DE1922562C3 - Verfahren zur Herstellung von Cystinhaltigen Peptiden - Google Patents

Verfahren zur Herstellung von Cystinhaltigen Peptiden

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Description

Gegenstand der Erfindung ist ein neues Verfahren zur Herstellung von Cystin-ha'tigen Peptiden.
In der Natur kommen verschiedene Cystin-haltige Peptide vor. in welchen die Disulfidbrücke des Cystins in einem Ring liegt. /. B. Oxytocin, Vasopressine, Vasotocin, Isotocin. Mesotocin. Wachstumshormon. Thyrocalcitonin. Insulin. Andererseits kann die Disulfidbrücke des Cystins aber auch geradlinige Aminosäureketten miteinander verbinden, wie dies z. B. bei den beiden Disulfidbrücken zwischen der A- und B-Kette des Insulins oder beim Glutathion der Fall ist. Es sind bereits verschiedene Verfahren zur Synthese solcher Disulfid- <■' brücken enthaltender Peptide bekannt. Außer natürlichen Peptiden mit Disulfidbrücken wurden auch bereits eine größere Zahl von aktiven Analogen, z. B.
Desamino-oxytocin. Ser'-Oxytocin.
Asn4-Oxytocin. Val8-Oxytocin. ίο
Tyr'(O-Methyl)-Oxytocin.
Khe^ Arg*·Vasopressin.
Phe2LysK-Vasopressin.
Phe^-Orn11- Vasopressin.
Asn4-1 .ysR Vasopressin.
synthetisiert.
Nach den bekannten Verfahren werden zur Herstellung der Disulfidbrücke zunächst aus einer die beiden zu Verbindenden Cysteinreste enthaltenden Aminosäure^ 6ö sequenz, in welcher die Mercaptogruppen geschützt sind, beispielsweise durch Carbobenzoxy- oder ßenzylgruppen oder durch die TrilylgrUppe, die Mercapto-Schutzgruppen abgespalten, Benzyl beispielsweise mit Natrium in Nüssigem Ammoniak, Trityl z. B, mittels Mercuriacelat und Schwefelwasserstoff oder mit 10-n. Salzsäure, und dann wird das die freien Mercaptogruppen enthaltende Peptid zum Disulfid oxydiert beispielsweise mit 1,2-Dijodäthan oder mit Sauerstoff. Dieses Verfahren hat den Nachteil, daß die genannten Abspaltungsmethoden Nebenreaktionen veranlassen, insbesondert bei empfindlichen Peptiden, und daß die Ausbeute dementsprechend beeinträchtigt wird.
Es wurde nun gefunden, daß man Cystin-haltige Peptide und ihre Derivate in einfacherer und schonender Weise und besserer Ausbeute erhält wenn man die die zu verbindenden Cysteinreste enthaltende(n) Aminosäuresequenz^), in welcher (welchen) die Mercaptogruppen durch Tritylgruppen geschützt sind, in einem Lösungsmittel bei Temperaturen von 0 bis 6O0C mit Jod behandelt Die Umsetzung findet vorzugsweise bei Raumtemperatur statt kann aber auch, je nach der Art des Peptids, bei niederiger oder höherer Temperatur erfolgen. Zweckmäßig führt man die Reaktion in einem Lösungsmittel, in welchem Jod und das Peptid wenigstens teilweise löslich sind, durch, vorzugsweise in einem Alkohol wie einem niederen Alkanol. z. B. Äthanol oder insbesondere Methanol oder einem Gemisch eines Alkohols mit einem organischen Lösungsmittel, in welchem das Peptid löslich ist wie Essigester, Dimethylformamid, Methylenchlorid, oder in Eisessig. Zweckmäßig sorgt man für einen jeweiligen Überschuß an Jod, z. B. durch Arbeiten in verdünnten Lösungen und Zugabe der Peptidlösung zur Jodlösung. Dabei wird ausschließlich das gewünschte Monomere erhalten. Wird hingegen umgekehrt vorgegangen, z. B. die Jodlösung in eine Peptidlösung eingetropft, so werden beträchtliche Mengen Polymere gebildet. Aus der erhaltenen Lösung kann das überschüssige Jod beispeilsweise mit Tim sulfat entfernt werden.
