CH628330A5

CH628330A5 - Verfahren zum entfernen einer oder mehrerer schutzgruppe(n) aus aminosaeuren oder peptiden mit einer oder mehreren thiolgruppe(n).

Info

Publication number: CH628330A5
Application number: CH759677A
Authority: CH
Inventors: Masahiko Fujino; Osamu Nishimura; Chieko Kitada
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Priority date: 1976-01-05
Filing date: 1977-06-21
Publication date: 1982-02-26
Also published as: SE7707387L; US4111924A; DE2728462A1

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren Die für die vorliegende Erfindung verwendbaren Peptide kön-

zur Entfernung von einer oder mehreren Schutzgruppe(n) aus nen auch andere Reste als Aminosäurereste enthalten, sofern einer Aminosäure oder einem Peptid mit einer oder mehreren 35 die Peptide eine oder mehrere geschützte Thiolgruppe(n) auf-

Thiolgruppe(n), die durch p-Methoxybenzyl, 1-Adamantyl oder weisen.

tert.-Butyl geschützt ist bzw. sind. Als Beispiele von Mercurisalzen von Carbonsäuren der For-

Im allgemeinen ist es bei organischen Reaktionen häufig mei I seien die Mercurisalze der Essigsäure, der Dichloressig-

erforderlich, eine Thiolgruppe zu schützen und dann zu regene- säure, der Trichloressigsäure und der Trifluoressigsäure ge-

rieren. Insbesondere bei der Peptidsynthese sind der Schutz und 4<> nannt, wobei die Mercurisalze der Essigsäure und der Trifluor-

die Regenerierung von Thiolgruppen ziemlich wichtig. essigsäure besonders bevorzugt werden. Ein solches Mercurisalz

Die am häufigsten angewandten Verfahren zum Schutz ei- kann, bezogen auf die Aminosäure oder das Peptid, in einer ner Thiolgruppe und zur anschliessenden Entfernung der Menge von z.B. 1 bis ca. 4 molaren Äquivalenten verwendet

Schutzgruppe sind heutzutage der Schutz der Thiolgruppe mit werden.

einer Benzylgruppe und die anschliessende Entfernung dieser "5 Bei der praktischen Ausführung der Erfindung können statt

Schutzgruppe mit metallischem Natrium in flüssigem Ammo- der direkten Zugabe eines solchen Mercurisalzes zu dem Reak-

niak und der Schutz der Thiolgruppe mit p-Methoxybenzyl und tionsgemisch die Materialien zugegeben werden, die ein solches die anschliessende Entfernung der letzteren Gruppe mit am Mercurisalz in dem Reaktionsgemisch zu bilden vermögen. Z.B.

Rückfluss siedender Trifluoressigsäure oder am Rückfluss sie- kann Mercurioxyd in einer Carbonsäure der Formel I gelöst dendem wasserfreiem Fluorwasserstoff. [J. Biol. Chem., Bd. 50 werden, so dass das resultierende Mercurisalz für die Zwecke

108,753-761 (1935), Bull. Chem. Soc. Japan, Bd. 37, Nr. 3, der Erfindung verwendet werden kann.

433-4-34 (1964), und Bull Chem. Soc. Japan, Bd. 40,2164- Das erfindungsgemässe Verfahren kann normalerweise in

2167 (1967)]. Weil aber die für die Entfernung dieser Schutz- Gegenwart eines Lösungsmittels ausgeführt werden. Das Lö-

gruppen angewandten Bedingungen ziemlich drastisch sind, gibt sungsmittel kann z.B. eine Carbonsäure der Formel I sein, z.B.

es Fälle, in denen es sich als unmöglich erweist, die Thiolschutz- 55 Essigsäure, Dichloressigsäure, Trichloressigsäure oder Trifluor-

gruppe selektiv zu entfernen, während die anderen funktionel- essigsäure, oder ein Gemisch einer solchen Säure mit Wasser,

len Gruppen und Schutzgruppen intakt bleiben. Es ist auch möglich, aus anderen Lösungsmitteln, wie Wasser,

Weil tert.-Butyl- und 1-Adamantylgruppen leicht in die Alkoholen, z.B. Methanol, Äthanol, Propanol oder Butanol,

Thiolgruppe eingeführt werden können, wurden Versuche un- und Gemischen von solchen Alkoholen mit Wasser, ferner Te-

ternommen, diese als Schutzgruppen für Thiolgruppen zu ver- 60 trahydrofuran, Dioxan, Dimethylformamid, Chloroform, Ace-

wenden, wobei jedoch lediglich gefunden wurde, dass sich diese tonitril, Ameisensäure und Gemischen davon mit Wasser, ein

Schutzgruppen danach sehr schwer entfernen lassen [J. A. C. S., Lösungsmittel zu wählen, das die gewünschte Verbindung ver-

Bd. 85,201-207 (1963)]. Somit war bisher kein wirksames Ver- gleichsweise leicht zu lösen vermag und sich für die beabsich-

fahren zur Entfernung dieser Schutzgruppen bekannt. tigte Reaktion eignet. Das erfindungsgemässe Verfahren kann

Unter diesen Umständen wurde ein neues Verfahren zum 65 bei einer angemessenen Temperatur, z.B. im Bereich von ca.

Regenerieren einer durch p-Methoxybenzyl, 1-Adamantyl oder —20 bis +100 °C, vorzugsweise von ca. 0 bis ca. 80 °C, ausge-

tert.-Butyl geschützten Thiolgruppe gesucht, wobei gefunden führt werden.

wurde, dass diese Schutzgruppen mit extremer Leichtigkeit und Die Behandlungsdauer beim erfindungsgemässen Verfahren

3

628 330

hängt von verschiedenen Faktoren, wie dem Typ und der Menge der verwendeten Aminosäure oder des verwendeten Peptides, vom verwendeten Lösungsmittel und vom verwendeten Mercurisalz ab, aber in vielen Fällen genügt es, die Behandlung ca. 30 Sekunden bis 12 Stunden lang auszuführen. 5

Die Thiolschutzgruppe, d.h. p-Methoxybenzyl, 1-Adaman-tyl oder tert.-Butyl, kann auf diese Weise erfindungsgemäss entfernt werden, aber die Aminosäure oder das Peptid kann in bestimmten Fällen in Form eines Mercaptides vorliegen, wobei die freie Thiolgruppe mittels eines an sich bekannten Verfah- io rens regeneriert werden kann. Z.B. wird das Mercaptid in Wasser, einem wässrigen Lösungsmittel oder einem reinen Lösungsmittel, z.B. Ameisensäure, Essigsäure, Dimethylformamid oder Tetrahydrofuran, gelöst oder suspendiert und mit einer Mercaptoverbindung, z.B. Schwefelwasserstoff, Mercaptoätha- 15 noi, Thioglycolsäure, Natriumsulfid oder Ammoniumsulfid, behandelt, wodurch die freie Thiolgruppe regeneriert wird.

Das erfindungsgemässe Verfahren hat die folgenden Vorteile:

1. Die Entfernung der Schutzgruppen wird unter extrem 20 milden Bedingungen erzielt.

2. Die Schutzgruppen können in guter Ausbeute entfernt werden.

3. Das Verfahren und die Nachbehandlung sind leicht und einfach. 25

4. Die Schutzgruppe an der Thiolgruppe kann selektiv entfernt werden, wobei andere funktionelle und Schutzgruppen intakt bleiben.

Im folgenden werden Beispiele für die Herstellung von Aminosäuren oder Peptiden mit geschützter Thiolgruppe oder 30 geschützten Thiolgruppen als Referenzbeispiele und Beispiele für die Entfernung der Schutzgruppen als Ausführungsbeispiele wiedergegeben.

Wenn in dieser Beschreibung Abkürzungen verwendet werden, um Aminosäuren, Peptide, Schutzgruppen usw. zu bezeich- 35 nen, werden die von IUP AC IUB vorgeschriebene Nomenklatur und die auf diesem speziellen Gebiet gewöhnlich angewandten Trivialnamen verwendet. Wenn irgendeine Aminosäure in der D- und L-Konfiguration vorliegen kann, bezeichnet jeder Hinweis auf diese Säure die L-Form, wenn die D-Form nicht 40 spezifisch erwähnt wird.

tBu

I

H-Cys-OH

Unter Verwendung von L-Cystein und tert.-Butanol wird die Verfahrensweise von Referenzbeispiel 1 wiederholt, um die obige Verbindung herzustellen.

