DE1793789C3 - Verfahren zur Herstellung von einen Cysteinrest enthaltenden Peptiden - Google Patents
Verfahren zur Herstellung von einen Cysteinrest enthaltenden PeptidenInfo
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Description
ii
R-C-NH-CH2-
R-C-NH-CH2-
schützt, in welcher R Niedrigalkyl, Aryl, Benzyloxy
oder Acetonyl bedeutet, indem man den Cysteinrest mit
ai) einem N-Hydroxymethyl-niedrigalkylamid,
a2) einem N-Hydroxymethyl-arylamid,
a3) N-Hydroxymethyl-benzyloxycarboxamid
oder
a3) N-Hydroxymethyl-benzyloxycarboxamid
oder
a4) 2-Hydroxymethyl-5-methyl-isoxazoliumchlorid
in einem Lösungsmittel unter Zugabe einer Säure, bei Verfahren a4) anschließend noch mit
wäßrigem Alkali, umsetzt,
b) das jeweilige schutzgruppenhaltige Peptid in üblicher Weise herstellt und
c) anschließend die Mercaptogruppe freisetzt, indem man die Schutzgruppe unter kontrollierten
pH-Bedingungen in wäßrigem Medium in der letzten Stufe de Synthese mit
Ci) einem wasserlöslichen Schwermetallsalz,
C2) einem Organometallsalz von Schwermetallen oder,
C2) einem Organometallsalz von Schwermetallen oder,
Cj) wenn R Acetonyl bedeutet, mit Hydrazin
oder Phenylhydrazin abspaltet.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Mercaptogruppe des Cysteinrestes
mit de.· S-Acetamidomethylgruppe schützt und diese mit Quecksilber(ll)-acetat abspaltet.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man dieses in Wasser als Lösungsmittel
durchführt und die Schutzgruppe bei saurem pH abspaltet.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die jeweilige Mercapto-Schutzgruppe
mit p-Chlorquecksilber(ll)-benzoesäure bei alkalischem pH abspaltet.
Peptide, die Cystein enthalten, werden im allgemeinen synthetisiert untjr Schutz ' der funktioneilen
Mercaptogruppe durch eine geeignete Gruppe. Es sind verschiedene Schutzgruppen bekannt, die für die
Synthese von Cysteinreste enthaltenden Peptide brauchbar sind, aber viele der bekannten Schutzgruppen
werden während des Endstadiums der Synthese unter Schwierigkeiten entfernt oder sie sind gegen
einige der im allgemeinen bei Peptidsynthesen verwendeten Reagenzien instabil.
Zu den Peptiden und Proteinen, die Schwefel enthalten, gehören Verbindungen, die Cystein mit der
freien Mercaptogruppe enthalten, beispielsweise Glutathion, und Verbindungen mit einer Disulfidbrücke, die
»us der Dehydrierung von zwei Cysteinresten unter
Bildung von Cystein stammt. Der Cystcinrcsl kann zu derselben Peptidkette gehören, wie beispielsweise in
Oxytocin, Vasopressin und Ribonuclease, oder sie können verschiedenen Peptidketten angehören, wie
beispielsweise im Insulin.
Peptide, welche Cystein mit ungeschützten Mercaptogruppen enthalten, sind bisher kaum synthesiert worden
wegen der Schwierigkeit beim Trennen der erhaltenen Verbindungen von den durch die Oxidation gebildeten
Nebenprodukten. Während der Synthese des Peptids
ίο mit der ungeschützten Mercaptogruppe findet sehr
leicht eine Dehydrierung unter Bildung de- Cystinderivate statt und dies hat oftmals weitere Komplikationen
zur Folge. Cystein wird darum fast ausschließlich in Form seiner S-geschützten Form bei der Synthese von
Cysteinreste enthaltenden Peptiden eingesetzt und es ist darum wünschenswert, eine geeignete Schutzgruppe zu
haben, die leicht während der Synthese entfernt werden kann, die aber auch gegenüber den bei Peptidsynthesen
angewendeten Reagenzien und Umsetzungsbedingungen stabil ist
Durch die Erfindung wird die Synthese von Peptiden mit einem oder mehr Cysteinresten, wie bei Glutathion,
Insulin, Oxytocin oder Ribonuclease, erleichtert.
