DE2347151A1

DE2347151A1 - Neue zwischenprodukte fuer die synthese von lrf und verfahren zur herstellung von lrf

Info

Publication number: DE2347151A1
Application number: DE19732347151
Authority: DE
Inventors: Dimitrios Sarantakis
Original assignee: American Home Products Corp
Current assignee: Wyeth LLC
Priority date: 1972-09-29
Filing date: 1973-09-19
Publication date: 1974-04-04
Also published as: US3855198A

Description

PATENTANWÄLTE
DR. W. KINZEBACH — DIPL-ING. O. HELLE3RÄND

^ ο / 7 ι r ι 8 München so 19. Sept. 1973

£ -J H I ID I Walpurgisstraße 6

Telefon: 0811/470 5034 Telegramme: Hekipat (München)

CASE: AHP-5870

AMERICAN HOME PRODUCTS CORPORATION 685 Third Avenue, New York, N.Y.10017, USA.

Neue Zwischenprodukte für die Synthese von LRi¹ und Verfahren zur Herstellung von

Die Erfindung "betrifft die Synthese des Decapeptides, das den Releasingfaktor für das luteinisierende Hormon darstellt, sie "betrifft neue Zwischenprodukte, die für eine solche Synthese verwendet werden, und sie betrifft die Synthese solcher Zwisohenprodukte.

Der Releasingfaktor für das luteinisierende Hormon (nachfolgend IiRP = "luteinizing hormone releasing factor" genannt) ist das Decapeptid L-(5-Oxoprolyl)-I-histidyl-L-tryptophyl-Ir-seryl-L-tyrosyl-glycyl-L-leucyl-Ii-arginyl-L-prolyl-glycinamid. Dieses Decapeptid wird vom Hypothalamus sekretiert und zur Adenohypophyse "befördert, wo es die Freisetzung des luteinisierenden Hormones und des Follikel-stimulierenden Hormones stimuliert.

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Zahlreiche Synthesewege sind in der Literatur für LRP "beschrieben worden, wobei die Festphasesynthese, klassiche Synthesen, oder eine Kombination dieser Methoden angewendet worden sind. Die Festphasesynthese ist beschrieben worden von R. B. Merrifield, J. Am. Chem. Soc, 85, 2144 (1963), J. M. Stewart und J.D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, W. H. Freeman und Co., San Francisco, 1969; und Solid Phase Synthesis of LRF von Monahan et al., C. R. Acad. Sc, Paris, JT73, 508 (1971); H. Sievertsson et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 44, 1566 (1971)» H. Matsuo et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 4Jj _f 882 (1971); P. Rivaille et al., HeI. Chim. Acta., 5±_t 2772 (1971). Die Anwendung der klassischen Synthesemethode ist vor kurzem von J.K. Chang et al., J. Med. Chem., _1_5, 623 (1972) beschrieben worden und Geiger et al., Biochem., Biophys. Res. Commun., _45_, 767 (1971) haben ebenfalls die Synthese von LRF nach der klassischenMethode beschrieben. Eine Kombination von Festphase- und klassicher Methode ist ebenfalls von Sievertsson et al., oben, beschrieben worden.

Die Anmelderin fand, daß die Festphasesynthese bestimmte Nachteile hat, wozu ein Mangel an strenger Kontrolle auf jedem Schritt des Syntheseweges über die Reinheit der verschiedenen Aminosäuresequenzen, die bei der Synthese verwendet werden, gehört.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Schaffung einer neuen LRF-Synthese mit Hilfe der klassichen Methode, die Racemisierungsreaktionen auf ein Minimum reduziert und hohe Ausbeuten an LRF und hohe &esamtreinheit für LRF bietet. Zur Aufgabe der Erfindung gehört auch die Schaffung von Verfahren zur Synthetisierung von Tetrapeptid-Zwischenprodukten, die für die Herstellung von LRF verwendet werden, sowie die Schaffung neuer Tetrapeptid- und Octapeptid-Zwischenprodukte, die für die Synthese von LRF verwendet werden.

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- 2 -

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Die neuen Tetrapeptide der vorliegenden Erfindtuag haben folgende Formeln:

,4

OR" ?^H2°

R—N—CH-C-NH-CH-C-NH-CH-C-NH-CHg- C-R

O=C- NH-

Il

C-NH,

worin:

R eine Schutzgruppe für OC-Amino darstellt; R¹ für -NHNH₂, -NHNH-R⁶, N₅ oder OR⁵ steht;

2
R eine Schutzgruppe für die phenolische Hydroxylgruppe des Tyrosine darstellt;

ΈΓ für Wasserstoff oder eine Schutzgruppe für die alkoholische Hydroxylgruppe steht;

R^ eine Schutzgruppe für die N , N und N^-Stickstoffatome des Arginins darstellt oder R Wasserstoff bedeutet; vorausgesetzt daß wenigstens eines aber nicht mehr als zwei der drei Seitenketten Stickstoffatome eine Schutzgruppe enthalten. Der Platz der Schutzgruppe wird durch den speziellen gewählten Schutzrest bestimmt. In den vorstehenden !Formeln stehen die Reste:

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R⁵ für eine Schutzgruppe für oC-Carboxyl;

R für eine Schutzgruppe für Hydrazid, die leicht abgespalten wird, wie z.B. tert.-Butyloxycarbonyl, Trityl und Benzyloxycarbonyl;

7
R für Wasserstoff oder eine Schutzgruppe, die durch R, verknüpft mit der oC-Aminogruppe des Leucine,gebildet wird; in Formel B, wo R Wasserstoff darstellt, kann das Tetrapeptid auch in Form seines Säureadditionssalzes vorliegen. Beispiele für derartige Salze sind das Hydrobromid, Hydrochlorid, Acetat und Trifluoracetat.

Die obigen Tetrapeptide der Formel A und B können auch wie folgt geschrieben werden:

R-Trp-Ser(R⁴)-Tyr(R²)-Gly-(R¹) A R⁷-Leu-Arg(N^G-R³)-PrO-GIy-NH₉ B

worin:

N die Seitenkettenstickstoffatome im Arginin betrifft;

R die Schutzgruppe an der phenolischen Hydroxylgruppe des Tyrosins betrifft;

R Wasserstoff am alkoholischen Sauerstoffatom im Serin oder die Schutzgruppe an einem derartigen Sauerstoffatom betrifft; 13 7

R, R , R-^ und R' die oben genannten Bedeutungen haben.

Die für Peptide verwendete Nomenklatur haben Schroder und lubke, The Peptides, 1, Seiten viii-xxix (Academic Press 1965) und in Biochemistry JM., Seiten 1726-1732 (1972), beschrieben.

Zur vorliegenden Erfindung gehört auch ein neues Octapeptid der Formel:

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OR

R-HH-CH-G-HH-CH-C-NH-CH-C-IIH-CH₂-C-Nh-CH-O-M-OH C-N

CH CH

0-R'

O=C

NH I

CH, I ? O=C

NH,

worin R, R , R und R die früher genannten Bedeutungen haben.

Die OC-Amino-Schutzgruppen R und R sind diejenigen, von denen bekannt ist, daß sie für die schrittweise Synthese von Polypeptiden geeignet sind. Bei der Wahl einer oC-Amino-Schutzgruppe ist darauf zu achten, daß sie bei der ganzen Synthese die folgenden Bedingungen erfüllt:

(a) Erhaltung ihrer schützenden Eigenschaften (das heißt sie soll unter Eupplungsbedingungen nicht abgespalten werden),

(b) keine Verursachung von Nebenreaktionen oder anderweitige Störung der Synthese und

(c) leichte und selektive Entfernbarkeit, so daß andere Schutzgruppen an der gleichen oder an anderen funktioneilen Gruppen bewahrt werden können (das heißt nicht abgespalten werden) wo es bei der Synthese erwünscht ist. In den Klassen der oC-Amino-Schutzgruppen gibt es (1) Schutzgruppen vom Acyltyp, z.B. Formyl-, Trifluoracetyl-, Phthalyl-, Toluolsulfonyl-(losyl-), Benzolsulfonyl-, Nitrophenylsulfenyl-, Tritylsulfenyl-, o-Nitrophenoxyacetyl-, Chloracetyl-, Acetyl-, if-Chlorbutyrylgruppen etc.; (2) Schutzgruppen vom aromatischen ürethantyp,

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z.B. Benzylοxycarbonyl- und substituierte Benzyloxyearbonalgruppen, wie p-Chlorbenzyloxycarbonyl-, p-Nitrobenzyloxycarbonyl-, p-Brombenzyloxycarbonyl-, p-Methoxybenzyloxycarbonylgruppenf (3) aliphatische Urethan-Schutzgruppen, z.B. tert.-Butyloxycarbonyl-, Diisopropylmethoxycarbonyl-, Isopropyloxycarbonyl-, Äthoxycarbonyl-, Allyloxycarbonylgruppen; (4) Cycloalkylurethan-Schutzgruppen, z.B. Cyclopentyloxycarbonyl-, Adamantyloxycarbonyl-, Cyclohexyloxycarbonylgruppen; (5) Thiourethan-Schutzgruppen, z.B. Phenyl thiocarbonylgruppen; (6) Alkyl-Schutzgruppen, z.B. Triphenylmethyl-, (Trityl-), Benzylgruppen etc.; (7) Trialkylsilangruppen, wie Trimethylsilan.

7 Die bevorzugten OG-Amino-Schutzgruppen R und B. werden unter den folgenden Schutzgruppen ausgewählt: tert.-Butyloxycarbonyl, Trityl, Phthalyl, Tosyl, Allyloxycarbonyl, Cyclopentyloxycarbonyl, tert.-Amyloxycarbpnyl und aromatische ürethangruppen der Formel:

12

worin R Wasserstoff, Halogen, Niedrigalkoxy oder Nitro dar-

12 '

stellt, vorzugsweise steht R für Wasserstoff.

Die von R^ dargestellte Schutzgruppe für Carboxyl ist eine Gruppe, die unter den Bedingungen stabil ist, die beim Entfernen der Schutzgruppe von der oC-Aminogruppe angewendet werden, und sie kann unter den folgenden Gruppen ausgewählt werden: Geradkettiges Cj-Cg-Niedrigalkyl (z.B. Methyl, Äthyl, Butyl, Pentyl), Benzyl, substituiertes Benzyl> wobei der Substituent zumindest einen Nitro-, Methoxy- oder Methylrest darstellt (z.B. p-Methoxybenzyl, p-Nitrobenzyl, 2,4-Bimethoxybenzyl, 2,4,6-Trimethylbenzyl, Pentamethylbenzyl), Phenacyl, Phthalimidomethyl, (3-Methyl-

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thioäthyl, 4-Picolyl und 4-(Meth.ylth.io)phenyl. Vorzugsweise steht R für Niedrigalkyl, Benzyl oder substituiertes Benzyl.

Repräsentative R und R -Hydroxylschutzgruppen für Serin und Tyrosin sind Acetyl, Tosyl, Benzoyl, tert.-Butyl, Trityl, Benzyl, Benzyloxycar"bonyl. Die bevorzugte Schutzgruppe ist die Benzylgruppe.

Beispiele für Schutzgruppen am N , N und N^ des Arginine sind z.B. die Nitro-, Tosyl-, Benzyloxycarbonyl-, Adamantyloxycarbonyl- und Tritylgruppen. Im Falle der Nitro- oder Tosylgruppe steht die Schutzgruppe an einem der N⁶^, N -Stickstoffatome und im Falle der Benzyloxycarbonyl-, Trityl- oder Adamantyloxycarbonylgruppe steht die Schutzgruppe am N -Stickstoff und an einem der N^, N^¹-Stickstoffatome.