Bei der Reaktion u erden als Ausgangsstoffe Peptide verwendet, in denen die freien Aminogruppen zweckmäßig geschützt sind. Auch freie Hydroxyl- und Carboxylgruppen können, wenn erwünscht in geschützter Form vorliegen. Als Amino-Schutzgruppen sind beispielsweise zu nennen Benzyl, Trifluormethyl, Phthaloyl, p-ToluoIsulfonyl. oder vor allem von der Kohlensäure sich ableitende Gruppen wie gegebenenfalls im aromatischen Rest durch Halogenatome. Niederalkyl- oder Niederalkoxy- oder Niedeicarbalkoxygruppen substituierte Carbobenzoxygruppen, farbige Benzyloxycarbonylgruppen wie p-Phenylazo-benzyloxycarbonyl und p-(p'-Methoxy-phenylazo)-benzyIoxycarbonyl. Tolyloxycarbonyl. 2-Phenylisopropyloxycarbonyl, 2-Tolyl-isopropyloxyearbon)l- und vor allem 2-p-Diphenylisopropyloxycarbonyl (vgl. FR-PS 15 54 051). ferner aliphatische Oxycarbonylgruppen wie 1. B. Allyloxycarbonyl. Cyclopentyloxycarbonyl. tert. Amyloxycarbonyl. Adamantyloxycarbonyl und in erster Linie tert. Butyl oxyearbonyl.
Die Carboxylgruppen können, wenn erwünscht, z. B. durch Amidierung oder Veresterung geschützt sein. Als F.ster sind z. B. diejenigen von Methanol. Äthanol. Benzylalkohol, ρ Methoxybcnylalkohol. 2.4.5-Trichlorphcnol. N Hvdroxysiiccinimid. N Hydroxyphthalimid. oder vor allem von tert. Fiutanol /11 nennen Hydroxygruppen, ζ. B. von Serin- oder I yrosinresten, können ζ. B. durch Veretherung, beispielsweise mit Benzylalkohol oder vorzugsweise mit tert.-Butanol geschützt sein, In Argininresten kann die Guanidinogruppe beispielsweise durch die Tosylgruppe geschützt sein. Die bei dem vorliegenden Verfahren erhaltenen, Schutzgruppen aufweisenden Disulfid-Peptide können direkt für die Synthese Von Peptiden mit längerer Aminosäurekette verwendet werden oder, wenn erwünscht, können die Schutzgruppen in bekannter Weise durch Hydrolyse
oder Hydrogenolyse abgespalten werden.
Die als Ausgangsstoffe verwendeten Cystein-haltigen Peptide und deren Derivate sind bekannt oder können nach an sich bekannten Methoden hergestellt werden. Unter Derivaten sind insbesondere Peptide zu verstehen, in denen funktioneile Gruppen wie z.B. Aminogruppen, Carboxylgruppen, Hydroxygruppen mit den obengenannten oder anderen für die Peptidsynthese bekannten Schutzgruppen versehen sind, ferner Verbindungen, die statt eines oder beider zu verbindenden Cysteinreste Desaminocysteinreste enthalten.