Die Erfindung betrifft das in den Patentansprüchen
Die Erfindung betrifft das in den Patentansprüchen
>■> gekennzeichnete Verfahren.
Von vielen Peptiden ist es bekannt, daß sie biologisch aktiv sind, einige sind nützlich für das Studium und für
die Analyse von Proteinen, insbesondere für Studien, die angestellt werden, um einen Einblick in die physiologi-
jo sehe Wirkung von Enzymen, Hormonen und anderen
Proteinen mit wichtigen Funktionen im Körper zu erhalten. Insulin hat beispielsweise die Schlüsselposition
bei der Hormonregulierung des Zuckergleichgewichts inne und ein Mangel an Insulin verursacht das
r, metabolische Krankheitsbild diabetes mellitus. Oxytocin, ein cyclisches Nonapeptid mit einem 20gliedrigen
Disulfidring stimuliert den Milchausstoß aus der Milchdrüse und wird häufig therapeutisch angewendet,
um Wehen einzuleiten. Vasopressin wurde schon als
4i) Ersatzheilmittel bei diabetes insipidus zur Behandlung
von Anenteroneurie angewendet.
Die am häufigsten angewendete Schutzgruppe für die Mercaptogruppe ist die S-Benzylgruppe. Die S-Benzylschutzgruppe
vermindert im allgemeinen die Löslichkeit
4-, des Peptids in hydroxylgruppenhaltigen Lösungsmitteln.
Diese Gruppe kann jedoch nur abgespalten werden, indem man Natrium in flüssigem Ammoniak verwendet.
Dieses System führt jedoch zur Zersetzung vieler Peptide. Fluorwasserstoff wurde bereits zur Entfernung
mi der S-Benzylschutzgruppe verwendet, aber er ist für die
Herstellung im größeren Maßstab unpraktisch, verursacht oftmals einen Abbau der Peptide und ist auch nicht
ausreichend selektiv, weil er auch die Carbobenzoxy-, t-Butoxy- und t-Butoxycarbonylgruppen entfernt. Andere re Gruppen, wie die S-p-Nitrobenzyl-, S-p-Diphenylmethyl-,
S-Benzylthio-inethyl und die Triphenylmethylgruppen
sind bei Synthesen von Cysteinpeptiden ■ angewendet worden, aber auch sie befriedigten noch
nicht vollständig. Beispielsweise erniedrigt die p-Nitro-
w) phenylgruppe die Löslichkeit des Peptids in hydroxylgruppenhaltigen
Lösungsmitteln und kann nur durch katalytische Hydrierung in Gegenwart eines Palladiumauf-Kohle-Katalysators
und von Chlorwasserstoffsäure entfernt werden. Dieses System arbeitet in Gegenwart
hi von Schwefel nicht gut, weil der Katalysator während
der Umsetzung oftmals vergiftet wird und wegen der mangelnden Selektivität, falls eine Carbobenoxygruppe
irgendwo in dem Molekül ist, weil diese Gruppe auch
durch dieses System entfernt wird. Beim S-Benzylthiomethylcysiein
kann die Schutzgruppe durch Quecksilber(Il)-chlorid in warmer Chlorwasserstoffsäure oder
durch Quecksilber(II)-acetat in 80%iger Ameisensäure entfernt werden. Sehr saure Bedingungen sind unerwünscht,
weil dadurch Gruppen, welche Tryptophan enthalten, zerstört werden und unerwünschte Nebenprodukte
sich bilden. Die Anwesenheit dieser Gruppe vermindert auch die Löslichkeit des Peptids in
hydroxylgruppenhaltigen Lösungsmitteln. Die S-p-Di- ι ο phenylmethylgruppe kann durch Natrium in flüssigem
Ammoniak oder durch Trifluoressigsäure entfernt werden. Das letztere Reagens ist aber ungeeignet, weil
es nicht selektiv ist und weil es auch die lert-Butylester-
und die terL-Butoxycarbonylgruppen entfernt. Die Anwesenheit einer starken Säure ist ein weiteres
unerwünschtes Merkmal. Die Triphenylmethylgruppe kann mit einer schwachen Säure oder mit Quecksilbersalzen
entfernt werden, aber diese Schutzgruppe wird zu leicht durch schwache Säuren unter üblichen
