DE2137971B2

DE2137971B2 - Polypeptide und Verfahren zu deren Herstellung

Info

Publication number: DE2137971B2
Application number: DE2137971A
Authority: DE
Inventors: Luigi Bernardi; Roberto De Castiglione; Gian Carlo Fregnan; Onofrio Milano Goffredo
Original assignee: Farmitalia Carlo Erba SpA 20259 Milano; Farmitalia Carlo Erba SRL
Current assignee: Pfizer Italia SRL
Priority date: 1970-07-31
Filing date: 1971-07-29
Publication date: 1981-09-17
Also published as: DE2137971A1; GB1309728A; JPS541311B1; FR2100975B1; FR2100975A1; DE2137971C3; CH565140A5; US3792032A

Description

Die Erfindung betrifft die biologisch aktiven Polypeptide gemäß Anspruch 1 und das Verfahren zu deren Herstellung.

Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung neue Polypeptide, deren Struktur durch ein Heptapeptid mit endständiger Carbonamidgruppe, welches an eine oder zwei Ausgangsaminosäuren gebunden sein kann, gekennzeichnet ist Die erfindungsgemäßen Polypeptide haben die folgende Strukturformel (die Aminosäuren werden durch Symbole dargestellt, wie sie üblicherweise in der Chemie der Polypeptide verwendet werden und beziehen sich auf die optische Konfiguration »L«):

X-TrP-AIa-VaI-GIy-HiS-LeU-MeMMH₂

in der X die Bedeutungen Wasserstoff, VaI₁ Phe, Asn, GIn und Asn-Gln hat, sowie deren N-terminale tert.-Butoxycarbonyl-Derivate und Salze.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist das Verfahren zur Herstellung der Polypeptide der oben genannten Formel, das gemäß Anspruch 2 in an sich bekannter Weise durchgeführt wird.

Zum Schutz der Aminogruppe können beispielsweise die folgenden Gruppen verwendet werden: Tosyl (p-Toluolsulfonyl), Carbobenzoxy (Carbobenzyloxy), Carbo-t-butoxy, p-Nitrocarbobenzoxy, Trityl (Triphenylmethyl), Formyl, Trifluoracetyl und andere, in der Polypetidchemie verwendete Gruppen.

Für den Schutz der Carboxylgruppen können beispielsweise die folgenden Gruppen verwendet werden: Methyl, Äthyl, t-Butyl, Benzyl, p-Nitro-phenyl und andere, auf diesem Gebiet verwendete Gruppen.

Die Kondensation zwischen der Aminogruppe eines Moleküls und der Carboxylgruppe eines anderen Moleküls zur Bildung der verbindenden Polypeptidgruppe erfolgt nach den, auf dem Gebiet der Polypeptide bekannten Methoden. Zum Beispiel kann diese mit einem geeigneten aktivierten Acylderivat, wie z. B. gemischte Anhydride, Azide, p-Nitrophenyl-ester,

ίο 2,4,5-Trichlorphenylester, oder N-Hydroxysuccinimidylester, oder durch direkte Kondensation zwischen der freien Aminogruppe und der freien Carboxylgruppe, in Gegenwart eines geeigneten Kondensationsmittels, wie z. B. eines Carbodiimide aus der Gruppe: Dicyclohexylcarbodiimide, l-Cyclo-hexyl-S-morpholinyl-carbodiimide und anderen aus der Literatur bekannten Kondensationsmitteln.

Die Kondensation kann in einem geeigneten Lösungsmittel der Gruppe: N, N-Dialkylformamide, niedere aliphatische Nitrile und Pyridine, z. B. Dimethylformamid, Acetonitril und Pyridin, durchgeführt werden. Die Umsetzung beginnt bei etwa — 20°C bis Raumtemperatur und ist bei einer Temperatur von Raumtemperatur bis etwa 35° C nach einer Zeit von 12 Stunden bis 10 Tagen abgeschlossen.

Die erfindungsgemäßen Produkte weisen eine hohe vielwertige biologische Wirksamkeit auf. Insbesondere wurde festgestellt, daß die erfindungsgemäßen Produkte eine große Wirkung auf den Systemdruck und eine stimulierende Wirkung auf den Uterus, den Dickdarm, den Krummdarm und die Magensekretion haben und außerdem eine Blutzucker erhöhende Wirkung aufweisen.
In vitro durchgeführte Versuche mit dem Uterus von Ratten in der Brunst haben gezeigt, daß die folgenden Produkte eine sehr hohe kontraktierende Wirkung mit einem Schwellenwert von 30— lOOwg/ml haben:

Boc-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NHi
Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH₂und
Boc-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NHj

und eine Wirksamkeit aufweisen, die 3-5mal höher als diejenige von Bradykinin und 2-3mal höher als diejenige von Oxytocin ist, sowohl im Hinblick auf die Intensität als auch auf die Dauer.