Das Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Herstellung von ERi¹, bei dem die Zwischenprodukte der Formel A, B und C verwendet werden, läßt sich - hinsichtlich eines Aspektes - durch das folgende Reaktionsschema darstellen:

(VIIIb)

Schema I

²)Gly-NH-NH₂

R-Trp-Ser(R⁴)-Tyr(R²)Gly-NH-NH₂ (Villa)

Reagenz das in situ Salpetersäure liefert

R-Trp-Ser (R⁴J-TyT(R²)-GIy-N₃ + H-Leu-Arg(N^G-R⁸) -PrO-GIy-NH₂

R-Trp-Ser(R⁴)-Tyr(R²)-Gly-Leu-Arg(N^G-R⁸)-PrO-GIy-NH₂ (XVI)

Abspaltung von Schutzgruppen

p-Giu-His-N, + H-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NHo (XVIa)

Φ 1 '

p-Glu-Hi S-NH-NH₂
(XIXa)

P-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂ (XX)

-7- ■ 4 0981^/1201

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2 4-worin R, R und R die bereits eingangs definierten Bedeutungen

8 3

haben und R hat entweder die gleiche Bedeutung wie R^ oder es bedeutet Wasserstoff (entschütztes Arginin).

Im Reaktionsschema I wird das Tetrapeptid der Formel Villa in das entsprechende Azid der Formel VIIIb umgewandelt, durch Umsetzung mit einem Reagenz, das Salpetrigsaure in situ liefert. Zu geeigneten Reagenzien für diesen Zweck gehören Niedrigalkylnitrit (z.B. tert.-Butylnitrit, Isoamylnitrit) oder ein Alkalimetallnitrit sal ζ (z.B. Natriumnitrit, Kaliumnitrit) in Anwesenheit einer starken Säure, wie Chlorwasserstoffsäure, Phosphorsäure, Schwefelsäure etc. Diese Umsetzung wird in Anwesenheit von Wasser und/oder einem nicht wässrigen Lösungsmittel, wie Dimethylformamid, Tetrahydrofuran, Dioxan, Chloroform, Methylenchlorid, Toluol etc., bei einer Temperatur zwischen etwa -40 C und +20⁰C durchgeführt. Das Azid der Formel VIIIb, das vorzugsweise nicht aus dem Reaktionsmedium isoliert wird, wird dann mit dem Tetrapeptid der Formel XVa gekuppelt, so daß das Octapeptid der Formel XVI gebildet wird. Diese Umsetzung wird zwischen etwa -40°C und +50⁰C, vorzugsweise zwischen etwa -25°C und 1O°C durchgeführt. Ein Säureakzeptor liegt im Reaktionsmedium vor, wenn das Tetrapeptid der Formel XVa in Form seines Säureadditionssalzes (z.B. des Salzes mit HBr, HCl, Essigsäure etc.) in das Reaktionsgefäß gegeben wird, um die freie Base in situ freizusetzen, die mit dem Azid der Formel VIIIb reagiert. Zu geeigneten Säureakzeptoren gehören tertiäre Amine (z.B. Triäthylamin, Pyridin, Chinolin, Dimethylanilin etc.), Alkalimetallcarbonate oder andere auf dem Gebiet bekannte säurebindende Mittel.

Das Octapeptid der Formel XVI wird dann mit einem Abspaltungsmittel umgesetzt, um das entschützte Octapeptid der Formel XVIa als freie Base oder vorzugsweise als Säureadditionssalz zu erhalten. Die Auswahl eines geeigneten Abspaltungsmittels richtet sich nach der Natur der Schutzgruppen. Wenn beispielsweise R

ο eine Benzyloxycarbonylgruppe darstellt, R für Benzyl steht,

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die Nitrogruppe am Arginin ist und am Serin keine Schutzgruppe ist, so beseitigt eine Hydrierung über einem Palladiumkatalysator in Essigsäure alle diese Gruppen. Zu anderen verwendbaren Abspaltungsmitteln gehören HBr in Essigsäure, eine alkoholische lösung von HCl, Natrium in flüssigem Ammoniak, Trifluoressigsäure und andere in der Peptidchemie gut bekannte Mittel. Die Auswahl eines angemessenen Reagenzes zur Entfernung verschiedener gut bekannter Schutzgruppen für oC-Aminoreste und Seitenketten ist von Schröder und Lubke, vgl. obiges Zitat, Seiten 72-74, beschrieben worden, auf diese Literaturstelle wird hier ausdrücklich Bezug genommen. Gewünschtenfalls kann die Entfernung der Schutzgruppen von dem Octapeptid stufenweise.durchgeführt werden, um die of-Ami no gruppe ohne Abspaltung der Seitenkettengruppen zu entfernen, so daß ein Octapeptid der Formel H-Trp-Ser(R²)-Tyr(R⁴)-Gly-Leu-Arg(N^G-R⁸)-Pro-Gly-NH₂ (XVIb) gebildet wird. Dies kann durch Verwendung von Trifluoressigsäure als Abspaltungsmittel erreicht werden, dieses Mittel entfernt nicht die Kitrogruppe am Arginin oder die Benzylgruppe am Tyrosin oder Serin (falls anwesend) sondern spaltet eine -Aminoschutzgruppe, wie tert.-Butyloxycarbonyl ab. Die Seitenketten-Schutzgruppen können danach durch Hydrierung über einem Palladiumkatalysator abgespalten werden, so daß man eine Verbindung der Formel XVIa, vorzugsweise als Säureadditionssalz, erhält. Ein anderes Verfahren ist die Bewahrung der Seitenketten-Schutzgruppen bis zum Zeitpunkt nach der Bildung eines Decapeptides mit der in Formel XX gezeigten Aminosäuresequenz.

Das synthetische Decapeptid LRF (XX) erhält man, wie im Schema I gezeigt, durch Umsetzung des Azides der Formel XIXb mit dem Octapeptid der Formel XVIa bei einer Temperatur zwischen -40⁰C und etwa +50 C in einem wässrigen oder nicht wässrigen Lösungsmittel (z.B. Dimethylformamid, Tetrahydrofuran etc.). Das Azid kann in situ gebildet werden, ohne Isolierung aus dem Reaktionsmedium, durch Umsetzung von 5-Oxoprolylhistidyl-hydrazid (XIXa) mit einem Reagenz, das Salpetrigsaure in situ ergibt, so daß das Azid der Formel XIXb gebildet wird und danach gibt man das

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■"* ji """

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Octapeptid der Formel XVIa zum Reaktionsmedium, um das Decapeptid LRP zu bilden. Die Umwandlung des Hydrazides XIXa in das Azid XIXb kann unter den gleichen Bedingungen und unter Verwendung der gleichen Reagenzien durchgeführt werden, wie es zuvor in Verbindung mit der Bildung des Azides der Formel VIIIb beschrieben worden ist. Ein Säureakzeptor, wie Triäthylamin, befindet sich im Reaktionsmedium, wenn das Octapeptid XVIa in Form eines Säureadditionssalzes vorliegt, um das Octapeptid als freie Base (XVIa) in situ für die Umsetzung mit dem Azid der Formel XIXb freizumachen. Obgleich man es vorzieht, das Azid (XIXb) in situ nach. Umwandlung aus dem entsprechenden Hydrazid (XIXa) umzusetzen, ist es möglich, das Azid als kristalline Verbindung zu isolieren.

Im Schema I sind die bevorzugten Schutzgruppen folgende: Benzyloxycarbonyl (R); Benzyl (R²); Nitro (R⁸).

Anstatt eine Verbindung der Formel XIXb zu verwenden, kann die Herstellung des Decapeptides (XX) so durchgeführt werden, daß man ein Octapeptid (XVIa) mit einer Verbindung der Formel p-Glu-His(N^im-R⁹)-N, (XIXb-1) umsetzt, wo N^im die Stickstoffatome

des Imidazolringes bedeutet und R eine Schutzgruppe für die Imidazolstickstoffatome darstellt, z.B. die Tosyl-, Benzyl-, Trityl-, 2,2,2-Trifluor-i-benzyloxycarbonylatmnoäthyl-- und 2,2,2-Trifluor-1-tert-butyloxycarbonylaminoäthylgruppe, so daß das Decapeptid: p-Glu-Hi s (N^im-R⁹ ) -Trp-S er-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-KHp gebildet wird. Die Schutzgruppe am Histidin kann dann unter Verwendung eines geeigneten Reagenzes, wie Hg/Pd oder unter· Verwendung eines anderen von Schröder und Lubke, oben, auf den Seiten 72-74, beschriebenen Reagenzes entfernt werden. Das Histidin geschützte Dipeptid der Formel XIXb-I erhält man aus dem entsprechenden Hydrazid p-G Iu-Hi s(N^im-R )-NHNH₂.

Anstelle einer Verbindung der Formal XVIa kann auch eine Verbindung der Formel XVIb mit einem Azid der Formel XIXb oder umgesetzt werden, so daß man ein Decapeptid der Formel:

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p-Glu-His-Trp-Ser(R⁴")-Tyr(R²)-Gly-Leu-Arg(N^G-R⁸)-Pro-Gly-NH₂ (XXa) bzw. der Formel p-Glu-His(N^im-R⁹)-Trp-Ser(R⁴)-Tyr(R²)-Gly-Leu-Arg(N^G-R⁸)-PrO-GIy-NH₂ (XXb) erhält. Diese Decapeptide können dann in gleicher Weise, wie vorher schon beschrieben, unter Verwendung eines geeigneten Abspaltungsmittels, entschützt werden, so daß man LRP (XX) erhält.

Die Dipeptide der Formel XIXa können auf verschiedenen Wegen hergestellt werden, einer davon wird durch das folgende Schema veranschaulicht:

XVII
p-Glu-OH

Schema II

Carbonsäuregruppeaktivierendes Reagenz

(XVIIa)

aktiviertes Zwischenprodukt von p-Glu-OH

(XVIII)

H-His-OR

p-Glu-His-OR

10

(XIX)

Hydrazin P-FIu-HiS-NHNH₂ (XIXa)

Gemäß dem vorstehenden Schema wird Pyroglutaminsäure (£,5-0xoprolin) der Formel XVII mit einem Reagenz, das Carboxylgruppen aktiviert, umgesetzt. Geeignete aktivierende Reagenzien sind solche, die in der Peptidchemie dafür bekannt sind, daß sie den Carboxylrest aktivieren. Zu den üblicheren Typen gehören (1) Carbodiimide (z.B. N,N -Dicyclohexylcarbodiimid, N-Äthyl-N -(iT-dimethylaminopropyl-carbodiimid); (2) Cyanamide (z.B.

Ν,Ν-Dibenzylcyanamit); (3) Ketimine; (4) Isoxazoliumsalze (z.B.

1
N-Äthyl-5-phenyl-isoxazalium-3 -sulfonat); (5) monocyclische stickstoffhaltige heterocyclische Amide mit aromatischem Charakter, die 1-4 Stickstoffatome im Ring enthalten, wie Imidazolide, Pyrazolide, 1,2,4-Triazolide. Zu geeigneten spezifischen

1 1

heterocyclischen Amiden gehören H,N -Carbonyldiimidazol, N,N -

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Carbonyl-di-1,2,4-triazol; (6) alkoxyliertes Acetylen (z.B. Äthoxyacetylen); (7) Reagenzien die ein gemischtes Anhydrid mit dem Carboxylteil der Aminosäure bilden (z.B. Äthylchlorformiat, Isobutylchlorformiat) und (8) stickstoffhaltige heterocyclische Verbindungen mit einer Hydroxygruppe an einem Ring Stickstoff (z.B. N-Hydroxyphthalimid, N-Hydroxysuccinimid, 1-Hydroxybenzotriazol). Andere aktivierende Reagenzien und ihre Verwendung bei der Peptidkupplung sind von Schroeder und Lubke oben, in Kapitel III und von Kapoor, J. Phann. Sei., JJ59, Seiten 1-27 (1970), beschrieben worden. Das aktivierte Zwischenprodukt XVIIa wird dann mit einem Carbonsäureester des Histidine (XVIII) bei einer Temperatur zwischen etwa -40⁰C und +20⁰C gekuppelt.