Die Erfindung wird in den nachfolgenden Beispielen beschrieben. Die Temperaturen sind in Celsiusgraden angegeben. In der Dünnschichtchromatographie werden die folgenden Systeme verwendet:
System 43A: terL-AmylalkohoI-Isopropanol Wasser
(100:40:10)
System 43C: tert.-Amylalkohol-IropropanoI-Wasser
(51 : 2i : 28)
System 45: see Butano!-3%iges wäßriges Ammoniak (70:30)
System 52: n-ButanoI-Eisessig-Wasser(75 :7,5 :21) System 53: n-Butanol-Ameisensäure-Wasser
(60 :0,74 : 39)
System 70: ÄthyIacetat-Pyridin-Wasser(40 :20 :40) System 101: n-ButanoI-Pyridin-Eisessig-Wasser
(38 : 24 :8 :30)
System 102E: Essigester-Methylethylketon-Eisessig-
We ser(50:30:10:10)
System 121A: Isopropanol-Ammop;<\k(26%ig)-Wasser
(85:5:10).
Folgende Abkürzungen werden ver -endet:
BOC = tert. ButyIoxycarbonyI;TRI=TrityL
Beispiel 1 zeigt die Herstellung der geschützten N-terminalen Sequenz 1—9 des Thyrocalcitonins mit Disulfidring; die Beispiele 2 und 8 zeigen die Disulfidverknüpfung des geschützten Fragments 20—21 der Α-Kette mit dem geschützten Fragment 18—21 bzw. 19-21 der B-Kette des Insulins; die Beispiele 3, 7 und 9 zeigen die Herstellung von geschützten Peptid-Dimeren mit Disulfidbrücke; die Beispiele 4—6 zeigen die Herstellung von Oxytocin, Lys^Vasopressin und Phe2, Lys8 Vasopressin nachdem neuen Verfahren.
Beispiel 1
BOC-Cys-SerOBuJ-Asn-Leu-Ser-itBuJ-ThrOBuJ-Cys-VaI LeuOH
39-68 (rms=53; K = 0,65). Der Inhalt dieser Elemente wird zusammen am Hochvakuum (40°) zur Trockne eingedampft und das Ammoniumacetat absublimiert Das erhaltene
BOC-Cys-SeritBuJ-Asn-Leu-SeritBuJ-ThritBuJ-Cys-Val-Leu-OH (1,49 g = 83% der Theorie) erweist sich im Dünnschichtchromatogramm (Silicagel) als einheiUch.
45
Rf45 = 0,42;
Rfl2IA = 0,70;
Rf70 = 0,75;
Rf53 = 0,43;
Rf«A = 0,22.
15
20
25
30
35
Zu einer gerührten Lösung von 3,73 g (14,78 mMol) Jod in 500 ml Methanol werden bei Zimmertemperatur 2.50 g( 1.478 mMol) BOC-Cys(TRI)-Ser-(tBu)-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys(TRl)Val-Leu-OH
in 500 TiI Methanol innen 45 Minuten zugetropft. Nach beendetem Eintragen rührt man 1 Stunde weiter und entfärbt dann die Lösung bei 0° mit 1,0-n. wäßriger Thiosulfatlösung (26.05 ml In. Thiosulfat). Die klare Lösung wird am Wasscrstrahlvakuum bei 30° auf ca. 100 ml eingeengt. Dann gibt man 13Ll Wasser zu, filtriert das ausgefallene Produkt und wäscht es mit Wasser, Nach dem Trocknen Ober Kaliumhydroxyd Wiegt das Rohprodukt 232 g^ Es wird zweimal mit Petroläther verrieben und zur Reinigung einer Gegensstromverteilung im System Methanol-Puffer-ChlorofornvTctrachlorkohlenstoff (10 :3 ;5 :4) unterworfen. (Puffer: 28,6 ml Eisessig; 19,25 g Ammoniumacetat, mit Wasser auf 1 Liter aufgefüllt) Nach 135 Schritten befindet sich das Hauptprodukt in den Elementen [«]? = -16° (c= 2 in Chloroform).
Das als Ausgangsmaterial verwendete geschützte Nonapeptid kann nach dem in der Anmeldung G. No. DEOS 18 17 938 beschriebenen Verfahren hergestellt werden.