Schmelzpunkt: 244,0 bis 245,0 °C; [ajg' —15,4° (c=0,57, Eisessig);

Elementaranalyse für C7H1502NS

Berechnet: C45,13; H8,65; N7,52; S 17,22;

Gefunden: C 45,11; H8,32; N7,47; S 17,77.

Referenzbeispiel 3

Herstellung des Dicyclohexylaminsalzes von tert.-Butoxy-carbonyl-S-tert.-butyl-L-cystein der Formel:

t-Bu

I

Boc-Cys-OH • DCHA

In herkömmlicher Weise wird das in Referenzbeispiel 2 erhaltene S-tert.-Butyl-L-cystein der Formel:

tBu

I

H-Cys-OH

mittert.-Butyl-S-4,6-dimethylpyrimidin-2-ylthiolcarbonat tert.-butoxycarbonyliert und dann als Dicyclohexylaminsalz kristallisiert.

Ausbeute: 90%; Schmelzpunkt: 181,0 bis 182,5 °C;

[a]ß+7,4° (c=0,83, Methanol);

Elementaranalyse für C24H4604N2S

Berechnet: C 62,93; H 10,10; N6,10; S 6,99;

Gefunden: C 62,92; H 10,36; N5,95; S 7,05.

Das Dicyclohexylaminsalz von tert.-Butoxycarbonyl-S-l-adamantyl-L-cystein der Formel:

Referenzbeispiel 1

Herstellung von S-l-Adamantyl-L-cystein der Formel:

Adm

I

H-Cys-OH

12,1 g L-Cystein werden in 120 ml Trifluoressigsäure gelöst, worauf 15,2 g 1-Adamantanol zugesetzt werden. Das Gemisch wird 12 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Die Trifluoressigsäure wird unter vermindertem Druck abdestilliert. Der ölige Rückstand wird in 200 ml Wasser gelöst und mit Eis gekühlt. Die Lösung wird dann mit konzentriertem wässrigem Ammoniak auf pH=6,0 gebracht, worauf sich Kristalle ausscheiden. Die Kristalle werden durch Filtration isoliert, mit Wasser, Äthanol und Äther gespült und aus Wasser umkristallisiert.

Ausbeute: 23,0 g; Schmelzpunkt: 227,0 bis 228,0 °C (Zersetzung); [cx]d — 14,5°C (c=0,51, Eisessig) ;

Elementaranalyse für C13H2202NS Berechnet: C60,90; H8,65; N5,46; S 12,51; Gefunden: C 59,51; H 8,16; N5.41; S 12,33.

Referenzbeispiel 2

Herstellung von S-tert.-Butyl-L-cystein der Formel:

Adm

I

45 Boc-Cys-OH DCHA

wird in der gleichen Weise wie oben hergestellt.

Ausbeute: 71,4%; Schmelzpunkt: 173,0 bis 174,0 °C; 50 Md+5,8°(c=0,55,Methanol);

Elementaranalyse für C30H53O4N2S Berechnet: C 67,00; H 9,93; N5,21; S 5,96; Gefunden: C67,09; H9,88; N5,08; S 5,85.

55 Das verwendete tert.-Butoxycarbonyl-S-p-methoxybenzyl-L-cystein der Formel:

MOB

I

Boc-Cys-OH

60

65

ist ein handelsübliches Produkt.

Referenzbeispiel 4

Herstellung der Verbindung der Formel:

tBu

I

Boc-Gly-Cys-Gly-OMe

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4

(1) Herstellung der Verbindung derFormel:

tBu

I

Boc-Cys-Gly-OMe

3,0 g Glycinmethylester-hydrochlorid werden in 30 ml Chloroform gelöst, worauf unter Eiskühlung 3,36 ml Triäthyl-amin zugesetzt werden. Dieses Gemisch wird mit dem N-Hydr-oxy-5-norbornen-2,3-dicarboximidester (HONB-Ester) der Verbindung der Formel:

tBu I

Boc-Cys-OH

(hergestellt aus 9,2 g der Verbindung der Formel:

tBu

I

Boc-Cys-OH DCHA

und 3,6 g HONB in Dioxan mit 4,1 g Dicyclohexylcarbodiimid als Kondensationsmittel) versetzt, worauf das Gemisch 12 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt wird. Das Chloroform wird unter vermindertem Druck abdestilliert und der ölige Rückstand in 24 bis 150 ml Essigsäure gelöst und mit einer 4%-igen wässrigen Natriumhydrogencarbonatlösung, einer gesättigten wässrigen Zitronensäurelösung und schliesslich Wasser gewaschen. Das Äthylacetat wird dann abgedampft und der Rückstand durch Zugabe von Wasser kristallisiert.

Ausbeute: 5,9 g ; Schmelzpunkt 73,0 bis 75,0 °C ; [a]^ —17,9 ° (c=0,56, Dimethylformamid) ;

Elementaranalyse für Q5H28O5N2S Berechnet: C 51,70; H 8,10; N8,04; S 9,20; Gefunden: C51,70; H 8,12; N8,05; S 9,14.

(2) Herstellung der Verbindung der Formel:

tBu I

Z-GIy-C ys-Gly-OMe

5,23 g der Verbindung der Formel:

tBu

I

Boc-C ys-Gly-OMe werden in 30 ml Trifluoressigsäure gelöst, worauf die Lösung 15 Minuten lang bei Raumtemperatur geschüttelt wird. Die Trifluoressigsäure wird unter vermindertem Druck abgedampft und der Rückstand gut getrocknet. Es wird dann in 30 ml Dimethylformamid gelöst und unter Eiskühlung mit 7,0 ml Triäthyl-amin versetzt. Nach Zugabe von 5,8 g der Verbindung der Formel Z-GIy-ONB wird das Gemisch 48 Stunden lang gerührt. Das Dimethylformamid wird unter vermindertem Druck abgedampft und der Rückstand in Äthylacetat gelöst. Die Lösung wird mit einer 4%-igen wässrigen Natriumhydrogencarbonatlösung, 1-normaler Salzsäure und Wasser gewaschen und danach unter vermindertem Druck zur Trockene eingeengt. Der Rückstand wird mit Petroläther versetzt, worauf man das Gemisch stehen lässt, wonach sich Kristalle ausscheiden. Die Kristalle werden durch Filtration isoliert.

Ausbeute 6,1 g; Schmelzpunkt: nicht bestimmbar, weil die Substanz bei Raumtemperatur flüssig ist ; [a]f? — 11,4° (c=0,46, Dimethylformamid) ;

Elementaranalyse für C2oH2906N3S

Berechnet: C 54,65; H 6,65; N9,56; S 7,30;

Gefunden: C55,ll; H6,60; N9,48; S 6,55.

5 Die Verbindung der Formel :

MOB

I

Z-Gly-Cys-Gly-OMe

10

wird ebenfalls in der gleichen Weise wie oben hergestellt. Schmelzpunkt: 90,0 bis 95,0 °C; [a]o — 23,1° (c=0,55, Dimethylformamid);

Elementaranalyse für C24H2y07N3S

15 Berechnet: C 57,20; H 5,80; N8,34; S 6,37;

Gefunden: C 57,60; H 5,81; N8,23; S 6,36.

Beispiel 1

20 Rückgewinnung von Cystein aus S-geschütztem Cystein

1) 1 Millimol S-geschütztes Cystein wird in 10 ml Trifluoressigsäure gelöst, worauf man 0,2 ml Anisol zugibt. Das Gemisch wird auf 0 °C abgekühlt und mit 319 mg (1 Millimol) Hg(CH3 COO)2 versetzt. Das Gemisch wird 15 Minuten lang 25 bei 0 °C gerührt. Die Trifluoressigsäure wird unter vermindertem Druck im Verlauf von 5 Minuten abgedampft, worauf 40 ml Wasser zu dem Rückstand gegeben werden. Das Gemisch wird einmal mit Äther gewaschen. In diese Lösung lässt man 30 Minuten lang Schwefelwasserstoffgas perlen und filtriert das resul-30 tierende HgS ab, worauf man das Filtrat einengt. Der erhaltene Rückstand wird in einer kleinen Menge Wasser gelöst, worauf das Wasser verdampft wird, um den Überschuss der Säure zu entfernen. Diese Verfahrensweise wird dreimal wiederholt, und der am Ende erhaltene Rückstand wird mit Hilfe eines Ami-35 nosäureanalysators analysiert. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle angegeben. Die S-Benzylgruppe ist unter den obigen Bedingungen ziemlich beständig.

tBu

Adm

MOB

40

50

55

60

65

S-geschützte H-Cys-OH H-Cys-OH H-Cys-OH

Aminosäure

% Rückgewinnung 99,8% 102,0% 100,8%

von Cystein

Es findet keine Entfernung der Schutzgruppen statt, wenn die obige Reaktion unter Verwendung des Acetats von Ag, Cu, Zn, Ni oder Pb anstelle von Hg(CH3COO)2 ausgeführt wird.

