DE2137971A1

DE2137971A1 - Polypeptide und Verfahren zu deren Herstellung

Info

Publication number: DE2137971A1
Application number: DE19712137971
Authority: DE
Inventors: Luigi Castighone Roberto de Fregnan Gian Carlo Goffredo Onofno Mailand Bernardi (Italien)
Original assignee: Farmaceutici Italia SpA
Current assignee: Pfizer Italia SRL
Priority date: 1970-07-31
Filing date: 1971-07-29
Publication date: 1972-02-03
Also published as: CH565140A5; FR2100975B1; FR2100975A1; DE2137971B2; US3792032A; DE2137971C3; GB1309728A; JPS541311B1

Description

PATENTANWÄLTE

dr. W. Schalk · diplying. P. Wirth · dipl.-ing. G. Dan ν en berg

DR.V. SCHMIED-KOWARZIK · DR. P. WEINHOLD · DR. D. GUDEL

6 FRANKFURT AM MAIN CR. ESCHENHEIMER STRASSE 39

G 289

Wd/Be

Societä Farmaceutici Italia Largo Guido Donegani, 1-2 20146 Mailand, Italien

Polypeptide und Verfahren zu deren Herstellung

Die vorliegende Erfindung "betrifft eine neue Klasse von biologisch aktiven Polypeptiden und das Verfahren zu deren Herstellung.

Insbesondere "betrifft die vorliegende Erfindung neue Polypeptide, deren Struktur durch ein Heptapeptid. mit öndständigem C, welches an eine oder zwei Ausgangsatninosauren gebunden, sein kann, gekennzeichnet ist. Die erfindungsgemäßen Polypeptide haben die folgende Strukturformel (die Aminosäuren werden durch Symbole dargestellt, wie sie üblicherweise in der Chemie der Polypeptide verwendet werden und beziehen sich auf die optische Konfiguration

X - Trp - AIa - VaI - GIy - His - Leu - Met -

in welcher X Wasserstoff, ein Karbonsäurerest, ein Aminosäurerest oder Rest eines Dipeptids ist bezw. deren'geschützte Derivate und Salze!.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist das Verfahren zur Herstellung der Polypeptide der oben genannten Formel. · .

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Es gibt viele Möglichkeiten für die Herstellung der erfindungsgemäßen Polypeptide, die im wesentlichen die aufeinanderfolgende Kondensierung von Aminosäuren oder geschützten Polypeptiden "betreffen, so daß das erhaltene Polypeptid die Folge von Aminosäuren der oben genannten Formel aufweist, wobei diese Kondensierung nach in der Polypeptidchemie an sich bekannten Methoden durchgeführt wird.

Die Amino-und Karboxylgruppen der Aminosäuren und Polypeptide, die von Zeit zu Zeit kondensiert werden, sind nicht an der Bildung der Polypeptidkette beteiligt, da diese durch eine schützende Gruppe, die durch Acidolyse oder Hydrogenolyse oder eine andere bekannte Methode entfernt werden kann, blockiert sind.

Zum Schutz der Aminogruppe können beispielsweise die folgenden schützenden Gruppen verwendet werden; Tosyl (p-Toluolsulfonyl), Oarbonbenzoxy (Carbobenzyloxy), Carbo-t-butoxy, p-Nitrocarbobenzoxy* Trityl (Triphenylmethyl), Pormyl, Trifluoracetyl und andere, in der Polypeptidchemie verwendete Gruppen.

Pur den Schutz der Karboxylgruppen können beispielsweise die folgenden schützenden Gruppen verwendet werden: Methyl, Äthyl, t-Butyl, Benzyl, p-Mtro-phenyl und andere, auf diesem Gebiet verwendete Gruppen.

Die Kondensation zwischen der Arainogruppe eines Moleküls und der Karboxylgruppe eines anderen Moleküls zur Bildung der verbindenden Polypeptidgruppe erfolgt nach den, auf dem Gebiet der Polypeptide bekannten Methoden.. Zum Beispiel kann diese mit einem geeigneten aktivierten Acylderivat, wie z.B. gemischte Anhydride, Azide, p-Nitrophenyl-ester, 2,4,5-Triehlorphenylester, oder n-Hydroxysuccinimidylester, oder durch direkte Kondensation zwischen der freien Aminögruppe und der freien Karboxylgruppe, in der Anwesenheit eines geeigne-ten Kondensationsmittels, wie

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z.B. eines Carbodiimids aus der Gruppe: Dicyclohexylcarbodiimide, l-Cyclo-hexyl^-morpholinyl-carbodiiiöide und anderen aus der Literatur "bekannten Kondensationsmitteln.

