DE2817208A1 - Geschuetzte aminosaeuren oder peptide - Google Patents

Description

Takeda Chemical Industries, Ltd.

27 Doshomachi 2-chome, Higashi-ku, Osaka, Japan

Geschützte Aminosäuren oder Peptide

Die Erfindung betrifft eine neue und nützliche Schutzgruppe zum Schutz von OJ-Aminogruppen von Aminosäuren oder Peptiden.

Bei der Herstellung eines Peptids, welches sich aus Aminosäuren zusammensetzt, die eine ^ω -Aminogruppe aufweisen, z.B. Lysin, Ornithin, et, γ -Diamlnobuttersäure oder <=S ß-Diaminopropionsäure, muß die ω-Aminogruppe in der Seitenkette mittels einer geeigneten Schutzgruppe während der Herstellung des Peptids geschützt werden, um Nebenreaktionen auszuschließen. Darüber hinaus muß eine ideale Schutzgruppe für diesen Zweck während der im allgemeinen in Zwischenstufen vorgenommenen Entfernung von ^-Aminogruppen stabil sein und muß in der Endstufe vollständig entfernt werden können. Die heute zum Schutz von co-Aminogruppen angewandten Techniken erfüllen diese Anforderungen nur unvollständig und haben eine Reihe von Nachteilen. Der Grund hierfür dürfte darin liegen, daß man den Schutz in der Verwendung von Verbindungen vom Urethantyp gesucht hat, die auf Grund ihrer Natur eine unzureichende Selektivität in der Abspaltung der Schutzgruppen haben. Bei der in fester Phase durchgeführten Synthese ist es beispielsweise herkömmliche Praxis, eine oc-Aminogruppe mit einer t-Butoxyc^bonylgruppe und eine cj-Aminogruppe mit einer

809844/0833

Karbobenzoxygruppe zu schützen, jedoch ist die Abspaltungs-j reaktion zur Entfernung der t-Butoxykarbonylgruppe in «£- I Stellung in gewissem Ausmaß von einer Abspaltung der Karbo- ^: benzoxygruppe in («-Stellung begleitet, die zur Bildung von j Nebenprodukten, wie verzweigten Peptiden, beiträgt, welche j sich ihrerseits zur vergleichsweise großen Anteilen von j Verunreinigungen summieren. Um Verbesserungen zu erreichen, '.

wurde der 2-Chlorbenzyloxykarbonyl- und der Diisopropyl- j

i methyloxykarbonylrest entwickelt. Diese Gruppen sind jedoch:

schwierig vollständig zu entfernen und erfordern bei ihrer

Entfernung mit Hydrogenfluorid eine verlängerte Behandlungsdauer oder eine Behandlung bei erhöhter Temperatur, wodurch j ein ungünstiger Einfluß auf das Peptid als solches aus- : geübt wird. All dies scheint der geringen Selektivität des I Urethantyps des Schutzes zuzuschreiben zu sein, angesichts j dessen Schutzgruppen vom Sulfonamidtyp untersucht wurden. ! Die Erfindung ist ein Ergebnis dieser Untersuchungen.

Gemäß einem Aspekt betrifft die Erfindung eine Verbesserung j der Schutzgruppen für cv-Aminogruppen einer Aminosäure oder !

eines aus Aminosäureresten bestehenden Peptides, die dadurch gekennzeichnet ist, daß als Schutzgruppe für die .co -Amino- ; gruppe die p-Methylbenzylsulfonylgruppe verwendet wird. j

Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein ver- J bessertes Verfahren zum Schutz von cj -Aminogruppen einer !

Aminosäure oder eines Aminosäurerestes in einem Peptid, das ; dadurch gekennzeichnet ist, daß man die Aminosäure oder das , Peptid mit einem reaktionsfähigen Derivat einer Verbindung J umsetzt, mit der eine Schutzgruppe in die cj -Aminogruppe j eingeführt werden kann, wobei als reaktionsfähiges Derivat

ein p-Methylbenzylsulfonylhalogenid verwendet wird.

Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Abspaltung der die ca-Aminogruppe einer Aminosäure oder eines Aminosäurerestes in einem Peptid schützenden p-Methylbenzylsulfonylgruppe mit Fluorwasserstoff.

8098U/0833

Als Aminosäuren mit «J-Aminogruppen können erfindungsgemäß ^; z.B. die obengenannten Aminosäuren verwendet werden, von denen eine der am meisten verwendeten Lysin ist. Zahlreiche Peptide, die diese besondere Aminosäure enthalten, sind unter den natürlich vorkommenden physiologisch aktiven Peptiden zu finden. So tritt der Lysinrest beispielsweise in beinah allen physiologisch aktiven Peptiden einschließlich MSH (Melanophoren stimulierendes Hormon) ACTH_P Lysin-vaso- ; pressin, Neurotensin₉ Thymusserumfaktor, Endorphinen,Substanz P, Thymosinct, Glucagon und Motilin auf. ;

Die mittels p-Methylbengylsulfonyl gemäß der Erfindung schützbare Aminosäure kann eine Aminosäure mit einer Aminogruppe in wenigstens einer «p-Stellung sein. Die Erfindung ist insbesondere mit besonderem Vorteil auf ct₈cü-Diamino~ säuren anwendbar, die auch eine <x-ständige Äminogruppe haben«, Wenn eine bestimmte Aminosäure optisch aktive Formen _; aufweist, kann die L-Fora, die D-Form oder das Racemat verwendet werdem So ist beispielsweise die erfindungsgemäße Schutzgruppe in vielen Fällen vorteilhaft auf geradkettige 'X s^-Diaminosäuren ait bis su β Kohlenstoffatomen anwendbar. \

Die Karboxylgruppe einer Aminosäure mit einer (J -ständiges Äminogruppe, die erfindungsgemäß durch p«=Methylbenzylsulfonyl geschützt ist, kann eine freie Karbösrf !gruppe oder eine Karboxylgruppe aufweisen, die auf geeignete Weise aktiviert oder auf herkömmliche Weise geschütst worden ist. Ist eine ' zusätzliche Aminogrupps in ©i-Stellung vorhanden₅ kann diese . eine freie Äminogruppe ©der ©ine Amiaogruppe s@in_? die durefo eine herkömmliehe Schutzgruppe geschütst Ist.

Die er-flndungsgemäß mittels p-Methylbenzylsulfonyl ge- , schützte Aminosäure mit ©iner a?-Ämiaogrupp© kann nach Eoutineverfahren zum Sehutg ύοώ. u3 ~ Amino gruppen hergestellt w@rdea_o Sie kass, beispielgx-jsis® hergestellt i-yereLen durch Umsetzung ©in©s p=Metliyll5©azylsialforijl!ialegGaicls₉ bevorzugt ; ä®s ©atsprecheadea Chloride j, alt dsr Aaiaognappe _s di© ©la©

oi -Aminogruppe aufweist. Diese Reaktion kann bei einer geeigneten Temperatur im Bereich von etwa -10 bis +50⁰C und in Gegenwart eines Lösungsmittels (z.B. Wasser, wässriges Tetrahydrofuran, wässriges Dioxan, wässriges Dimethylformamid usw.) durchgeführt werden.