2) 1 Millimol S-geschütztes Cystein wird in 10 ml 80%iger Ameisensäure oder 80%iger Essigsäure gelöst, worauf man 0,2 ml Anisol zugibt. Bei Raumtemperatur werden 319 mg (1 Millimol) Hg(CH3COO)2 zugesetzt, worauf das Gemisch 1 Stunde lang gerührt wird. Das Reaktionsgemisch wird in der gleichen Weise wie unter 1) behandelt und analysiert.

Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle wiedergegeben:

MOB

tBu

S-Geschützte Aminosäure Lösungsmittel

80%ige Ameisensäure 85,0% 80 %ige Essigsäure 73,0%

Adm

I I I

H-Cys-OH H-Cys-OH H-Cys-HO

86,0% 48,0%

80,0%

3) 1 Millimol S-geschütztes Cystein wird in 20 ml 80%iger Essigsäure gelöst, worauf 0,2 ml Anisol und danach 512 mg (1,2 Millimol) Hg(CF3COO)2 zugegeben werden. Das Gemisch wird 1 Stunde lang bei Raumtemperatur gerührt.

5

628 330

Das Reaktionsgemisch wird dann in der gleichen Weise wie unter 1) behandelt und analysiert.

Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle wiedergegeben:

MOB tBu

I I

S-geschützte H-Cys-OH H-Cys-OH

Aminosäure % Rückgewinnung von Cystein 94,0% 92,0%

Wenn man eine Lösung von Hg(CCl3COO)2 anstelle von Hg(CF3COO)2 verwendet, beträgt die prozentuale Rückgewinnung von Cystein aus der Verbindung der Formel:

MOB

I

H-Cys-OH 96,0%.

Beispiel 2

Herstellung der Verbindung der Formel Z-Gly-Cys~Gly-OMe 1) Aus der Verbindung der Formel:

5 MOB

I

Z-Gly-Cys-Gly-OMe

3,02 g der Verbindung der Formel:

10

MOB

I

Z-Gly-Cys-Gly-OMe

15 werden in 45 ml kalter Trifluoressigsäure gelöst, worauf man 1,5 ml Anisol zugibt. Nach Zugabe von 1,91 gHg(CH3COO)2 bei 0 °C wird das Gemisch 15 Minuten lang gerührt. Die Trifluoressigsäure wird unter vermindertem Druck abdestilliert und der Rückstand mit Äther versetzt. Der resultierende Nie-20 derschlag wird durch Filtration isoliert.

Ausbeute: 4,1 g ;

Elementaranalyse für Ci8H2oOgN3SF3Hg;

Berechnet: C 31,06; H 2,90; N6,04; S 4,61; Hg 28,32; F 8,19.

Gefunden: C31,02; H2,87; N6,18; S4,60; Hg28,68; F8,18.

2,0 g des obigen Mercaptides werden in 30 ml Dimethylfor- 30 der Verbindung der Formel Z—Gly-Cys-Gly-OMe an, die mamid gelöst, worauf man 80 Minuten lang Schwefelwasser- durch Behandlung der Verbindung der Formel:

stoffgas in die Lösung perlen lässt. Das resultierende HgS wird mit Celite als Filterhilfsmittel abfiltriert und das Filtrat unter MOB

vermindertem Druck zur Trockene eingeengt. Der kristalline I

Rückstand wird mit Wasser versetzt, worauf die Kristalle durch 35 Z-Gly-Cys-Gly-OMe Filtration isoliert und aus Methanol und Wasser umkristallisiert werden. mit Hg(CF3COO)2 in 80 %iger Essigsäure erhalten werden.

Ausbeute: 1,1g (100%) ; Schmelzpunkt 130 bis 132 °C; 1 Millimol der Verbindung der Formel:

D - C *7° (n — D II Ìi m afïntïînmi\ 40

[Ujlf, Jj / VjJ / j JL/lHlWUlJ>UVllliaiIIlU^

Elementaranalyse für C16H2i06N3:

Berechnet: C 50,12; H 5,52; N 10,96; S 8,36.

Gefunden: C49,61; H 5,18; N 10,97; S 8,44.

2) Aus der Verbindung der Formel:

tBu

I

Z-Gly-C ys-Gly-OMe

Durch Behandlung der Verbindung der Formel:

tBu

I

Z-Gly-C ys-Gly-OMe in der gleichen Weise wie unter 1) erhält man das Mercaptid und Z-Gly-Cys-Gly-OMe in Ausbeuten von 84,2% bzw. 84,5%.

Diese Verbindung ist hinsichtlich Schmelzpunkt und des Wertes von [a]D identisch mit der unter 1) erhaltenen Verbindung.

Elementaranaly se :

Berechnet: C50,12; H5,52; N10,96; S8,36. Gefunden: C50,13; H5,61; N 10,77; S8,27.

3) Die folgende Tabelle gibt die Ausbeuten an Kristallen

MOB

I

Z-Gly-Cys-Gly-OMe

45 wird in 20 ml 80%iger Essigsäure gelöst, worauf 512 mg (1,2 Millimol) oder 853 mg (2,0 Millimol) Hg(CF3COO)2 zugesetzt werden. Das Gemisch wird 60 Minuten lang bei Raumtemperatur gerührt. Nach Zugabe von 40 ml 80%iger Essigsäure lässt man 20 Minuten lang Schwefelwasserstoffgas in das Gemisch 50 perlen. Das HgS wird abfiltriert und das Filtrat unter vermindertem Druck zur Trockene eingeengt. Der Rückstand wird mit Wasser versetzt, worauf die resultierenden Kristalle durch Filtration isoliert und aus Äthylacetat umkristallisiert werden.

55 Hg(CF3COO)2 1,2 molare Äquiv. 2,0 molare Äquiv. Ausbeute 83,9% 76,5%

Wenn das obige Reaktionsverfahren unter Verwendung von 1,2 molaren Äquivalenten Hg(CCl3COO)2 anstelle von 60 Hg(CF3COO)2 ausgeführt wird, beträgt die Ausbeute an der Verbindung der Formel Z-Gly-Cys-Gly-OMe 74,9%.

65

Beispiel 3

Herstellung von Bis-tert.-butoxycarbonyl-L-cystin 3,41 g der Verbindung der Formel:

628 330

6

MOB

!

BOC-Cys-OH

werden in 200 ml 80%igem wässrigem Methanol gelöst, und nach Zugabe von 5,12 g Hg(CF3COO)2 wird die Lösung 2 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Nach Zugabe von 100 ml 80%igem wässrigem Methanol lässt man 30 Minuten lang Schwefelwasserstoffgas in das Reaktionsgemisch perlen. Das resultierende HgS wird abfiltriert und das Filtrat unter vermindertem Druck auf die Hälfte seines anfänglichen Volumens eingeengt. Der Rückstand wird mit 4,2 g Natriumhydrogencar-bonat versetzt und das Gemisch unter vermindertem Druck weiter eingeengt. Nachdem das Methanol entfernt worden ist, werden 100 ml Wasser zu dem Rückstand gegeben, worauf eine Oxydation durch Einleiten von Luft im Verlauf von 40 Stunden ausgeführt wird. Das Gemisch wird mit Zitronensäure angesäuert und das resultierende Öl zweimal mit je 150 ml Äthylacetat extrahiert. Das Äthylacetat wird abdestilliert und der Rückstand durch Zugabe von Petroläther kristallisiert und durch Filtration isoliert. Das kristalline Produkt wird aus Äthylacetat umkristallisiert.

Ausbeute: 1,85 g; Schmelzpunkt: 149,0 bis 150,0 °C (Zersetzung) ; [a]^ —136,4° (c= 1,84 in Methanol) ; Elementaranalyse für C16H28OgN2S2:

Berechnet: C 43,62; H 6,48; N6,36; S 14,55. Gefunden: C43,72; H6,34; N6,24; S 14,25.

