DE2243066C3

DE2243066C3 - Verfahren zur Herstellung von (Pyro) glutamyl-histWyl-tryptophyl-seryltyrosyl-glycyl-leucyl-arginyl-prolylglycinamid

Info

Publication number: DE2243066C3
Application number: DE19722243066
Authority: DE
Inventors: Shunpei; Kumahara Yuichi; Osaka; Kimura Terutoshi Hyogo; Sakakibara (Japan)
Original assignee: Daiichi Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Daiichi Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1971-09-02
Filing date: 1972-09-01
Publication date: 1976-11-25

Description

35:

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von (Pyro) - glutamyl - histidyl - tryptophyl - seryl - tyrolyl-glycyl-leucyl-arginyl-prolyl-glycinarnid.

Dieses im folgenden mit RH abgekürzte Decapeptid bewirkt eine Freisetzung des luteinisierenden Hormons (im folgenden mit LH abgekürzt) und des lollikelstimulierenden Hormons (im folgenden als FSH abgekürzt). RH konnte aus Kalbshypothalamus gewonnen und seine Aminosäuresequenz bestimmt werden.

Bisher waren weder ein Syntheseverfahren für RH ■och dessen physikalische Eigenschaften bekannt. Im allgemeinen ist die Synthese von Polypeptiden zwar theoretisch möglich, aber schwierig durchzuführen end häufig erfolglos, auch wenn die Aminosäurezutammensetzung und die Aminosäuresequenz bekannt ist. Diese Schwierigkeiten beruhen darauf, daß die Kr einen geplanten Syntheseweg benötigten Oligopeptidfragmente unerwartete physikalische Eigen-

Ate

Bung von Nebenprodukten unmöglich ist.

Aus diesem Grund wird im allgemeinen die schrittweise Verlängerung von Aminosäuren als geeignetstes Syntheseverfahren zur Herstellung von Polypeptiden angesehen. Dieses Verfahren ist jedoch sehr unwirtschaftlich und eignet sich nur zu Forschungszwecken.

Zur Bildung von Peptidbindungen sind eine Reihe von Verfahren bekannt. Zur kommerziellen Herstellung von solchen langkettigen Polypeptiden benötigt man jedoch einen Syntheseweg, der über Fragmente der langen Sequenz oder über eine geeignete Kombination des Einsatzes von Fragmenten und der schrittweisen Verlängerung verläuft. Theoretisch sind zahlreiche Kombiiiationsmöglichkeiten von Fragmenten für die Herstellung solcher langkettiger Polypeptide möglich. Abgesehen von dieser großen Zahl von Kombinationsmöglichkeiten sind jedoch die meisten Oligopeptidfragmente neue Verbindungen, deren physikalische Eigenschaften unbekannt sind, so daß bei der Auffindung des geeignetsten Synthesewegs viele Probleme zu lösen sind, z. B. welche Schutzgruppen Tür die Fragmente und welche Art von Kupplungsreaktionen verwendet werden können.

Aufgabe der Erfindung ist es daher, ein Verfahren zur Synthese von RH zur Verfugung zu stellen, das wirtschaftlich durchführbar ist und eine Lösung der vorgenannten Problem? bringt.

Gegenstand der E."⁰ vr.« ist somit ein Verfahren zur Herstellung von (PyrOglutamyl-histidyi-tryptophyl - seryl - tyrosy! - glycyl - leucyl - arginyl - prolylglycinamid, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man

A. Leucyl - (N - geschüt;tes)arginyl - prolyl - glycinamid (I), das durch Kuppeln von geschütztem Arginin mit an der Carboxylgruppe geschütztem Prolin zu Arginyl-prolin, Kuppeln des Arginylprolins mit Glycinamid zu Arginyl-prolyl-glycinamid. Kuppeln dieses Produktes an der endständigen NH₂-Gi uppe mit Leucin und Entfernen der Schutzgruppe an der NH₂-Gruppe des Leucylrestes hergestellt worden ι**, mit

B. (N- und O-geschütztes) Seryl-(0-geschütztes)tyrosyl-glycin (II), das durch schrittweises Kuppeln eines niederen Alkylesters von Glycin mit geeignet geschütztem Tyrosin und Serin und anschießende Hydrolyse der Estergruppe hergeslo.'t worden ist,

C. zu mit einigen Schutzgruppen versehenem Seryltyrosy 1 - glycyl - leucyl - arginyl - prolyl - glycinamid kuppelt und d^;eses Heptapeptid schrittweise an der aminoendständigen Seite mit geeignet geschütztem Tryptophan, Histidin und (Pyroglutaminsäure zu einem geschützten Decapeptid verlängert und die Schutzgruppen durch Behandlung mit Fluorwasserstoffsäure entfernt.

wiedergegeben.