Beispiel 2
BOC- C vs—Asn — OtBu (I)
BOC-VaI-CyS-GIy-GIu(OtBu)2
Zu 172 mg (0,2 mMol) BOC-Val-Cys(TRI)-GIy-GIu(OtBu)2 und 128 mg BOC-Cys(TRI)-Asn-OtBu in 5 ml Essigester und 2 ml Methanol gibt man 254 mg (1 mMol) Jod in 5 ml Methanol und läßt die Lösung eine Stunde bei Zimmertemperatur stehen. Bei 0° wird dann mit 1-n. Thiosulfatlösung entfärbt, das Reaktionsgemisch in 200 ml Essigester aufgenommen und dreimal mit Wasser gewaschen. Bei Einengen der (mit Natriumsulfat getrockneten) Essigesterlösung fällt [BOC-CyS-ASn-OtBu]2 kristallin aus (32 mg, F. 194—196°) und wird abfiltriert. Das Filtrat wird zur Trockne eingedampft und der Rückstand zweimal mit Petroläther verrieben. Aus dem unlöshcnen Rückstand erhält man durch Säulenchromatographie an Silicagel 90 mg (I). Dieses zeigt im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel Rf = 0,25, im System Chloroform-Methanol (95 : 5) und Rf = 0,30 im System Toluol-Aceton (1 : 1).
Als zweites Produkt erhält man bei der Säulenchromatographie 54 mg [BOC-Val-Cys-GIy-Glu(OtBu)]2; Rf (an Silicagel) im System Chloroform-Methanol (9 :1) = 0,55. Das obenerwähnte kristalline Dimere vom F. 194-196° zeigt folgende Rf-Werte (an Silicagel): in Chloroform-Methanol (9 : 1) Rf = 0,25; in Toluol-Aceton (I : I)Rf = 018.
Die beiden Ausgangspeptide können hergestellt werden.
Beispiel 3
Man versetzt 172 mg (0.2 mMol) BOC Val-Cys(TRI)-GIy-CjIu(OtBu)2 in 5 ml Essigester und 2 ml Methanol mit 127 mg (0,5 mMol) |od in 2.5 ml Methanol und läßt dns Reaktionsgemiseh 1 Stunde bei Zimmertemperatur stehen. Die Lösung wird dann bei Ö° mit 1-n-Thiosulfat entfärbt, in 200 ml Essigester aufgenommen und dreimal mit Wasser gewaschen. Das nach dem Eindampfen der Essigesterlösung erhaltene Produkt wird zweimal mit Petroläther verrieben. Das in Petroläther unlösliche [BOC-VaI-CyS-GIy-GIu(OtBu)J2 ist dünnschichtchromatographisch (Silicagel; System Toluol/Aceton 1:1; Rf=0,34) einheitlich. [<x]'-68° (C= 1.8 in Methanol.) Ausbeute 123 mg (100%).
Beispiel 4
BOC-Cys-TyrftBuJ-IIe-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu -GIy-NH2
Zu einer Lösung von 620 mg Jod in 150 ml Methanol werden bei 25° unter starkem Rühren
SOOmgBOC-CysCTRO-TyrUBuJ-IIe-Gln-Asn-CyS(TRJ)-PrO-Leu-Gly-NH2,
gelöst in 100 ml Methanol, innert 45 Minuten eingetropft Man rührt eine Stunde weiter, kühlt dann die Lösung auf 5° ab und entfärbt sie durch Zugabe von 1,0-n. wäßriger Natriümthiosulfatlösung. Hierauf wird die Lösung im Wasserstrahlvakuum auf ein Volumen von ca. 5 ml eingeengt und das Produkt durch Zugabe von viel Wasser ausgefällt. Es wird abgenutscht und im Vakuum über Natriumhydroxyd getrocknet. Zwecks Überführung in das freie Oxytocin wird das Produkt in 5 ml eiskalter konzentrierter Salzsäure suspendiert und unter Rühren gelöst. Nach 10 Minuten bei 0° verdünnt man die [.ösung mit 20 ml Eiswasser, gibt 5 ml Eisessig zu, filtriert über eine Säule mit schwach oasischen (Acetatform) Ionenaustauscher, und wäscht mit 20%iger Essigsäure nach. Dann wird im Vakuum bei 30° eingedampft, der Rückstand in Wasser gelöst und die Lösung lyophilisiert. Das so erhaltene rohe Oxytocin (280 mg, 86% der Theorie) kann, falls erwünscht, nach dem Verfahren von Yamashiro (Nature 201, 76 (1964) weiter gereinigt werden.