Beispiel 4

Herstellung von Oxytocin

1) Herstellung der Verbindung der Formel Boc-Cts(MOB)-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys(MOB)-Pro-Leu-Gly-Harz

Boc-Gly-Harz (Gly-Gehalt: 2,2 Millimol) wird in das Reak-tionsgefäss eines automatischen Peptidsyntetisiergerätes Shi-madzu APS-800 gebracht, worauf nacheinander die folgende Verfahrensweise ausgeführt wird:

(1) Waschen mit Dichlormethan (2 Minuten, dreimal)

(2) 50% Trifluoressigsäure in Dichlormethan (10 Minuten, zweimal)

(3) Waschen mit Dichlormethan (2 Minuten, dreimal)

(4) Waschen mit Äthanol (2 Minuten, dreimal)

(5) Waschen mit Chloroform (2 Minuten, dreimal)

(6) 10% Triäthylamin enthaltendes Chloroform (2 Minuten und 10 Minuten, jeweils einmal)

(7) Waschen mit Chloroform (2 Minuten, dreimal)

(8) Kondensationsreaktion mit 6,6 Millimol des symmetrischen Anhydrids von BOC-Aminosäure (60 Minuten) oder 6,6 Millimol BOC-Aminosäure-p-nitrophenylester (12 Stunden für BOC-Asn, Boc-Gln oder Boc-Tyr).

(9) Waschen mit Dichlormethan (2 Minuten, dreimal)

(10) Acetylierung der nicht umgesetzten Aminogruppe (4,5% Essigsäureanhydrid enthaltendes Dichlormethan)

(11) Waschen mit Dichlormethan (2 Minuten, dreimal)

Nachdem alle Reaktionszyklen ausgeführt worden sind,

wird das Produkt in der angegebenen Reihenfolge mit Essigsäure, Dimethylformamid und Methanol gewaschen und getrocknet.

Ausbeute: 13,15 g.

2) Herstellung der Verbindung der Formel

Boc-Cys(MOB)-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys~ (MOB)-Pro-Leu-Gly—NH2

12,6 g des unter 1) erhaltenen Harzes werden in 70 ml Methanol, die 15,5 % Ammoniak enthalten, suspendiert, worauf die Suspension 46 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt wird.

Das Harz wird abfiltriert und zweimal mit 20 ml Dimethylformamid gewaschen. Das Filtrat und die Waschflüssigkeiten werden vereinigt und unter verminderten Druck zur Trockene eingeengt. Der Rückstand wird mit 50 ml Äther versetzt und 5 das resultierende Pulver durch Filtration isoliert und getrocknet. Ausbeute 2,86 g. Dieses Produkt wird durch wiederholte Um-fällung aus heissem Methanol, wässrigem Äthanol und einem Gemisch aus Dimethylformamid und Äthanol gereinigt.

Ausbeute 1,0 g.

io Dieses Pulver wird auf einer Säule (2,8 X 4,0 cm) mit Kieselgel entwickelt (Lösungsmittelsystem: Chloroform/Methanol/ Wasser/Pyridin/Essigsäure= 1085:150:25:63:84).

Die Fraktionen, die reich an der gewünschten Verbindung sind, werden vereinigt und zur Trockene eingedampft.

15

Ausbeute: 768 mg; [a]o —39,1° (c=0,47 in Dimethylformamid);

Elementaranalyse für C66H98Q16N12S2 • CH3COOH- H20: Berechnet: C55,52; H6,92; N 11,78; S4,49. 20 Gefunden: C 55,24; H 7,00; N 11,92; S 4,43.

3) Herstellung von Oxytocin

125 mg des unter 2) hergestellten Pulvers werden zusammen mit 0,22 ml Anisol in 1 ml Trifluoressigsäure gelöst, wor-25 auf 127 mg Hg(CH3COO)2 zugegeben werden. Man lässt das Gemisch 30 Minuten lang bei Raumtemperatur stehen. Nach Zugabe von 30 ml Äther wird der resultierende Niederschlag durch Filtration isoliert (173 mg). Dieser Niederschlag wird in 3 ml 50%iger wässriger Essigsäure gelöst; nach Zugabe von 30 0,31 ml 2-Mercaptoäthanol wird der resultierende Niederschlag abfiltriert. Das Filtrat wird unter vermindertem Druck zur Trockene eingeengt. Der Rückstand wird in 1 ml 50%iger wässriger Essigsäure gelöst und die Lösung auf eine Säule (2,2 X 92,5 cm) mit Sephadex G-15 gegeben, worauf man mit 35 50%iger Essigsäure eluiert. Die Fraktionen 149 bis 188 ml werden vereinigt und gefriergetrocknet (85 mg).

Das gefriergetrocknete Produkt wird in 150 ml 0,1 %iger wässriger Essigsäure gelöst ; nach Einstellen der Lösung mit 1-normalem wässrigem Ammoniak auf pH=7,3 lässt man Luft 40 in die Lösung perlen. Nach 4,5 Stunden wird die Lösung auf pH= 3,5 gebracht und gefriergetrocknet (76 mg). Das gefriergetrocknete Produkt wird auf einer ähnlichen Säule wie oben erwähnt entwickelt. Die Fraktionen von 154 bis 188 ml werden aufgefangen und gefriergetrocknet, wobei man 50 mg Oxytocin 45 erhält.

[a]22—24,6° (c=0,47,1-normale wässrige Lösung von Essigsäure; Aminosäureanalyse: Asp 1,03, Glu 1,13, Pro 1,06, Gly 1,00, Cys 1,97, Ile 1,03, Leu 1,03, Tyr 0,90 ; Dünnschichtchromatographie: Rf (n-Butanol/Essigsäure/Wasser=3; 50 l:l)=0,44;Rf (n-Butanol/Äthylacetat/Essigsäure/Was-ser = 1:1:1:1)=0,66 (in jedem Falle ein einziger Fleck).

Beispiel 5 Herstellung von Somatostatin 55 1) Synthese der Verbindung der Formel:

MOB

I

H-Cys-O'Bu • L-Tartrat

60

Eine Suspension von 4,82 g (0,02 Mol) der Verbindung der Formel:

MOB

65 ,

H-Cys-OH

in 150 ml Dioxan wird unter Rühren bei Raumtemperatur trop-

7

628 330

fenweise mit 4,8 ml konzentrierter Schwefelsäure versetzt. In das Gemisch lässt man unter Eiskühlung 75 ml Isobutylen perlen. Das Gemisch wird dicht verschlossen, worauf man es bei Raumtemperatur 12 Stunden lang stehen lässt. Das Gemisch wird auf 300 ml einer 1-normalen Natriumhydroxydlösung gegossen und dreimal mit Äther extrahiert. Die Ätherschicht wird über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und der Äther unter vermindertem Druck abdestilliert. Der ölige Rückstand wird in 50 ml Äther gelöst, worauf man 3 ml 6,69-normale Salzsäure in Dioxan zugibt. Die resultierenden Kristalle werden durch Filtration isoliert und aus Äthylacetat umkristallisiert.

Ausbeute: 2,4 g.

1,99 g der Kristalle werden in Äther suspendiert und mit 10 ml einer 1-normalen Natriumhydroxydlösung versetzt. Das Gemisch wird so gut geschüttelt, dass sich alles löst, und zweimal mit Äther extrahiert. Die Ätherlösungen werden vereinigt, getrocknet und unter vermindertem Druck destilliert. Der ölige Rückstand wird in Äthanol gelöst. In der Lösung werden 900 mg L-Weinsäure gelöst, worauf man sie eine Weile stehen lässt. Die resultierenden Kristalle werden durch Filtration isoliert und zweimal aus Äthanol umkristallisiert.

Ausbeute: 2,3 g; Schmelzpunkt: 100,0 bis 102,0 0C;[ci]d7 — 3,2" (c=0,53, Dimethylformamid) ;

Elementaranalyse für C15H2303NS.C4H606.1/2H20:

Berechnet: C 49,99; H 6,62; N3,07; S 7,02. Gefunden: C 49,85; H 6,74; N2,98; S 6,68.