Die Kondensation kann in einem geeigneten Lösungsmittel der Gruppe: Ν,Ν-Dialkylformamide, niedere aliphatische Nitrile und Pyridine, z.B. Dimethylformamid, Acetonitril und Pyridin, durchgeführt werden. Die Umsetzung beginnt "bei etwa -20°c "bis Raumtemperatur und ist "bei einer Temperatur von Raumtemperatur his etwa 35⁰C nach einer Zeit von 12 Stunden his IO Tagen-abgeschlossen.

Me erfindungsgemäßen Produkte weisen eine hohe vielwertige biologische Wirksamkeit auf. Insbesondere wurde festgestellt, daß die erfindungsgemäßen Produkte eine große Wirkung auf den Systemdruck und eine stimulierende Wirkung auf den Uterus, den Dickdarm, den Krummdarm und die Magensekretion nahen und außerdem eine Blutzucker erhöhaide Wirkung aufweisen.

"In vitro" durchgeführte Versuche mit dem Uterus von Ratten in der Brunst haben gezeigt, daß die folgenden Produkte eine sehr hohe kontraktierende Wirkung mit einem Schwellenwert von 30-100

l' haben: Boc-Trp-Ala-Yal-Gly-His-Leu^Met-NH^. Gln-Trp-Ala-Val-Gly-Eis-Leu-Met-KH und Boc-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH_,und eine Wirksamkeit aufweisen, die 3^5mal höher als diejenige von Bradykinin und 2-3mal höher als diejenige von Oxytocin ist, sowohl im Hinblick auf die Intensität als auch auf die Dauer. "

Durch die folgenden Beispiele wird die vorliegende Erfindung näher erläutert:

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Beispiel 1

Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-ITH ₂

15,7 g BoC-VaI-GIy-OXt(R. de Castiglione, Il Farmaco, Ed.Sei. 2Λ, Seite 664, 1969) werden in 60 ml Chlorwasserstoffsäure/Essigsäure (l,33n) 40 Min. lang reagieren -gelassen. Die Lösung wird dann im Vakuum eingedampft, der Rückstand wird mit wasserfreiem Diäthyläther angerieben und das Produkt wird im Vakuum über Kaliumhydroxyd und Phosphorpentoxyd getrocknet. Es werden 11,05 g an "^Hp-VaI-G-Iy-OÄt-Cl" in Formeines festen Schaumes erhalten; E₁ ₀- 1,05 Leu.

Einer Lösung von 8,76 g Boc-Ala (E. Schnabel, Liebigs Ann.Chem. 702,"Seite 188, 1967) in 80 ml wasserfreiem -Tetrahydrofuran wird eine Lösung von 11,05 g ^p-Val-Gly-Olt-Cl^in 80 ml wasserfreiem Tetrahydrofuran gegeben. Die Reaktionsmischung wird auf 0 C gekühlt und nach Zugabe von 5,14 ml F-Methylmorpholin werden zunächst 5,32 g N-Hydroxysuccinimid und dann 9,55 g Dicyclo hexylcarbodiimid zugegeben.

Die Reaktionsmischung wird bei O⁰O zwei Stunden lang und über .. Nacht bei Raumtemperatur stehen gelassen. Das Tetrahydrofuran wird abgedampft und der Rückstand in kochendem Xthylacetat aufgenommen. Durch Filtration wird Dicyclohexylharnstoff abgetrennt und die organische Lösung mit Chlorwasserstoffsäure (In) bei 0 C, Wasser, einer 5$igen Hatriumbikarbonatlösung und erneut mit Wasser gewaschen.

Die Mischung wird über Natriumsulfat getrocknet, das"Lösungsmittel abgedampft. Durch Umkristallisation aus Ithylacetat werden 10 g Boc-Ala-Val-Gly-OÄt erhalten. Der Schmelzpunkt liegt bei .165°-167°C; ßj*⁵= -23,5° (c = 1 Dimethylformamid).