Bedingungen entfernt und ist darum eino ungenügende Schutzgruppe für Peptidsynthesen. Darüber hinaus wird
durch die Gegenwart dieser Gruppe die Löslichkeit des Peptids in hydroxylgruppenhaltigen Lösungsmitteln
vermindert. 2>
Die erfindungsemäßen S-Schutzgruppen können wie folgt unter Verwendung des Cysteinmoleküls als
Beispiel eines Cysteinrestes veranschaulicht werden:
O H COOH
Il I I
R C-N-CH,- S CH1-CH (I)
NH,
worin bedeuten: R Niedrigalkyl, wie Methyl, Äthyl, Propyl oder Butyl, Aryl, wie Phenyl oder Naphthyl oder
einen Acetonyl- oder Benzyloxyrest. w
Bedeutet R in Formel 1 Niedrigalkyl oder Aryl, so kann die Schutzgruppe in einem Zweistufenverfahren
eingeführt werden. In der ersten Stufe wird ein H-Hydroxymethylalkylamid oder N-Hydroxymethylarylamid
hergestellt, beispielsweise N-Hydroxymethyl- 4; acetamid oder N-Hydroxymethylbenzamid durch Umsetzung
einer etwa äquimolekularen Menge eines Amids, vie Acetamid oder Benzamid, und Formaldehyd
in Gegenwart einer katalytischen Menge von Kaliumcarbonat. Am einfachsten kann man eine 36- bis 38%ige w
wäßrige Formaldehydlösung verwenden. Die Mischung wird mehrere Minuten auf einem Dampfbad erhitzt und
anschließend läßt man sie im allgemeinen mehrere Stunden bei Raumtemperatur stehen. Man fügt dann
Trockeneis zur Einführung von Kohlendioxid in die ■>■>
Lösung, worauf anschließend die Lösung im Vakuum auf einem Dampfbad bei etwa 40 bis 500C verdampft wird.
Der Rückstand wird in einem geeigneten Lösungsmittel gelöst, beispielsweise in Ace'on oder Methylenchlorid,
die Lösung wird über einem geeigneten Trocknungsmit- wi
tel getrocknet und das Lösungsmittel wird im Vakuum abgedampft. Der Rückstand wird durch Kristallisation
oder durch andere bekannte Methoden gereinigt.
In der zweiten Stufe wird Cysteinhydrochlorid-monohydrat
und ein geringer Überschuß des N-Hydroxyme- b>
thyl-alkylamids oder N-Hydroxymethyl-arylamids in
einem geeigneten Lösungsmittel, wie Wasser, Methanol oder Äthanol, gelöst. Wie das folgende Reaktionsschema
veranschaulicht, verläuft die Reaktion wahrscheinlich über ein Zwischenprodukt:
Il
R-C-N=CH,
O H
O H
Il Γ
R-C-N=CH,
-Η"1
Cystein
O H COOH
Il I I
R — C—N—CH2-S-CH2-CH
NH2
worin R Niedrigalkyl, Aryl oder Benzyloxy bedeutet. Die Lösung der Reaktionsteilnehmer wird in einem
Eisbad gekühlt und unter Rühren gibt man eine Säure, wie konzentrierte Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure
oder Schwefelsäure, zu. Die Reaktionsmischung wird dann vorzugsweise unter einer inerten
Atmosphäre, wie Stickstoff, verschlossen und beim Raumtemperäiur mehrere Stunden bis 1 oder 2 Tagen
stehengelassen. Die Verwendung von Stickstoff ist nicht kritisch, aber seine Verwendung führt im allgemeinen zu
besseren Ausbeuten an dem gewünschten Produkt. Das Reaktionsgemisch wird im Vakuum bei etwa 40 bis 500C
eingedampft. Ein Lösungsmittel, wie Benzol oder Äthanol, wird zugegeben und anschließend entfernt, um
Spuren von Wasser zu entfernen, und der feste Rückstand wird aus einem geeigneten Lösungsmittel,
wie Methanol oder Äthanol, oder Mischungen aus Alkohol und wasserfreiem Äther, umkristallisiert. Das
Produkt wird als Säuresalz erhalten, und die Abwesenheit von freiem Cystein in dem 5-Alkylamidomethylcysteinsalz
wird durch Dünnschichtchromatographie bestimmt. Die freie Aminosäure kann erhalten werden,
indem man das Säuresalz mit wäßrigem Alkali behandelt, bis die Lösung genau am isoelektrischcn
Punkt ist, oder indem man Silberoxid zufügt, um das Chlorid als Silberchlorid zu entfernen.