2) Synthese der Verbindung der Formel Z-Thr-Ser-OMe

6,22 g (0,04 Mol) der Verbindung der Formel H-Ser-OMe-HCl werden in 50 ml Dimethylformamid gelöst, worauf man unter Eiskühlung Triäthylamin zugibt. Das resultierende Salz wird durch Filtration abgetrennt, worauf das Filtrat mit 16,6 g (0,04 Mol) der Verbindung der Formel Z-Thr-ONB versetzt wird. Das Gemisch wird 12 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt, worauf das unlösliche Material durch Filtration entfernt und das Filtrat im Vakuum eingeengt wird. Der ölige Rückstand wird in Äthylacetat gelöst, mit Natriumchlorid gesättigt und mit 1-normaler Salzsäure und 5 %igem Natriumhydro-gencarbonat gewaschen. Nach dem Trocknen wird das Äthylacetat abdestilliert, worauf die resultierenden Kristalle isoliert werden.

Ausbeute: 10,6 g (74,5%); Schmelzpunkt: 133,0 bis 135,0 °C; [°0d +10,1° (c=0,86, Dimethylformamid) ;

Elementaranalyse für C16H2207N2:

Berechnet: C 54,23; H 6,26; N7.91.

Gefunden: C 54,44; H 6,33; N7,84.

3) Synthese der Verbindung der Formel Z-Phe-Thr-Ser-OMe

9,91 g (0,028 Mol) der Verbindung der Formel Z-Thr-Ser-OMe werden in 100 ml Methanol gelöst, worauf man 6,3 ml 6,69-normalen Chlorwasserstoff in Dioxan zugibt. Das Gemisch wird in herkömmlicher Weise der katalytischen Reduktion in Gegenwart von Palladiumschwarz unterworfen. Der Katalysator wird abfiltriert und das Filtrat eingeengt. Der Rückstand wird in 50 ml Dimethylformamid gelöst und die Lösung mit 4,31 ml Triäthylamin neutralisiert, worauf man filtriert. Das Filtrat wird mit der Verbindung der Formel Z-Phe-ONB versetzt, die aus 8,38 g (0,028 Mol) der Verbindung der Formel Z-Phe-OH, 6,0 g (0,034 Mol) HONB und 5,78 g (0,028 Mol) Dicy-clohexylcarbodiimid hergestellt ist, worauf das Gemisch 12

Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt wird. Das Lösungsmittel wird im Vakuum abdestilliert und der Rückstand in Äthylacetat gelöst, worauf man in herkömmlicher Weise wäscht und trocknet. Beim Verdampfen des Lösungsmittels scheiden sich Kristalle aus. Nach dem Abkühlen werden die Kristalle durch Filtration isoliert.

Ausbeute: 11,0 g (80,0%). Schmelzpunkt: 180,0 bis 182,0 °C; [gc]d3— 3,8° (c=0,67, Dimethylformamid);

Elementaranalyse für C25H3108N3 • 1/2H20 Berechnet: C 58,81; H 6,12; N8,23;

Gefunden: C 58,80; H 6,25; N8,26.

4) Synthese der Verbindung der Formel

Z(N02)-Thr-0H • DCHA

Die Verbindung wird nach dem herkömmlichen Verfahren [F. H. Carpenter und D. T. Gish, J. Amer. Chem. Soc. 74,3818 (1952)] mit Natriumhydrogencarbonat als Base hergestellt.

Ausbeute: 50,0%; Schmelzpunkt: 186,0 bis 188,0 °C; [o.]q +14,9° (c=0,77, Dimethylformamid) ;

Elementaranalyse für CpH14N207 • C12H23N Berechnet: C60,ll; ~ H7,78; N8,76;

Gefunden: C 60,14; H 7,83; N8,80.

5) Synthese der Verbindung der Formel

Z(N02)-Thr-Phe-Thr-Ser-0Me

Nach einem herkömmlichen Verfahren werden 11,0 g (0,022 Mol) der Verbindung der Formel Z-Phe-Thr-Ser-OMe in Methanol katalytisch zu H-Phe-Thr-Ser-OMe reduziert. Zu dem erhaltenen Produkt wird eine Lösung der Verbindung der Formel (Z(N02)-Thr-0NB in Tetrahydrofuran gegeben, die aus 10,6 g (0,022 Mol) der Verbindung der Formel Z(N02)-Thr-OH • DCHA, 3,94 g (0,022 Mol) HONB und 4,54 g (0,022 Mol) Dicyclohexylcarbodiimid hergestellt ist. Das Gemisch wird 12 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wird abdestilliert, worauf man Wasser zugibt. Die resultierenden Kristalle werden durch Filtration isoliert und aus Methanol umkristallisiert.

Ausbeute: 12,8 g (90,1%); Schmelzpunkt: 194,0 bis 196,0 °C; Md — 057° (c=0,72, Dimethylformamid) ;

Elementaranalyse für C29H37012N5 Berechnet: C 53,78; H 5,76; N 10,81;

Gefunden: C 53,80; H 5,85; N 10,75.

6) Synthese der Verbindung der Formel

Z(N02)-Thr-Phe-Thr-Ser-NHNH2

12,3 g (0,019 Mol) der Verbindung der Formel Z(N02)-Thr-Phe—Thr-Ser-OMe werden in 100 ml Dimethylformamid gelöst, worauf man 100 ml Methanol und danach 9,5 ml (0,19 Mol) Hydryzinhydrat zusetzt. Man lässt das Gemisch 48 Stunden lang bei Raumtemperatur stehen und kühlt es mit Eis. Die resultierenden Kristalle werden durch Filtration isoliert und aus Methanol umkristallisiert.

Ausbeute: 11,4 g (92,7 %); Schmelzpunkt: 229,0 bis 232,0 °C (Zersetzung); [a]o +3,2° (c=0,44, Dimethylformamid); Elementaranalyse für C28H37OnN7 • H20 Berechnet: C 50,52; H 5,91; N 14,81;

Gefunden: C 50,89; H 5,92; N 14,90.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

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55

60

65

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8

7) Synthese der Verbindung der Formel:

MOB

I

Z(N02)-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-0tBu

3,24 g (0,005 Mol) der Verbindung der Formel Z(N02)-Thr-Phe- Thr-Ser-NHNH2 werden in 50 ml Dimethylformamid gelöst. Während die Lösung auf —20 °C gekühlt wird, werden 3,1 ml 6,51-normaler Chlorwasserstoff in Dioxan zugesetzt und 0,81 ml (0,06g Mol) Isoamylnitrit zugetropft. Nach 10 Minuten wird das Gemisch weiter auf —50 °C abgekühlt und mit Triäthylamin neutralisiert.

Inzwischen werden 2,24 g (0,005 Mol) der Verbindung der Formel:

MOB

l

H-C ys-O'B u-L-Tartrat in Dimethylformamid gelöst und die Lösung unter Eiskühlung mit 1,4 ml Triäthylamin neutralisiert. Diese Lösung wird mit der oben hergestellten Azidlösung vereinigt, worauf die vereinigten Lösungen 48 Stunden lang bei 4 °C gerührt werden. Das unlösliche Material wird durch Filtration entfernt und das Filtrat eingeengt. Der Rückstand wird mit Wasser versetzt und das resultierende Pulver durch Filtration isoliert. Das Pulver wird zweimal aus Methanol umkristallisiert.

Ausbeute: 3,55 g (77,7%) ; Schmelzpunkt: 193,0 bis 195,0 °C (Zersetzung) ; [a]gs —18,0° (c=0,56, Dimethylformamid) ; Elementaranalyse für C43H56Oi4N6S Berechnet: C56,67; H6,18; N9,21; S 3,51; Gefunden: C 56,31; H 6,08; N9,34; S 3,47.

8) Synthese der Verbindung der Formel

Z(NOz)-Trp-OH

Die Verbindung wird nach einem herkömmlichen Verfahren hergestellt.

Ausbeute: 88,6%; Schmelzpunkt: 108,0bis 115,0 ^(Zersetzung); [a]p —43,5° (c=0,65, Dimethylformamid); Elementaranalyse für C19H1704N3 • 2H20 Berechnet: C 58,91; H 5,46; N 10,85;

Gefunden: C 59,63; H 4,63; N 10,74.