Im Fall einer ^,^-Diaminosäure liefert die Umsetzung eines Metallkomplexes, in dem die * -Aminogruppe und die !Carboxylgruppe durch Chelatbildung maskiert" sind, vorzugsweise ein Kupferkomplex hiervon mit p-Methylbenzylsulfonylhalogenid, den Metallkomplex der <*·, ω -Diaminosäure, iipem die G;-Aminogruppe durch die obige Schutzgruppe geschützt ist, worauf diese Verbindung in die in cc -Stellung geschützte Aminosäure mit einer freien oi-Aminogruppe und·einer freien Karboxylgruppe nach Entfernung des Metalls auf an sich bekannte Weise (z.B. durch Behandlung mit Schwefelwasserstoff oder einem Harz) umgewandelt werden kann. Falls gewünscht, kann die freie <*-Aminogruppe dieser zuletzt genannten Verbindung mit einer bekannten Schutzgruppe (z.B. t-Butoxykarbonyl, Karbobenzoxy usw.) auf bekannte Weise geschützt sein. Es ist auch möglich, die freie KarboxyIgruppe der gleichen Verbindung mit einer bekannten Schutzgruppe (z.B. Metallsalz, niederem Alkylester usw.) zu schützen oder sie durch herkömmliche Verfahren (z.B» durch Bildung des Säureanhydes Azids oder eines aktiven Esters) zu aktivieren. ,

Die obengenannt© Aminosäure, die eine durch p-Methylbenzyl- j sulfonyl erfindungsgemäß geschützte tu -Aminogruppe aufweist,: kann mit bemerkenswertem Vorteil in an sich bekannten Ver- ■ fahren für die Herstellung von Peptiden angewendet werden, die Rests einer solchen Aminosäure enthalten. Die erfin- \ dungsgemäßs Schutzgrupp© kann leicht_? beispielsweise durch , 1-stündige Behandlung mit Fluorwasserstoff bei etwa -2O⁰C entfernt werden.

Die /üflinosäurens welche ω-Aainograppen aufweisen, die durch

l geieliütst gindp sowie die Peptide,

die Reste solcher geschützten Aminosäuren enthalten, haben die folgenden und weitere nützliche Eigenschaften, durch deren Ausnutzung Peptide auf profitable Weise nach in der Peptidsynthese bekannten Methoden erzeugt werden können:

(1) Die Schutzgruppe (p-Methylbenzylsulfonyl) kann durch eine zweckmäßige Behandlung (z.B. Behandlung mit Fluorwasserstoff) innerhalb kurzer Zeit und beinahe quantitativ entfernt werden. :

(2) Die Schutzgruppe zeigt spezifische Selektivität und bleibt ohne Zersetzung unter den normalerweise bei verschiedenen Zwischenstufen in der Peptidsynthese angewendeten Bedingungen stabil, z.B. unter den üblicherweise zur Entfernung von t-Butoxykarbonyl, welches eine cc-Amino-Schutzgruppe ist, angewandten Bedingungen (z.B. Behandlung mit Trifluoressigsäure, Trifluoressigsäure-Dichlormethan oder 2N-HCl-dioxan) sowie unter den Bedingungen der katalytischen Reduktion zur Entfernung der Karbobenzoxy- und Benzylester-Gruppe.

(3) Die Schutzgruppe kann gleichermaßen vorteilhaft in

Flüssigphaseverfahren ebenso wie in Festphasenverfahren angewandt werden.

(4) Peptide können in hoher Reinheit und hoher Ausbeute erzeugt werden. ,

Die herkömmlichen Verfahren zum Schutz und zur Aktivierung j der vorstehend genannten Amino- und !Carboxylgruppen sowie die Routineverfahren zur Synthese von Peptiden sind beispielsweise beschrieben "Chemistry of the Amino Acids", '■. Volume 2 (1961), von J.P. Greenstein und M. Wintitz, John Wiley & Sons, Inc. New York, U.S.A. sowie "The Peptides" Band 1 (1966), von Schröder und Lübke, Academic Press, New York, U.S.A.

In der folgenden Beschreibung werden für Aminosäuren,Peptide, Schutzgruppen und aktive Gruppen manchmal einige der von der IUPAC-UIB Kommission für Biologische Nomenklatur

809844/0833

festgesetzten Abkürzungen oder die üblicherweise verwendeten Trivial-Abkürzungen verwendet. Beispiele für solche Abkürzungen sind:

Boc

2-Cl-Z Xys HCNb OSu OKP CBzI BzI OBut MBS DCC Lys GIy GIu Leu Tyr Asn Pro Arg lie Ala Ser pGlu

t-Butoxykarbonyl

Karbobenzoxy

2-Chlorbenzyloxykarbonyl

p-Methylbenzylsulfonyl (p-Xylyl- -sulfonyl)

N-Hydroxy-5-norbornen2,3-dikarboxyimid

N-Hydroxysuccinimidester

p-Nitrophenylester

Benzylester

Benzylather

t-Butylester

p-Methoxybenzolsulfonyl

Di cyclohexylkarbodiimid

Lysin

Glycin

Glutaminsäure

Leucin

Tyrosin

Asparagin

Prolin

Arginin

Isoleucin

Alanin

Serin

Pyroglutaminsäure

In den Beispielen, in denen Aminosäure optische Isomere haben, sind die L-Verbindungen gemeint, falls nicht anderweitig angegeben.

809844/0833

Beispiel 1 Synthese von p-Me thylbenzyl sulf onylchlor id.

In einer 10 l&igen wäßrigen Lösung von Natriumhydroxid (250 ml) werden 67 g (0,53 Mol) Natriunmsulfit gelöst, worauf 75 g (0,53 Mol) p-Menthylbenzylchlorid zugegeben werden. Das Gemisch wird unter Rühren 4 Stunden am Rückfluß erhitzt. Das Reaktionsgemisch wird mit der zweifachen Wassermenge verdünnt und heiß filtriert. Das Filtrat wird abgekühlt und die Kristalle von Natrium-p-methylbenzylsulfonat abfiltriert. Ausbeute: 51 g (46 %).

In 90 ml Dimethylformamid werden 30 g (0,145 Mol) Natriump-methylbenzylsulfonat, das ausreichend trocken ist, dispergiert. Die Dispersion wird auf -10⁰C gekühlt, worauf unter Rühren 19,2 ml (0,29 Mol) Thionylchlorid zugegeben werden. Das Gemisch wird 3 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und dann in Eiswasser (500 g) gegossen und dreimal mit je 150 ml Äther extrahiert. Die Ätherschichten werden vereinigt, zweimal mit kaltem Wasser gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Der Äther wird abdestilliert, worauf dem kristallinen Rückstand Petroläther zugesetzt und abgekühlt wird. Die Kristalle werden abfiltriert. Ausbeute: 23,5 g (78 #), Schmelzpunkt 80-81⁰C.

Beispiel 2

Synthese von H-Lys(Xys)-OH

In einer 2N-wäßrigen Lösung von Natriumhydroxid (54 ml) werden 65 Millimol Lysin-Kupfer-Komplex gelöst, worauf 15 ml Dioxan zugegeben werden. Unter heftigem Rühren setzt man tropfenweise bei O⁰C 40 ml einer Dioxanlösung zu, die 14,7 g (72 mMol) p-Methylbenzylsulfonylchlorid enthält. Nach Been- > digung der tropfenweisen Zugabe wird das Gemisch 1 Stunde bei O⁰C und 4 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Der erhaltene Niederschlag wird durch Filtration gesammelt, mit

809844/0833

no

/fässer und Alkohol gewaschen und getrocknet. Dieser Niederschlag -wird in IN-Chlorvasserstoffsäure gelöst, worauf man in die Dispersion etwa 30 Minuten lang Schwefelwasserstoffgas einleitet. Danach wird 1 1 warmes Vasser zur Lösung des Niederschlags der gewünschten Verbindung zugegeben, worauf das Kupfersulfid abfiltriert wird. Das FiItrat wird auf pH eit konzentriertem wäßrigen Ammoniak eingestellt, worauf nach dem Abkühlen die Kristalle durch Filtration gesammelt und aus heißes Wasser unkristallisiert werden.