Pharmakologische Daten in Form relativer Angaben, die sich auf die Wirksamkeit von

Asn-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NHj

(=100) beziehen, sind in der Tabelle zusammengestellt.

Die Schwellendosis dieser Verbindung beträgt bei den vier durchgeführten Versuchen: 0,03 — 0,5 ng/cm³; 0,1 -O,5ng/cm³; 0,005 - 0,050 ng/cm³ bzw. 0,2-1 ng/ cm³.
Durch die folgenden Beispiele wird die vorliegende Erfindung näher erläutert:

Tabelle I	Meer schweinchen	Kätzchen	Ratten	Ratten
Verglcichsverbindungen	Dickdarm	Dünndarm	Uterus	Harnblase
	1 bis 10	1	40	I
Oxytocin	3 bis 5	0,2 bis 0,5	10 bis 20	2 bis 5
Vasopressin-8-lysin	1 bis 5	0,1	0.2 bis 2,0	0,5 bis 2,0
Serotonin

Fortsetzung

Vergleichsverbindungen

Meerschweinchen

Dickdarm Kätzchen

Dünndarm

Rauen
Uterus

Erfindungsgemäße Polypeptide
;r-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH₂

X: Asn-Gln 100

Boc-Asn-Gln 100-200

Boc-GIn 25-60

Boc-Phe 4-16

Boc-Val 15-60

Phe 5-20

Rauen
Harnblase

100	100	100
70-150	65-250	150-250
40-100	40-75	32-60
1-6	200-300	15-60
10-30	200-300	2-8
5-15	130-200	5-20

Beispiel 1
TrP-AIa-VaI-GIy-HiS-LeU-MeI-NH₂

15,7 g Boc-VaI-Gly-OÄt(R. de Castiglione, II Farmaco, Es. Sei. 24, Seite 664, 1969) werden in 60 ml Chlorwasserstoffsäure/Essigsäure (1,33 n) 40 Min. lang reagieren gelassen. Die Lösung wird dann im Vakuum eingedampft, der Rückstand wird mit wasserfreiem Diäthyläther angerieben und das Produkt wird im Vakuum über Kaliumhydroxyd und Phosphorpentoxyd getrocknet Es werden 11,05 g an ®H₂-Val-Gly-OÄt-Cl^e in Form eines festen Schaumes erhalten; Eu= 1,05 Leu.

Einer Lösung von 8,76 g Boc-Ala (E. Schnabel, Liebigs Ann. Chem. 702, Seite 188, 1967) in 80 ml wasserfreiem Tetrahydrofuran wird eine Lösung von 11,05 g + H₂-VaI-Gly-OÄt-Clin 80 m! wasserfreiem Tetrahydrofuran gegeben. Die Reaktionsmischung wird auf 0⁰C gekühlt und nach Zugabe von 5,14 ml N-Methylmorpholin werden zunächst 5,32 g N-Hydroxysuccinimid und dann 9,55 g Dicyclohexylcarbodiimid zugegeben.

Die Reaktionsmischung wird bei 0"C zwei Stunden lang und über Nacht bei Raumtemperatur stehen gelassen. Das Tetrahydrofuran wird abgedampft und der Rückstand in kochendem Äthylacetat aufgenommen. Durch Filtration wird Dicyclohexylharnstoff abgetrennt und die organische Lösung mit Chlorwasserstoffsäure (In) bei 0⁰C, Wasser, einer 5%igen Natriumbikarbonatlösung und erneut mit Wasser gewaschen.

Die Mischung wird über Natriumsulfat getrocknet, das Lösungsmittel abgedampft. Durch Umkristallisation aus Äthylacetat werden 10 g Boc-Ala-Val-Gly-OÄt erhalten. Der Schmelzpunkt liegt bei 165°-167⁰C; [λ] £--23,5° (c= 1 Dimethylformamid).

8 g Boc-Ala-Val-Gly-OÄt werden für die Dauer von 40 Minuten in 30 ml Chlorwasserstoffsäure/Essigsäure (1,33 n) umgesetzt. Das Lösungsmittel wird im Vakuum abgedampft, der Rückstand wird mit wasserfreiem Diäthyläther angerieben und das Produkt im Vakuum über Kaliumhydroxyd und Phosphorpentoxyd getrocknet.