9) Synthese der Verbindung der Formel:

BOC

I

Z(N 02)-Trp-L ys-OH • DCHA

7,39 g (0,03 Mol) der Verbindung der Formel:

BOC

I

H-Lys-OH

werden in 100 ml Dimethylformamid gelöst, worauf man 4,2 ml (0,03 Mol) Triäthylamin zusetzt. Die Lösung wird mit der Verbindung der Formel Z(N02)-Trp—ONB versetzt, die aus 10,5 g (0,03 Mol) der Verbindung der Formel Z(N02)-Trp-0H, 5,4 g (0,03 Mol) HONB und 6,19 g (0,03 Mol) Dicyclohexylcarbodi-imid hergestellt ist. Das Gemisch wird 12 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt, worauf das Lösungsmittel abdestilliert wird. Nach Zugabe von 30 ml 1-normaler Salzsäure wird das Gemisch in Äthylacetat gelöst. Die Äthylacetatschicht wird dreimal mit Wasser gewaschen, getrocknet und destilliert, um das Lösungsmittel zu verdampfen. Der ölige Rückstand wird in 100 ml Acetonitril gelöst und mit 6,0 ml (0,03 Mol) Dicyclo-

5 hexylamin versetzt, worauf man das Gemisch in einem Kühlschrank stehen lässt. Die resultierenden gelatinösen Kristalle werden durch Filtration isoliert und aus Acetonitril umkristallisiert.

io Ausbeute: 12,5 g (52,6%); Schmelzpunkt: 95,0 bis 100,0 °C;[oi]q — 20,9° (c=0,56, Dimethylformamid) ; Elementaranalyse für C30H37O9N5 • C12H23N Berechnet: C 63,61; H 7,63; N 10,60;

Gefunden: C 63,77; H 7,67; N 11,08.

10) Synthese der Verbindung der Formel:

BOC MOB

20 I I

Z(NQ2)-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-OtBu

3,29 g (0,0036 Mol) der Verbindung der Formel:

25 MOB

I

Z(N02)-Thr-Phe-Thr-Ser—Cys-O'Bu werden in 150 ml eines Gemisches aus Essigsäure und Wasser 30 (Volumenverhältnis 8:2) gelöst, worauf die Lösung bei 50 °C 8 Stunden lang der katalytischen Reduktion in Gegenwart von Palladiumschwarz unterworfen wird. Der Katalysator wird abfiltriert und das Filtrat gefriergetrocknet. Das gefriergetrocknete Produkt wird in Methanol gelöst und mit Äther versetzt. 35 Der resultierende Niederschlag wird durch Filtration isoliert und aus einem Gemisch aus Methanol und Äther umgefällt. Ausbeute: 2,75 g

2,62 g (0,0033 Mol) des oben erhaltenen Pulvers werden in einer kleinen Menge Dimethylformamid gelöst. Eine Lösung 40 von 627 mg p-Toluolsulfonsäure in Dimethylformamid wird unter Kühlen zu der Lösung gegeben, worauf man das Gemisch stehen lässt. Der grösste Teil des Dimethylformamides wird abdestilliert und der Rückstand mit Äther versetzt. Das resultierende Pulver wird durch Filtration isoliert und in 20 ml Dime-45 thylformamid gelöst, worauf man die Verbindung der Formel:

BOC I

Z(N02)-Trp—Lys-OH

50

zugibt, die aus 2,88 g (0,0036 Mol) der Verbindung der Formel:

BOC

I

55 Z(NOz)-Trp-Lys-OH • DCHA

hergestellt ist, und ferner 1,30 g (0,0072 Mol) HONB, 0,42 ml (0,0033 Mol) N-Äthylmorpholin und 819 mg (0,004 Mol) Di-cyclohexylcarbodiimid zusetzt. Das Gemisch wird 3 Stunden 60 lang bei —10 °C gerührt und weitere 48 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Der resultierende Dicyclohexylharn-stoff wird abfiltriert und das Filtrat eingeengt. Der Rückstand wird mit Wasser versetzt.

Der resultierende Niederschlag wird durch Filtration isoliert 65 und zweimal aus Methanol umkristallisiert.

Ausbeute: 3,5 g (80,6%); Schmelzpunkt: 183,0 bis 185,0 °C (Zersetzung);

9

628 330

[a] 0 —26,6° (c=0,67,Dimethylformamid) ; Elementaranalyse für N10S

Berechnet: C 58,52; H 6,45; N 10,66; S 2,44;

Gefunden: C 58,36; H 6,47; N 10,49; S 2,54.

11) Synthese der Verbindung der Formel Z-Phe-Phe-O'Bu Nach einem herkömmlichen Verfahren werden 17,8 g (0,05 Mol) der Verbindung der Formel Z-Phe-O'Bu in Methanol katalytisch zu der Verbindung der Formel H-Phe-O'Bu reduziert. Diese Verbindung wird mit einer Lösung der Verbindung der Formel Z-Phe-ONB versetzt, die aus 15,0 g (0,05 Mol) der Verbindung der Formel Z-Phe-OH, 9,0 g (0,05 Mol) HONB und 10,3 g (0,05 Mol) Dicyclohexylcarbodiimid hergestellt ist, worauf das Gemisch 12 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt wird. Das Dioxan wird abdestilliert und der Rückstand in Äthylacetat gelöst. Die Lösung wird in herkömmlicher Weise gewaschen, getrocknet und destilliert, um das Äthylacetat zu verdampfen. Die resultierenden Kristalle werden durch Filtration isoliert und aus Äthylacetat umkristallisiert.

Ausbeute: 15,4 g (60,0%); Schmelzpunkt: 107,0 bis 109,0 °C; [a]o —13,5° (c=0,53, Dimethylformamid);

Elementaranalyse für C30H34O5N2 Berechnet: C 71,96; H 6,82; N5,57;

Gefunden: C 71,61; H 6,64; N5,50.

12) Synthese der Verbindung der Formel BOC-Asn-Phe-Phe-O'Bu

In herkömmlicherWeise werden 13,1 g (0,026 Mol) der Verbindung der Formel Z-Phe-Phe-O'Bu in Methanol katalytisch zu der Verbindung der Formel H-Phe-Phe-O'Bu reduziert. Diese Verbindung wird zusammen mit 6,04 g (0,026 Mol) der Verbindung der Formel BOC-Asn-OH und 4,65 g (0,026 Mol) HONB in 50 ml Dimethylformamid gelöst. Unter Eiskühlung werden 5,36 g (0,026 Mol) Dicyclohexylcarboiimid zugesetzt, worauf das Gemisch 3 Stunden lang bei 0 °C und weitere 12 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt wird. Der resultierende Dicyclohexylharnstoff wird durch Filtration entfernt und das Filtrat im Vakuum eingeengt, worauf man Wasser zusetzt. Die resultierenden Kristalle werden durch Filtration isoliert und zweimal aus Methanol umkristallisiert.

Ausbeute: 11,0 g (72,8%); Schmelzpunkt: 163,0 bis 166,0 °C;[a]j)7 —28,9 ° (c=0,85, Dimethylformamid); Elementaranalyse für C31H4207N4 Berechnet: C63,90; H 7,27; N9,62;

Gefunden: C 64,12; H 7,20; N9,90.

BOC I

Z-Lys-ONB

5 versetzt, die aus 8,2 g (0,0216 Mol) der Verbindung der Formel:

BOC

I

io Z-Lys-OH

3,8 g (0,0216 Mol) HONB und 4,4 g (0,0216 Mol) Dicyclohexylcarbodiimid hergestellt ist. Das Gemisch wird 12 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt, worauf 10 ml Essigsäure zu-15 gegeben werden. Das Lösungsmittel wird im Vakuum abdestilliert und der Rückstand mit Wasser versetzt. Der resultierende Niederschlag wird durch Filtration isoliert und durch zweimalige Umfällung aus wässrigem Methanol und dann aus einem Gemisch aus Dimethylformamid und Äthylacetat gereinigt.

20

Ausbeute 11,1 g (78,1%); Schmelzpunkt: 194,0 bis 196,0 °C (Zersetzung); [a]"—26,9°(c=0,59, Dimethylformamid); Elementaranalyse für C41H52O10N6 Berechnet: C 62,42; H 6,64; N 10,65;

25 Gefunden: C 62,27; H 6,66; N10,72.

14) Synthese der Verbindung der Formel:

30

MOB

I

Z(N02)-Cys-0H

Die Verbindung wird nach einem herkömmlichen Verfahren hergestellt.

35

Ausbeute: 80,0%; Schmelzpunkt: 163,0 bis 165,0 °C; Md — 51,2° (c=0,61, Dimethylformamid) ; Elementaranalyse für C19H20O7N2S Berechnet: C 54,28; H 4,79; N6,66; S 7,62; 40 Gefunden: C54,18; H4,74; N6,57; S7,56.

15) Synthese der Verbindung der Formel:

MOBBOC

45

50

13) Synthese der Verbindung der Formel:

BOC

!