10
Bei der mit R bezeichneten Estergruppe kann es sich um Niedrigalkyl (z.B. Methyl, Äthyl etc.), Benzyl oder durch Nitro oder Methoxy substituiertes Benzyl handeln. Der Ester des Histidins (XVIII) kann im Reaktionsmedium vorliegen während das aktivierte Zwischenprodukt XVIIa aus XVII gebildet wird oder er kann zugegeben werden, nachdem die Pyroglutaminsäure in das aktivierte Zwischenprodukt umgewandelt worden ist, was sich jeweils nach der Wahl der Aktivierung richtet. Die Kupplungsreaktion zur Bildung des Dipeptides (XIX) wird in Anwesenheit eines inerten organischen Lösungsmittels, wie Dimethylformamid,. Chloroform, Dioxan, Toluol, Methylenchlorid etc., durchgeführt. Falls der Histidinester (XVIII) als Säureadditionssalz zum Reaktionsmedium gegeben wird, verwendet man einen Säureakzeptor im Reaktionsmedium, so daß eine freie Base gebildet wird, die mit dem aktivierten Zwischenprodukt XVIIa reagiert. Das durch die Kopplung von XVIIa und XVIII gebildete Dipeptid XIX wird dann durch Umsetzung mit Hydrazin in alkoholischer lösung in das Hydrazid (XIXa) überführt.

Es können auch andere Materialien zur Herstellung des Dipeptides XIXa verwendet werden. Beispielsweise kann man einen N^im geschützten Histidincarbonsäureester anstelle einer Verbindung der Formel XVIII verwenden. Die Schutzgruppe am Imidazolring kann auf übliche Weise abgespalten werden, Nachbildung von

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p-Glu-His(N^llü-R⁹)-NHNH₂, so daß man das Dipeptid XIXa erhält oder die Schutzgruppe kann bis nach der Bildung des Decapeptides beibehalten werden, wie oben bereits erläutert. Ein anderer Weg zur Herstellung des Dipeptides (XIXa) ist die Kopplung des aktivierten Zwischenproduktes (XVIIa) mit His-NHNHR⁶ (XVIIIa-1) oder mit His(N^im-R⁹)-NHNHR⁶ (XVIIIa-2), worin R⁶ eine Schutzgruppe wie QJrityl, tert.-Butyloxycarbonyl oder Benzyloxycarbonyl darstellt, so daß p-Glu-His-NHNHR⁶ (XIXa-1) oder ¹¹¹¹

⁹⁶

, p P

R⁹)-NHNHR⁶ (XIXa-2) gebildet wird und danach erfolgt die Ab-

spaltung der R -Schutzgruppe unter Bildung des Dipeptides XIXa.

Ein anderes Verfahren zur Gewinnung einer Verbindung der Formel XIXa besteht darin, daß man p-Gly-His-OH in der ,von Geiger et al., Biochem. und Biophys. Res, Gomm., A3, 1971, auf Seite 769 (Schema 2), beschriebenen Weise herstellt und dieses Dipeptid durch Veresterung in p-Glu-His-OR (XIX) umwandelt und anschließend mit Hydrazin umsetzt, um das Hydrazid herzustellen.

!tetrapeptide der Formel Villa können auf verschiedenen Wegen hergestellt werden, ein solcher Weg ist unten dargestellt:

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Schema III

(ι)

R-Trp-OH

(V)
R-Tyr-(R²)-OH

Carboxylgruppe aktivierendes Reagenz

aktiviertes Zwischenprodukt von R-Trp-OH

(Ia)

Carboxygruppe aktivierendes Reagenz

(II) H-Ser(R⁴)-OR⁵

aktiviertes
Zwischenprodukt von
R-Tyr(R²)-OH

(VI) + H-GIy-OR'

R-Erp-Ser(R⁴)-OR⁵ (III) R-Tyr(R²)-G Iy-OR⁵

(VII)

R-Irp-Ser(R⁴)-NHNH₀ (IHa)

Salpetrigsäure lieferendes ,,Reagenz

Abspaltung der Schutzgruppe der oc-Aminogruppe

R-Trp-Ser(R⁴)-N₅ (HIb) + H-Tyr(R²)-GIy-OR⁵ · (Vila)

R-Trp-Ser(R⁴)-Tyr(R²)-Gly-0R⁵ (VIII)

!Hydrazin R-Try-Ser(R⁴)-Tyr(R²)-GIy-NHNH₀ (Villa)

In Schema III wird ein an der oc-Aminogruppe geschütztes Tryptophan (i) mit einem Carboxyl aktivierenden Reagenz, bei einer Temperatur zwischen etwa -40⁰G und +20⁰C unter Bildung des aktivierten Zwischenproduktes Ia-aktiviert. Geeignete Aktivierungsreagenzien sind solche wie sie bereits oben in Verbindung mit der Kopplung von p-Glu-0H (XVII) mit His-QR⁵ (XVIII) erwähnt

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worden sind. Ein besonders bevorzugtes Aktivierungsmittel ist Dicyelohexylearbodiimid. Das aktivierte Zwischenprodukt Ia wird mit einem Garbonsäureester des Serins oder einem Carbonsäureester von Hydroxyl geschütztem Serin unter Reaktionsbedingungen gekoppelt, die bereits oben in Verbindung mit Schema II beschrieben worden sind. Das resultierende Dipeptid (III) wird mit Hydrazin in alkoholischer Lösung behandelt, so daß man das entsprechende Hydrazid (IIIa) erhält, diese Umsetzung wird bei einer Temperatur im Bereich von -40⁰C und +50⁰C durchgeführt. Das Hydrazid wird dann mit einem Reagenz umgesetzt, welches Salpetrigsaure liefert, derartige Reagenzien sind bereits oben beschrieben worden, so daß das Azid der Formel IHb gebildet wird. Das Azid kann isoliert werden, es wird jedoch vorzugsweise in situ gebildet und danach wird das Dipeptid der Formel VIIa damit umgesetzt, so daß das Tetrapeptid der Formel VIII gebildet wird. Diese Umsetzung kann bei einer Temperatur zwischen -40⁰C und +20⁰C durchgeführt werden. Dieses Tetrapeptid wird durch Umsetzung mit Hydrazin in alkoholischer Lösung in sein Hydrazid (Villa) umgewandelt.

Das Dipeptid der Formel VII erhält man durch Aktivierung eines oc-Amino- und Hydroxyl geschützten Tyrosins (V) mit einem Carboxylgruppen aktivierenden Reagenz. Ein Reagenz, das ein gemischtes Anhydrid bildet, wie Isobutylchlorformiat, hat sich als besonders geeignet für die Aktivierung erwiesen. Das aktivierte Zwischenprodukt V(a) reagiert dann mit einem Carbonsäureester des Glycins unter geeigneten Kopplungsbedingungen, was eine Temperatur zwischen etwa -40⁰C und +20⁰C einschließt, so daß das Dipeptid der Formel VII gebildet wird. Die oC-Amino-Schutzgruppe am Tyrosin wird dann unter Bildung des Dipeptides Vila abgespalten. Wenn es sich bei der Oi-Amino-Schutzgruppe um tert.-Butyloxycarbonyl handelt, kann sie unter Verwendung von Trifluoressigsäure ohne Abspaltung einer Hydroxyl-Schutzgruppe, wie Benzyl oder Tosyl, abgespalten werden. Die Wahl der OG-Amino- und Hydroxy 1-Schutzgruppe ist nicht entscheidend, diese Gruppen sollten jedoch so gewählt werden, daß die oC-Amino-

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Schutzgruppe unter Bedingungen und unter Verwendung von Reagen-

p zien abgespalten werden kann, die nicht die R -Gruppe am Tyrosin abspalten. Andere übliche Abspaltungsmittel sind von Schroeder und Lubke, siehe oben, Seiten 72-74, beschrieben worden.

Bs sind zahlreiche Modifikationen bei der Synthese des Tetrapeptides der Formel Villa, die in Schema III veranschaulicht ist, möglich. Beispielsweise kann das aktivierte Zwischenprodukt Ia mit einer Verbindung der Formel Ser-NHNH-R gekoppelt werden, so daß man R-Trp-Ser-NHNH-R (IHb) erhält. Die R -Gruppe kann unter Bedingungen abgespalten werden, unter denen dieoC-Amino-Schutzgruppe am Tryptophan nicht abgespalten wird, so daß man das Hydrazid der Formel IHa erhält. Wenn daher R für Benzyloxycarbonyl steht, kann R Trityl oder tert.-Butyloxycarbonyl darstellen, diese beiden letzteren Gruppen werden durch Trifluoressigsäure abgespalten, während die Benzyloxycarbonylgruppe gegenüber diesem Reagenz stabil ist. Eine andere Alternative für die Synthese des Tetrapeptides Villa ist die, den Carbonsäureester des Glycins durch GIy-NHKH-R (VIa) zu ersetzen und dieses geschützte Hydrazid mit dem aktivierten Zwischenprodukt Va zu koppeln, so daß man R-Tyr(R²)-Giy-NHNH-R (VIIb) erhält, das dann behandelt wird, um R abzuspalten ohne Abspaltung von

2 6
R und R . Dies kann erreicht werden, wenn R die tert.-Butyloxycarbonylgruppe darstellt, R für Benzyl steht und R Tosyl bedeutet und als Abspaltungsmittel Trifluoressigsäure verwendet wird. Das resultierende. Dipeptid Tyr(R )-GIy-NHNH-R (VIIc) wird dann mit dem Dipeptid der Formel IHa gekoppelt,

2 6

so daß man das Tetrapeptid R-Trp-Ser-Tyr(R)-GIy-NHNH-R (VIIIc) erhält, das dann in ein Tetrapeptid der Formel Villa überführt wird, indem man R in der oben beschriebenen Weise abspaltet. Auf den vorstehend beschriebenen alternativen Wegen können die gleichen Carboxylgruppen-aktivierenden Reagenzien verwendet werden, wie sie in Verbindung mit den Schemata II und III verwendet wurden.

Das Tetrapeptid der Formel XVa kann auf folgendem Wege hergestellt werden:

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Schema IY

(ix) ,

R-Arg(N^G-R³)-OH

Carboxylgruppe aktivierendes Reagenz

aktiviertes Zwischenprodukt von , R-Arg(N&-R^;')-0H

(IXa)

(X) _p

H-Pro-OR⁵

R-Arg&^-R^-Pro-OR⁵ (Xl)

Abspaltung der oc-Amino-,gruppe

(XIa) H-Arg(N^G-R⁵)-Pro-OR⁵

(XIII) R-Leu-Arg(N -RO-Pro-OR³

Abspaltung von

r5 durch Hydrolyse ■

R-Leu-Arg(N^G-R³)-Pro-OH (XIIIa)

Nl/

Carboxylgruppe aktivierendes Reagenz

aktiviertes Zwischenprodukt

von

AHP-5870

R-Leu-OH

(XII)

Carboxylgruppe

aktivierendes

Reagenz

aktiviertes
Zwischenprodukt von
R-Leu-OH

(XIIa)

(XIIIb) + H-GIy-KH₂ (XIV)

R-Leu-Arg(N^G-R³J-PrO-GIy-HH₉ (XV)

Abspaltung der oC-Amino-Schutzgruppe und gegebenenfalls des Restes R^

H-Leu-Arg(N^G-R⁸)-Pro-Gly-NH,

(XVa)

- 17 -

AHP-5870

In Schema IV wird eine Verbindung der Formel IX mit einem geeigneten Carboxylgruppen aktivierenden Reagenz, für das oben bereits Vertreter genannt worden sind, aktiviert, so daß man das aktivierte Zwischenprodukt IXa erhält, das nicht isoliert wird. Dieses Zwischenprodukt wird mit einem Carbonsäureester des Prolins (X) bei einer Temperatur zwischen etwa -40 C und +20⁰C unter Bildung eines Dipeptides der Formel XI umgesetzt.