Syniheseweg für die Herstellung von RH

AOC-

—OH H-I Pro

— OBzI

WSC!

BzI

3OC H

Tyr

OSu Η —

22	43	06β Tos π	Arg-Pro	Arg-Pro
		AOC-	H₁ Tos .. !
HCl ι		AOC-
GIy	-OEt

— OBzI

HCl

- OH HH

GIy

-NH₁

BzI

BOC

Ij -Ciit

BzI

AOCH

Ser

BzI I

CF₃COOH

-OSu H —

Tyr-Gly

-OEf BOC-j Leu

I	Ί Tos I	WSCI	—	—
	Arg-Pro-Gly	CF₃CC
AOC-	Tos I	Arg-Pro-Gly

-OSu H —

-NH₁

BzI BzI Tos

AOCH

Ser-Tyr-GIy

BzI BzI i

-OEt BOC H

Leu-Arg-Pro-Gly

-NH,

MeOH-NaOH Tos

CF,COOH

AOCH

Ser-Tyr-Gly

-OH ■ · · Fragment(II) H-Leu-Arg-Pro-Gly

-NH₂ ■ ■ · Fragmefit(I)

.! WSCI
BzI BzI Tos

AOC-! Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly

CF₃COOH

BzJ BzI 1 Tos

—NB,

AOC-Trpl—ONp H— Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly

-NH₂

üzi Bzi

AOC-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly

-NH₂

Tos CF₃COOH

BzI BzI 1 Tos

BOC-

His

-OH Η — Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly

-NH₇

Tos BzI BzI

BOC-

His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly

Tos BzI BzI -NH,

CF₃COOH Tos

Z —

(Pyro)GluJ—ONp H —

His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly

-NH,

Tos BzI BzI

Tos

Z —I (PyrolGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly - NH₂

HF

Hl PyrolGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly NH₂

Die verwendeten Abkürzungen haben folgende Bedeutung:

= tert.-Amyloxycarbonyigruppe.

= tert.-Butyloxycarboxylgruppe.

—- p-ToluolsuIfonylgruppe.

= Benzylgruppe.

= Benzyloxycarbonylgruppe.

= Verbleibender Rest von Succinimid.

= p-Nitrophenylgruppe.

= Wasserlösliche Carbodiimide, wie

ET-N = CN-(CH₂I₃-N

CH₃

CH,

30

35

oder deren Salze mit Mineralsäuren.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von RH hat gegenüber anderen mit Peptidfragmenten arbeitenden Verfahren folgende Vorteile:

a) Bei den Reinigungsschritten ist nicht eine große Menge eines bestimmten Lösungsmittels nötig, wie es im allgemeinen bei der Synthese von Polypeptiden mit 8 bis 12 Aminosäuren, wie Angiotensin I oder II, Bradykinin oder Kallidin, die eine ähnliche Kettenlänge wie RH aufweisen, der Fall ist. Beim erfindungsgemäßen Verfahren können die Reinigungsschritte leicht chromatographisch an Silicagelsäulen unter Verwendung von billigen Lösungsmitteln durchgeführt werden. Dabei werden gute Ausbeuten an Zwischenprodukten sowie an RH erhallen. Außerdem sind im erfindungsgemäßen Verfahren nur wenige Reinigungsschritte notwendig.

b) Die verwendeten Peptidkupplungsreaktionen verursachen keine Racemisierung der Aminosäuren oder der Fragmente. Es werden geeignete Acyloxy-Schutzgruppen für die Aniinoreste verwendet, um die Bildung eines Oxazolidonrings bei den Kupplungsreaktionen zu verhindern.