Z-L ys-Asn-Phe-OH

10,5 g (0,018 Mol) der Verbindung der Formel BOC-Asn-Phe-Phe-O'Bu werden in 100 ml Trifluoressigsäure gelöst, worauf man das Gemisch 1,5 Stunden lang bei Raumtemperatur stehen lässt. Die Trifluoressigsäure wird unter vermindertem Druck abdestilliert und der Rückstand mit Äther versetzt. Der resultierende Niederschlag wird durch Filtration isoliert und getrocknet und in 100 ml Dimethylformamid gelöst. Die Lösung wird mit 5,04 ml (0,036 Mol) Triäthylamin und einer Lösung der Verbindung der Formel:

55

65

Z(N02) - Cys - Lys - Asn - Phe - Phe - OH

Nach einem herkömmlichen Verfahren werden 10,3 g (0,013 Mol) der Verbindung der Formel:

BOC

I

Z-Lys-Asn-Phe-Phe-OH

in einem Gemisch aus Essigsäure und Wasser (Volumenverhältnis 8:2) katalytisch reduziert. Die resultierende Verbindung der Formel:

BOC

I

H-Lys-Asn-Phe-Phe-OH

wird durch zweimalige Umfällung aus Äthanol gereinigt. Ausbeute: 7,0 g.

6,55 g (0,01 Mol) dieser Verbindung werden in 100 ml Dimethylformamid suspendiert, worauf man 1,40 ml (0,01 Mol) Triäthylamin und ferner eine Lösung der Verbindung der Formel:

628 330

10'

MOB

I

Z(N02)-Cys-0NB

in Dimethylformamid zugibt, die aus 5,05 g (0,012 Mol) der Verbindung der Formel:

MOB

i

Z(N02)-C ys-OH

2,15 g (0,012 Mol) HONB und 2,48 g (0,012 Mol) Dicy-clohexylcarbodiimid hergestellt ist. Das Gemisch wird 12 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Nach Zugabe von 10 ml Essigsäure wird das Dimethylformamid im Vakuum abdestilliert und der Rückstand mit Wasser versetzt. Der resultierende Niederschlag wird durch Filtration isoliert und zweimal aus einem Gemisch aus Methanol und Wasser (Volumenverhältnis 8:2) umkristallisiert.

Ausbeute: 9,6 g (92,3 %) ; Schmelzpunkt: 209,0 bis 210,0 °C (Zersetzung); [aß7—24,6° (c=0,74, Dimethylformamid); Elementaranalyse für C52H64014N8S Berechnet: C 59,08; H 6,10; N 10,60; S 3,03; Gefunden: C59,04; H6,02; N 10,60; S 3,19.

16) Synthese der Verbindung der Formel BOC-Ala-Gly-OBzl

8,10 g (0,024 Mol) der Verbindung der Formel H-Gly-OBzl • p-Ts-OH werden in 50 ml Dimethylformamid gelöst und unter Eiskühlung mit 3,36 ml (0,024 Mol) Triäthylamin versetzt. Das erhaltene Gemisch wird mit der Verbindung der Formel BOC-Ala-ONB versetzt, die aus 4,35 g (0,023 Mol) der Verbindung der Formel BOC-Ala-OH, 4,12 g (0,023 Mol) HONB und 4,74 g (0,023 Mol) Dicyclohexylcarbodiimid hergestellt ist. Das Gemisch wird 12 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt und das Lösungsmittel im Vakuum abdestilliert. Der Rückstand wird in Äthylacetat gelöst, in herkömmlicher Weise gewaschen und getrocknet. Das Äthylacetat wird abdestilliert und der Rückstand mit Petroläther versetzt, um ihn zu kristallisieren. Die Kristalle werden durch Filtration isoliert und aus einem Gemisch aus Äthylacetat und Petroläther umkristallisiert.

Ausbeute: 5,5 g (71,2%); Schmelzpunkt: 86,0 bis 87,0 °C; [ajß7—10,8° (c=0,56, Dimethylformamid) ;

Elementaranalyse für C17H2405N2 Berechnet: C 60,70; H 7,19; N8,33;

Gefunden: C 60,82; H 7,19; N8,28.

17) Synthese der Verbindung der Formel

BOC-Ala-Gly-OH

5 Nach einem herkömmlichen Verfahren wird diese Verbindung durch katalytische Reduktion von 5,29 g (0,015 Mol) der Verbindung der Formel BOC-Ala-Gly-OBzl in Methanol hergestellt.

io Ausbeute: 3,3 g (85,3%); Schmelzpunkt: 111,0 bis 113,0 °C (Zersetzung); [a]^7—6,8° (c=0,56, Dimethylformamid); Elementaranalyse für C10H18O5N2 • 1/2H20 Berechnet: C47,05; H 7,50; N 10,98;

Gefunden: C46,66; H 7,65; N 11,03.

15

18) Synthese der Verbindung der Formel:

MOBBOC I I

20 BOC - Ala - Gly — Cys — Lys — Asn — Phe — Phe — OH 5,2 g (0,005 Mol) der Verbindung der Formel:

MOBBOC

25 | |

Z(N02) — Cys—Lys - Asn — Phe — Phe — OH

werden in einem Gemisch aus Essigsäure und Wasser (Volumenverhältnis 8:2) über Palladiumschwarz 8 Stunden lang bei 30 50 °C katalytisch reduziert. Der Katalysator wird abfiltriert und das Filtrat eingeengt, worauf der Rückstand mit Äther verrieben wird. Das resultierende Pulver wird durch Filtration isoliert und aus Äthanol umgefällt. Ausbeute: 4,05 g.

Das Pulver wird in 50 ml Dimethylformamid suspendiert 35 und mit 0,7 ml Triäthylamin und dann mit der Verbindung der Formel BOC-AIa-Gly-ONB versetzt, die aus 1,48 g (0,006 Mol) der Verbindung der Formel BOC-Ala-Gly-OH, 1,08 g (0,006 Mol) HONB und 1,24 g (0,006 Mol) Dicyclohexylcarbodiimid hergestellt ist. Das Gemisch wird 12 Stunden lang kräftig 40 gerührt. Nach dem Ansäuern mit 10 ml Essigsäure wird das Dimethylformamid im Vakuum abdestilliert. Der Rückstand wird mit Wasser versetzt und das resultierende Pulver durch Filtration isoliert und zweimal aus einem Gemisch aus Methanol und Wasser (Volumenverhältnis 8:2) umgefällt.

45

Ausbeute: 3,5 g (60,4%); Schmelzpunkt: 201,0 bis 203,0 °C (Zersetzung) ; [ajo — 28,2° (c=0,69, Dimethylformamid) ; Elementaranalyse für Cs^-^O^NgS Berechnet: C58,63; H6,83; Nil,40; S2,90; 50 Gefunden: C58,86; H6,83; N 11,53; S2,79.

19) Synthese der Verbindung der Formel:

MOB BOC BOC MOB

II I • I

BOC - Ala - Gly - Cys - Lys - Asn - Phe - Phe - Trp - Lys - Thr - Phe-Thr - Ser-Cys - O'Bu

3,29 g (0,0025 Mol) der Verbindung der Formel:

BOC MOB

I I

Z(N02)-Trp-L ys-Thr-Phe-Thr-Ser-C ys-O'Bu werden in 150 ml eines Gemisches aus Essigsäure und Wasser (Volumenverhältnis 8:2) suspendiert, worauf die Verbindung bei 50 °C 5 Stunden lang über Palladiumschwarz reduziert wird. Der Katalysator wird durch Filtration entfernt und das Filtrat unter vermindertem Druck eingeengt. Der Rückstand wird mit einer kleinen Menge Äthanol versetzt und ferner Äther zuge-65 setzt, um den Rückstand zu verreiben. Dieses Verfahren wird wiederholt.

Ausbeute: 2,90 g.