3
Eine besonders geeignete R -Schutzgruppe ist die Nitrogruppe und R ist eine oc-Amino-Schutzgruppe, die ohne Abspaltung der R -Gruppe abgespalten werden kann. Das Dipeptid der Formel XI wird dann mit einem geeigneten Reagenz zur Abspaltung der Schutzgruppe an der (X-Amino gruppe, z.B. mit HBr in Essigsäure, behandelt, dabei erhält man ein HBr-SaIz des H-Arg(ir-R )-Pro-

5
OR der Formel XIa. Dieses Dipeptid wird mit einem an der Carboxylgruppe aktivierten Zwischenprodukt des oC-Amino geschützten Leucins (XIIa) bei einer Temperatur zwischen etwa —40 C und +20⁰C umgesetzt, dabei erhält man ein Tripeptid der Formel XIII. Dieses Tripeptid wird behandelt, um die Estergruppe abzuspalten, z.B. durch alkalische Hydrolyse, dabei erhält man die entsprechende Säure der Formel XIIIa. Zu Beispielen für geeignete Reagenzien gehören methanolisches oder äthanolisches Natriumhydroxyd oder Kaliumhydroxyd; wässrige organische Gemische, wie Methanol/ Wasser, Aceton/Wasser; Dioxan/wässriges Natriumhydroxyd. Die alkalische Hydrolyse wird normalerweise bei Raumtemperatur durchgeführt, jedoch können Temperaturen von sogar 40⁰C angewendet werden. Saure Hydrolyse kann ebenfalls zur Abspaltung der Esterfunktion angewendet werden. Bestimmte Estergruppen, wie Benzylester, kann man auch mit Hilfe der katalytischen Hydrierung abspalten, in einem solchen Falle sollte jedoch die

für das Leucin gewählte OC-Amino-Schutzgruppe und die N -Schutzgruppe am Arginin unter den Hydrierungsbedingungen stabil sein. Das Tripeptid der Formel XIIIa wird dann mit einem Carboxylgruppeaktivierenden Reagenz unter Bildung des aktivierten Zwischenproduktes XIIIb umgesetzt, das seinerseits mit Glycinamid unter Bildung des Tetrapeptides der Formel XV umgesetzt wird. Das Glycinamid ist im Reaktionsmedium vorzugsweise als Säureadditions-

40981 4/120 1 - 18 -

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salz enthalten, da es in einer solchen Form stabiler ist, und es wird durch Mitverwendung eines Säureakzeptors der bereits oben beschriebenen Art im Reaktionsmedium in situ in die freie Base überführt. Dieses. Tetrapeptid wird dann mit einem Standard-Abspaltungsmittel zur Entfernung der cx^-Amino-Schutzgruppe am leucin behandelt, mit oder ohne Entfernung der Schutzgruppe am N des Arginine. Wenn es sich bei der oC-Amino-Schutzgruppe um eine Benzyloxycarbonylgruppe handelt und die Nitrogruppe die Schutzgruppe am Arginin ist, so ist HBr in Essigsäure ein Abspaltungsmittel, das die oC-Amino-Schutzgruppe aber nicht die Nitrogruppe entfernt. Ähnlich ist es, wenn R die tert.-Butyloxycarbonylgruppe und R die Tosylgruppe darstellen, dann können als Abspaltungsmittel HBr in Essigsäure, Trifluoressigsäure oder alkoholische HCl-Lösung verwendet werden, keines dieser Reagenzien spaltet die Tosylgruppe ab. Wenn R die Tri-

3
tylgruppe und R die Nitro- oder Tosylgruppe darstellt, sind Eisessig oder wässrige Essigsäure geeignete Abspaltungsmittel für die Abspaltung des Tritylrestes. Palis man die oC-Amino- und Arginin-Schutzgruppen abspalten möchte, ist für diesen Zweck eine Hydrierung über einem Palladiumkatalysator in Essigsäure geeignet. Das Tetrapeptid, das durch Entfernung der of-Amino-Sohutzgruppe am Leucin erhalten wird, wird vorzugsweise in Form eines Säureadditionssalzes, im allgemeinen als Bromid, Chlorid, Trifluoracetat oder als Acetatsalz, gewonnen.

In Schema IV sind zahlreiche Modifizierungen der Synthese des Tetrapeptides der !Formel XVa möglich. Beispielweise kann das aktivierte Zwischenprodukt der Formel IX mit Pro-NHNHR gekoppelt werden, wobei man R-Arg(N-R⁵)-Prο-NHNH-R erhält und anschließend kann R abgespalten werden, ohne Abspaltung von R , z.B. durch Verwendung von Trifluoressigsäure (z.B. steht R

3 für Benzyl oxy carbonyl, R für tert.-Butyloxycarbonyl und R für Tosyl). Das resultierende Dipeptid H-Arg(N -R )-Pro-NHNH-R wird gewonnen, vorzugsweise als Säureadditionssalz. Dieses Dipeptid wird dann in Anwesenheit eines Säureakzeptors mit dem aktivierten Zwischenprodukt XIIa gekoppelt, dabei erhält man

_ ₁₉ _ 4098 1Ul 120 1

R-Leu-Arg(N^G-R⁵)-Pro-NHNH-R⁶, worin R für die tert.-Butyloxycarbonylgruppe steht. Danach wird die R -Gruppe abgespalten,

3 dabei verwendet man ein Reagenz, demgegenüber die R und R Schutzgruppen stabil sind, wie Wasserstoff in Anwesenheit von Pd auf Kohle, was zur Abspaltung der Benzyloxycarbonyl-Schutzgruppe führt, nicht aber zur Absapltung des tert.-Butyloxycarbonylrestes (R) oder des Tosylrestes (R ). Eine weitere Modifizierung des Schemas IV ist die Verwendung eines Carbon-

5 säureesters des Glycins der Formel GIy-OR anstelle des Glycinamides und dessen Umsetzung mit dem aktivierten Zwischenprodukt der Formel XIIIb, wobei man R-Leu-Arg(N^G-R⁵)-Pro-GIy-OR⁵ erhält, das dann entweder (1) in Leu-Arg-(K^G-R⁵)-Pro-Gly-OR⁵ überführt wird durch Abspaltung deroGAmino-Schutzgruppe, wie bereits oben beschrieben, und anschließende Umwandlung des Esters (OR ) in das C-beendete Amid (Formel XVa), indem man den Ester mit Ammoniak in alkoholischer Lösung zwischen etwa O⁰C und Raumtemperatur behandelt oder den Ester zur freien Säure verseift und anschließend das gemischte Anhydrid bildet, das wiederum mit Ammoniak unter Bildung des C-beendeten Amides der Formel XVa umgesetzt wird; oder (2) einer Umkehrung der gerade beschriebenen Stufenfolge unterworfen wird, indem man zuerst das R-Leu-Arg(N^&-R⁵)-Pro-Gly-OR⁵ in das C-beendete Amid R-Leu-Arg(N^G-R⁵)-PrO-GIy-NH₂ (XV) überführt und dann die o^-Amino-Schutzgruppe abspaltet, so daß man eine Verbindung der Formel XVa erhält. Die Benutzung des Glycinamides ist jedoch gegenüber der Verwendung eines Carbonsäureesters des Glycins bevorzugt, da die Behandlung eines C-beendeten Esters mit Ammoniak in Alkohol, um diesen in das C-beendete Amid zu überführen, zur Aufspaltung der Prolin-Glycin-Bindung oder zu anderen Nebenreaktionen führen kann.

Die folgenden Beispiele dienen zur Veranschaulichung des bevorzugten Verfahrens zur Herstellung von synthetischem LRF und der Zwischenprodukte für diese Synthese.

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Beispiel 1 I)-(5-Oxoprolyl)-L-histidin-methylester

L-5-Oxoprolin (13 g, 0,1 Mol) und L-Histidin-methylester-dihydrochlorid (22,8 g, 0,1 Mol) werden in Dimethylformamid (200 ml) suspendiert. Man behandelt die Mischung mit Triathylamin (27 ml, 0,2 Mol) und kühlt auf -5⁰C, dann gibt man Dicyclohexylcarbodiimid (20,6 g, 0,1 Mol) hinzu und rührt die Mischung 2 Stunden lang bei -5 C und über Nacht bei Raumtemperatur. Der sich abscheidende Dicyclohexylharnstoff wird abfiltriert und das Piltrat wird zur Trockene eingedampft. Man verreibt den Rückstand mit Wasser und filtriert die unlösliche Pestsubstanz ab. Das Piltrat wird zur Trockene eingedampft und der Rückstand wird zweimal mit absolutem Äthanol getrocknet. Der ölige Rückstand kristallisiert aus absolutem Äthanol und ergibt den in der Überschrift bezeichneten Dipeptid-methylester, 13g (45%), Pp = 198 - 1.99⁰C; /⁶^² = -4,3 (c= 1, Methanol); R_f (n-Butanol/ Wasser/Essigsäure = 4:1:1) = 0,30; R_f (n-Butanol/Wasser/Essigsäure/Pyridin = 30:24:6:20) =0,50; ein einziger Fleck mit Pauly- und Jg-Reagenzien.

Analyse berechnet.für C₁₂H₁₆F.O.(280,28):

C 51,42, H 5,75, N 19,'

Gef.: C 51,34, H 6,04, N 20,12#

Beispiel 2 L-(5-0xoprolyl)-L-histidyl-hydrazid

Der L-(5-0xoprolyl)-L-histidin-methylester des Beispieles 1 (10 g, 0,036 Mol) wird in Methanol (150 ml) gelöst und mit 99#igem Hydrazinhydrat (8 ml) bei -10⁰C eine Stunde lang und dann bei Raumtemperatur über Nacht behandelt. Die sich abscheidende weiße Festsubstanz wird filtriert, mit Methanol und dann mit Äther gewaschen. Umkristallisation aus Wasser/Äthanol ergibt das in der Überschrift genannte Dipeptid-hydrazid, 8,8 g (88$), umkristallisation aus Wasser/Äthanol /78947, Pp = 241,5 - 242⁰C;

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^ = -14,50 (c = 1, H₂O); R_f (n-Butanol/Wasser/Essigaäure = 4:1:1) = 0,05; R_f (n-Butanol/Wasser/Essigsäure/Pyridin = 30:24: 6:20) = 0,10; ein einziger Fleck mit Pauly- und Jp-Reagenz.

Beispiel 3 N-Benzyloxycarbonyl-L-tryptophyl-L-serin-methylester

N-Benzyloxycarbonyl-L-tryptophan (24,5 g, 0,0725 Mol) wird in Dimethylformamid (200 ml) gelöst und mit L-Serin-methylester·¹-hydrochlorid (11,25 g, 0,073 Mol) vermischt, dann auf -15°C abgekühlt und mit Triäthylamin (10 ml, 0,073 Mol) und anschließend mit Dicyclohexylcarbodiimid (H₁9 g, 0,073 Mol) behandelt. Die .Reaktionsmischung wird eine Stunde lang bei -10⁰C und dann bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Der sich abscheidende Dicyclohexylharnstoff wird abfiltriert und das Filtrat wird zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wird in Äthylacetat aufgenommen, mit 5%igem wässrigem KHSO., Wasser, gesättigter wässriger NaHCO,-Lösung und Wasser gewaschen und schließlich über Natriumsulfat getrocknet. Beim Eindampfen zur Trockene erhält man einen Schaum, der beim Verreiben mit Äthylacetat kristallisiert und den in der Überschrift genannten Dipepüdester ergibt. Bei einer anderen Herstellung wird der Rückstand aus Äthylacetat /Pent an kristallisiert, man erhält 26,8 g (84$), Fp = HO - HI⁰C; Rf (Chloroform/Methanol = 10:1) = 0,55J ein einziger Fleck mit ^

Beispiel 4 N-Benzyloxycarbonyl-L-tryptophyl-L-seryl-hydrazid

Der N-Benzyloxycarbonyl-L-tryptophyl-L-serin-methylester des Beispieles 3 (43,9 g, 0,1 Mol) wird in Dimethylformamid (200 ml) und Methanol (400 ml) gelöst und mit Hydrazinhydrat (85 ml) über Nacht behandelt. Der größte -Teil des Methanoles wird im Vakuum entfernt und man behandelt den Rückstand mit 1,5 Volumina Wasser, dabei erhält man die in der Überschrift genannte kristalline Verbindung, 39 g (89#), I¹P = 187 - 188⁰C; R_f (Ohloro-

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form/Methanol = 10:1) = 0,00; R_f (n-Butanol/Wasser/Essigsäure = 4:1:1) = 0,75» R_f (n-Butanol/Wasser/Essigsäure/Pyridin = 30:24: 6:20) = 0,70; R_f (n-Butanol/Wasser/Pyridin = 3:1,5:2) = O,75i einzelner Fleck mit J₂- und Erlich-Reagenz.