Ausbeute: 8,2g (40,7 %). Schmelzpunkt 261⁰C (Zersetzung). Rf (n-Eutanol-äthylacetat-Essigsäure-Wasser=1:1:1:1) = 0,73

Ω°ϋ^ + 15,5°(c=0,5, Essigsäure)
Elezaentaranalyse für ^c-j4^H22°4^N2^S

Berechnet: C, 53,48; H, 7,05; N, 8,91; S, 10,20 Gefunden: C, 53,36; H, 7,35; N, 8,86; S, 10,00

Beispiel 3 Synthese von Boc-Lys(Xys)-OH

H-Lys(Xys)-OH(6,3 g, 20 mMole) Triäthylamin (4,2 ml) und 2-t-Butoxykarbonyl-4,6-dimethyl-2-mercaptopyrimidin (6,2 g, 26 mMole) werden in einem Lösungsmittelgemisch aus Wasser und Dioxan (25 ml-25 ml) bei Raumtemperatur unter intensivem Rühren während 48 Stunden umgesetzt. Nach der Zugabe von 50 ml Wasser wird das Reaktionsgemisch zweimal mit je 50 ml Äther extrahiert. Die wäßrige Schicht wird gekühlt, mit 3N-Chlorwasserstoffsäure auf pH 2 eingestellt und mit 100 ml Äthylacetat extrahiert. Die Äthylacetatschicht wird mit 1N-ChIorwasserstoffsäure (50 ml, dreimal) und Wasser gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Das Äthylacetat wird abdestilliert, worauf der Rückstand durch Anreiben mit Petroläther kristalliert. Nach dem Abkühlen werden die Kristalle abfiltriert. Ausbeute: 7,6 g (91,7 %), Schmelzpunkt 94-95⁰C

809844/0833

Rf² (Chloroform-methanol-Essigsäure=9:1:0,5)=0,58 (oc)^2O-1,5°(c=O,5, Methanol)

Elementaranalyse für C^gH^OgNpS

Berechnet: C, 55,05; H, 7,30; N, 6,76 Gefunden: C, 55,27; H, 7,09; N, 6,72

Beispiel 4

Relative Stabilität von Amino-Schutzgruppen, nämlich Xys, 2-Chlorbenzyloxycarbonyl und Z gegen Trifluoressigsäure.

41,4 mg (0,1 mMol) Box-Lys(Xys)-OH, 48,8 mg (0,1 niMol) Boc-Lys(2-Cl-Z)-0H«t-butylaniinsalz und 56,1 mg (0,1 mMol) Boc-Lys(Z)-OH«dicyclohexylaminsalz werden jeweils in 0,5 ml Trifluoressigsäure, welches 0,03 ml Anisol enthält, gelöst, worauf die Lösungen bei Raumtemperatur 24 Stunden stehengelassen werden. Die Trifluoressigsäure wird abdestilliert, worauf der Rückstand mit kaltem Wasser auf 20 ml aufgefüllt wird. In aliquoten Anteilen dieser Lösung wird der Lysingehalt mittels eines Aminosäureanalysators bestimmt. Die Ausbeuten an Lysin (% Abspaltung der £-Aminoschutzgruppen) wird berechnet.

Xys : 0,0 %
2-Cl-Z : 4,8 %
Z : 70,6 %

Beispiel 5

Relative Leichtigkeit (96) der Abspaltung verschiedener Aminoschutzgruppen, nämlich Xys, Benzylsulfonyl und 2-Chlorbenzoxycarbonyl mit Fluorwasserstoff

124,4 mg (0,3 mMol) Boc-Lys(Xys)-OH, 90 mg (0,3 mMol) N^£-Benzylsulfonyllysin und 146,4 mg (0,3 mMol) Boc-Lys-(2-Cl-Z)-0H»t-butylaminsalz werden jeweils mit 2 ml Fluor-

809844/0833

•wasserstoff in Gegenwart von 0,1 ml Anisol 1 Stunde lang bei -20⁰C behandelt. liach dem Abdestillieren des Fluorwasserstoffs wird der Rückstand in 50 ml Wasser gelöst. In aliquoten Teilen der Lösung wird der Lysingehalt der Probe mittels eines Aminosäureanalysators bestimmt. Die prozentualer. Ausbeuten an Lysin werden berechnet.

Xys : 97,3 %

Benzylsulfonyl : 64,4 % 2-Cl-Z : 86,3 %

Beispiel 6 Synthese von H-GIy-Lys-Gly-OH

a) Herstellung von Boc-Lys(Xys)-Gly-OBzl

829 mg (2 sMol) Boc-Lys(Xys)-OH, 742 mg (2,2 mMol) H-GIy-OBzl-TosOH und 396 mg (2,2 mMol) HONb werden in 30 ml Acetonitril gelöst, worauf auf 0⁰C abgekühlt wird. 0,31 ml Triäthylaain und 454 mg (2,2 mMol) Dicyclohexylkarbodiimid werden zu dieser Lösung zugegeben, worauf das Gemisch 3 Stunden bei 0⁰C und 15 Stunden bei Raumtemperatur gerührt wird. Der Dicyclohexy!harnstoff wird abfiltriert, worauf das Lösungsmittel durch Destillation entfernt wird. Der Rückstand wird in 50 ml Äthylacetat gelöst, mit 5 #iger wäßriger Natriumhydrogenkarbonatlösung, 1N-ChIorwasserstoff und Wasser gevi-aschen und über Natriumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wird abdestilliert und der Rückstand aus Äther umkristallisiert. Nach dem Abkühlen werden die Kristalle abfiltriert. Ausbeute: 1,10 g (97,7 9Ü Schmelzpunkt 87r89°C. (oc) ^°-9,4°(c=0,5 Methanol)

Rf²=0,59.

Elementaranalyse für C₂qH,q0₇N,S

Berechnet: C, 59,87; H, 7,00; N, 7,48 Gefunden: C, 59,99; H, 6,70; N, 7,55

809844/0833

b) Herstellung von Boc-Gly-Lys(Xys)-Gly-OBzl

In 2 El Trifluoressigsäure werden 562 mg (10 mMol) 3oc-Lys-(Xys)-Gly-03zl gelöst, worauf man 20 Minuten lang bei Raumtemperatur reagieren läßt. Die Trifluoressigsäure wird danach abdestilliert.

Der Rückstand wird mit Äther behandelt und der pulverförmige Rückstand abfiltriert und getrocknet. Das Salz der Trifluoressigsäure und 370 ml (1,0 mMol) Z-GIy-ONb werden in 10 ml Disi'ithyLformaaid gelöst. Nach Zugabe von 0,14 ml Triäthylasin wird das Gemisch 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Danach wird das Lösungsmittel abdestilliert und der Rückstand in 20 ml Äthylacetat gelöst. Die Lösung wird mit 5 tigern wäßrigen Natriumhydrogenkarbonat, IN-Chlorwasserstoff und Wasser gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wird abdestilliert, worauf der Rückstand durch Zugabe von Äther kristallisiert. Danach wird Petroläther zugesetzt, worauf nach Abkühlen die Kristalle abfiltriert werden. Ausbeute: 561 mg (86 %), Schmelzpunkt 70-71⁰C

(x) g°+1,34°(c 0,5, Methanol)
Rf²=0,48
Elenentaranalyse für C,,H»qOqN^S

Berechnet: C, 60,71; H, 6,18; N, 8_r58; S, 4,91 Gefunden: C, 60,71; H, 6,27;, N, 8,57; S, 4,89

c) Synthese von H-Gly-Lys-Gly-OH

195 mg (0,3 mMol) Z-GIy-Lys(Xys)-Gly-OBzl werden mit 3 ml Fluorwasserstoff in Gegenwart von 0,3 nil Anisol 1 Stunde bei -2O⁰C behandelt. Der Fluorwasserstoff wird abdestilliert, worauf der Rückstand in 20 ml Wasser gewaschen und mit Äther extrahiert wird. Die wäßrige Schicht wird durch eine Säule von Amberlit IR-45 (Acetatform, 2x5 cm) gegeben, worauf die Säule mit 30 ml Wasser gespült wird. Abfluß und Waschwasser werden vereinigt und nach der Zugabe von 0,6 ml 1N-Chlorwasserstoffsäure lyophilisiert, wobei ein flockiges weißes Pulver erhalten wird. Ausbeute 91 mg (90,4 %)