8 g Boc-Ala-Val-Gly-OXt werden für die Dauer von 40 Minuten in 30 ml Chlorwasserstoffsäure/Essigsäure (1,33 n) umgesetzt. Das Lösungsmittel wird im Vakuum abgedampft, der Rückstand wird mit wasserfreiem Diäthyläther angerieben und das Produkt im Vakuum über Kaliumhydroxyd und Phosphorpentoxyd getrocknet.

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— 5 —
wird "^H-AIa-VaI-GIy-OAt-Cl" erhalten. Der Schmelzpunkt liegt

bei 188°-190°C; E, _o- 0,83 Leu; /"A7^⁵= + 5,5 (c= 1 Dimethyl-

' , *— JJ ι

formamid).

0,746 g Boc-Trp werden in 10 ml wasserfreiem Tetrahydrofuran gelöst, au.f -15°C gekühlt und 0,274 ml N-Methylmorpholin· zusammen mit 0,32 ml Isobutylchlorformiat zugefügt. Nach 7 Minuten bei -15⁰C wird eine vorgekühlte Lösung von 0,76 g +Hg-Ala-Val-Gly^OÄt·. 01" in 5 ml wasserfreiem Dimethylformamid, in welchem 0,274 ml N-Methylmorpholin enthalten sind, zugefügt. Die Temperatur wird von -15 G auf Raumtemperatur während einer Dauer von 3 Stunden gebracht, dann wird die Reaktionsmischung über Nacht bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die Reaktionsmischung wird filtriert, das Lösungsmittel im Vakuum verdampft, der Rückstand in Ä'thylacetat, das Methanol enthält, gelöst und die Lösung mit Chlorwasserstoff säure (In) bei 0⁰C mit 5$igem Natriumbikarbonat und dann mit Wasser gewaschen. Die Mischung wird über Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel abgedampft. Durch TJmkristallisation aus Methanol/Äther werden 1,16 g Boc-Trp-Ala-Val-Gly-OÄt erhalten. Der Schmelzpunkt liegt bei 200⁰C; PJ.l·^-= -16,2 (c=l Dimethylformamid ).

1,12 g Boe-Trp-Ala-Val-Gly-OA't werden in IQ ml Äthanol suspendiert und durch Zugabe von 5 ml Natriumhydroxyd verseift. Nach 2 Stunden bei ,Raumtemperatur wird die Mischung mit Wasser verdünnt, zweimal mit Ä'thylacetat gewaschen, mit Chlorwasserstoff säure (In) bei O⁰C angesäuert, und das Produkt mit Äthylacetat, das etwas Methanol enthält, extrahiert. Es wird mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet, das Lösungsmittel wird abgedampft und der Rückstand aus Äthylacetat umkristallisiert. Es werden 0,85 g Boe-Trp-Ala-Val-Giy erhalten. Der Schmelzpunkt liegt bei 150⁰C; /"067 ri~ -14,4 (c= 1 Dimethylformamid).

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5,39 g Βοο-Ηΐδ-ΙΤΗ-ΝΉρ (E.Schröder et al, Liebigs Ann. Chera. 656, Seite 19Oj 1962; werden in 30 ml wasserfreiem Dimethylformamid gelöst, die lösung wird auf -25⁰C gekühlt, dann werden 33,3 ml Chlorwasserstoffsäure/Tetrahydrofuran (2,1 n) und anschließend 2,38 ml t-Butylnitrit zugetropft. Nach 10 Minuten "bei -30 c werden 9,8 ml Triäthylarain tropfenweise zugegeben. Die Reaktionsmischung wird zu einer auf -30 C vorgekühlten Suspension, die durch Lösen von 5,96 g ⁺H -Leu-Met-NH .ClT (Bernardi et al, Gazz. CMm. Ital. 94, Seite 853, 1964) in 25 ml wasserfreiem Dimethylformamid, Abkühlen und Zugabe :

" von 2_;8 ml Triäthylamin erhalten worden war, gegeben.