c) Durch die Reihenfolge der Kupplungsreaktionen bei der Fragmentbildung, insbesondere bei Fragment I. erhält man leicht handhabbare Zwischenprodukte (z. B. auf Grund der hydrophilen und lipophilen Eigenschaften), was auf die Reihenfolge und Auswahl der Schutzgruppen zurückzuführen isi. Außerdem wird kein Diketopiperazin als Nebenprodukt gebildet. Beispielsweise kann bei einer anderen Kupplungsreihenfolge, Pro-Gly —»Arg-Pro-Gly, Diketopiperazin als Nebenprodukt entstehen. Diese Zwischenprodukte sind zu stark hydrophil und können deshalb schlecht gehandhabt werden. Diese Tatsache zeigt, daß die erfindungsgempße Kupplungsreihenfolge und die erfindungsgemäß verwendeten Schutzgruppen optimal ausgewählt sind.

d) Beim erfindungsgemäßen Syntheseweg wird das »aktivierte Ester-Verfahren und das WSCI-Verfahren so günstig zusammen mit geeigneten Schutzgruppen kombiniert, daß die Bildung von Nebenprodukten (Acylharnstoffderivate) vermieden wird, wobei die hydrophilen Eigenschaften und die leichte Oxidierbarkeit des Peptidzwischenprodukts berücksichtigt wird.

Die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Zwischenprodukte mit geeigneten Schutzgruppen an den endständigen Amino- oder Carboxylgruppen sind neue Verbindungen.

Bei der Herstellung von Fragment II eignet sich am besten die Estergruppe als Carboxylschutzgruppe des Glycins. Es war zu befürchten, daß beim Entfernen der Esterschutzgruppe gleichzeitig eine Peptidspaltung eintritt. Aber durch selektive Hydrolyse läßt sich die Estergruppe von Fragment II onne Nebenreaktion abspalten.

Das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte RH ist biologisch aktiv und setzt LH und FSH frei, wie durch Tierversuche bestätigt wurde.

Das Beispiel erläutert die Erfindung.

Beispiel

A. Herstellung von Fragment I
I. Synthese von AOC-Arg(Tos)-Pro-OBzl

In 60 ml Methylenchlorid werden 23 g (52 mMol) AOC-Arg(Tos)-OH und 13,9 g (57 mMol)

H-Pro-OBzl · HCl
gelöst. Die Lösung wird in einem Kühlbad auf

22 43

-10 C gekühlt. Anschließend werden in drei Portionen unter Kühlen auf -10 bis -2 C 8.1g (52 mMol) N - Äthyl - N' - (dimcthylaminopropyl)-carbodiimid zugegeben. Das erhaltene Gemisch wird durch Zusatz von 0.53 ml N-Methylmorpholin auf einen pH-Wert von 7 gebracht und 30 Minuten bei — 5°C und 16 bis 18 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das nach dem Abdcstilliercn des Melhylcnchlorids aus dem Reaktionsgemisch erhaltene ölige Produkt wir·' in Chloroform gelöst. Die Chloroformlösung wird nacheinander mit 0,5 η-Salzsäure. Wasser, 5%iger Natriumhydrogencarbonatlösung und Wasser gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und abfiltriert. Das nach dem hindampfen des Filtrates erhaltene ölige Produkt wird in 150 ml Essigsäureäthylester unter Erwärmen gelöst Die Lösung wird anschließend in einen Kühlschrank gestellt. v.obei Nadeln ausfallen Die Kristalle werden abfiltriert. mit Essigsäureäthylester gewaschen und im Exsikkator über Phosphorpentoxid unter vermmdertem Druck getrocknet Man erhält 24.0 g (73,4% der Theorie) des gewünschten Produktes vom F. 163.5 bis 164.5 C. [<»]? -33.4 (c = 1.1. Dimethylformamid).

gesättigten Natriumsulfatlösung wird die erhaltene Flüssigkeit mit einem großen Volumen Essigsäurcüthylcstcr extrahiert.

Die Essigsäurcälhylcsterphuse wird nacheinander mit 0,5n-Salzsäurc. Wasser. 5%igcr Natriumhydrogencarbonatlösung und Wasser gewaschen. Bei diesen Waschvorgängen ist die wäßrige Phase jeweils mit Natriumsulfat gesättigt. Die Essigsäureäthylesterphase wird anschließend über Magnesiumsulfat getrocknet und abnitriert. Das Filtrat wird zu einem öligen Rückstand eingedampft. Der nach dem Versetzen dieses Rückstands mit Diäthyläther gebildete Niederschlag wird auf einer Glasfritte abgenutscht und über Phosphorpentoxid im Vakuumexsikkatot getrocknet Man erhält 2 g (48% der Theorie) des gewünschten AOC -Arg(Tos)-PrO-GIy-NH₂.