8098U/0833

<--ΐ) Q°-22,7°(c 0,5, IN-KCl)

Rf¹= 0,13

Slexentaranalyse für C^K^O^N^

Berechnet: C, 35,03; K, 6,77; N, 16,37 C, 35,41; η, 6,70; N, 16,16

Gerunden

Beispiel 7 Synthese von K-Gly-Lys(Xys)-GIy-OK

130 mg (0,2 EiXoI) Z-Gly-Lys(Xys)-Gly-03zl wird in einem Lcsungsniittelgemisch aus Äthanol und Wasser (je 15 sil) mit Pallaiiunscnwarz als Katalysator 3 Stunden bei Zirenertemperatur reduziert, worauf der Katalysator abfiltriert und das Lösungsmittel abdestilliert vird. Der kristalline Rückstand wird aus Hasser-Äthanol umkristallisiert. Ausbeute: 75 mg (87 %), Schmelzpunkt 214°C (Zersetzung). '*} ß°-i4,5°(c 0,5, Essigsäure)
Rf¹=0,61
Slementaranalyse für C₁₈H₂₈O₆N^S.1/2H₂O Berechnet: C, 49,41; H, 6,68; N, 12,80; S, 7,33 Gefunden: C, 49,78; H, 6,81; N, 12,86; S, 6,77

Beispiel 8

Herstellung von pGlu-Leu-Tyr-Glu-Asn-Lys-Pro-Arg-Arg-Pro-Tyr-Ile-Leu-OH (Neurotens in)

a) Herstellung von Z-Asn-Lys(Xys)-Pro-OBzl

4,14 g (10 mMol) Boc-Lys(Xys)-OH, 2,65 g (11 mMol) H-Pro-03Zl-KCl und 1,99 g (11 mMol) HONb werden in 30 ml Acetonitril gelöst, worauf die Lösung auf O⁰C gekühlt vird. Danach werden 1,54 ml Triäthylamin und 2,27 g (11 mMol) Dicyclohexylkarbodiimid zugegeben, worauf das Gemisch 4 Stunden bei 0⁰C und 15 Stunden bei Raumtemperatur gerührt wird.

8098U/0833

L'3r Dicycloherylharnstoff wird abfiltriert und das Lösungsmittel dvrcb Destillation entfernt. Der Rückstand wird in ICO rl Äthylacetat gelöst, mit 5 tigern wäßrigen Katriumh-'dro2?r.ko.rbonat. 1?7-Chlorwasser stoff säure und Wasser ge- -i?.scr.?r. urd über Natriumsulfat getrocknet. Das Äthylacetat xird dr-^r. e/ccestilli^rt, worauf Boc-Lys(Xys)-Pro-CBzl als 3iru-'i.rt:.ge Substanz erhalten wird (5,9 g, 98 %; Rf¹=0,82).

Dierr^r Sirup >rird in 30 nl Trifluoressigsäure gelöst und 3C y.trjjtcr. bei Raumtemperatur stehengelassen. Nach der Zu-

'Ό ~abc -.-cn 5,5 N-HCl-Dioxan (2 nl) wird die Trifluoressig- s^:i".T°, - te.-, stilli ert. Der ölige Rückstand wird mit 50 ml Ä^h-sr ur.d 50 ±1 Petrolather angerieben, worauf der überrr~anu verworfen wird. Diese Operation wird insgesamt drei-CiI ---.-i^aerholt, worauf der Rückstand in Gegenwart von Natri-

'5 v-hyrirc^id .getrocknet wird. Dieses Trifluoressigsäure salz, 2.0' g (10 -allol) Z-Asu-OH und 2,07 g (11,5 taKol) HONb werden in 30 ei Dimetyhlformamid gelöst und nach dem Abkühlen auf O⁰C rit 1,4 nl Triäthylamin und 2,38 g (11,5 BiMoI) Dicycloh?;cylkarcOdiinid versetzt. Das Gemisch wird 3 Stunden bei 0°C gerührt, danach 15 Stunden bei Raumtemperatur. Der Niederschlag wird abfiltriert, worauf das Lösungsmittel abdestiliiert wird. Der Rückstand wird durch Säulenchromatograpliie an Silikagel (6x15 cm) unter Verwendung von 3 % Xcthanol-Chlcrofona als Entwicklungslösungsmittel gereinigt.

Die 500 nil - 640 mi-Fraktionen werden vereinigt, das Lösungsmittel wird abdestilliert, der Rückstand mit Petroläther behandelt und die erhaltenen Pulver durch Filtration ge-G3.nrelt. Ausbeute 2,7 g (36 96), Schmelzpunkt 75-78°C v-'/i;^J-33 5 4°(c=0,5, Dimethylformamid)

Rf¹=0,58.

Sienentaranaiyse für C,_QH.«OqNcS

Berechnet: C, 60,86; H, 6,32; N, 9,34; S, 4,28 Gefunden: C, 60,71; H, 6,24; N, 9,14; S, 4,17

809844/0833

b) Herstellung von H-Asn-Lys(Xys)-Pro-OH

2,25 g (3 mMol) Z-Asn-Lys(Xys)-Pro-OBzl werden in einem Lösur.gS3ittelgemisch aus Äthanol und Wasser (70 ml-40 ml)" gelöst und katalytisch mit Palladiumschwarz während 4 Stunden reduziert. Der Katalysator wird abfiltriert, worauf das Lösungsmittel durch Destillation entfernt wird. Zum Rückstand werden 50 ml Acetonitril gegeben, worauf die erhaltenen Pulver durch Filtration gesammelt werden. Ausbeute: i.39 g (89 %), Schmelzpunkt 108⁰C (Zersetzung) ^/p°-38,7⁰(c=0,5, Essigsäure)
Rf¹=0,63
Elementaranalyse für C₂,H,,=0₇NeS

Berechnet: C, 52,55; H, 6,71; N, 13,33; S, 6,10 Gefunden: C, 52,65; H, 6,88; N, 12,75; S, 5,92

c) Herstellung von Boc-Glu(OBzl)-Asn-Lys(Xys)-Pro-OH

1,01 g Boc-Glu(0Bzl)-0H (3 mMol) und 537 mg HOKb (3 mMol) werden in 20 ml Acetonitril gelöst, worauf nach Abkühlen auf O⁰C 618 mg (3 mMol) Dicyclohexylkarbodiimid zugegeben werden. Das Gemisch wird 3 Stunden bei 0⁰C und 5 Stunden bei Rauntemperatur gerührt. Der ausgefallene Dicyclohexylharnstcff wird abfiltriert und das Lösungsmittel durch Destillation abgedampft, wobei Boc-Glu(OBZl)-ONb erhalten wird. (Nachfolgend werden die aktiven HONb-Ester von Boc-Aminosäuren in der oben beschriebenen Weise hergestellt.)