Bedeutet R in der Formel I Benzyloxy, so kann die Schutzgruppe in gleicher Weise wie vorher beschrieben
wurde, eingeführt werden. N-Hydroxymethyl-benzyloxycarboxamid
wird hergestellt, indem man Benzyloxycarboxamid mit Formaldehyd umsetzt, und die Schutzgruppe
wird angefügt, indem man ungefähr äquimolekulare Mengen von Cysteinhydrochlorid-inonohydrat mit
N-Hydroxymethylbenzyloxy-carboxamid umsetzt unter Bildung des Säuresalzes von S-[Benzyloxycarboxamklomethyl]-cystein.
Die Abwesenheit von freiem Cystein im Produkt wird durch Dünnschichtchromatographie bestimmt.
Bedeutet R in Formel I Acetonyl, so wird die N-Hydroxymethyl-Verbindung gebildet und durch Umsetzung
von ungefähr äquimolekularen Mengen S-Methyl-isoxazol
und Formaldehyd in Gegenwart einer äquivalenten Menge Chlorwasserstoffsatirc. Das vorstehend
beschriebene Verfahren wird im wesentlichen wiederholt, wobei sich 2-Hydroxymeihyl-5-melhyl-isov
'tliumchlorid bildet. Diese Verbindung wird mit Cjsteinhydrochlorid-monohydrat umgesetzt in Gegenwart
einer Säure, wie Chlorwassersioffsaure oder
Bromwasserstoffsäure, wobei sich ein Kondensationsprodukt bildet, das isoliert, aber nicht gereinigt wird.
Das Kondensationsprodukt wird mit wäßrigem Alkali behandelt, wodurch der Oxazolring sich öffnet und man
S-[Acetoacetamidomethyl]-cystein erhält
Die S-Alkylamidomethylcystein-Verbindungen können
hergestellt werden, indem man Derivate des N-Hydroxymethylalkylamids, wie die Ester oder HaIogenmethyl-alkylamide,
verwendet. Die Ester können einfach aus den N-Hydroxymethylalkyi- oder Arylamiden
durch Umsetzung mit einem Acylierungsmittel, wie Acetylchlorid, Essigsäureanhydrid, Trifluoressigsäureanhydrid,
Methansulfonylchlorid oder p-ToIuoIsulfonylchlorid
hergestellt werden.
Die Halogenderivate können aus einem geeigneten Amid, wie Acetamid oder Benzamid, durch Umsetzung
mit Formaldehyd und trockenem Chlorwasserstoffoder Bromwasserstoffgas in einem geeigneten Lösungsmittel,
wie Eisessig, hergestellt werden. Die Halogenmethyl-Derivate können hergestellt werden, aus dem
entsprechenden N-Hydroxymethylamid durch Umsetzung mit Phosphorpentachlorid oder Phosphortribromid
in einem geeigneten Lösungsmittel, wie Dioxan, oder einer Mischung von Äther und Dioxan.
Diese Derivate können mit Cystein in einem weiten pH-Bereich umgesetzt werden unter sauren oder
basischen Bedingungen, wobei sich das entsprechende S-Alkyl- oder S-Arylamidomethylcystein bildet. Man
kann beispielsweise S-Acetamidomethylcystein aus O-Methansulfonyl-N-hydroxymethylacetamid durch
Umsetzung mit Cystein in einem geeigneten Lösungsmittel, wie Wasser oder Äthanol, oder einer Mischung
von Lösungsmitteln, herstellen. Die Umsetzung wird bei pH 5 unter Verwendung etwa äquimolekularer Mengen
der Reaktanten durchgeführt. Der pH wird durch Zugabe von Alkali, wie Natriumhydroxid kontrolliert.