Das ganze Produkt wird in 7,5 ml Trifluoressigsäure gelöst und 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wird die Trifluoressigsäure unter vermindertem Druck abgedampft und der Ruckstand über Natriumhydroxid in einem Vakuumexsikkator getrocknet. Man erhält

H-Arg(Tos|-Pr₀-GIy-NH₂ CF₃C OOH

Analyse fur C₁₁H₄₁O-N₅S:

Berechnet C 59.13. H 6,88. N 11.12:
gefunden .. C 59,09. H 6.65. N 11.02.

2. Synthese von AOC-Arg(Tos)-Pro-OH

In 2C ml Methanol werden 22 g (35 mMol) AOC-Arg(Tos)-Pro-OBzl gelöst. Nach der Zugabe von 1,5 g Palladium-auf-Kohlenstoff wird unter Rühren 5 Stunden Wasserstoff durch die Lösung geleitet. Anschließend wird der Katalysator abfiltriert und das Methanol abgedampft. Der erhaltene Rückstand wird in 300 ml Essigsäureäthylester gelöst und mit 5%iger Natriumhydrogencarbonatlösung extrahiert. Der Extrakt wird unter Kühlen mit 6n-Salzsäure auf den pH-Wert 3 gebracht und nochmals rasch mit Essigsäureäthylester extrahiert. Nach dem Waschen mit Wasser wird der Extrakt über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und filtriert. Das Filtrat wird zur Trockene eingedampft. Der erhaltene Rückstand wird mit Diäthyläther versetzt. Der erhaltene Niederschlag wird über Phosphorpentoxid im Vakuumexsikkator getrocknet. Man erhält 17 g (90% der Theorie) des gewünschten Produktes.

3. Synthese von BOC-Leu-Arg(Tos)-Pro-Gly-NH₂

In einem Gemisch aus 10 ml Dimethylformamid und 4 ml Wasser werden 1,2 g (10,5 mMol)

H-GIy-NH₂ ■ HCl

gelöst. Die Lösung wird mit einer Lösung von 3,8 g (7 mMol) AOC-ArgfTos)-Pro-OH in 15 ml Methylenchlorid versetzt. Das entstandene Gemisch wird in einem Kühlbad auf -5° C gekühlt und unter Rühren mit 1,1 g (7 mMol) N-Athyl-N'-iaHneihyiaminopropyl}-carbodiimid (wasserlöslich) und 3 ml Methylenchlorid versetzt. Nach dem Einstellen des pH-Wertes mit 0,4 ml N-Methylmorpholin auf 7 wird die Lösung 30 Minuten unter Kühlung heftig gerührt und anschließend weitere 16 bis 18 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wird das Methylenchlorid abgedampft. Nach der Zugabe einer als öl. Dieses (Jl wird in 2.5 ml Dimethylformamid gelöst und durch Zugabe von 2 ml Triäthylamin unter l· skühlung auf den pH-Wert 4 gebracht. Anschließend wiril die Lösung durch weitere Zugabe

jo von 1 ml N-f nylmorpholin auf den pH-Wert 7 gebracht. Diese Lösung wird mit 1,7 g (5 mMol) BOC-Leu-OSu und 1 ml Dimethylformamid versetzt. Nach 17stündigem Rühren bei Raumtemperatur werden 1,5 ml N.N'-Diirethylaminopropylanin zugegeben. Anschließend wird die Lösung 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wird mit einem großen Volumen Wasser versetzt und mit Chloroform extrahiert. Die Chloroformphase wird nacheinander mit O,5n-Salzsäure, Wasser, 5%iger Natriumhydrogencarbonatlösung und Wasser gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Das Magnesiumsulfat wird sodann abfiltriert und das Filtrat zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wird mit Äthanol und Essigsäureäthylester versetzt und erwärmt. Die beim Stehen im Kühlschrank ausgefallenen Kristalle werden abfiltriert, mit einer ausreichenden Menge Essigsäureäthylester gewaschen und im Vakuumexsikkator über Phosphorpentoxid getrocknet. Man erhält 1,78 g (76,4% der Theorie)

J₀ der gewünschten Verbindung vom F. 150,5 bis 152,5° C (zersetzt sich und wird durchsichtig bei 182° C). [«]f -33,0° (c = 1,0, Dimethylformamid).

Analyse für C₃₁H₅₀O₈N₈S · 1/2H₂O:

Berechnet ... C 52,89, H 7,31, N 15,92;
gefunden .... C 52,79, H 7,35, N 15,67.