1,39 g H-Asn-Lys(Xys)-Pro-OH (2,67 mMol) werden in 40 ml Dimethylformamid gelöst. Nach der Zugabe von 0,38 ml Triäthylamin und dem obigen Boc-Glu(OBzl)-ONb wird das Gemisch 20 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wird abdestilliert, worauf der Rückstand in 5 #iger wäßriger Natriumhydrogenkarbonatlösung (80 ml) gelöst und zweimal mit je 40 ml Äthylacetat extrahiert wird. Die wäßrige Schicht wird abgekühlt,mit 3N-Chlorwasserstoff säure auf pH 2 eingestellt und mit Äthylacetat-n-butanol (100 ml-20 ml) extra-

809844/0833

hiert. Die organische Schicht wird ait Wasser gewaschen, über Katriuxsulfat getrocknet und auf etwa 15 ml eingeengt. Dem Konzentrat werden 60 ml Äther zugesetzt, worauf nach Abkühlen der Niederschlag durch Filtration gesammelt wird. Ausbeute: 1,55 g (69 %), Schmelzpunkt 124⁰C (Zersetzung).

fr) !°-23,9°(c=0,5 Dimethylformamid)

Rf^ (Äthylacetat-Pyridin-Essigsäure-¥asser=60:20:6:11) =0,60

Eleinentaranalyse für ^c4n^H56^1 2^N6^S

Berechnet: C, 56,85; H, 6,68; N, 9,96; S, 3,80 Gefunden: C, 56,70; H, 6,78; N, 9,84; S, 3,69

d) Herstellung von Boc-Tyr-Glu(OBzl)-Asn-Lys(Xys)-Pro-CH

In 10 ml Trifluoressigsäure werden 1,01 g (1,2 mMol) Boc-Glu(OBzl)-Asn-Lys(Xys)-Pro-OH gelost, worauf die Lösung bei Raumtemperatur 30 Minuten lang stehengelassen wird. Nach dem A'odestillieren der Trifluoressigsäure werden zum Rückstand 30 ml Äther gegeben, worauf der Niederschlag abfiltriert, getrocknet und in 20 ml Dimethylformamid gelöst wird. Danach werden 0,34 ml Triäthylamin und 570 ml (1,5 eMoI) Boc-Tyr-OSu zugegeben, worauf das Gemisch bei Raumtemperatur 43 Stunden gerührt wird. Zu dem Reaktionsgemisch setzt man 100 ml einer 2 #igen wäßrigen Lösung von Zitronensäure, worauf der Niederschlag mit n-Butanol extrahiert wird. Die n-Butanolschicht wird gut mit Wasser gewaschen und auf etwa 10 ml eingeengt. Zum Konzentrat werden 50 ml Äther gegeben, worauf nach dem Abkühlen der Niederschlag abfiitriert wird. Ausbeute: 1,13 g (93,4 %), Schmelzpunkt 119-120⁰C Q*)|°-22,9°(c=0,5 Dimethylformamid)
Rf³=0,46
Elementaranalyse für ^c4g^H65°i4^N7^S

Berechnet: C, 58,37; H, 6,50; N, 9,73; S, 3,18 : Gefunden: C, 58,29; H, 7,14; N, 9,61; S, 3,16

809844/0833

e) Herstellung von Boc-Leu-Tyr-Glu(OBzl)-Asn-Lys(Xys)-

?rc-CH

Ir. 5 tJ. Trifluoressigsäure werden 860 mg (0,85 mMol) Boc- -7r-GIu-(03zl)-Asn-Lys(Xys)-?ro-0H gelöst. Die Lösung wird 30 Minuten bei Rauntenvperatur stehengelassen, worauf die Trifluoresoigsäure abdestilliert wird. Zum Rückstand werden 30 nil Äther gegeben, worauf der Niederschlag abfiltriert, getrocknet vnä in 20 ml Dimethylformamid gelöst wird. Zu dieser Lösung setzt man tropfenweise 0,24 ml Triethylamin und Boc-Leu-Ojfü (hergestellt aus 1,02 ml-lols jeweils von Boc-Leu-CH. KC:rb und DCC). Das Gemisch wird 20 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Danach versetzt man mit 100 ml einer 2 %igon wäßrigen Zitronensäurelösung, sammelt den erhaltenen Miederschlag und wäscht gut mit Wasser. Der Niederschlag wird eus Acetonitril-Ather umgefällt. Ausbeute: 824 ng (33,2 %), Schmelzpunkt 158-160⁰C

Ή P°-21,4°(c=C,5 Dimethylformamid) Rf⁵=0,48

Elementaranalyse für CccHygO^cNgS

Berechnet: C, 58,91; H, 6,83; N, 9,99; S, 2,86 Gefunden: C, 58,77; H, 7,10; N, 9,99; S, 2,71

f) Herstellung von Z-pGlu-Leu-Tyr-Glu(OBzI)-Asn-Lys(Xys)-Pro-OH

In 5 ml Trifluoressigsäure löst man 617 mg (0,55 mMol) Boc-Leu-Tyr-Glu(OBzl)-Asn-Lys(Xys)-Pro-OH. Die Lösung wird 30 Minuten bei Zimmertemperatur stehengelassen, worauf die Trifluoressigsäure abdestilliert wird. Der Rückstand wird mit 30 ml Äther versetzt, der erhaltene Niederschlag abfiltriert und in 10 ml Dimethylformamid gelöst. Danach wird mit 0,16 ml Triäthylamin und 281 mg (0,66 mMol) Z-pGlu-ONb versetzt, worauf das Gemisch 48 Stunden bei Raumtemperatur gerührt wird. Zu dem Reaktionsgemisch gibt man 100 ml einer 2 #igen wäßrigen Lösung von Zitronensäure, sammelt den

809844/0833

BAD ORIGINAL

28172Q8

erhaltenen Niederschlag durch Filtration und wäscht gut mit Wasser. Das rohe Produkt wird mit 30 ml heißem Acetonitril gewaschen. Ausbeute: 595 mg (85,4 %), Schmelzpunkt .209-211⁰C. ■ ■ .

^) ²⁰-31,2°(c=0,5 Dimethylformamid) Rf²=0,43
Elementaranalyse für

Berechnet: C, 59,75; H, 6,29; N, 9,95; S, 2,53 Gefunden: C, 59,48; H, 6,50; N, 9,73; S, 2,18

g) Herstellung von Z-Arg(MBS)-Fro-CBu

7,79 g (15 mKol) Z-Arg(MBS)-OH und 3,57 g (15,5 sjKoI) H-Pro-OBu* werden in 100 ml Acetonitril gelöst. Nach Abkühlen auf Q⁰C fügt man 3,71 g (18 mMol) DCC zu, worauf das Gemisch 5 Stunden bei 0⁰C und 15 Stunden bei Zimmertemperatur gerührt wird. Der Dicyclohexylharnstoff wird abfiltriert und das Acetonitril durch Destillation entfernt. Der Rückstand wird in 150 ml Äthylacetat gelöst und mit 5 #iger wäßriger Natriumhydrogenkarbonatlösung 1N-HCl und Yasser gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Das Äthylacetat wird ab-' destilliert, worauf Äther zugegeben und der Rückstand mit Äther unter Kristallisierung verrieben wird. Die Kristalle werden aus Äthyiacetat-Äther umkristallisiert. Ausbeute: 6,62 g (70 96), Schmelzpunkt 107-108⁰C ;

i^D⁰"²⁷»5° (c=0,5 Dimethylformamid Rf²=0,69

Elementaranalyse für C,qH^qO₈NcS'

Berechnet: C, 57,03; H, 6,54; N, 11,09; S, 5,08 Gefunden: C, 57,Ot; H, 6,45; N, 11,13; S, 5,09

809844/0833

- ψ-

ZO

h) Herstellung von Z-Arg(KBS)-Arg(MBS)-Pro-OBu Kan lest 5,05 g Z-Arg(XBS)-Pro-OBu* (8 mMol) in 100 ml Methanol.