Die Reaktionsmischung wird 15 Minuten lang bei -25⁰C geschüttelt und dann 2 Tage lang bei -1O⁰C gehalten. 1 ml Triäthylamin wird zugegeben und die Lösung 5 Stunden lang bei O⁰C.gehalten. Die Reaktionsmischung wird dann in Äther gegossen, der gebildete Niederschlag in Äthylaeetat gelöst und mit einer Lösung von Borsäure (0,5 n) und dann mit einer 5$igen Natriumbikarbonatlösung gewaschen. '

Mach dem Trocknen über Hat r ium sulfat, Konzentrieren auf ein geringes Volumen und Ausfällen mit Äther werden 7,6 g Boc-His-, Leu-Met-NH erhalten.

Durch Umkristallisation aus Äthylacetat hat die Analysenprobe einen Schmelzpunkt von 159-161⁰C; 'B^J^= -29,9 (c= 1 Dimethylformamid).

4,02 g Boc-His-Leu-Met-NH werden 30 Minuten lang bei Zimmertemperatur mit 40 ml Chlorwasserstoffsäure/Essigsäure (1,33 n) umgesetzt. Das Lösungsmittel wird abgedampft und der Rückstand in wasserfreiem Diäthyläther aufgenommen. Wach dem Trocknen im Vakuum werden 3,95 g ⁺H_-His-Leu-Met-1JH .Cl" erhalten, welches in Methanol gelöst und durch eine Säule von Am.berlit IR-45 (OH*"). geschickt wird. Es werden 3 g Tripeptid als freie Base erhalten. Der Schmelzpunkt..liegt-bei 65-7O⁰C; Z"°^⁴= -39,1 (c = 1 Dimethylformamid};. E. „= 1,21 Leu. ' 1,2 109886/1879

0,82 g Boc-Trp-Ala-Val-Gly und 0,18 g N-Hydroxysuccinimid
werden in 2 ml wasserfreiem Dimethylformamid gelöst. Nach
Abkühlen auf O⁰O werden 0,32 g Dicyclohexylcarbodiimid zugefügt.Die Reaktionsmischung, wird 2 Stunden lang bei O⁰C und
1 Stunde lang bei Zimmertemperatur gehalten. Dicyclohexy!harnstoff wird durch Filtration in einen Kolben, welcher 0,614 g .His-Leu-Met-NH enthielt, abgetrennt und 3 ml wasserfreies
Dimethylformamid wird zum Waschen verwendet. Nach 22 Stunden bei Zimmertemperatur wird die Lösung filtriert und dann auf 'ein geringes Volumen konzentriert. Durch Verdünnung mit
Äthylacetat werden 1,30 g Boc-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-N^ mit einem Schmelzpunkt von 219-221⁰C, woraus man durch Umkristallisation aus Methanol ein Produkt mit einem Schmelzpunkt von 231⁰C; E. _O=0,46 Leu; ^JU/^⁴= -17,4 (c = 1 Dimethylformamid*) erhält, gewonnen.

1 -

0,50 g Boc-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NHg werden 40 Minuten lang bei Zimmertemperatur mit 10 ml Chlorwasserstoffsäure/Essigsäure (1,33 n), wobei diesem System 2 ml. 99$ige Ameisensäure zugefügt wurden, um die Lösung zu erleichtern, umgesetzt.
Die Lösung wird im Vakuum konzentriert und mit Äther verdünnt. Es werden 0,48 g von ⁺H₂-Trp-AIa-Val-Gly-His(H⁺)-Leu-Met-NH₂. 201" mit einem Schmelzpunkt bei 195-205⁰C (Zersetzung) erhalten; E. =0,83 Leu. Das auf diese Weise erhaltene Produkt wird in Methanol gelöst und durch eine Säule von Amberlit IR-45 (OH") geschickt. Dabei wird die entsprechende freie Base Irp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH erhalten.

Beispiel 2 '

Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH,,.