Es wird ®H₂-Ala-Val-Gly-OÄt-Cl^e erhalten. Der Schmelzpunkt liegt bei 188°-190°C; Ei,₂=0,83 Leu; [χ]',' = +5,5 (c= 1 Dimethylformamid).

0,746 g Boc-Trp werden in 10 ml wasserfreiem Tetrahydrofuran gelöst, auf -15° C gekühlt und 0,274 ml N-Methylmorpholin zusammen mit 0,32 ml Isobutylchlorformiat zugefügt. Nach 7 Minuten bei — 15° C wird eine vorgekühlte Lösung von 0,76 g ®H₂-Ala-VaI-GIy-OAtCr⁹ in 5 ml wasserfreiem Dimethylformamid, in welchem 0,274 ml N-Methylmorpholin enthalten sind, zugefügt Die Temperatur wird von —15° C auf Raumtemperatur während einer Dauer von 3 Stunden gebracht, dann wird die Reaktionsmischung über Nacht bei Raumtemperatur stehengelassen. Die Reaktionsinischung wird filtriert, das Lösungsmittel im Vakuum verdampft, der Rückstand in Äthylacetat das Methanol enthält, gelöst und die Lösung mit Chiorwasserstoffsäure (In) bei 0⁰C mit 5%igem Natriumbikarbonat und darn mit Wasser gewaschen. Die Mischung wird über Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel abgedampft Durch Umkristallisation aus Methanol/ Äther werden 1,16 g Boc-Trp-Ala-Val-Gly-OÄt erhalten. Der Schmelzpunkt liegt bei 200⁰C; [oc]% -16,2 (c= 1 Dimethylformamid).

1,12 g Boc-Trp-Ala-Val-Gly-OÄt werden in 10 ml Äthanol suspendiert und durch Zugabe von 5 ml Natriumhydroxyd verseift. Nach 2 Stunden bei Raumtemperatur wird die Mischung mit Wasser verdünnt,

zweimal mit Äthylacetat gewaschen, mit Chlorwassersjoffsäure (In) bei 0⁰C angesäuert, und das Produkt mit Äthylacetat, das etwas Methanol enthält, extrahiert. Es wird mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet, das Lösungsmittel wird abgedampft und der

Rückstand aus Äthylacetat umkristallisiert. Es werden 0,85 g Boc-Trp-Ala-Val-Gly erhalten. Der Schmelzpunkt liegt bei 150°C; [λ]!'-14,4 (c=\ Dimethylformamid).
5,39 Boc-His-NH-NH₂ (E. Schröder et al, Liebigs Ann.

Chem. 656, Seite 190,1962) werden in 30 ml wasserfreiem Dimethylformamid gelöst, die Lösung wird auf -25⁰C gekühlt, dann werden 33,3 ml Chlorwasserstoff säure/Tetrahydrofuran (2,1 n) und anschließend 2,38 ml t-Butylnitrit zugetropft. Nach 10 Minuten bei -30⁰C werden 9,8 ml Triäthylamin tropfenweise zugegeben. Die Reaktionsmischung wird zu einer auf -30⁰C vorgekühlten Suspension, die durch Lösen von 5,96 g ®H₂-Leu-Met-NH₂.Cl^e (Bernardi et al, Gazz. Chim. hai. 94, Seite 853, 1964) in 25 ml wasserfreiem Dimethyl-

formamid, Abkühlen und Zugabe von 2,8 ml Triäthylamin erhalten worden war, gegeben.

Die Reaktionsmischung wird 15 Minuten lang bei -25° C geschüttelt und dann 2 Tage lang bei -10⁰C gehalten. 1 ml Triäthylamin wird zugegeben und die Lösung 5 Stunden lang bei O⁰C gehalten. Die Reaktionsmischung wird dann in Äther gegossen, der gebildete Niederschlag in Äthylacetat gelöst und mit einer Lösung von Borsäure (0,5 n) und dann mit einer

5%igen Natriumbikarbonatlösung gewaschen.

Nach dem Trocknen über Natriumsulfat, Konzentrieren auf ein geringes Volumen und Ausfällen mit Äther werden 7,6 g Boc-His-Leu-Met-NHj erhalten.

Durch Umkristallisation aus Äthylacetat hat die Analysenprobe einen Schmelzpunkt von 159— 161°C; [«]? -29,9 (c= 1 Dimethylformamid).