Zur Lösung wird Palladiumschwarz-Katalysator gegeben, worauf lan durch die Lösung 16 Stunden zwecks katalytischer Reduktion Wasserstoff durchleitet. Der Katalysator wird durch Filtration entfernt, worauf das Methanol abdestilliert wird. Der Rückstand und 4,15 g (8 mMol) Z-Arg(MBS)-OH werden in 50 El Dimethylformamid gelöst und auf O⁰C abgekühlt. Hierzu gibt man 1,98 g DCC (9,6 mMol) und rührt 5 Stunden bei 0⁰C und weitere 12 Stunden bei Raumtemperatur. Der erhaltene Niederschlag wird abfiltriert und das Filtrat mit 300 ml Wasser versetzt. Der ölige Niederschlag wird mit einem L6-sungsnittelgesisch aus Äthylacetat-n-butanol (200 ml-50 ml) versetzt. Die organische Schicht wird mit 5 #iger wäßriger Natriuikarbonatlösung, IN-Chlcrwasserstoffsäure und Wasser gewaschen, worauf über Natriumsulfat getrocknet wird. Das Lösungsmittel wird bis zu einem Volumen von etwa 30 ml abgecanpft, worauf 100 ml Äther zugegeben werden. Nach dem

2C Abkühlen wird der Niederschlag abfiltriert. Ausbeute: 5,30 g (69,2 96), Schmelzpunkt 119⁰C (Zersetzung) £<7£⁰-17,7°(c=0,5, Dimethylformamid) Rf²=0,34

Elementaranalyse für ^c43^H5gO-j 2^No°2 *^2^

Berechnet: C, 52,90; H, 6,30; N, 12,92; S, 6,57 ; Gefunden: C, 53,21; H, 6,37; N, 12,91? S, 6,29

i) Herstellung von Z-Ile-Leu-OBu _:

6,41 g (15 mMol) Z-IIe-ONb und 2,81 g (15 mMol) H-Leu-OBu* werden in 30 ml Acetonitril gelöst, worauf die Losung 24 : Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen wird. Das Acetonitril wird abdestilliert, worauf der Rückstand in 100 ml : Äthylacetat aufgelöst wird. Die Lösung wird mit 5

809844/0833

wäßriger Natriumhydrogenkarbonatlösung, 1N-Chlorwasserstoffsäure und Wasser gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wird abdestilliert, worauf der Rückstand aus einer kleinen Menge Petroläther kristallisiert
wird. Nach dem Abkühlen werden die Kristalle abfiltriert.
Ausbeute: 5,90 (90,4 %), Schmelzpunkt 83-85°C

(<*)q^O-18,5° (c=0,5 Dimethylformamid)

Rf2=0,80.	für C.	,34;	H,	8	5N2	N,	6	,45
Elementaranalyse	66,	,52;	H,	8	,81;	N,	6	M
Berechnet: C,	66				,97;
Gefunden: C,

3) Herstellung von Z-Tyr-Ile-Leu-OBu

3,05 g Z-Ile-Leu-OBu^ (7 mMol) werden in 100 ml Methanol
gelöst, worauf Palladiumschwarz zugegeben und zwecks kata- ' lytischer Reduktion Wasserstoffgas während 3 Stunden durch die Lösung geleitet wird. Der Katalysator wird abfiltriert, worauf das Lösungsmittel abdestilliert wird. Der Rückstand sowie 3,81 g (8 mMol) Z-Tyr-ONb werden in 80 ml Acetonitril gelöst, worauf die Lösung 24 Stunden bei Raumtemperatur

stehengelassen wird. Das Lösungsmittel wird abdestilliert,
worauf der Rückstand in 100 ml Äthylacetat gelöst wird. Die Lösung wird mit 5 tigern wäßrigen Natriumhydrogenkarbonat,
1N-Chlorwasserstoffsäure und Wasser gewaschen und über : Natriumsulfat getrocknet. Das Äthylacetat wird abdestil- :

liert, worauf der kristalline Rückstand aus Äthylacetat-

Petroleumbenzin umkristallisiert wird. Ausbeute: 3,10 g ; (74,2 %), Schmelzpunkt 142-144°C. !

(°9i;⁰-22,2⁰(c=0_t5 Dimethylformamid) ^;

R Ao, 64 ;

Elementaranalyse für C,,H^yOyN, j

Berechnet; C, 66,31; H, 7,93; N, 7,03 !

Gefunden: C, 66,12; H, 7,93; N, 7,05 !

8098U/0833

- 26 -

k) Herstellung von Z-Arg(MBS)-Arg(MBS)-Pro-Tyr-Ile-Leu-OBu*

2,09 g (3,5 mMol) Z-Tyr-Ile-Leu-OBu werden in 50 ml Äthanol gelöst, worauf mit Palladiumschwarz als Katalysator 4 Stunden katalytisch reduziert wird. Der Katalysator wird abfiltriert, worauf das Lösungsmittel abdestilliert wird und H-Tyr-Ile-Leu-OBu erhalten wird.

In 20 ml Trifluoressigsäure löst man dann 3,35 g (3,5 mMol) Z-Arg-(M3S)-Arg(MBS)-PrO-OBu* und läßt 1,5 Stunden bei O⁰C stehen. Die Trifluoressigsäure wird abdestilliert, worauf der Rückstand mit 50 ml kaltem Wasser versetzt wird. Der Ölige Niederschlag wird mit einem Lösungsmittelgemisch aus Chloroform-n-butanol (120 ml-30 ml) extrahiert, worauf die organische Schicht mit Wasser gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet wird. Das Lösungsmittel wird dann abdestilliert, der Rückstand mit 50 ml Äther versetzt und das erhaltene Pulver durch Filtration gesammelt, wobei 3,15 g Z-Arg(MBS)-Arg(MBS)-Pro-0H erhalten werden (Ausbeute: 100 %)

In 50 ml Dimethylformamid werden Z-Arg-(MBS)-Arg(MBS)-Prο-OH, H-Tyr-Ile-Leu-OBu* und 822 mg (4,55 mMol) HONb gelöst.

Die Lösung wird auf O⁰C gekühlt, worauf 940 mg (4,55 mMol) DCC zugegeben werden. Das Gemisch wird 5 Stunden bei 0° und 15 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, worauf der Dicyclohexylharnstoff abfiltriert und das Lösungsmittel abdestilliert werden. Der Rückstand wird in einem Lösungsmittelgemisch aus Äthylacetat-n-butanol (120 ml - 30 ml) gelöst, worauf die Lösung mit einer 5 Jiigen wäßrigen Natriumhydrogenkarbonatlösung, 1N-Chlorwasserstoff säure und Wasser gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet wird. Das Lösungsmittel wird auf etwa 10 ml eingeengt und mit 100 ml Äther versetzt. Der erhaltene Niederschlag wird abgekühlt und filtriert und aus Chloroform-Äthylacetat umgefällt. Ausbeute: 3,5 g (74,5 %), Schmelzpunkt 138 - 141°C.

Q°-24,5°(c=0,5 Dimethylformamid) *

809844/0833

Rf²=0,29
Elementaranalyse für

Berechnet: C, 56,28; H, 6,79; N, 12,31; S, 4,70 Gefunden: C, 56,08; H, 6,62; N, 12,08; S, 4,52

1) Synthese von pGlu-Leu-Tyr-Glu-Asn-Lys-Pro-Arg-Arg-Pro-Tyr-Ile-Leu-OH(Neurotensin)

Z-Arg(MBS)-Arg(MBS)-Pro-Tyr-Ile-Leu-OBu^t (472 mg, 0,35 mMol) wird in einem Lösungsmittelgemisch aus Äthanol-Dimethylforinamid (20 ml - 10 ml) gelöst und in Gegenwart von Palladiumschwarz katalytisch reduziert, indem man 7 Stunden lang gasförmigen Viasserstoff bei Raumtemperatur durch die Lösung hindurchleitet. Der Katalysator wird durch Filtration entfernt, worauf das Lösungsmittel abdestilliert wird. Dieser Rückstand wird in 10 ml Dimethylformamid zusammen mit 443mg (0,35 bbKoI) Z-pGlu-Leu-Tyr-Glu(OBzI)-Asn-Lys(Xys)-Pro-0H und 123 mg HONb (0,7 mMol) gelöst, worauf die Lösung auf O⁰C gekühlt wird. Man gibt 144 mg (0,7 mMol) DCC hinzu und rührt zunächst 5 Stunden bei O⁰C und danach 24 Stunden bei Raumtemperatur. Der ausgefallene Dicyclohexy!harnstoff wird aofiltriert, worauf das Filtrat mit 50 ml Äthylacetat versetzt wird. Der resultierende Niederschlag wird mit 30 ml heißem Acetonitril gewaschen, wobei Z-pGlu-Leu-Tyr-Glu (OBzI)-Asn-Lys(Xys)-Pro-Arg(MBS)-Arg(MBS)-Pro-Tyr-Ile-Leu-OBu gehalten wird. Ausbeute: 677 mg (78,5 90, Schmelzpunkt