B. Herstellung von Fragment II
1. Synthese von BOC-Tyr(Bzl)-Gly-OEt

5 ml DitseihjlfeiiTiainid werden isk 590 rag GIy-OEt · HCl versetzt Anschließend werden unter Rühren und Kühlung 0,5 ml Triäthylamin zugesetzt. Das Gemisch wird anschließend mit 1,45 g

BOC-Tyr(Bzl)-OSU

versetzt, 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt

609 648/262

60

65

und sodann mit Chloroform verdünnt. Nach der Zugabe von 0,5 ml Dimethylaminopropylamin wird das erhaltene Gemisch 30 Minuten gerührt. Sodann wird mit 1 η-Salzsäure, Wasser, 1 n-Natriumcarbonatlösung und Wasser gewaschen. Die Chloroformphase wird über Magnesiumsulfat getrocknet und abfiltriert. Nach dem Abdampfen des Chloroforms aus dem FiI-trat erhält man Kristalle, die aus einer Mischung von Essigsäureäthylester und Hexan zu 1,21 g (85,8% der Theorie) der gewünschten Verbindung vom F. 131.5 bis 132,5⁰C umkristallisierl werden.

2. Synthese von AOC-Ser(Bzl)-Tyr(Bzl)-Gly-OEt

5 ml Trifluoressigsäure werden unter Rühren und Kühlung zu 3.76 g BO(-Tyr( BzD-GIy-OLt gegeben Nach 10 Minuten läßt man auf Raumtemperatur erwärmen und rührt weitere 40 Minuten. Die Trifluoressigsäure wird unter vermindertem Druck abgedampft und der erhaltene ölige Rückstand über Natriumhydroxid im Exsikkator getrocknet Das Produkt wird in 4 ml Dimethylformamid gelöst und mit 2,64 ml Triäthylamin unter Rühren und Kühlung auf den pH-Wert 7 bis 8 eingestellt. Sodann gibt man 3,70 g AOC-Ser(Bzl)-OSu zu und rührt 2 Tage bei Raumtemperatur Anschließend wird das Reaktionsgemisch mit Chloroform verdünnt, mit 1 n-Salzsäure. Wasser. 1 n-Natriumcarbonatlösung und Wasser gewaschen. Die Chloroformphase wird über Magnesiumsulfat getrocknet und abfiltriert. Nach dem Abdampfen des Chloroforms aus dem Filtrat erhält man Kristalle, die beim Umkristallisieren aus einer Mischung von Essigsäureäthylester und Hexan 4,54 g (84,1% der Theorie) des gewünschten Produktes vom F. 71 bis 74,5'C ergaben.

Analyse Tür C₁₆H₄SO)₁N₁:

Berechnet ... C
gefunden ... C"

66.74. H 7.00. N 6.48; 66.95. H 7.20. N 6.42.

3. Synthese von AOC-Ser(Bzl)-Tyr(Bzl)-Gly-ÜH In 5 ml Methanol werden 2,02 g

AOC-Ser( Bzl)-Tyr( BzI KiIy-OEt

gelost. Die Lösung wird unter Rühren tropfenweise mit 3 ml I n-Natnumhydroxidlösung versetzt und anschließend 4 Stunden zur Umsetzung gebracht. Nach der Einstellung des pH-Wertes mit 1 n-Salzsäure auf 7 wird das Methanol entfernt. Anschließend wird die Lösung mit weiterer 1 η-Salzsäure auf den pH-Wert 3 eingestellt. Die ausgefallenen Kristalle werden mit Essigsäureäthylester extrahiert. Die Essigsäureäthylesterphase wird mit Wasser gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Nach dem Filtrieren wird der Essigsäureäthylester abgedampft. Das erhaltene Produkt wird aus einer Mischung von Essigsäureäthylester und Hexan zu 3,54 g (80,4% der Theorie) des gewünschten Produktes vom F. 94,5 bis 98,0⁰C umkristallisiert. [«]„ -16,Γ (c = 1,5, Dimethylformamid).

Analyse für C₃₄H₄₁O₈N₃:

Berechnet ... C 65,89. H 6,67, N 6.78; gefunden .... C 66.20. H 6,76. N 6,68.

Aminosäureanalyse (6n-HCL I05C, 24 Stunden): Ser 0,95, Tyr 0,89, GIy 1,00.