4,02 g BoC-HiS-LeU-MCt-NH₂ werden 30 Minuten lang bei Zimmertemperatur mit 40 ml Chlorwasserstoffsäure/Essigsäure (133 n) umgesetzt Das Lösungsmittel wird abgedampft und der Rückstand in wasserfreiem Diäthyläther aufgenommen. Nach dem Trocknen im Vakuum werden 3,95 g ®H₂-His-Leu-Met-NH₂.Cl^e erhalten, welches in Methanol gelöst und durch eine Säule von Amberlit® 1R-45 (OH-) geschickt wird. Es werden 3 g Tripeptid als freie Base erhalten. Der Schmelzpunkt liegt bei 65-70⁰C; [«]?-39,l (c=\ Dimethylformamid); Eu= 1,21 Leu.

0,82 g Boc-Trp-Ala-Val-Gly und 0,18 g N-Hydroxysuccinimid werden in 2 ml wasserfreieni Dimethylformamid gelöst Nach Abkühlen auf 0⁰C werden 0,32 g Dicyclohexylcarbodümid zugefügt Die Reaktionsmischung wird 2 Stunden lang bei 0°C und 1 Stunde lang bei Zimmertemperatur gehalten. Dicyclohexylharnstoff wird durch Filtration in einen Kolben, welcher 0,614 g His-Leu-Met-NH₂ enthielt, abgetrennt und 3 ml wasserfreies Dimethylformamid wird zum Waschen verwendet Nach 22 Stunden bei Zimmertemperatur wird die Lösung filtriert und dann auf ein geringes Volumen konzentriert Durch Verdünnung mit Äthylacetat werden 1,30 g Boc-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH₂ mit einem Schmelzpunkt von 219-22 Γ C, woraus man durch Umkristallisation aus Methanol ein Produkt mit einem Schmelzpunkt von 231⁰C; Eu = 0,46 Leu; + <x]^!o' —17,4 (c=\ Dimethylformamid) erhält, gewonnen.

0,50 g Boc-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH₂ werden 40 Minuten lang bei Zimmertemperatur mit 10 ml Chlorwasserstoffsäure/Essigsäure (1,33 n), wobei diesem System 2 ml 99%ige Ameisensäure zugefügt wurden, um die Lösung zu erleichtern, umgesetzt. Die Lösung wird im Vakuum konzentriert und mit Äther verdünnt. Es werden 0,48 g von ®H₂-Trp-Ala-Val-Gly-His(H®)-Leu-Met-NH₂. 2 Cl- mit einem Schmelzpunkt bei 195-205° C (Zersetzung) erhalten; £_u = 0,83 Leu.

Das auf diese Weise erhaltene Produkt wird in Methanol gelöst und durch eine Säule von Amberlit® IR-45 (ΟΗ^Θ) geschickt. Dabei wird die entsprechende freie Base Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH₂ erhalten.

Beispiel 2
Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH₂

246 mg Boc-Gln und 115 mg N-Hydioxy-succinimid werden in 2 ml wasserfreiem Dimethylformamid gelöst, auf 0⁰C gekühlt, und 206 ml Dicyclohexylcarbodiimid werden zugefügt. Die Mischung wird 2 Stunden lang bei 0⁰C und 2 Stunden lang bei Zimmertemperatur stehen gelassen. Sie wird direkt in einen Kolben, in welchem 895 mg ®H₂-Trp-Ala-Val-Gly-His(H®)-Leu-Met-

NH₂.2 Cl^e enthalten sind, filtriert, wobei mit 2 ml Dimethylformamid gewaschen wird. 0,48 ml Tri-n-butylamin werden zugefügt und die Mischung wird über Nacht bei Zimmertemperatur stehen gelassen. Die Mischung wird filtriert, auf ein geringes Volumen konzentriert und mit Diäthyläther verdünnt. Der Niederschlag wird aus Methanoi umkristallisiert, wobei 700 mg BoC-GIn-TrP-AIa-VaI-GIy-HiS-LeU-MCt-NH₂ erhalten werden. Der Schmelzpunkt liegt bei 218-219⁰C; £^=0,38 Leu; [«]? -11,6 (c=\ Dimethylformamid).
0,57 g Boc-GIn-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH, werden 40 Minuten bei Zimmertemperatur mit 10 ml Chlorwasserstoffsäure/Essigsäure (1,33η), wobei diesem System 2 ml 99%ige Ameisensäure zugegeben wurden, um die Lösung zu erleichtern, umgesetzt Die Lösung wird konzentriert und mit Äther verdünnt Es werden 0,47 g «H^Gln-Trp-Ala-Val-Gly-HisiH^J-Leu-Met-NH₂ · 2 Cl^e erhalten. Der Schmelzpunkt liegt bei 185-190⁰C (Zersetzung); E₁₅=0,76 Leu; [α]? -43 (c= 1 Dimethylformamid).