Das Ausgangsmaterial kann gemäß der DE-OS 19 22 562 hergestellt werden.
Beispiel 5
G!n-Asn-Cys(TRI)-Pro-Lys(ElOC)-G!y-nH2 hergestellt und in Phe2, Lys8-Vasopressin übergeführt werden.
Die Ausbeute aus 600 mg des genannten Ausgangsmaterials betrug 360 mg (89%) Rohprodukt. Dünn-Schichtchromatographie (Cellulose): System n-Butanol-Eisessig-Wasser (67 :10:23) Rr=0,41; System n-Butanol-Pyridin-Ameisensäure-Wasser (42 :42 : 4 : 20), Rf=0,6.
BOC-Cys-TyritBuJ-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-LyS(BOC)-GIy-NH2
Zu einer Lösung von 1120 mg Jod in 500 ml Methanol wird bei Raumtemperatur unter starkem Rühren eine Lösur<i von
800 mg BOC-CysfTRIJ-TyritBuJ-Phe-Gln-Asn-Cys(TRI)-PrO-LyS(BOC)-GIy-NH2,
in 500 ml Methanol innert 45 Minuten tropfenweise zugegeben. Dann wird die Lösung auf 2° gekühlt und durch Zutropfen von wäßriger 1-n. Natriumthiosulfatlösung Entfärbt. Hierauf wird im Wasserstrahlvakuum bei 30° Badtemperatur auf ein kleines Volumen eingeengt und das Produkt durch Zugabe von viel Wasser ausgefällt. Es wird abgenutscht und im Vakuumexsikkalor getrocknet. Zvecks Überführung in Lysin8-Vasopressin wirddas
BOC-Cys-TyrftRuJ-Phe-Gln-Asn-Cys
Pro-Lys(BOC)-GIy-NH2
unter Rühren in 10 ml eiskalter konzentrierter Salzsäure gelöst. Nach 10 Minuten bei 0° verdünnt man mit 50 ml Eiswasser und gibt 5 ml Eisessig zu. Hierauf wird über eine Säule mit schwach basischem. Ionenaustauscher (Acetatform filtriert und das Eluat zur Trockne eingedampft. Rohausbeute 434 mg (83%).
Das Ausgangsmaterial kann in analoger Weise wie jenes des Beispiels 4 hergestellt werden.
Beispiel 6
BO&Cys-Phe-Phe-Gln-AsivCys-Pro-Lys(BOC)-Gly-NH2
Diese Verbindung kann nach dem in Beispiel 5 beschriebenen Verfahren aus BOC-Cys(TRI)-Phe-Phe-
Beispiel 7
1,524 g BOC-CyS(TRI)-GIy-GIu(OtBu)2 und 508 mg Jod werden in 25 ml Methanol während einer Stunde bei Zimmertemperatur reagieren gelassen. Durch tropfenweise Zugabe von wäßriger 1-n. Natriumthiosulfatlösung wird die Reaktionslösung bei 0" entfärbt und das Produkt mit 50 ml Wasser ausgefällt. Das getrocknete Rohprodukt wird dreimal mit je 10 ml Petroläther verneben. Kristallisation des Rückstandes aus Essigester-Petroläther liefert 945 mg (91%) [BOC-Cys-Gly-GIu(OtBUk]2 vom F. 150-152°. Rf = 0,60 (Chloroform-Methanolg : 1).