Beispiel 5 N-tert.-Butyloxycarbonyl-O-benzyl-L-tyrosylglycin-äthylester

N-tert.-Butyloxycarbonyl-O-benzyl-L-tyrosin (37,5 g, 0,1 Mol) wird in Tetrahydrofuran (200 ml) gelöst und auf -15⁰C abgekühlt, dann gibt man N-Methylmorpholin (11 ml, 0,1 Mol) hinzu und · anschließend Isobutylchlorformiat (13,4 ml, 0,1 Mol). Es bildet sich ein weißer Niederschlag aus N-Methylmorpholinhydrochlorid nach ungefähr 1 Minute. Man rührt die Reaktionsmischung 5 Minuten lang, dann gibt man eine Lösung von Glycinäthylester-hydrochlorid (14 g, 0,1 Mol) und N-Methylmorpholin (11 ml) in Dimethylformamid (100 ml) hinzu und läßt die Mischung über Nacht Raumtemperatur erreichen.

Das Lösungsmittel wird im Vakuum abgedampft und der Rückstand in Äthylacetat/n-Butanol (1:2) aufgenommen und mit 5$igem wässrigem KHSO., Wasser (Salzlösung), 5%igem Na₂CO, oder NaHCO,, Wasser (Salzlösung) gewaschen und über Na₂SO. getrocknet.

Bei einer anderen Herstellung wird der Rückstand nach dem Verdampfen des Lösungsmittels mit Wasser verrieben und die kristalline Festsubstanz filtriert und auf dem Filter, wie oben gewaschen. In beiden Fällen wird das feste Produkt aus Chloroform/Hexan umkristallisiert, dabei erhält man den in der Überschrift genannten Dipeptidester, 44 g (96,5$), Fp = 130-132⁰C; R_f (Äthylacetat/Heptan = 1:1) «0,50; R_f (Chloroform/Methanol =25:1) = 0,90.

Beispiel 6 O-Benzyl-L-tyrosyl-glycinäthylester-trifluoracetat

Der N-tert.-Butyloxycarbonyl-O-benzyl-L-tyrosyl-glycinäthylester

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des Beispieles 5 (20 g, 0,044 Mol) wird in Trifluoressigsäure (200 ml) während der ersten 10 Minuten in einem Eisbad und dann 50 Minuten lang bei Raumtemperatur gelöst, danach entfernt man die überschüssige Trifluoressigsäure im Vakuum bei 25-3O⁰C. Der ölige Rückstand wird zweimal mit etwas trockenem Äther eingedampft und ergibt eine ölige Verbindung. Dieses Material ist in Äther ziemlich löslich, fällt aber aus Hexan aus, die Ausbeute ist quantitativ; R_f (Chloroform/Methanol/Essigsäure = 85:10:5) = 0,50; R_f (Chloroform/Methanol, 10:1) = 0,70.

Beispiel 7

N-Benzyloxycarbonyl-L-tryptophyl-L-seryl-O-benzyl-L-tyrosylglycinäthylester

Das N-Benzyloxycarbonyl-L-tryptophyl-L-seryl-hydrazid des Beispieles 4 (22 g, 0,05 Mol) wird in Dimethylformamid (200 ml) gelöst und auf -30⁰C abgekühlt, dann gibt man 3 η HCl/Tetrahydrofuran (50 ml, 0,15 Mol) hinzu (falls das Hydrazid aus der Lösung ausfällt oder sich nicht auflöst bringt es die Chlorwasserstoffsäure in Lösung). Man gibt tert.-Butylnitrit (7 ml, 0,06 Mol) hinzu und rührt die Lösung bei -30⁰C 15-20 Minuten lang, dann gibt man Triäthylamin (34 ml, 0,25 Mol) hinzu und behandelt die kalte Mischung mit einer Lösung von O-Benzyl-L-tyrosyl-glycinäthylester-trifluoracetat (harziges Material aus 0,05 Mol des geschützten Dipeptides des Beispieles 6) in Dimethylformamid (100 ml). Der pH der Lösung wird mit Triäthylamin bei etwa 8 gehalten und die Reaktionsmischung wird bei -25⁰C 2 Stunden lang gerührt, dann läßt man sie bei -10⁰C 24 Stunden lang und bei O⁰C 48 Stunden lang stehen, danach wird das abgeschiedene Triäthylaminhydrochloridsalz filtriert und das Filtrat zur Trockene eingedampft.

Der harzige Rückstand wird mit Wasser verrieben und ergibt eine Pestsubstanz, die auf dem Filter mit 1n Chlorwasserstoffsäure, Wasser, gesättigter NaHCO,-Lösung und Wasser gewaschen und anschließend getrocknet wird. Die Festsubstanz wird mit siedendem

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Methanol digeriert und filtriert und ergibt das in der Überschrift genannte Tetrapeptid, 30 g (77%). Das Tetrapeptid kann weiter gereinigt werden durch Umkristallisation aus Dimethylformamid/Wasser, Pp = 194 - 195°C; R_f (Chloroform/Methanol = 10:1) = 0,70; R- (n-Butanol/Wasser/Essigsäure = 4:1:1) = 0,90.

Beispiel 8

N-Benzyloxycarbonyl-L-tryptophyl-L-seryl-O-benzyl-l-tyrosylglycyl-hydrazid

Der N-Benzyloxycarbonyl-L-tryptophyl-L-seryl-O-benzyl-L-tyrosylglycinäthylester (1,3 g, 1,7 mMol) des Beispieles 7 wird in einer Mischung aus Methanol/Dimethy!formamid (2:1) (50 ml) aufgelöst und mit 99%igem Hydrazinhydrat (2 ml) bei Raumtemperatur über Nacht behandelt. Es scheidet sich eine weiße Festsubstanz ab, die filtriert wird, das Piltrat wird auf die Hälfte des Volumens eingeengt und mit 1 Volumen Wasser verdünnt. Die sich abscheidene Festsubstanz wird filtriert und mit der vorhergehenden Substanz vereinigt (langsam filtrieren). Ausbeute = 1 g (85$), ^¹P = 248 - 25O⁰C; R_f (n-Butanol/Wasser/ Essigsäure = 4:1:1) = 0,5; R-_f (n-Butanol/Wasser/Essigsäure/ Pyridin = 30:24:6:20) = 0,7.

Beispiel 9 N-Benzyloxycarbonyl-N -nitro-L-arginyl-L-prolin-methylester

N-Benzyloxycarbonyl-N -nitro-L-arginin (35,3 g, 0,1 Mol) wird in 1Obigem Dimethylformamid in Dichlormethan (ca. 150 ml) gelöst und auf -15°C abgekühlt, dann gibt man N-Methyl-morpholin (11,1 ml, 0,1 Mol) und anschließend Isobutylchlorformiat (13,4 ml, 0,1 Mol) hinzu, wobei die Mischung kalt gehalten wird. Nach 5 Minuten gibt man eine kalte Lösung von L-Prolin-methylesterhydrochlorid (16,5 g, 0,1 Mol) und Triäthylamin (13,6 ml, 0,1 Mol) in Dimethylformamid hinzu. Man bringt die Temperatur auf O⁰C und hält dort 1 Stunde lang, dann läßt man auf Raumtemperatur kommen und bleibt 18 Stunden bei dieser Temperatur.

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Man filtriert die Mischung und engt das Filtrat unter vermindertem Druck bei 3O⁰C ein. Den Rückstand nimmt man in 1:1 Äthylacetat/n-Butanol auf, gewaschen wird mit 5$ KHSO., Wasser, wässrigem NaHCO, und Salzlösung. Die organische Phase wird über Na₂SO. getrocknet, filtriert und im Vakuum eingeengt bis eine üPestzustanz auszufallen beginnt. Man kühlt die Lösung auf O⁰C und läßt 18 Stunden lang stehen, dann filtriert man die abgeschiedene kristalline Verbindung ab. Die Ausbeute der in der Überschrift genannten Verbindung beträgt 16,3 g (35$). Beim weiteren Einengen der Mutterlauge wird eine zweite Fraktion erhalten, 18,7 g (4(#), Pp = 154 - 156⁰C; faj^ = -46,7 (c = 0,5, Methanol); R_f (Chloroform/Methanol = 9:1) = 0,6.

Beispiel 10 N -Nitro-L-arginyl-L-prolin-methylester-hydrobromid

Der N-Benzyloxycarbonyl-N -nitro-L-arginyl-L-prolin-methylester (16,3 g, 25,1 mMol) des Beispieles 9 wird mit 30% Bromwasserstoff säure in Eisessig (50 ml) eine Stunde lang bei Raumtemperatur behandelt. Man gibt trockenen Äther (ca. 500 ml) hinzu und erhält dabei eine blaßgelbe sehr hygroskopische Pestsubstanz. Das Produkt wird wegen seiner sehr hygroskopischen Natur nicht weiter charakterisiert. Man trocknet es im Vakuum über KOH und verwendet es für die nächste Reaktion.

Beispiel 11

N-Benj
ester

ΛΙ

N-Benzyloxycarbonyl-L-leucyl-N -nitro-L-arginyl-L-prolin-methyl-

N-Benzyloxycarbonyl-L-leucin (8,84 g, 33,4 mMol) wird in Tetrahydrofuran (100 ml) gelöst und auf -15°C abgekühlt. Man gibt N-Methylmorpholin (3,73 ml, 33,3 mMol) und anschließend Isobutylchlorformiat (4,36 ml, 33,3 mMol) hinzu. Nach 5 Minuten bei -15 C gibt man eine Lösung von N -Nitro-L-arginyl-L-prolin— methylester-hydrobromid aus Beispiel 10 in Dimethylformamid, mit Triäthylamin auf pH 7,5 eingestellt, hinzu (während der

409814/1201 - 26 -

23i7151

Neutralisierung wird die Lösung "bei O⁰G gehalten). Man hält die Reaktionsmischung 1 Stunde lang bei 0 C, läßt dann langsam auf Raumtemperatur ansteigen und "bleibt 18 Stunden lang "bei dieser Temperatur, danach wird das Lösungsmittel im Vakuum bei 30⁰C entfernt. Man nimmt den Rückstand in Äthylacetat/n-Butanol, 2:1, auf und wäscht mit 5$igem KHSO,, Wasser, wässrigem KHCO, und Salzlösung. Die organische Phase wird über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und unter vermindertem Druck bei 30 C eingeengt. Das resultierende Harz wird in Äthylacetat aufgenommen und mit Äther ausgefällt. Man erhält eine weiße Festsubstanz des oben bezeichneten Produktes, 13,11 g (68$), Fp = 93 - 96°C; [oc]?5 = -50,46 (c = 0,34, Methanol); R_f (Chloroform/Methanol = 9:1) = 0,70.

Beispiel 12 N-Benzyloxycarbonyl-L-leucyl-N -nitro-L-arginyl-L-prolin

Der N-Benzyloxycarbonyl-L-leueycl-N -nitro-L-arginyl-L-prolinmethylester (13 g, 23 mMol) des Beispieles 11 wird in 1:1 Dioxan/n-Natriumhydroxyd (50 ml) gelöst und 2 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Das Dünnschichtchromatograimn zeigt kein vorhandenes Ausgangsmaterial. Die Lösung wird mit 1,5 η Chlorwasserstoffsäure auf pH 6,5 eingestellt und im Vakuum bei 30⁰C auf ein kleines Volumen eingeengt. Den Rückstand verdünnt man mit Wasser (ca. 200 ml) und kühlt ihn auf O⁰C ab, säuert dann mit 1,5 η Chlorwasserstoffsäure auf pH 3. Die auskristallsierende weiße Festsubstanz wird isoliert und mit

nc

kaltem Wasser gewaschen, Ausbeutet 1,8 g (92$); !&]-£ - -54,84 (c = 1, Methanol); R- (n-Butanol/Wasser/Essigsäure/Pyridin = 30:24:6:20) = 0,70.

Beispiel 13

N-Benzyloxj
glycinamid

N-Benzyloxycarbonyl-L-leucyl-N -nitro-L-arginyl-L-prolyl-

Das N-Benzyloxycarbonyl-L-leucyl-N -nitro-L-arginyl-L-prolin (5,64 g, 10 mMol) des Beispieles 12 wird in Tetrahydrofuran

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AHP-5870

23*7151

(ca. 50 ml) aufgelöst und auf -15°C abgekühlt. Dann gibt man N-Methylmorpholin (1,12 ml, 10 mMol) und anschließend Isobutylchlorformiat (1,31 ml, 10 mMol) hinzu. Nach 5 Minuten "bei -16⁰C wird eine kalte Mischung aus Glycinamid-hydrochlorid (2,11 g, .20 mMol) und Triäthylamin (2,78 ml, 20 mMol) in Dimethylformamid hinzugegeben. Man hält die Temperatur 1 Stunde lang bei 0°, läßt dann auf Raumtemperatur kommen und bleibt 18 Stunden bei diesem Wert.