246mg Boc-Gln und 115 mg N-Hydroxy-succinimid werden in 2 ml wasserfreiem Dimethylformamid gelöst, auf O⁰C gekühlt, und
206 ml Dicyclohexylcarbodiimid werden .zugefügt. Die Mischung wird 2 Stunden lang bei O⁰C und 2 Stunden lang bei Zimmertemperatur stehen gelassen. Sie wird,direkt in einen Kolben,, in welchem 895 mg ⁺H2-Trp-Ala-Väl-Gly-His(H⁺)-Leu-Met-NH₂.2Cl" enthalten

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sind, filtriert, wobei mit 2 ml Dimethylformamid gewaschen wird. 0,48 rol Tri-n-butylamin werden zugefügt und die Mischung wird über Nacht bei Zimmertemperatur stehen gelassen. Die Mischung wird filtriert, auf ein geringes Volumen konzentriert und mit Diäthyläther verdünnt. Der'Niederschlag wird aus Methanol urakristallisiert, wobei 700 rag Boc-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-KHp erhalten werden. Der Schmelzpunkt liegt bei 218-219°C; E_{1 2} = 0,38 Leu; ßj^= -11,6 (c= 1 Dimethylformamid ).

0,57 g Boc-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH werden 40 Minuten bei Zimmertemperatur mit 10 ml Chlorwasserstoff säure/Essigsäure (l,33n), wobei diesem System 2 ml 99$ige Ameisensäure zugegeben wurden, um die Lösung zu erleichtern, umgesetzt. Die Lösung wird konzentriert und mit Ätherverdünnt. Es werden 0,47 g von ⁺H₂-Gln~airp-Ala-Yal-Gly-His(H⁺)-Leu-Met-NH_o. 2Ö1~ erhalten.

C.

Der Schmelzpunkt liegt bei 185-190°C (Zersetzung); E. =0,76 Leu;

OA ' ι <- ~

βΊ Z. = -4,3 (c = 1 Dimethylformamid "). Das auf diese Weise erhaltene Produkt wird in Methanol gelöst und durch eine Säule von Amberlit IR-45(0H~) geschickt, wobei die entsprechende freie Base Θη-ϊφ-Ala^al-Gly-His-Leu-Met-lTH« erhalten wird.

C.

Beispiel 3 Yal-Irp-Ala-Tal-Gly-His-Leu-Met-NHy

Unter den gleichen Arbeitsbedingungen wie in Beispiel 2 beschrieben, wird durch Kondensierung von Boc-Val mit ⁺H -Trp-Ala-Yal-Gly-His(H⁺)-Leu-Met-NH₂-2Cl"'das Produkt Boe-Val-Trp-ΑΙε His-Leu-Met-IH₂ erhalten. Der Schmelzpunkt liegt bei 225-226°C; £<kjj^= -17,2 (c = 1 Dimethylformamid ); E =0,38 Leu. Aus'dem Produkt wird das entsprechende freie Octapeptid Val-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH erhälten;E = 0,76 Leu.

d 1,2

1 0 9 8 8 6/1879

Beispiel 4 Phe-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NHo

Unter den gleichen Arbeitsbedingungen, wie in Beispiel 2 beschrieben, v/ird durch Kondensierung von Boc-Phe mit, "¹Oo-^¹P"" Äla-Val-Gly-His(H⁺)~Leu-Met-NR .2Cl" das Produkt Boc-Phe-Trp Ala-Yal-Gly-His-Leu-Met-NH erhalten. Der Schmelzpunkt liegt

bei 228-230 C; ftu 1 = --13,5 Cc = 1 Dimethylformamid );

"D

E = 0,38 Leu. Aus dem Produkt wird das entsprechende freie Qeiapeptid Phe-Trp-Ala-Yal-Gly-His-Leu-Met-NH erhalten; E. - 0,76 Leu. ■ ' ° .

Beispiel 5 - '

Aenr-a?rp-Ala-Val-Gly-His-Leu-]y[et-NHn

Unter den gleichen Arbeitsbedingungen, wie In₁ Beispiel 2 beschrieben, wird durch Kondensierung von Boc-Asn mit H —Trp-Ala-Val-Gly-His(H⁺)-Leu-Met-NH v2Cl" das Produkt Boc-Asn-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH erhalten; E = 0,38 Leu. Aus dem Produkt wird das entsprechende freie Oetapeptid Asn-Trp-