189-1900C	Dimethylformamid)	C, 58,	05; H, 6,59; N,	11	,95;	S,	3	,91
Hg°-32,6C		C, 57,	72; H, 6,66; N,	11	,67;	S,	3	,65
	Elementaranalyse für C^^qH1g^°30N21i
5(c=O,5	Berechnet:
Rf^=O,74, Rf1=0,87	Gefunden:

809844/0833

-JA -

482 mg (0,196 mMol) dieses geschützten Tridekapeptids werden zerstoßen und mit 7 ml Fluorwasserstoff in Gegenwart von 0,25 al Anisol 1 Stunde bei -20⁰C behandelt. Der Fluorwasserstoff wird abdestilliert, worauf der Rückstand in einer 5 ^igen wäßrigen Lösung von Essigsäure (20 ml) gelöst vnd mit zweimal je 20 ml Äther gewaschen wird. Die wäßrige Schicht wird durch Ionenaustauschersäule aus Amberlit IR-410 (Acetatform 2x7 cm) gegeben. Abfluß und Wäsche (insgesamt annähernd 80 ml) werden vereinigt und lyophilisiert.

Das erhaltene Pulver wird in der oberen Schicht einer kleinen Menge aus n-Butanol-Essigsäure-Wasser (4:1:5) gelöst und die Lösung auf eine Säule aus Sephadex G-25 (2,5x120 cm) gegeben, die mit der unteren Schicht dieses ^: Lösungsmittelgemischs equilibriert wurde. Danach wird die Säule mit der Lösung der oberen Schicht des gleichen Lösungsmittelgemischs entwickelt. Die Durchflußmenge beträgt ' 40 ml/Stunde; das Eluat wird in 8 ml-Fraktionen aufgefangen. Die Fraktionen von 320-400 ml werden vereinigt, das Lösungsmittel wird abdestilliert. Der Rückstand wird in 100 ml Wasser gelöst und lyophilisiert, wobei das gewünschte Produkt als flockiges Pulver erhalten wird. Ausbeute 215 mg (66%).

C'^x)_D ⁹-100,6^o(c=0,5, 1 #ige wäßrige Essigsäure) Rf (n-Butanol-pyridin-Essigsäure-Wasser = 15:10:3:12)=0,50

Rf¹=0,6i

Elementaranalyse für ^C78^H12I°20^N21.3CH₅COOH^SH₂O ;

Berechnet: C, 51,93; H, 7,42; N, 15,14 ^;

Gefunden: C, 52,05; H, 7,42; N, 15,31 " ;

Aminosäureanalyse: Lys 1,00; Ammoniak 0,93; Arg 2,13; Asp 1,10; GIu 1,93; Pro 2,24; lie 0,94; Leu 1,87; Tyr 1,90.

8098U/0833

Beispiel 9

Herstellung von Thymusserumfaktor (pGlu-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn-OH)

Die Reaktionszelle eines automatischen Peptid-Synthetisiergeräts (Shimadzu Seisakusho, K.K. APS-800) wird mit 3 g Boc-Asn-Harz beschickt, welches danach mit Dichlormethan 12 Stunden lang gequollen wird. Die verwendeten Aminosäure-Derivate sind Boc-Ser, (BzI)-OH, Boc-Gly-OH, Boc-Gln-OH, Boc-Lys(Xys)-OH, Boc-Ala-OH und pGlu-OH, Die verschiedenen Aminosäuren werden in der folgenden Reihenfolge eingeführt:

Dichlormethan ( 3 min.x3), 50 # Trifluoressigsäure/Dichlormethan (10 min. & 30 min.)» Dichlormethan (3 min. χ 3) Äthanol (3 min. χ 3), Chloroform (5 min. χ 3), 10 % Triäthylamin/Chloroform (10 min.) Chloroform (3 min. χ 3), Dichlormethan (3 min. χ 2), Boc-Aminosäure-Anhydrid (synthetisiert aus Boc-Aminosäure und DCC auf herkömmliche Weise und unverzüglich gebraucht) (30 min. & 60 min.), Acetylierung (Dichlormethan, Triäthylamin und Essigsäureanhydrid) (10 min.x2), Dichlormethan (3 min. χ 3) /vorausgesetzt, daß Boc-Gln als Boc-Gln-ONP eingeführt wird und die Kupplung von pGlu-OH in DMF unter Verwendung von DCC durchgeführt wirdj. i

Abschließend wird das Peptidharz pGlu-Ala-Lys(Xys)-Ser(BzI)-Gln-Gly-Gly-Ser(Bzl)-Asn-Harz mit Methanol,Eisessig, Dime- I thylformamid und Äther gewaschen und getrocknet. \

Ausbeute: 3,94 g ;

30 ml Fluorwasserstoff werden in einen Teflonzylinder ein- I gebracht, der 3 g des obengenannten Peptidharzes und 3 ml Anisol enthält, worauf der Inhalt 1 Stunde bei O⁰C gerührt I wird. Der Fluorwasserstoff wird unmittelbar unter verringertem Druck abdestilliert, worauf der Rückstand zweimal mit i 100 ml Wasser extrahiert wird. Der Extrakt wird dreimal ■ mit 50 ml Äther gewaschen und durch eine Säule (0 1,5 cm ; χ 30 cm) gegeben, die mit Amberlit IRA-410 (Acetatform)

8098^4/0833

"beschickt ist. Der Abfluß wird lyophilisiert, wobei 190 mg weißes Pulver erhalten werden. Dieses Pulver wird in einer 0,1 N-wäßrigen Lösung von Essigsäure gelöst und der Gelfiltration an einer Säule (0 2 χ 150 cm) unterworfen, die mit Sephadex LH-20 beschickt ist. Eine nochmalige Gelfiltration an einer Säule (0 2 χ 16O cm) aus Sephadex G-25 liefert 110 mg des gewünschten Nonapeptids.

Aminosäureanalyse (Hydrolyse mit 5,7N-HCl):

Lys 1,05; Asp 0,96; GIu 2,08; Ser 1,87; GIy 1,92; ; AIa 1,00 (86 #ige Rückgewinnung)

Beispiel 10

Synthese von N -p-Methylbenzylsulfonyl-DL-ociß-Diaminopropionsäure

140 mg DL-cc, ß-Diaminopropionsäure-Hydrochlorid werden in 3 ml 1-N-wäßriger Natriumhydroxidlösung gelöst, worauf 180 mg basisches Kupferkarbonat zugegeben werden. Das Gemisch wird 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, worauf das Unlösliche abfiltriert wird.