Beispiel 8
Die Fleaktion von 762 mg (1,OmM) BOC-Cys(TRI)-GIy-GIu(OtBu)2 und 634 mg (1,0 mM) BOC-Cys(TRI)-Asn-OtBu mit 508 mg (2,0 mM) Iod und die Aufarbeitung werden wie in Beispiel 7 ausgeführt. Das JO Rohprodukt zeigt im Dünnschichtchromatogramm an Silicagel im System Chloroform-Methanol (9:1) drei Flecken:
Rf=0,60 ([BOC-Cys-GIy-GluiOtBuhl· = I),
0.25 pOC-Cys-ASn-OtBu]2 = II) und 0,45
BOC-Cvs—Asn OtBu
BOC CyS-GIy-GIu[OtBu]2 -■= III
"η Die Trennung gelingt durch Gegenstromverteilung im System MethanoI-0,1 -Ammoniumacetat-Chloroform-Tetrachlorkohlenstoff (4:2:1:1:3). Nach 100 Schritten befindet sich II in den Elementen 56—76 (Vma, = 65; K = 1,85). Diese werden geleert, 'rische untere Phase eingefüllt und weitere 100 Schritte ausgeführt. III befindet sich nun in den Rohren 8 — 25 (rmas—\b; K = 0,09), I in den Elementen 0—5. Eindampfen dieser Fraktionen und Absublimieren von Ammoniumacetat liefert die drei Verbindungen in dünnschichtchromatographisch rein.ar Form:
I schmilzt nach Umkristallisation aus Essigester-Petroläther bei 150—152°; Ausbeute 225 mg (statistisch: 260 mg);
II schmilzt nach Umkristallisation aus Methanol-Äther bei 194—196°: Ausbeule 162 mg (statistisch 195 mg).
III ist amorph; Ausbeute463 mg.
Wird die Reaktion mit 1 mM BOC-Cys(TRI)-GIy-GIu(OtBu)2, 2 mM BOC-CyS(TRI)-ASn-OtBu und 3 mM Jod ausgeführt, so werden 580 mg IfI isoliert (statistisch 606 mg).
Beispiel 9
Zu 254 mg (1 mMol) Jod in 5 ml Eisessig wird die Lösung von 380 mg (0,5 mMol BOC-Cys(TR I)-GIy-GIu(OtBu)2 und 45 mg (0,55 mMol) Natriumacetat
(wasserfrei) in 5 ml Eisessig gegeben und eine Stunde bei Zimmerlemperatur gerührt. Durch Zugabe von l-n. Nalriumthiosulfat (1,7 rhi) wird die braune Lösung entfärbt: man gibt weitere 5 fril Eisessig zu und lyophilisierl. Das resultierende Pulver wird iri Wasser
aufgenommen, filtriert und der Rückstand gut mit Wasser gewaschen. Nach dein Trocknen über Phosphorpcntoxyd werden durch Umkristallisieren aus Essigester-Pclroläther 205 mg (80%) [BOC-Cys-Gly-Glu(OtBu)2]2Vom F. 151-152° erhalten.

Claims (7)

Patentansprüche:
1. Verfahren zur Herstellung von Cystin-haltigen Peptiden und deren Derivaten aus Cystein-haltigen Aminosäuresequenzeif, in denen die Mercaptogruppen durch Tritylgruppen geschützt sind, dadurch gekennzeichnet, daß man die die zu verbindenden Cysteinreste enthaltende(n) Aminosäuresequenz(en) in einem Lösungsmittel bei Temperaturen von 0 bis 60° C mit Jod umsetzt
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man dieses bei Raumtemperatur durchführt
3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man dieses in einem Alkohol durchführt
4. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet daß man dieses in einem niederen Alkanol durchführt.
5. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet daß man dieses in Methanol durchführt
6. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man dieses in Eisessig durchführt.
7. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man dieses in einem Gemisch aus einem niederen Alkanol und einem anderen organischen Lösungsmitte! durchführt.
30
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