Man filtriert die Reaktionsmischung und engt im Vakuum bei 30 ein, nimmt den Rückstand in Äthylacetat/n-Butanol 1:1 auf und wäscht mit 5% KHSO., Wasser, wässrigem KHCO., und Salzlösung. Die organische Phase wird über Na₂SO, getrocknet, filtriert und unter vermindertem Druck bei 3O⁰C zu einem Harz eingeengt. Dieses Harz wird in Äthanol (ca. 20 ml) aufgenommen, filtriert und eine weiße Festsubstanz, bei der es sich um die in der Überschrift genannte Verbindung handelt, fällt mit Äther aus. 5,85 g (94/0, Μψ = -46,37 (c = 1, Methanol); R_f (Chloroform/Methanol = 9:1) = 0,26.

Beispiel 14

L-Leucyl-N -nitro-L-arginyl-L-prolyl-glyciriamid-hydrobromid

Λ!

Das N-Benzyloxycarbonyl-L-leucyl-N -nitro-L-arginyl-L-prolylglycinamid (2g, 3,24 mMol) des Beispieles 13 wird mit wasserfreier HBr in Essigsäure 30$ (50 g) 5 Minuten lang in einem Eisbad und dann 1 Stunde lang bei Raumtemperatur behandelt. Man gibt einen Überschuß an über Natrium getrocknetem Äther hinzu und erhält einen weißen, sehr hygroskopischen festen Niederschlag, der abfiltriert und im Vakuum über ^₂ ⁰S ^¹¹¹⁰- ^Na0H getrocknet wird; R- (n-Butanol/Wasser/Essigsäure =4:1:1) = 0,20; R_f (n-Butanol/Wasser/Essigsäure/Pyridin = 30:24:6:.20) = 0,75.

Beispiel 15

N-Benzyloxycarbonyl-L-tryptophyl-L-seryl-O-benzyl-L-tyrosyl-

-arginyl-L-prol.ylrgylcinamid

-28- 4098U/1201

glycyl-L-leuoyl-Hfr-nltro-L-arginyl-L-prolyl-gylcinamid

AiIP-5870

Das N-Benzyloxycarbonyl-L-tryptophyl-L-seryl-O-benzyl-L-tyrosylglycyl-hydrazid (749 mg, 1 mMol) des Beispieles 8 wird in Dimethylformamid (75 ml) aufgelöst und auf -20⁰C in einem Trockeneis/Acetonbad abgekühlt. Man gibt 3 Äquivalente 3n Hcl/Tetrahydrofuran (1 ml, 3 mMol) und anschließend 1,5 Äquivalente Isoamylnitrit (0,266 ml) hinzu. Die Reaktionsmischung wird bei -20⁰C 15 Minuten lang gerührt, dann wird sie mit Triäthylamin (0,55 ml, 4 mMol) behandelt. Zu dieser Lösung des Tetrapeptidazides gibt man eine Lösung von L-Leucyl-N -nitro-L-arginyl-L-prolyl-glycinamid-hydrobromid des Beispieles 14 (570 mg, 1 mMol) in Dimethylformamid (20 ml) und Triethylamin (0,22 ml, 1,5 mMol). Die Mischung wird 2 Stunden lang bei -20⁰C gerührt, dann läßi; man sie 3 Tage lang bei 0 - 5⁰C stehen. Man verdampft das Lösungsmittel im Vakuum bei 30⁰C und verreibt den Rückstand mit überschüssigem Wasser. Es fällt eine Festsubstanzaus, die abfiltriert, sorgfältig auf dem Filter mit 1 η HCl und Wasser gewaschen und schließlich getrocknet wird. Die Pestsubstanz wird dann aus Methanol/Äthylacetat/Äther ausgefällt. Ausbeute 600 mg (50$) von dem in der Überschrift genannten Produkt, Erweichung bei 150⁰C, schmilzt bei 170⁰C unter Zersetzung; R_f (n-Butanol/Wasser/Essigsäure =4:1:1) = 0,7; R_f (n-ButancO/Wasser/Essigsäure/Pyridin = 3Oi24:6:20) = 0,9.

Beispiel 16

L-Tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-glycyl-L-leucyl-L-arginyl-L-prolyl-glycinamid-diacetat (XVII)

Das N-Benzyloxycarbonyl-L-tryptophyl-L-seryl-O-benzyl-L-tyrosylglyeyl-L-leucyl-N -nitro-L-arginyl-L-prolyl-glycinamid des Beispieles 15 (500 mg, 0,42 mMol) werden in einer Mischung aus Methanol/Eisessig/Wasser (1:1:1, 60 ml) gelöst und in Anwesenheit von % Pd auf Kohle (100 mg) 20 Stunden lang hydriert. Man filtriert den Katalysator ab und dampft das Filtrat zur Trockene ein (es ist darauf zu achten, daß längere Lufteinwirkung vermieden wird, um eine Oxydation des Tryptophane zu vermeiden). Der Rückstand wird zweimal mit absolutem Äthanol getrocknet und

409Ö U/1 20 1 - 29 -

AHP-5870

dann in etwas absolutem Äthanol aufgenommen, mit trockenem Äther ausgefällt und man erhält eine hygroskopische Festsubstanz in einer Ausbeute von 382 mg (86$); R~ (n-Butanol/Wasser/Essigsäure/ Pyridin = 30:24:6:20) = 0,7; Ninhydrin-, Sakaguchi- und Erlich-Reagenz ergeben einen einzigen positiven Fleck; Cellulosplatten R_f (n-Butanol/Wasser/Essigsäure = 4:1:1) = 0,3; Ninhydrin-, Sakaguchi- und Erlich-Reagenz ergeben einen positiven Fleck; Celluloseplatten R- (n-Butanol/Wasser/Essigsäure/Pyridin = 30:24:6:20) = 0,90; Ninhydrin-, Sakaguchi- und Erlich-Reagenz ergeben positiven. Fleck.

Amino säureanalys e Trp Ser Pro GIy Leu Ber.: 1112 1
Gef.: 0,81 0,90 0,99 1,92 1

Beispiel 17

Tyr	1	NH₅	Arg
1	1	1
0,97	,01	0,93,

5-0xoprolyl)-L-histidyl-L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosylglycyl-L-leucyl-L-arginyl-L-prolyl-glycinamid-diacetat-tetrahydrat (IRP)

Das L(5-0xoprolyl)-L-histidyl-hydrazid des Beispieles 2 (105 ^mg> 0,375 mMol) wird in Dimethylformamid (6 ml) gelöst /etwas Hydrazid, das ungelöst bleibt wird gegebenenfalls nach Behandlung mit HCl in Tetrahydrofuran aufgelöst/ und mit 3 η HCl/ Tetrahydrofuran (0,68 ml, 2,04 mMol) behandelt. Die Mischung wird in einem Trockenei s/Ac etonbad auf -30⁰C abgekühlt und dann gibt man tert.-Butylnitrit (0,0865 ml, 0,75 mMol) unter Rühren hinzu, nach 15 Minuten wird die lösung mit Triäthylamin (0,239 ml, 7 Äquivalente) und dann mit einer Lösung von L-Tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-glycyl-L-leucyl-L-arginyl-L-prolylglycinamid-diacetat (Beispiel 16) (297 mg, 0,28 mMol) in Dimethylformamid (5 ml) behandelt. Man rührt die Reaktionsmischung 2 Stunden lang bei -20⁰C, dann über das Wochenende bei 5°C, danach wird das lösungsmittel im Vakuum bei 30⁰C abgedampft und

409 8 U/1201 - 30 -

AHP-5870

der Rückstand in etwas Wasser aufgenommen und erneut zur Trockene eingedampft (etwas Triäthylamin-hydrochlorid, das aus der Mischung ausfällt, wird abfiltriert). Man erhält 615 mg rohe Festsubstanz, das Übergewicht stellt das Aminsalz dar (theoretische Ausbeute = 385 mg).

Das Rohprodukt zeigt bei der Dünnschichtchromatographie.(Cellulose) einen Hauptfleck, der von einem zweiten kleineren Fleck mit höherem R_f-Wert bekleidet ist, sowie das Triäthylamin-hydrochlorid; R- (n-Butanol/Wasser/Essigsäure = 4:1:1) = 0,31 Hauptfleck; Erlich-, Sakaguchi- und Pauly-Reagenz ergeben positiven Fleck; R~ (n-Butanol/Wasser/Essigsäure = 4:1:1) = 0,40, kleinerer Fleck; Erlich- und Sakaguschi-Reagenz ergeben positiven Fleck aber Pauly-Reagenz ist negativ; R_f (n-Butanol/Wasser/Esssigsäure/Pyridin = 30:24:6:20) = 0,60, Hauptfleck; Erlich-, Sakaguchi- und Pauly-Reagenz ergeben positiven Fleck; R„ (n-Butanol/Wasser/Essigsäure/Pyridin = 30:24:6:20) = 0,7, kleinerer Fleck.

Ein Teil des Rohproduktes (500 mg) wird chromatographiert an einer Sephadex G-25 (Fine) Verteilungskolonne (3 x 90 cm), die zuerst mit der unteren Phase einer Mischung aus n-Butanol/ Essigsäure/Wasser (4:1:5) und damm mit der oberen Phase äquilibriert worden ist. Die Verbindung wird im kleinsten Volumen der oberen Phase gelöst und vorsichtig auf die Kolonne aufgebracht. Die Fließrate beträgt 1 ml/Minute und die Fraktionsgröße beträgt 180 Tropfen (ungefähr 4 ml). Die aufgefangenen Fraktionen werden dünnschichtchromatographisch auf Cellulose mit dem System n-Butanol/Wasser/Essigsäure = 4:1:1 untersucht und diejenigen, die eine zufriedenstellende Reinheit zeigen werden vereinigt und in einem Rotationsverdampfer bei 3O⁰C zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wird in 1$iger wässriger Essigsäure aufgenommen, lyophilisiert und ergibt 100 mg weiße lockere Festsubstanz; M-^ = -46,6 +_ 1,2. Analyse (C₅₅H₇₅N₁₇O₁₅, 2 CH₅CO₂H, 4 H₂O); MG 1373

U 0 9^J8 1 4 / 1 2 0 1 - 31 -

AHP-5870

2 3 Λ 7 1 5 1

Ber.: C, 51,58; H, 6,68; N, 17,35$
Gef.: C, 51,12; H, 5,98; N, 17,74$

Amino säur eanalys e

Trp Ser GIu Pro GIy Leu Tyr NH₅ Ber.ι 1 11 1 2 1 1 1

Gef.: 0,779 0,994 1,074 1,203 2,056 1 1,083 1,558 0,774 0,957 1,046 1,123 2 0,968 1,037 1,546

	1	His	Arg
Ber.:	1	1	1
Gef.:	,060	0,982
	,022	0,966

Falls nichts anderes speziell angegeben ist, ist in allen obigen Beispielen das zur Bestimmung der R-,-Wert verwendete Absorbens "Merck" Silicagel F-254 in Form von vorbe schlicht et en Platten. Die in den Beispielen auch erwähnte Cellulose ist "Avicel F" von der Analtech Inc.