2,69 g (0,0023 Mol) der oben hergestellten Verbindung

11

628 330

werden in einer kleinen Menge Dimethylformamid gelöst und unter Eiskühlung tropfenweise mit einer Lösung von 437 mg (0,0023 Mol) p-Toluolsulfonsäure in Dimethylformamid versetzt. Nach dem Stehenlassen des Gemisches während einer Weile wird das Lösungsmittel im Vakuum abdestilliert und Äther zugesetzt, um den Rückstand zu verreiben. Das resultierende Pulver wird in 20 ml Dimethylformamid gelöst, worauf 823 mg (0,0046 Mol) HONB, 0,29 ml (0,0023 Mol) N-Äthyl-morpholin und 2,54 g (0,0023 Mol) der Verbindung der Formel:

MOBBOC

I (

BOC - Ala - Gly - Cys - Lys - Asn - Phe - Phe - OH

zugesetzt werden. Bei — 10°C werden 949 mg (0,0046 Mol) Di-cyclohexylcarbodiimid in Dimethylformamid zugesetzt, worauf das Gemisch 3 Stunden lang bei der gleichen Temperatur und weitere 72 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt wird. Der

5 resultierende Dicyclohexylharnstoff wird durch Filtration entfernt und das Filtrat im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird mit Wasser versetzt und der resultierende Niederschlag durch Filtration isoliert und zweimal aus Methanol umgefällt.

io Ausbeute: 3,8 g (75,1%); Schmelzpunkt: 224,0 bis 226,0 °C (Zersetzung) ; [ajp —18,3° (c=0,70, Dimethylformamid) ; Elementaranalyse für QogH^OzeN^Sz Berechnet: C59,62; H7,06; Nil,47; S2,92; Gefunden: C 59,55; H 6,75; N 11,32; S 2,95.

15

20) Synthese der Verbindung der Formel:

I I

H - Ala - Gly - Cys - Lys — Asn - Phe - Phe - Trp - Lys—Thr - Phe - Thr - Ser - Cys - OH (Somatostatin)

220 mg (0,1 mMol) der Verbindung der Formel:

MOBBOC BOC MOB

II I I

BOC - Ala - Gly - Cys - Lys - Asn - Phe - Phe - Trp - Lys - Thr - Phe-Thr - Ser - Cys - O'Bu werden in 20 ml eines Gemisches aus Essigsäure und Wasser Lösung bei Raumtemperatur 30 Minuten lang geschüttelt. Die

(Volumenverhältnis 8:2) gelöst. Die Lösung wird mit 171 mg 30 Trifluoressigsäure wird unter 30 °C unter vermindertem Druck

(0,4 mMol) Hg(CF3COO)2 versetzt und das Gemisch bei im Verlauf von 10 Minuten abdestilliert. Äther wird zugesetzt

Raumtemperatur 12 Stunden lang gerührt. Man lässt Schwefel- und der resultierende Niederschlag durch Filtration isoliert und wasserstoffgas in das Reaktionsgemisch perlen und entfernt den in einer kleinen Menge Wasser gelöst. Die Lösung wird durch resultierenden schwarzen Niederschlag durch Filtration mit Ce- eine Säule (2,0 X 7,0 cm) mit Amberlite IRA-410 (Acetatform)

lite. Das Filtrat wird unter vermindertem Druck eingeengt und 35 geleitet, um den Ionenaustausch auszuführen. Die ausfliessende der Rückstand mit Äther verrieben, der eine geringe Menge Flüssigkeit (60 ml) wird durch eine Säule (5,5 X 35,0 cm) mit

ß-Mercaptoäthanol enthält. Das resultierende Pulver wird Sephadex LH-20 geleitet, die mit 0,1-normaler Essigsäurelö-

durch Filtration isoliert und getrocknet. sung eluiert wird. Die Hauptfraktionen von 560 bis 640 ml wer-

Ausbeute: 193 mg. den aufgefangen und gefriergetrocknet.

Die Verbindung wird in 500 ml Dimethylformamid gelöst, 40

worauf 0,28 ml 10%Triäthylamin enthaltendes Dimethylfor- Ausbeute: 20,4 mg; [<x]d — 31,2° (c=0,13, l%igeEssig-mamid und weiter 30 mg 1,2-Dijodäthan zugesetzt werden. Das säure) ; Dünnschichtchromatographie: Rf=0,60 (n-Butanol/

Reaktionsgemisch wird 30 Minuten lang bei Raumtemperatur Pyridin/Essigsäure/Wasser im Volumenverhältnis 30:20:6:24,

gerührt und das Lösungsmittel im Vakuum abdestilliert. Der Avicel), Rf=0,40 (n-Butanol/Äthylacetat/Essigsäure/Wasser

Rückstand wird mit Äther verrieben und das resultierende Pul- 45 im Volumenverhältnis 1:1:1:1, Kieselgel) ;

ver durch Filtration isoliert und getrocknet. Aminosäureanalyse (6-normale Salzsäure, 110 °C, 24 Stunden):

Ausbeute: 158 mg. Lys 1,97(2); Asp 1,01(1); Thr 1,95(2); Ser 0,92(1); Gly

Die Verbindung wird in 3 ml eines Gemisches ausTrifluo- 1,00(1); Ala 1,02(1); Half Cys 1,58(2); Phe 3,01(3); durch-

ressigsäure und Wasser (Volumenverhältnis 9:1) gelöst und die schnittliche Rückgewinnung 82%.

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Claims

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PATENTANSPRÜCHE in guter Ausbeute entfernt werden können, indem man das Sub-

1. Verfahren zur Entfernung einer oder mehrerer Schutz- strat unter sehr milden Bedingungen behandelt, d.h. mit einem gruppe(n) aus einer Aminosäure oder einem Peptid mit einer Mercurisalz einer Carbonsäure der Formel :

oder mehreren Thiolgruppe(n), die durch p-Methoxybenzyl,

1 -Adamantyl oder tert.-Butyl geschützt ist bzw. sind, dadurch 5 CX3COOH (I) gekennzeichnet, dass man die geschützte Aminosäure bzw. das geschützte Peptid mit dem Mercurisalz einer Carbonsäure der worin X Wasserstoff, Chlor oder Fluor bedeutet.

Formel CX3COOH, worin X Wasserstoff, Chlor oder Fluor be- Die vorliegende Erfindung bezieht sich somit auf ein Verdeutet, behandelt. fahren zur Entfernung einer oder mehrerer Schutzgruppe(n) aus
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, 10 einer Aminosäure oder einem Peptid mit einer oder mehreren dass man das Mercurisalz der Essigsäure verwendet. Thiolgruppe(n), die durch p-Methoxybenzyl, 1-Adamantyl oder
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, tert.-Butyl geschützt ist bzw. sind, welches Verfahren dadurch dass man das Mercurisalz der Trifluoressigsäure verwendet. gekennzeichnet ist, dass man die geschützte Aminosäure oder
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, das geschützte Peptid mit einem Mercurisalz einer Carbonsäure dass man das Mercurisalz der Trichloressigsäure verwendet. 15 der Formel I behandelt.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch Das vorliegende Verfahren ist anwendbar auf beliebige gekennzeichnet, dass man als geschützte Aminosäure geschütz- Aminosäuren mit einer oder mehreren Thiolgruppe(n), die tes Cystein verwendet. durch eine oder mehrere dieser Schutzgruppen geschützt ist
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch bzw. sind; Beispiele solcher Aminosäuren sind Cystein und Ho-gekennzeichnet, dass man ein geschütztes Peptid verwendet, das 20 mocystein. Das vorliegende Verfahren ist auch anwendbar auf einen oder mehrere Cysteinrest(e) enthält. beliebige Peptide mit einer oder mehreren Thiolgruppe(n), die
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 2, 5 und 6, dadurch durch eine oder mehrere dieser Schutzgruppen geschützt sind, gekennzeichnet, dass man die Entfernung der Schutzgruppen in Diese Peptide können solche sein, die einen oder mehrere Gegenwart des Mercurisalzes der Essigsäure in Trifluoressig- Rest(e) des Homocysteins oder einer beliebigen anderen, eine säure ausführt. 25 oder mehrere Thiolgruppe(n) enthaltenden Aminosäure als
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 3,5 und 6, dadurch Baustein enthalten, wobei die Thiolgruppe(n) durch eine oder gekennzeichnet, dass man die Entfernung der Schutzgruppen in mehrere dieser Schutzgruppen geschützt sind; ein typisches BeiGegenwart des Mercurisalzes der Trifluoressigsäure in Essig- spiel eines solchen Peptides ist Glutathion. Das vorliegende säure ausführt. Verfahren ist ferner anwendbar für die Herstellung von Ami-

30 nosäuren oder Peptiden mit einer oder mehreren Disulfidbin- dung(en), z.B. Cystin, Oxytocin, Vasopressin, Somatostatin, Insulin, Calcitonin, Trypsininhibitor, Ribonuclease oder Lysozym.