Das FiItrat wird mit 5 ml Dioxan versetzt, worauf das Gemisch mit Eis gekühlt wird. Unter heftigem Rühren wird eine Lösung aus 408 mg p-Methylbenzylsulfonylchlorid in 3 ml Dioxan tropfenweise zugegeben, während der pH-Wert des Gemisches durch Zugabe von 1-N-wäßriger Natronlauge oberhalb ' von 10 gehalten wird. Nach der Zugabe wird das Gemisch 3 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Dioxan wird abdestilliert, worauf der pH-Wert des wäßrigen Rückstandes durch Zugabe von konzentrierter Schwefelsäure auf pH 2 eingestellt wird. Man leitet Schwefelwasserstoff in das Gemisch ein und¹ filtriert danach das entstandene Kupfersulfid ab. Das FiI-trat wird durch eine Ionenaustauschersäule (1x5 cm) ge- ; geben, die mit Amberlit IR-120 (H⁺ Form) beschickt ist,

worauf mit 20 ml Wasser nachgewaschen wird. Die Säule wird ' mit 1-N-wäßrigen Pyriüin eluiert, worauf das Eluat auf etwa

809844/0833

5 ml eingeengt wird. Die erhaltenen Kristalle werden abfiltriert und aus heißem Wasser umkristallisiert. Ausbeute: 37 mg (13,6 %), Schmelzpunkt 235⁰C (Zersetzung) Rf¹=0,62

Elementaranalyse für C₁^ H₁gO^^S

Berechnet: C, 48,51; H, 5,92; N, 10,29; S, 11,78 Gefunden: C, 48,11; H, 5,80; N, 10,14; S, 11,65

Beispiel 11
Synthese von Thymusserumfaktor

a) Synthese von pGlu-Ala-Lys(Xys)-Ser(BzI)-GIn-GIy-GIy-Harz

6,0 g Boc-Gly-Harz wird mit Dichlormethan 12 Stunden in einem automatischen Peptidsynthetisierungsgerät (APS-800 von Shimadzu Seisakusho) gequollen. Jede Aminosäure wird in dem in Beispiel 9 gezeigten Zyklus eingeführt. Für GIn und pGlu ist das Verfahren ähnlich dem in BeiBpiel 9 angewandten Verfahren. Das abschließend erhaltene Harz wird mit Methanol, Eisessig, Dimethylformamid und Äther gewaschen und getrocknet. Ausbeute: 7,0 g

b) Synthese von pGlu-Ala-Lys(Xys)-SerTBzl)-Gln-Gly-Gly-

NHNH₂

pGlu-Ala-Lys(Xys)-SerTBzl)-Gln-Gly-Gly-Harz (3,6 g) wird ^j in 18 ml Dimethylformamid gelöst, worauf 2 ml Hydrazin-

hydrat zugegeben werden. Das Gemisch wird 48 Stunden lang ' bei Raumtemperatur schwach gerührt. Das Harz wird abfiltriert, worauf das Filtrat unter vermindertem Druck destil-

liert wird. Der Rückstand wird mit Äther versetzt, worauf j

das erhaltene Pulver abfiltriert wird. Ausbeute: 476 mg j

Das Pulver wird an einer Säule (2,7 x 3 cm) aus Silikagel j mit Äthylacetat-Pyridin-Essigsäure-Wasser (30:10:3:5) chro-; matographiert und die Fraktionen von 70 bis 80 ml vereinigt.

•09844/0833

Das Lösungsmittel wird abdestilliert, worauf Äther zugesetzt und das erhaltene Pulver filtriert wird. Ausbeute:
168 mg, Schmelzpunkt 196-199°C, Rf³=O,i6, Rf¹=0,51

Aminosäureanalyse (Hydrolyse nit 5,7N HCl)
Lys 0,96, Ser 0,92, GIu 2,02, GIy 1,94, AIa 1,0
(durchschnittliche Rückgewinnung 76,6 %)

c) Synthese von Thymusserumfaktor, pGlu-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn-OH I

140 mg pGlu-AIa-Lys(Xys)-Ser(BzI)-GIn-GIy-GIy-NHNH₂ werden

in 5 ml Dimethylformamid gelöst. Während die Lösung auf . -70⁰C gekühlt wird, zersetzt man mit 0,05 ml 6,5-N-HCl-Dioxan und 0,02 ml Isoamylnitrit. Das Gemisch wird 35 Minu-' ten bei -3O⁰C gerührt und wieder auf -70⁰C abgekühlt, worauf man 0,05 ml Triäthylamin zugibt. Zum Gemisch setzt man dann HCl-H-Ser-Asn-OBu , hergestellt durch Reduktion von 123 mg : Z-Ser-Asn-OBu*, wird in 2 ml Dimethylformamid gelöst,
worauf diese Lösung dem Reaktionsgemisch zugesetzt wird,
gefolgt von der Zugabe von 0,05 ml Triäthylamin. Das Ge- ; misch wird zwischen -15°C und +5⁰C 30 Stunden gerührt, wo-

nach vom Unlöslichen abfiltriert und das Filtrat zur Entfernung des Lösungsmittels destilliert wird. Danach wird
mit Äther versetzt und das erhaltene Pulver abfiltriert. ; Einem Gemisch aus dem Pulver und Anisol, welches sich in ! einem Teflonzylinder befindet, werden 5 ml Fluorwasserstoff zugesetzt, worauf 1 Stunde bei 0⁰C gerührt wird. Darauf \ wird der Fluorwasserstoff unmittelbar unter vermindertem . Druck abdestilliert und der Rückstand zweimal mit je .10 ml
Wasser extrahiert. Der wäßrige Extrakt wird dreimal mit je
3 ml Äther gewaschen und durch eine Säule (1,5 x 10 cm)

ι mit Amberlit IR-410 (Acetatform) gegeben. j

Der Abfluß wird lyophilisiert, wobei 170 mg eines Pulvera . erhalten werden, welches der Gelfiltration an einer Säule ⁱ (2,2 χ 119 cm) mit Sephadex LH-20 mit 0,1 N-wäßriger Essig-j säure unterworfen wird. Die Fraktionen von 176 - 188 ml j werden vereinigt und lyophilisiert und liefern dabei 23 mg

809844/0833

Thymusserumfaktor.

(*) ^⁷-65,6°(c=O,5, Wasser), Rf^=O,19 (Zelluloseplatte), Elektrophorese (pH 6,5 , 600 V): 0,17 χ Arg (Elektrophorese von Arg: 5,4 cm)
Aninosäureanalyse: Lys 1,10;, Asp 1,03;, Ser 1,86; GIu 2,05}

GIy 2,0; AIa 1,0 (durchschnittliche

Rückgewinnung 71,3 %)

109844/0833

Claims (19)

Patentansprüche

1. Aminosäure mit einer geschützten Aminogruppe in 6j-

\ / Stellung oder Peptid, welches einen Rest einer so geschützten Aminosäure enthält, dadurch gekennzeichnet, daß die Schutzgruppe die p-Methylbenzylsulfonylgruppe ist.

2. Aminosäure oder Peptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Aminosäure eine O:,O-Diaminosäure mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen ist.

3. Aminosäure oder Peptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Aminosäure Lysin ist.

k. Aminosäure oder Peptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Aminosäure "^,^-Diaminopropionsäure ist.

5♦ Aminosäure oder Peptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Aminosäure Oc^-Diaminobuttersäure ist.

6. Aminosäure oder Peptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Aminosäure Ornithin ist.

7. Peptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Peptid Neurotensin ist.

8. Peptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das■ Peptid Thymusserumfaktor ist.

9. Peptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das■ Peptid das Melanophoren stimulierende Hormon ist.

1O. Peptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Peptid ACTH.ist.

8098 U/0833

11. Peptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Peptid Lysin-Vasopressin ist.

12. Peptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Peptid Endorphin ist.

13. Peptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Peptid Substanz P ist.

14. Peptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es aus Thymosin Ot besteht.

15. Peptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es Glucagon ist.

16. Peptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es Motilin ist.

17. Verfahren zum Schutz von cj -Aminogruppen einer Aminosäure oder eines Aminosäurerests in einem Peptid durch Umsetzung der Aminosäure oder des Peptids mit einem reaktionsfähigen Derivat einer die Schutzgruppe in die &> -Aminogruppe einführenden Verbindung, dadurch gekennzeichnet, daß man als reaktionsfähiges Derivat ein p-Methylbenzylsulfonylhalogenid verwendet.

18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß man p-Methylbenzylsulfonylchlorid verwendet.

19. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß man die p-Methylbenzylsulfonylgruppe mit Fluorwasserstoff abspaltet.

809844/0833