Das in Beispiel 17 erhaltene Decepeptid wurde auf die charakteristische hormonale Aktivität bezüglich der Freisetzung des luteinisierenden Hormones (LH) getestet. Der LRF des Beispieles 17 erwies sich bezüglich der Freisetzung von LH aus Primärkulturen dispergierter Hypophysenvorderlappenzellen der Ratte . als wirksam, verglichen mit dem synthetischen Standard-LRF des SaIk Instituts, dessen Aktivität von VaIe et al., Science, I76, 933 (1972), beschrieben worden ist. Die in vivo Freisetzung von LH mit der Verbindung des Beispieles 17 wurde bestimmt, indem man diese Verbindung mit Hilfe eines Katheters in die rechte Vena jugularis von mit Äther anästhesierten männlichen Sprague Dowley-Ratten, die 250 - 300 g wogen, verabreichte. Blutproben wurden durch Herzpunktur zum Zeitpunkt Null und nach verschiedenen Zeiträumen, die in der Tabelle unten angegeben sind, entnommen. 40 9 814/1201

- 32 -

	Dosis g/pro Ratte	χ 10"⁶	Ί ■ Zeit (min.)	. ^3 ⁹	34 7	AHP-5870	151	184^36
	25	χ 10"⁶	! 30	iMittleres i am Angang	Plasma-LH ng/ml* am Ende	1.09+10
Zahl der Tiere	25	χ 10"⁶	' ¹⁵	^; 32±4		162^5
2	10	χ 10"⁶	15	: 24^2		107+10
2	1	χ 10"⁶	ί ¹5	I 23,+ 2		138+18
1	1	χ 1O~⁷	! 8	25+4		83+6
4	1	χ 1O~⁸	! 15	! 22+1	j	60+_2
1	1	Kontrollen (Salzlösung)	ι 15	I 33^2	:	25+.2
4		I 15	I 38+3	I j i
			: 33,+ 2 ί	j I I
5

Das EH wurde durch Radioimmuno-Prüfung gemessen und auf das Natinal Institute of Arthritis and Metabolic Diseases - Reference Preparation I (NIAMD-RPI) bezogen.

40981 4/1201

- 33 -.

ORIGINAL INSPECTED

Claims

CASE: AHP-5870

PATENTANSPRÜCHE

Tetrapeptid der Formel: OR,

ι;

R—Ν—CH-C—NH- ΟΠ

J—NH-CH-C —NH-CH₂- C —]

worms

R eine 06-Amino-Schutzgruppe darstellt;

R¹ für -NHNH,

-NHNH-R⁶, -N₅ oder -OR⁵ steht;

R eine Schutzgruppe für die phenolische Hydroxylgruppe des Tyrosins darstellt;

4 R Wasserstoff oder eine Schutzgruppe darstellt;

5 R eine Carboxyl-Schutzgruppe bedeutet; und

R eine Hyrazid-Schutzgruppe darstellt; wobei die Reste R- und R nicht gleich sein dürfen und R nicht gleich R² oder R^ sein darf.

40981Λ/12Ω1

- 34 -

AHP-5870
2. Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß R für tert.-Butyloxycarbonyl, tert.—Amyloxycarbonyl, Trityl, Phthalyl, Tosyl, Allyloxycarbonyl, Cyclopentyloxycarbonyl oder eine Gruppe der Formel:

0
CH₂-O-C-

12

steht, worin R Wasserstoff, Halogen, Methoxy oder Nitro bedeutet.
3. Verbindung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß R und R unter Acetyl, Tosyl, Benzoyl, Benzyl, tert,-Butyl, Trityl und Benzyloxycarbonyl ausgewählt werden.
4. Verbindung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß R⁴ Wasserstoff darstellt und R²

definierten Resten ausgewählt wird.

daß R Wasserstoff darstellt und R unter den in Anspruch 3
5. Verbindung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß R¹ für -NHNH₂ steht.
6. Verbindung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß R¹ für -N₅ steht.
7. Verbindung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet,

•IC C

daß R für OR^ steht und R^ für Cj-Cg-Alkyl, Benzyl, Phenacyl, Phthalimidomethyl, /3-Methylthioäthyl, 4-(Methylthio)phenyl,
4-Picolyl und substituiertes Benzyl steht, wobei es sich bei dem Substituenten um den Methoxy-, Methyl- und Nitrorest

handelt.
8. Verbindung nach Anspruch 7, daduroh gekennzeichnet, daß R⁵ für C₁-Cg-AIlCyI steht.

409814/1201
- 35 -

AHP-5870

7 3^7151
9. Verbindung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß R² für Benzyl steht.
10. Verbindung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß R für Benzyloxycarbonyl steht.
11. Verbindung nach Anspruch 1, nämlich N-Benzyloxycarbonyl-L-tryptophyl-L-seryl-O-benzyl-L-tyrosyl-glycin-äthylester.
12. Verbindung nach Anspruch 1, nämlich N-Benzyloxycarbonyl-L-tryptophyl-L-seryl-O-benzyl-L-tyrosyl-glycyl-hydrazid.
13. Verbindung nach Anspruch 1, nämlich N-Benzyloxycarbonyl-L-tryptophyl-L-seryl-O-benzyl-L-tyrosyl-glycylazid.
14. Tetrapeptide der Formel:
R⁷-Leu-Arg(N^G-N0₉)-Pro-Gly-NH₉

7
worin R Wasserstoff oder eine OC-Amino-Schutzgruppe darstellt.
15. Verbindung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß R⁷ für Wasserstoff steht.
16. Verbindung nach Anspruch 15 in Form eines Säureadditionssalzes.
17. Verbindung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß R¹ für eine der folgenden OC-Amino-Schutzgruppen steht: tert.-Butyloxycarbonyl, tert.-Amyloxycarbonyl, Trityl, Phthalyl·, Tosyl, Allyloxycarbonyl, Oyclopentyloxycarbonyl oder eine Gruppe der Formel:

12
worin R für Wasserstoff, Halogen, Methoxy und Nitro steht.

4 0 9 8 U / 1 2 0 1 - 36 -

AHP-5870

? 3 Λ 7 1 5 1 -
18. Verbindung nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, 7

daß R für Benzyloxycarbonyl steht.
19. Verbindung nach Anspruch 14, nämlich N-Benzyloxycarbonyl-L-leucyl-N -nitro-L-arginyl-L-prolyl-glycinamid.
20. Verbindung nach Anspruch 14, nämlich L-Leucycl-N nitro-1-arginyl-L-prolyl-glycinamid und seine Säureadditionssalze.
21. Octapeptid der Formel:

R-Trp-Ser(R⁴)-Tyr(R²)-Gly-Leu-Arg(N^G-R⁸)-PrO-GIy-NH₂

R eine oC-Amino-Schutzgruppe bedeutet;

ρ
R eine Schutzgruppe für die phenolische Hydroxylgruppe am Tyrosin darstellt;

R für das Wasserstoffatom der alkoholischen Hydroxylgruppe am Serin oder für eine Schutzgruppe für die alkoholische Hydroxylgruppe des Serins steht;

R für Wasserstoff oder eine Schutzgruppe an wenigstens einem aber nicht mehr als zwei der Seitenkettenstickstoffatome im Arginin steht; wobei der Rest R nicht die gleiche Schutzgruppe

2 4-8
darstellen darf wie R , K* oder R .
22. Verbindung nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß der Reste R die in Anspruch 2 definierten Bedeutungen hat.
23. Verbindung nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß R für eine Nitro-, Tosyl-, Adamantyloxycarbonyl-, Benzyloxycarbonyl- oder Trityl-Schutzgruppe steht,., -
24. Verbindung nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet,

2
daß R für Acetyl, Tosyl, Benzoyl, Benzyl, tert.-Butyl, Trityl oder Benzyloxy steht und R Wasserstoff bedeutet.

4098U/1201 - 37 -

ORIGINAL INSPECTED

AHP-5870

2 3 Λ 7 1 5 7
25. Verbindung nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß R für Benzyloxycarbonyl steht.
26. Verbindung nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß R für Nitro und R für das Wasserstoff atom steht.
27. Verbindung nach Anspruch 21, nämlich N-Benzyloxycarbonyl-L-tryptophyl-L-seryl-O-benzyl-L-tyrosyl-glycyl-L-leucyl-N-nitro-L-arginyl-L-prolyl-glycinamid.
28. Verfahren zur Herstellung eines Octapeptides, dadurch gekennzeichnet, daß man

(a) ein Tetrapeptid der.Formel: R-Trp-Ser(R⁴)-Tyr-R²)-Gly-N₅

mit einem Tetrapeptid der Formel:

H-Leu-Arg(K^G-R⁸) -Pro-Gly-NH₂ zu einem Octapeptid der Formel:

R-Trp-S er (R⁴ )-Tyr (R² )-G ly-Leu-Arg (N⁰^-R⁸)-Pro-Gly-NH₂

umsetzt, worin

R eine oc-Amino-Schutzgruppe bedeutet;

R für eine Schutzgruppe an der aromatischen Hydroxylgruppe des Tyrosins steht;

4
R für das Wasserstoffatom an der alkoholischen Hydroxylgruppe des Serins oder für eine Schutzgruppe für die alkoholische Hydroxylgruppe am Serin steht;

R für das Wasser stoff atom an jedem der Seitenketten-Stickstoffatome des Arginine oder für eine Seitenketten-Schutzgruppe für wenigstens ein, aber nicht mehr als zwei der Seitenketten-Stick-

2 4 stoffatome des Arginine steht; wobei R nicht gleich R , R oder R sein darf;

(b) die cC-Amino-Schutzgruppe von dem in Stufe (a) erhaltenen Octapeptid abspaltet.

409814/1201

- 38 -

AHP-5870
29. Verfahren zur Herstellung des Decapeptides IRF, dadurch gekennzeichnet, daß man das oC-Amino ent schützte Oc tapeptid nach. Anspruch 28 mit einem Dipeptid, nämlich p-Glu-His-N, oder p-G-lu-His(N -R)-N, umsetzt, worin R eine Schutzgruppe am Stickstoffatom des Imidazolringes darstellt, so daß ein Decapeptid mit der gleichen Aminosäuresequenz wie "beim IRI¹ gebildet wird und an dem Decapeptid eventuell vorhandene Seitenketten-Schutzgruppen unter Bildung von IRE abgespalten werden.
30. Verfahren nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, daß als abspaltendes Reagenz, das in Stufe (b) verwendet worden ist, ein Reagenz verwendet wird, das auch alle Seitenketten-Schutzgruppen an dem in Stufe (a) erhaltenen Octapeptid abspaltet.
31. Verfahren nach. Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, daß die Abspaltung in Stufe (b) durch Hydrierung erfolgt.
32. Verfahren nach. Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, daß die freie Base des in Stufe (b) erhaltenen entschützten Octäpeptides mit dem Dipeptid: p~Glu-His-N~ zu LRP umgesetzt wird.
33. Verfahren zur Herstellung von LRP, das ist L-(5-0xoprolyl)-L-histidyl-L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-glycyl-L-leucycl-L—arginyl-L—prolyl-glycinamid, dadurch gekennzeichnet,

(a) ein-Tetrapeptid der Pormel:

R-Irp-Ser (R⁴ )-Tyr (R²) -GIy-KHNH ₂

worin R, R und R die in Anspruch 28 genannten Bedeutungen haben, mit einem Reagenz umgesetzt wird, das in Anwesenheit einer starken Säure salpetrige Säure in situ erzeugt und das Tetrapeptid in das Azid der Formel:

R-irp-Ser(R⁴)-Tyr-(R²)-Gly-N,

• • *

überführt;

4098*4/ 1201 - 39 -

ΑΗΓ-5870

das in Stufe (a) erhaltene Azid mit einem Tetrapeptid der Formel:

H-Leu-Arg(N^G-R⁸)-PrO-GIy-MH₂ ,

worin R die in Anspruch 28 genannten Bedeutungen hat, zu einem Octapeptid der Formel:

R-Trp-Ser(R⁴)-Tyr(R²)-Gly-Leu-Arg-(N^G-R⁸)-Pro-Gly-NH₂ umgesetzt wird;

(c) die Seitenketten- und oC-Amino-Schutzgruppen von dem in Stufe (b) erhaltenen Octapeptid abgespalten werden; und

(d) das entschützte Octapeptid mit p-GIu-His-N~ unter Bildung von LRP oder dessen Säureadditionssalz umgesetzt wird.
34. ..Verfahren nach Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet, daß für R tert.-Butyloxycarbonyl-, tert.-Amyloxycarbonyl-, Trityl-, Phthalyl-, Tosyl-, Allyloxycarbonyl-, Cyclopentyloxycarbonylrest oder eine Gruppe der Formel:

