 3-Hydroxy-4-oxo-3.4-dihydro-1.2.3-benzotriazin und einem Carbodiimid zu einem aktivierten Derivat umsetzt und anschließend. mit einem gegebenenfalls geschützten Peptid oder einer Aminosäure bzw. deren Amiden, bei denen diejenige Aminogruppe, die in Reaktion treten soll, frei ist, in einem in der Peptidchemie gebräuchlichen Lösungsmittel reagieren läßt und nach beendeter Reaktion und üblicher Reinigung gegebenenfalls die Schutzgruppen ganz oder teilweise in an sich bekannter Weise abspaltet.Q09887/2192
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