Nach der Entfernung des Lösungsmittels im Vakuum wird das Produkt durch Umkristallisation aus Methanol/
Äther oder durch andere bekannte Methoden gereinigt. Die S-Alkylamino-Schutzgruppe kann vollständig
von dem einen Cysteinrest enthaltenden Peptid abgespalten werden, indem man etwa ein Moläquivalent
eines wasserlöslichen Salzes eines Schwermetalles, wie die Acetate oder Nitrate von Quecksilber, Silber,
Cadmium, Zinn, Antimon, Platin, Gold, Blei oder Wismut oder Organometallsalze von Schwermetallen,
wie p-Chlormercuri-benzoesäure, mit einer wäßrigen Lösung des S-Alkylamidomethylcystein 1 bis 2 Stunden
rührt. Dabei können Lösungsmittel, wie Methanol, Dimethylformamid oder Mischungen dieser Lösungsmittel
verwendet werden. Die Umsetzung wird im allgemeinen bei Raumtemperatur durchgeführt, aber
andere Temperaturen als Raumtemperatur können auch angewendet werden. Das feste Metallsalz wird im
allgemeinen zu der Lösung des Cysieinderivates zugegeben, aber man kann das Salz auch als Lösung
zusetzen. Dabei bildet sich im allgemeinen ein Niederschlag und man läßt die Reaktion etwa 30 bis 90
Minuten laufen. Die Umsetzung kann in einem weiten pH-Bereich unter sauren oder basischen Bedingungen
durchgeführt werden, je nachdem welches spezielle Mittel zur Entfernung der Schutzgruppe verwendet
wird. Die besten Resultate werden jedoch bei pH 4 erhalten, wenn man anorganische Salze als Schutzgruppen-Abspaltungsmittel
verwendet, und bei pH 9, wenn Organometallsalze von Schwermetallen als Schutzgruppen-Abspaltungsmittel
verwendet werden. Werden diese Salze in Lösung zugegeben, so wird der pH der Losung im allgemeinen dem pH, bei dem die Reaktion
durchgeführt wird, angepaßt Nachdem die Umsetzung vollständig ist leitet man Schwefelwasserstoffgas in die
Mischung ein, um das Metall zu entfernen oder man kann dieses durch Dialyse gegen eine Chelatverbindung,
wie Äthylendiamintetraessigsäure entfernen. Die vollständige Abwesenheit der Schutzgruppe wird durch
Dünnschichl-Chromatographie bestimmt. Bedeutet R Acetonyl, so kann die Schutzgruppe durch
ίο Hydroxylamin, Hydrazin oder Phenylhydrazin in Eisessig
bei Raumtemperatur abgespalten werden. Das Hydrazin reagiert mit den funktionellen Carbonylresten
unter Bildung eines cyclischen Hydrazids und des S-Aminomethylcystein als Rückstand. Dieser Rückstand
ist im wäßrigen Medium instabil und durch Zugabe von Wasser oder wäßrigem Alkohol bricht er auf unter
Bildung von Ammoniak, Formaldehyd und dem freien Peptid. Das Produkt wird im allgemeinen mit Äther als
bromwassestoffsaures Salz ausgefüllt Ist in dem als Endprodukt hergestellten Peptid eine
Disulfidbindung erwünscht, so läßt man nach Entfernung der Schutzgruppen in die Reaktionsmischung Luft
einperlen, wobei sich das Disulfid durch Luftoxidation bildet.
Das Verfahren der Erfindung ist nützlich bei Peptidsynthesen, weil die Schutzgruppen unter den
verschiedenen Reaktionsbedingungen, wie sie im allgemeinen bei Peptidsynthesen angewendet werden,
stabil sind. So sind die Schutzgruppen z. B. unter sauren
jo und basischen Bedingungen im pH 0 bis 13, in konzentriertem Ammoniak und in Trifluoressigsäure
stabil. S-Acetamidomethylcystein, ein nützliches Zwischenprodukt bei der Synthese von cysteinenthaltenden
Peptiden ist sehr löslich in Wasser, eine Eigenschaft, die
j5 bei einigen Peptidsynthesen sehr nützlich ist
Die neuen Schutzgruppen können bei der Synthese von bekannten Peptiden, die allgemein bekannte
biologische Eigenschaften haben, wie Oxytocin, welches die Milchbildung reguliert, und Vasopessin, welches
κι blutdrucksenkende Eigenschaften hat, verwendet werden.