C. Kondensation der Fragmente I und II und schrittweise Verlagerung zu RH

1. Synthese von AOC-Scr(BzI)-Tyr(Bzl)-C!y-Leu-Arg(Tos)-Pro-Gly-NH,

694 mg BOC-Leu-Arg(Tos)-Pm-GIy-NH₂ werden unter Rühren und Kühlen mit 3 ml Trifluoressigsäure versetzt. Nach 40minütigem Rühren bei Raumtemperatur wird die Trifluoressigsäure unter

ίο vermindertem Druck abgedampft. Der erhaltene ölige Rückstand wird durch Zusatz von Diäthylätber zur Kristallisation gebracht. Der abfiltrierte Niederschlag wird im Exsikkator über Natriumhydroxid getrocknet und in einem Gemisch .ms 20 ml Tetrahydrofuran und 3 ml Acetonitril gelost. Die erhaltene Lösung wird bei - 15 bis 20 C unter Rühren mit 0,17 ml N-Athyl-N'ldimethylaminopropyD-carbodiirnid versetzt Dieser Verfahrensschritt wird bei einem pH-Wert von 7 his K durchgeführt Anschließend wird das

Gemisch mit 711 mg" AOC-Sen >zl)-Tyr( BzI)-GIy-OH versetzt, das erhaltene (icmisch 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt und sodann 16 bis 18 Stunden stehengelassen Das Lösungsmittel wird unter vermindertem Druck entfernt und der Rückstand in Chloroform gelost Die Chloroformphase wird nacheinander mit I n-Salzsaure. Wasser. 5%iger Natriumhydrogencarbonatlösung und Wasser gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und abfiltnert. Nach dem Abdampfen des Chloroforms aus dem Filtrat erhält man ein gelartiges Produkt. Dieses Produkt wird chromatographisch an einer Siliciumdioxidsäule unter Elution mn einem Gemisch aus Chloroform, Methanol und hssigsaure (95:5:3) gereinigt. Das nach dem Aufarbeiten erhaltene Pulver ergibt bei der Dünnschichtchromatographie einen einzigen Flecken. Das Pulver wird aus einer Mischung von Chloroform und Diäthyläther umgefällt. Man erhält 960 mg (78,7% der Theorie) des gewünschten Produktes vom F. 118,5 bis 123 C. [«]_t -29,1 (c - 1.

Dimethylformamid).

Analyse für C₆₀H₈₂O₁₃N₁₁S ■ H₂O:

Berechnet ... C 59,29, H 6,97, N 12,67; gefunden .... C 59,35, H 6,97, N P.,20.

2. Synthese von AOC-Trp-(IHII)

856 mg AOC-Ser(Bzl)-Tyr(Bzl)-Gly-Leu-Arg(Tos)-Pro-Gly-NH₂ werden unter Rühren und Kühlen mit 5 ml Trifiuoressigsäure versetzt. Nach 10 Minuten wird das Gemisch auf Raumtemperatur erwärmt und weitere 40 Minuten gerührt. Nach dem Entfernen der überschüssigen Trifluoressigsäure durch Destillation erhält man einen öligen Rückstand, der

nach dem Versetzen mit Diäthyläther einen weißen Niederschlag ergibt. Der Niederschlag wird über Natriumhydroxid im Exsikkator getrocknet und in 2 ml Dimethylformamid gelöst. Die Lösung wird durch Zusatz von 0,2 ml N-Methylmorpholin unter

Rühren und Kühlen auf den pH-Wert 8 eingestellt Nach Zugabe von 400 mg AOC-Trp-ONp wird die Lösung 2 Tage bei Raumtemperatur gerührt und anschließend mit Chloroform verdünnt Das Gemisch wird mit 0,5 ml Dimethylaminopropylamin versetzt

und 45 Minuten gerührt. Die Chloroformphase wird nacheinander mit 1 η-Salzsäure, Wasser, 1 n-Natriumcarbonatlösung und Wasser gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet Nach fcm Abfiltrieren

und Eindampfen des Filtrates zur Entfernung des Chloroforms erhält man ein gelartiges Produkt, das ' chroiiiatographisch an einer Siliciumdioxidsäule unter Verwendung eines -Gemisches aus Chloroform, Essigsäureäthylester und Äthanol (5:5:2) als Elutionsmittel gereinigt wird. Das nach dem Aufarbeiten erhaltene Produkt ergibt bei der Dünnschichtchromatogn.phie einen einzigen Flecken. Das Produkt wird aus einer Mischung von Chloroform und Diäthyläther zu 777 mg (78,7% der Theorie) der gewünschten Verbindung vom F. 143,0 bis 148,0⁰C umkristallisiert. [u]₀ -34,5°(c= K Dimethylformamid).