Al:a-Val-Gly-His-Leu-Met-NH₉ erhalten; E = 0,76 Leu. ¹ , c. 1,2

Beispiel 6 Asn-Gln-Trp-Ala-Yal-Gly-His-Leu-Met-NHg

Einer Lösung von 200 mg Boc-Asn-ONp und 515 mg von H₂""⁶"¹?¹"" · Trp-Ala-Val-Gly-His(⁺H)-Leu-Met-im .2Cl" in 4 ml wasserfreiem Dimethylformamid werden 0,24 ml' Tributylarain zugefügt. Nach 4.Tagen bei Zimmertemperatur wird die Lösung in Diäthylacetat ■ gegossen und dßr Niederschlag aus MethanolAther umkristallisiert. Es werden 270 mg Boc-Asn-Gln-Trp-Ala-Yal-Gly-His-Leu-Met-NHp erhalten. Der Schmelzpunkt..liegt bei 230 - 231⁰C; &$ψ= -25,7 Cc = 1 Hexamethylphosphofieriamid:); E = 0,39 Leu.

.1,2-

Unter den gleichen Arbeitsbedingungen, wie in Beispiel 1 beschrieben, erhält man aus 100 mg dieses Produktes 95 rag von ⁴B -Asn-Gln-Trp-Ala-Yal-Gly-His(⁺H)-Leu-Met-NH .2Cl". Der Schmelzpunkt liegt bei 200°c (Zersetzung); /$7&'=-24,4- Cc=I.'.'. , Hexamethylphoöpboipriaraia.); E = 0,72'Leu. Das auf diese -·.; r'' 109-886/1879

Weise erhaltene Produkt wird in Methanol gelöst und durch eine Säule von Amberlit IR-45(OH~) geschickt, wobei das entsprechende freie Polypeptid Asn-G-ln-Trp-Ala-Val-G-ly-His-Leu-Met-HH erhalten wird.

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Claims

- 11 Patentansprüche

A.ι Verfahren zur Herstellung von Polypeptiden der folgenden / J Formel:

X - Trp - AIa - VaI - GIy- His - Leu - Met - HHg

in welcher X Wasserstoff, der Acylrest einer Karbonsäure, einer Aminosäure oder eines Polypeptide ist bezw. deren geschützte Derivate und deren Salze, dadurch gekennzeichnet, daß eine Aminosäure oder ein Polypeptid mit einer anderen Aminosäure oder Polypeptid kondensiert wird, wobei die Aminounä Karb oxy !'gruppen, die nicht bei der Bildung der Peptidbinäung beteiligt sind, durch eine geeignete Schutzgruppe blockiert sind, so daß das Polypeptid mit der gewünschten · Folge von Aminosäuren erhalten wird.

2. Ein Polypeptid der Formel:

X - Trp - AIa - VaI - GIy - His - Leu - Met - KH

in welcher X Wasserstoff, der Acylrest einer Karbonsäure, einer Aminosäure oder eines Dipeptide ist bezw. deren geschützte Derivate und deren Salze.

3. Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH

4. Boc-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-ini ..■-"*

5. ⁴H₂-IrP-AIa-VaI-GIy-HiS(H*)-Leu-Met-BH_O. 2Cl"

6. GIn-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH

7. Boc-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH

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. - 12 -

8. ⁺H -Gln-Trp-Ala-YaI-GIy-HIs(H⁺)-Leu-Met-lO^.2Gl"

9. Val-Trp-Ala-Tal-Gly-HIs-Leu-Met-Mp

10. Boc-Yal-irp-Ala-Yal-Gly-His-Leu-Met-KE^

11. ⁺H₂-Val-Trp-Ala-Yal-&ly-His(H⁺)-Leu-Met-JETH . 2C1~ 12» Phe-Trp-Ala-Yal-Gly-Hi s-Leu-Met-liH₂

13. Boc-Phe-Trp-Ala-Yal-Gly-His-Leu-Met-ira^

14. ⁺H_o-Phe-Trp-Ala-Val-Gly-His(H⁺)-Leu-Met-HH₀.2Gl"

15. Asn-Trp-Ala-Yal-Gly-His-Leu-Met-Mi

16. Boc-Asn-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-Μί -

17. ⁺H₂-Asn-Trp-Ala-Yal-&ly-His (H⁺)-Leu-Met-2iH . 2C1~

18. Asn-Gln-Trp-Ala-Gly-His-Leu-Met-N^

19. Boc-Asn-Gln-Trp-Ala-Yal-Gly-His-Leu-Met-liH

20. ^-Asn-Gln-Trp-Ala-Yal-Gly-His (H⁺ )-Leu-Met-lffl₂. 2Cl"

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