So wurde z. B. bei der Synthese von Oxytocin festgestellt, daß die Mercaptogruppe geschützt werden
kann, indem man zunächst S-Acetamidomethylcystein-N-carboxyanhydrid
mit Propyl-leucylglycinamid in Gegenwart von Kaliumborat bei einem pH von etwa 10
bis 11 umsetzt, wobei im allgemeinen ein etwa l°/oiger
molarer Überschuß des Carboxyanhydrids verwendet wird. Nach der Zugabe des N-Carboxyanhydrids wird
so der pH auf etwa 3 mit einer Mineralsäure, wie
konzentrierte Schwefelsäure, eingestellt, und das Reaktionsgefäß wird zur Entfernung von Kohlendioxid etwa
15 Minuten mit Stickstoff gespült. Der pH wird dann wiederum auf 10 bis 11 mit Kaliumhydroxid einreguliert
und anschließend wird Asparagin-N-carboxyanhydrid zu der Mischung gegeben. Die vorstehend genannte
Reihenfolge, nach welcher der pH auf 3 gesenkt und dann wieder auf 10 erhöht wird nach der darauffolgenden
Zugabe des Carboxyanhydrids, wird während der
bo Zugabe von Glutamin-N-carboxyanhydrid, Isolucin-N-carboxyanhydrid
und Tyrosin-N-carboxyanhydrid wiederholt, bis die letzte Verfahrensstufe erreicht wird,
wo der pH auf etwa 8 erhöht wird und ein etwa 10%iger Überschuß an N-t-Butoxycarbonyl-S-acetamidomethyl-
b5 cystein-N-hydroxycussinimidester zugefügt wird. Der
pH wird dann erniedrigt und etwa 15 bis 20 Stunden bei
1 gehalten, um die t-Butoxycarbonylgruppe zu entfernen und die S-Acetamidomethyl-Schutzgruppe wird
durch Zugabe von Quecksilber(ll)-acetat bei einem pH von etwa 4 bis 5 entfernt. In die Mischung läßt man zur
Entfernung des Quecksilbers Schwefelwasserstoffgas perlen und anschließend Luft, um den Rückstand zu
Oxytocin zu oxidieren. Es wurde auch festgestellt, daß man anstelle von N-t-Butoxycarbonyl-S-acetamidomethylcystein-N-hydroxysuccinimidester
N-o-Nitrophenylsulfenyl-S-acetamidomethylcystein-p-nitrophenylester
verwenden kann, um das Endprodukt zu erhalten.
S-Acetamidomethylcystein-N-carboxyanhydrid wird hergestellt indem man S-Acetamidomethylcystein mit
Phosgen in einem geeigneten trockenen Lösungsmittel, wie peroxidfreiem Tetrahydrofuran, umsetzt. Phosgen
wird unter Rühren in die Reaktionsmischung eingeleitet und man erhält nach Beendigung der Reaktion eine
klare Lösung. Das Produkt wird durch Verdampfen des Lösungsmittels gewonnen und dann in bekannter Weise
gereinigt.
N-t-Butoxycarbonyl-S-acetamidomethylcystein-N-hydroxysuccinimidester
kann hergestellt werden, indem man t-Butoxy-S-acetamidomethylcystein mit N-Hydroxysuccinimid
in einem geeigneten Lösungsmittel, wie trockenem Dioxan, umsetzt. t-Butoxycarbonyl-S-acetarnidomethylcystein
erhält man, indem man S-Acetamidomethylcystein mit t-Butoxycarbonylazid in einem
geeigneten Lösungsmittel, wie Dioxan, in Gegenwart einer Base, wie Magnesiumoxid, umsetzt. N-o-Nitrophe-
nylsulfenyl-S-acetamidomethylcystein-p-nitrophenylester
kann hergestellt werden, indem man N-o-Nitrophenylsulfenyl-S-acetamidomethylcystein
mit Nitrophenol in einem geeigneten Lösungsmittel, wie Tetrahydrofuran, in Gegenwart eines Überschusses des
Dicyclohexylcarbodiimids umsetzt. N-o-Nitrophenylsulfenyl-S-acetamidomethylcystein
erhält man durch Umsetzung von S-Acetamidomethylcystein mit o-Nitrophenylsulfenylchlorid
in einem geeigneten Lösungsmittel, wie Dioxan, in Gegenwart einer Base, wie Magnesiumoxid.