Analyse für C₇IH₉₂O₁₄N₁₃S · H₂O:

Berechnet . . . C 60.83. H 6.76. N 12,99; gefunden . . . . C 60.96. H 6.66, N 13,10.

3 Synthese von B(X -His! los)-1rp-iI)-{11)

549mg AOC-Trp-SerlBzll-TyrtBzll-Gly-Leu-Arg(Tos)-Pro-Gly-NH, werden mit 0,05 ml Mercaptoäthanol (HSCH₂C H₂OH) und 5 ml Trifluoressigsäure versetzt Nach 10 Minuten läßt man auf Raumtemperatur -wärmen und rührt 40 Minuten. Die überschüssige Trifluoressigsäure wird abdestilliert und der ölige Rückstand mit Diäthyläther versetzt. Der gebildete weiße Niederschlag wird abfiltriert, über Natriumhydroxid im Exsikkator getrocknet und in einem Gemisch aus 2 ml Dimethylformamid und 3 ml Acetonitril gelöst. Die Lösung wird bei - 15 bis -20 C unter Rühren mit 0,08 ml N-ÄthyI-N'-(dimethylaminopropyD-carbodiimid und anschließend 226 mg BOC-His(Tos)-OH versetzt. Sodann wird das Gemisch eine weitere Stunde bei der gleichen Temperatur gerührt, auf Raumtemperatur erwärmt und 16 bis 18 Stunden stehengelassen. Nach dem Entfernen des Acetonitrils unter vermindertem Druck wird mit Chloroform versetzt. Die Chloroformphase wird mit 1 n-Sa!zsäure, Wasser, 5%iger Natriumhydrogencarbonatlösung und Wasser gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und filtriert. Nach dem Entfernen des Chloroforms aus dem Filtrat erhält man ein gelartiges Produkt, das chromatographisch an einer Siliciumdioxidsäule unter Verwendung eines Gemisches aus Chloroform, fcsaigsäureäthylester und Äthanol (5:5:2) als Eiutiorsrnittel gereinigt wird. Das erhaltene Produkt zeigt bei der Dünnschichtchromatographie einen einzigen Flecken. Es wird aus einer Mischung von Chloroform und Äther zu 390 mg (59,3% der Theorie) der gewünschten Verbindung vom F. 154.0 bis 157,5" C umgefällt. [<φ - 36,8' (c = 0,4, Dimethylformamid).

Raumtemperatur erwärmt und 40 Minuten gerührt. Anschließend wird die überschüssige Trifluoressigsäure durch Destillation entfernt. Der erhaltene ölige Rückstand ergibt beim Versetzen mit Diäthyläthe^r einen weißen Niederschlag, der über Natriumhydroxid im Exsikkator getrocknet und in 1 ml Dimethylformamid gelöst wird. Die Lösung wird unter Rühren und Kühlen durch Zusatz von 0,15 ml N-Methylmorpholin auf den pH-Wert 7 bis 8 eingestellt. Anschließend werden 86 mg Z-(Pyro)Glu-ONp zugegeben, und das Gemisch wird auf Raumtemperatur erwärmt und 2 Tage gerührt. Nach Zugabe vor Chloroform wird das Reaktionsgemisch mit 1 n-HCl, H₂O, 1 n-Natriumcarbonatlösung und H₂O gewaschen. Die Chloroformphase wird über Magnesiumsulfat getrocknet und filtriert. Nach dem Abdampfen des Chloroforms aus dem Filtrat erhält man ein gelförmiges Produkt. Dieses wird chromatographisch an einer Siliciumdioxidsäule unter Verwendung eiies Gemisches von Chloroform, Methanol und Essigsäure (95:5:3) als Elutionsmittel gereinigt. Das erhaltene Produkt zeigt bei der Dünnschichtchromatographie einen einzigen Flecken. Dieses Produkt wird aus einer Mischung von Chloroform und Diäthyläther zu 150 mg (54,6% der Theorie) des gewünschten Produktes vom F. 133 bis 138,5''C (Zersetzung) ungefällt.