1 2
verwendet wird, worin R für Wasserstoff, Nitro, Methoxy oder Halogen steht; als Schutzgruppe R und R Acetyl, Tosyl, Benzyl, Benzoyl, tert.-Butyl, Trityl und Benzyloxycarbonyl verwendet werden; als Schutzgruppe R Nitro, Tosyl, Adamantyloxycarbonyl, Benzyloxycarbonyl und Trityl verwendet wird.
35. Verfahren nach Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, daß die OC-Amino- und Seitenketten-Schutzgruppen durch Hydrierung entfernt werden.
36. Verfahren zur Herstellung von LRF, dadurch gekennzeichnet, daß N-Benzyloxycarbonyl-L-tryptophyl-L-seryl-O-benzyl-L-tyrosyl-glycyl-hydrazid mit einem Reagenz, das in einer starken

4098 U/1201 - 40 -

ORiGfNAL INSPECTED^

AHP-5870

ψ ?ΊΛ7151

Säure salpetrige Säure ergibt, zu dem entsprechenden Azid umgesetzt wird, das Azid mit L-Leucyl-N -nitro-L-arginyl-L-prolylglycinamid zu dem Octapeptid: N-Benzyloxycarbonyl-L-tryptophyl-

L-seryl-O-benzyl-I-tyrosyl-glycyl-L-leucyl-N -nitro-L-arginyl-L-prolin-glycinamid umgesetzt wird, die Schutzgruppen von dem Octapeptid durch Hydrierung über einem Palladiumkatalysator abgespalten werden und das entschützte Octapeptid mit dem Dipeptid: p-Glu-His-N^ zu LRP umgesetzt wird, wobei das Dipeptid in situ durch Umsetzung von p-GIu-HiS-NHEH₂ mit einem Reagenz, das in Anwesenheit einer starken Säure salpertige Säure ergibt, gebildet wird.
37. Verfahren zur Herstellung des Tetrapeptides der Formel: R-Trp-Ser(R )-Tyr(R )-Gly-NH₂, dadurch gekennzeichnet, daß

(a) R-Trp-OH mit einem Carboxylgruppe-aktivierenden Reagenz umgesetzt wird;

(b) die in Stufe (a) erhaltene an der Carboxylgruppe aktivierte Verbindung mit H-Ser(R)-ORr zu dem Dipeptid der Formell R-Trp-Ser(R⁴)-OR⁵ umgesetzt wird;

(c) das in Stufe (b) erhaltene Dipeptid mit Hydrazin zu R-Trp-Ser(R^)-NHNH₂ umgesetzt wird;

(d) das in Stufe (c) erhaltene Dipeptid mit einem Reagenz, das in Anwesenheit einer starken Säure salpetrige. Säure ergibt, zu .

R-Trp-Ser(R⁴)-N₃

umgesetzt wird und das Dipeptid mit

zu dem Tetrapeptid der Formel:

R-Trp-Ser(R⁴)-Tyr(R²)-Gly-OR⁵ umgesetzt wird; und

(e) das in Stufe (d) erhaltene Terapeptid mit Hydrazin zu R-Trp-Ser(R⁴)-Tyr(R²)-Gly-NH-NH₂

4098 ή/1201

- 41 -

ORIGINAL INSPECTED

AHP-5870

umgesetzt wird, worin R, R und R die in Anspruch 28 genannten Bedeutungen haben und R für eine Carboxyl-Schutzgruppe steht.
38. Verfahren nach Anspruch 37, dadurch gekennzeichnet, daß der Rest R unter den .
deutungen ausgewählt wird.

κ 5

daß der Rest R unter den in Anspruch 7 für R genannten Be-
39. Verfahren nach Anspruch 38, dadurch gekennzeichnet,

2 2

daß als Rest R und R die in Anspruch 34 für R und R genannten Reste verwendet werden.
40. Verfahren nach Anspruch 58, dadurch gekennzeichnet,

ρ daß für R der Benzyloxycarbonylrest, für R der Benzylrest und

4
für R der Wasserstoffrest verwendet wird.
41. Verfahren zur Herstellung des Tetrapeptides der

Formel: _p ,

dadurch gekennzeichnet, daß

(a) R-Arg(N -R )-0H mit einem Carboxylgruppe-aktivierenden Mittel umgesetzt wird;

(b) die in Stufe (a) erhaltene aktivierte Verbindung mit H-Pro-OR-^ zu dem Dipeptid R-Arg(N -R^j-Pro-OR^ umgesetzt wird;

(c) die oC-Amino-Schutzgruppe von dem in Stufe (t>) erhaltenen Dipeptid abgespalten wird;

(d) das in Stufe (c) erhaltene Dipeptid mit einer Verbindung der Formel: R-Leu-OH, deren Carboxylgruppe aktiviert ist, zu dem Tripeptid der Formel:

R-Leu-Arg(N^G-R⁵)-Pro-OR⁵ umgesetzt wird;

(e) der in Stufe (d) erhaltene Tripeptidester zur entsprechenden freien Säure hydrolysiert wird;

(f) das in Stufe (e) erhaltene Tripeptid mit einem Carboxylgruppe-aktivierenden Reagenz umgesetzt wird und die

4098 U/ 1 20 1 - 42 -

All?-5870

resultierende aktivierte Verbindung mit Glycinamid zum Tetrapeptid der Formel

R-Leu-Arg(N^G-R⁵)-Pr0-GIy-NH₂ umgesetzt wird; worin
R eineoC-Amino-Schutzgruppe bedeutet;

R für Nitro, Tosyl, Adamantyloxycarbonyl, Benzyloxycarbonyl oder Trityl steht;

R für Niedrigalkyl, Benzyl, substituiertes Benzyl (Nitro-, Methyl- und Methoxysubetituenten), Phenacyl, Phthalimidomethyl, ß-Methylthioäthyl, 4-Picolyl und 4-(Methylthio)phenyl steht; wobei R und R nicht gleich sein dürfen.
42. Verfahren nach Anspruch 41, dadurch gekennzeichnet,

3 daß für R der Benzyloxycarbonylrest, für R der Nitrorest und

5
für R ein Niedrigalkylrest verwendet wird.
43. Verfahren zur Herstellung von LRP, dadurch gekennzeichnet, daß

(a) eine Verbindung der Formel: R-Trp-OH

mit einem Garboxylgruppe-aktivierenden Reagenz umgesetzt wird;

(b) die in Stufe (a) erhaltene aktivierte Verbindung mit H-Ser(R⁴)-OR⁵

zu dem Dipeptid der Formel:
R-Trp-Ser(R⁴)-OR⁵
umgesetzt wird;

(c) das in Stufe (b) erhaltene Dipeptid mit Hydrazin zu R-Trp-Ser(R )-ΝΗΝΉρ umgesetzt wird;

(d) das in Stufe (c)erhaltene Dipeptid mit einem Reagenz, das in Anwesenheit einer starken Säure salpetrige Säure liefert, zu einer Verbindung der Formel: R-Trp-Ser(R )-N₅ umgesetzt wird;

40981W1201 - 43 -

AHP-5870

ο 3 L 7 1 5 1

(e) die Verbindung R-Trp-SeriR^-N, mit H-Tyr(R²)-2

GIy-OR zu dem Tetrapeptid der Formel:

R-Trp-Ser(R⁴")-Tyr(R²)-Gly-OR^ umgesetzt wü;

(f) das Tetrapeptid der Stufe (e) mit Hydrazin zu R-Trp-Ser(R^)-?yr(R²)-Gly-KHNH₂ umgesetzt wird;

(g) die Verbindung der Formel:
R-Arg(li^G-R⁵)-OH

mit einem Carboxylgruppe-aktivierenden Reagenz umgesetzt wird;

(h) die in Stufe (g) erhaltene aktivierte Verbindung mit H-Pro-OR umgesetzt wird;

(i) die <X-Amino-Schutzgruppen von dem in Stufe (h) erhaltenen Dipeptid abgespalten werden, wobei es sich um ein Abspaltungsreagenz h
Gruppen stabil sind;

3 5

Abspaltungsreagenz handelt, gegenüber dem die R- und R-

(j) das Dipeptid der Formel:
H-Arg(N^G-R⁵)-Pro-OR⁵
mit einer Verbindung der Formel:

R-Leu-OH, deren Carboxylgruppe aktiviert ist, zu dem Tripeptid der Formel:

R-Leu-Arg(N^G-R⁵)-Pro-OR⁵ umgesetzt wird;

(k) das in Stufe (j) erhaltene Tripeptid hydrolysiert wird, um die Carbonsäureestergruppe abzuspalten und das Tripeptid der Formel:

R-Leu-Arg(N -R )-Pro-0H gewonnen wird;

(1) das in Stufe (k) erhaltene Tripeptid mit einem Carboxylgruppe-aktivierenden Reagenz umgesetzt wird und die erhaltene aktivierte Verbindung mit Glycinamid zu dem Tetrapeptid der Formel:

R-Leu-Arg(N -R^p)-PrO-GIy-NH₂ umgesetzt wird;

L G 9 8 U / 1 2 O 1 - 44- -

ORIGINAL INSPECTED

AIIP-5870

(m) die Λ-Ämino-Schutzgruppe von dem in Stufe (l) erhaltenen Tetrapeptid abgespalten wird;

(η) das Tetrapeptid der Formel:

R-Trp-Ser(R⁴)-Tyr(R²)-Gly-KHXH₂

mit einem Reagenz, das in Anwensenheit einer starken Säure salpetrige Säure liefert, zu

R-Trp-Ser (R⁴")-Tyr (R²)-GIy-N, umgesetzt wird und dieses Tetrapeptid mit

H-Leu-Arg(K^G-R⁵)-PrO-GIy-KH₂ . zu dem Octapeptid:

R-Trp-Ser(R⁴)-Tyr(R²)-Gly-Leu-Arg(N^G-R³)-Pro-Gly-KH₂ umgesetzt wird;

(o) die -X-Amino- und Seitenkette-Schutzgruppen von dem in Stufe (n) gebildeten Octapeptid abgespalten werden und das entschützte Octapeptid mit

p-GIu-His-N., zu LRF umgesetzt wird;

wobei in den obigen Formeln:

R eine OJ-Amino-Schutzgruppe darstellt;

R für Acetyl, Tosyl, Benzoyl, Benzyl, tert.-Butyl, Trityl und Benzyloxycarbonyl steht;

R Nitro, Tosyl, Adamantyloxycarbonyl, Benzyloxycarbonyl und Tosyl bedeutet;

R für das Wasserstoffatom an der alkoholischen Hydroxylgruppe des Serins und für eine Schutzgruppe an der Hydroxylgruppe des Serins, nämlich für Acetyl, Tosyl, Benzoyl, Benzyl, tert.-Butyl, Trityl und Benzyloxycarbonyl steht; R⁵ Niedrigalkyl, Benzyl, Phenacyl, Phthalimidornethyl, fJ-Methylthiomethyl, 4-Picolyl, 4-(Methylthiο)phenyl und substituiertes Benzyl bedeutet, wobei R nicht gleich R , R^ oder R sein darf,
44. Verfahren nach Anspruch 43, dadurch gekennzeichnet, daß alle Stufen (a) bis (o) bei einer Temperatur unter +20⁰C durchgeführt werden. 4 09814/1201

- 45 -

AHP-5870
45. Verfahren nach Anspruch 43, dadurch gekennzeichnet, daß die Abspaltung in Stufe (o) durch Hydrierung erfolgt.
46. Verfahren nach Anspruch 43, dadurch gekennzeichnet,

2 3

daß R für Benzyloxycarbonyl, R für Benzyl, R für Nitro und R für Wasserstoff steht.
47. Verfahren nach Anspruch 46, dadurch gekennzeichnet, daß in Stufe (a) als Reagenz zur Aktivierung der Carboxylgruppe DicyclohexylcarDodiimid und in den Stufen (g) und (l) als Reagenz zur Aktivierung der Carboxylgruppe ein Reagenz verwendet wird, das ein gemischtes Anhydrid mit der Carboxylgruppe bildet.
48. Verfahren nach Anspruch 47, dadurch gekennzeichnet, daß in den Stufen (i) und (m) als Abspaltungsreagenz HBr in Essigsäure oder Trifluoreasigsaure verwendet wird.

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