Das auf diese Weise erhaltene Produkt wird in Methanol gelöst und durch eine Säule von Amberlit® IR-45(OH-) geschickt wobei die entsprechende freie Base Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH₂ erhalten wird.

Beispiel 3

Val-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NHj

Unter den gleichen Arbeitsbedingungen, wie in Beispiel 2 beschrieben, wird durch Kondensierung von Boc-Val ®H₂-Trp-Ala-Val-Gly-His(H®)-Leu-Met-NH₂-2CF das Produkt Boc-Val-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH₂ erhalten. Der Schmelzpunkt liegt bei 225-226°C; [λ]?-17,2 (c=\ Dimethylformamid); Eu = 0,38 Leu.

Aus dem Produkt wird das entsprechende freie Octapeptid Val-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH₂ erhalten; Ei 2 = 0,76 Leu.

Beispiel 4
Phe-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH₂

Unter den gleichen Arbeitsbedingungen, wie in Beispiel 2 beschrieben, wird durch Kondensierung von Boc-Phe mit ®H₂-Trp-Ala-Val-Gly-His(H®)-Leu-Met-NH₂ · 2 CF das Produkt Boc-Phe-Trp-Ala-VaI-GIy-His-Leu-Met-NH₂ erhalten. Der Schmelzpunkt liegt bei 228-230°C; [λ]?-13,5 (c=\ Dimethylformamid); Ei₂ = 0,38 Leu.

Aus dem Produkt wird das entsprechende freie Octapeptid Phe-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH₂ erhalten; E|,2 = 0,76 Leu.

Beispiel 5
Asn-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH₂

Unter den gleichen Arbeitsbedingungen, wie in Beispiel 2 beschrieben, wird durch Kondensierung von Boc-Asn mit ®H₂-Trp-Ala-Val-Gly-His(H®)-Leu-Met-NH₂ · 2 CF das Produkt Boc-Asn-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH₂ erhalten; Eu = 0,38 Leu.

Aus dem Produkt wird das entsprechende freie Octapeptid Asn-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH₂ erhalten; Eu = 0,76 Leu.

Beispiel 6
Asn-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH₂

Einer Lösung von 200 mg Boc-Asn-ONp und 515 mg von ®H₂-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(®H)-Leu-Met-

NH₂ ■ 2 CF in 4 ml wasserfreiem Dimethylformamid werden 0,24 ml Tributylamin zugefügt. Nach 4 Tagen bei Zimmertemperatur wird die Lösung in Diäthylacetat gegossen und der Niederschlag aus Methanol/Äther umkristallisiert. Es werden 270 mg Boc-Asn-Gln-Trp-

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Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH erhalten. Der Schmelz- bei 20O⁰C (Zersetzung); [«]? -24,4 (c=l Hexamethyl-

punkt liegt bei 230-231⁰C; [«]'„· -25,7 (c= 1 Hexame- phosphorsäuretriamid); £Ί,₂ = 0,72 Leu.

thylphosphorsäuretriamid); E₁₂ = O^LeU. Das auf diese Weise erhaltene Produkt wird in

Unter den gleichen Arbeitsbedingungen, wie in Methanol gelöst und durch eine Säule von Amberlit®

Beispiel ! beschrieben, erhält man aus 100 mg dieses 5 IR-45(OH^e) geschickt, wobei das entsprechende freie

Produktes 95 mg ®H₂-Asn-Gln-Trp-Ala-VaI-Gly- Polypeptid Asn-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-

His(®H)-Leu-Met-NH₂ · 2CI^e. Der Schmelzpunkt liegt Met-NH₂ erhalten wird.

Claims

Patentansprüche:

1. Polypeptide der allgemeinen Formel
X-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH*

in der X die Bedeutungen Wasserstoff, VaI, Phe, Asn, GIn und Asn-Gln hat, sowie deren N-terminale tert-Butoxycarbonyl-Derivate und Salze.

2. Verfahren zur Herstellung von Polypeptiden nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine entsprechende Aminosäure oder ein entsprechendes Polypeptid mit einer anderen entsprechenden Aminosäure oder einem anderen entsprechenden Polypeptid in an sich bekannter Weise kondensiert, wobei die Amino- und Carboxylgruppen, die nicht bei der Bildung der Peptidbindung beteiligt sind, durch eine Schutzgruppe blockiert sind.