5. Synthese von RH

In ein HF-Reaktionsgefaß werden 100 mg Z-(Pyro)-GIu - His(Tos) - Trp - Ser(Bzl) - Tyr(Bzl) - GIy - Leu-Arg(Tos)-PrO-GIy-NH₂ gebracht. Anschließend werden 51 mg Tryptophan, 21,6 mg Skatol, 0,6 ml Anisol und 5 ml HF zugegeben. Das Gemisch wird 1 Stunde bei 0"C zur Umsetzung gebracht. Anschließend wird der Fluorwasserstoff bei 0 C abdestillien. Der Rückstand wird im Exsikkator über Natriumhydroxid getrocknet, in kaltem Wasser gelöst und mit Diäthyläther gewaschen. Die wäßrige Phase wird auf eine mit einem Ionenaustauscherharz (Dowex 1 -2;AcO~- Form) beschickte Säule aufgesetzt und mit Wasser eluiert.

Die wäßrige Lösung ergibt nach Gefriertrocknung ein Pulver, das chromatographisch mit Hilfe eines Molekularsiebs (Sephadex G-15) unter Verwendung von O,2n-Essigsäure als Elutionsmittel gereinig, wird. Die Hauptfraktionen werden vereinigt und gefriergetrocknet. Man erhält 25 mg Pulver. Dieses Pulver zeigt bei der Elektrophorese einen einzigen Flecken, dessen Ninhydrinreaktion negativ und Paurireaktion positiv ist. [>z] D -46,2° (c = 0,3, Wasser).

Analyse für C₈₃H₁₀₃O_nN₁₆S₂ · H₂O:

Berechnet ... C 58.74, H 6,35, N 13,20;
gefunden .... C 58,40. H 6,11, N 13,00.

Analyse für C₅₅H₇₅O₁₃N_n · 3(CH₃COOH) ■ 4 H₂O:
Berechnet ... C 51,07, H 6,68, N 16,60;

gefunden

C 51,00, H 6,59, N 16,48.

4. Synthese von Z-(Py-o)Glu-His(Tos)-Trp-(I)-(II)

252 mg BOC-His(Tos)-Trp-Ser(Bzl)-Tyr(Bzl)-Gly-Leu-Arg(Tos)-Pro-Gly-NH₂ werden unter Rühren und Kühlen mit 0,05 ml Mercaptoäthariol, IQ mg Tryptophan und 3 ml Trifluoressigsäure versetzt. Nach 10 Minuten wird das erhaltene Gemisch auf Aminosäureanalyse (6n-HCl, 105⁰C, 24 Stunden): GIu 1,11, His 0,90, Trp 0,94, Ser 0,97. Tyr 0,96, GIy 2,02, Leu 1,00, Arg 1,02, Pro 1,05.

Der Wert für Trp wurde aus dem UV-Absorptionsspektrum, das in der Zeichnung wiedergegeben ist, gewonnen.

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Claims

Patentanspruch:

Verfahren zur Herstellung von (Pyro)glutamylhistidyl - tryptophyl - seryl - tyrosyl - glycyl - leucylarginyl-prolyl-glycinamid, dadurch gekennzeichnet, daß man

A. Leucyl-(N-geschütztes)arginyl-prolyl -glycinarnid (I), das durch Kuppeln you geschütztem Arginin mit an der Carboxylgruppe geschütztem Prolin zu Arginyl-prolin, Kuppeln des Arginyl-prolins mit Glycinamid zu Arginylprolyl-glycinamid, Kuppeln dieses Produktes an der endständigen NH₂-Gruppe mit Leucin und Entfernen der Schutzgruppe an der NH₂-Gruppe des Leucylrestes hergestellt worden ist, mit

B. (N- und O-geschütztes) Seryl-(O-geschütztes) Tyrosyl-glycin, das durch schrittweises Kuppeln eines niederen Alkylesters von Glycin mit geeignet geschütztem Tyrosin und Serin und anschließen e Hydrolyse der Estergruppe hergestellt worden ist,

C. zu mit einigen Schutzgruppen versehenem Seryl - tyrosyl - glycyl - leucyl - arginyl - prolylglycinamid kuppelt und dieses Heptapeptid schrittweise an der aminoendständigen Seite mit geeignet geschütztem Tryptophan, Histidin und (Pyroglutaminsäure zu einem geschützten Decapeptid verlängert und die Schutzgruppen durch Behandlung mit Fluorwasserstoffsäuic entfernt.