Wie aus der vorstehenden Beschreibung hervorgeht können die neuen Schutzgruppen bei der Synthese einer
Anzahl von verschiedenen Peptiden, die einen oder mehrere Cysteinreste enthalten, verwendet werden. Die
nachgewiesene chemische Stabilität der neuen Schutzgruppen und die Leichtigkeit, mit der sie mit
spezifischen Reagenzien wieder entfernt werden können, sind ganz besondere Vorteile gegenüber den zur
Zeit verwendeten Schutzgruppen bei Peptidsynthesen.
Die folgenden Beispiele beschreiben die Erfindung. Das als Ausgangsmaterial verwendete S-Acetamidomethylcystein
und sein Hydrochlorid können nach Beispiel 1 und der N-tert-Butoxycarbonyl-S-acetamidomethylcystein-N-hydroxysuccinimidester
nach Beispiel 3 der DE-AS 17 93 119 hergestellt werden.
Die folgenden Beispiele 1 und 2 zeigen die Verarbeitungsmöglichkeit des in der Stufe a) des
erfindungsgemäßen Verfahrens erhaltenen Peptids zum schutzgruppenhaltigen Peptid in der Stufe b).
Beispiel 1
S-Acetamidomethylcystein-N-carboxyanhydrid
S-Acetamidomethylcystein-N-carboxyanhydrid
1,0 g S-Acetamidomethylcystein wird in einem trokkenen Dreihalskolben, der mit einem Gaseinleitungsrohr
und einem Kühler mit Trockenrohr versehen ist, vorgelegt. Dazu gibt man 50 ml trockenes peroxidfreies
Tetrahydrofuran und rührt die Suspension, während ein Phosgenstrom bei Raumtemperatur eingeleitet wird.
Nach 3 Stunden hat sich praktisch alles gelöst und die Lösung wird filtriert und im Vakuum abgedampft unter
Bildung von S-Acetamidomethylcystein-N-carboxyanhydrid in Form eines gelben Öls. Das öl wird durch das
Infrarotspektrum als das gewünschte Produkt identifiziert.
N-o-Nitrophenylsulfenyl-S-acelamidomethylcystein-p-nitrophenylester
N-o-Nitrophenylsulfenyl-S-acetamidomethylcystein
22,8 g (0,1 Mol) S-Acetamidomethylcystein-hydrochlorid
werden in 250 ml 50%igem peroxidfreiem Dioxan in einem 500 ml Dreihalskolben, der mit einem
mechanischen Rührer und einem Kühler ausgerüstet ist, gelöst. Man gibt 12 g (0,3 Mo!) Magnesiumoxid zu und
rührt die Mischung 30 Minuten bei Raumtemperatur. Dazu werden 0,11 Mol o-Nitrophenylsulfenylchloid
gegeben und die Mischung wird 3 Stunden auf einem Ölbad bei 45° C gerührt. Das Reaktionsgemisch wird auf
Raumtemperatur abgekühlt und 1 I Wasser wird zugefügt. Die wäßrige Mischung wird zweimal mit
200 ml Äthylacetat gewaschen, auf einem Eisbad gekühlt und mit Zitronensäure auf den pH 3 angesäuert.
Die Lösung wird dann mit Natriumchlorid gesättigt und mit Äthylacetat extrahiert. Die Extrakte werden
zweimal mit einer gesättigten Natriumchloridlösung gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet,
filtriert und im Vakuum verdampft. Der Rückstand
jo kristallisiert aus Äthylacetat/Benzol.
N-o-Nitrophenylsulfenyl-S-acetamidomethylcysein-p-nitrophenylester
0,025 Mol N-o-Nitrophenylsulfenyl-S-acetamidome-
j5 thylcystein werden in einem trockenen Kolben in 100 ml
peroxidfreiem Tetrahydrofuran gelöst. Die Lösung wird auf einem Eisbad gekühlt und 0,025 Mol o-Nitrophenyl
werden zugefügt Nachdem alles gelöst ist, wird ein 10%iger molarer Überschuß von Dicylohexylcarbodiimid
zugefügt, die Mischung wird 1 Stunde auf einem Eis/Salz-Bad gerührt und dann übernacht bei 0 bis 5° C
stehengelassen. Der als Nebenprodukt gebildete Harnstoff wird abfiltriert und das Filtrat im Vakuum
abgedampft. Der Rückstand wird in Äthylacetat gelöst,
einmal mit 1 η Natriumbicarbonat und dann dreimal mit gesättigtem Natriumchlorid gewaschen, über wasserfreiem
Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum abgedampft Beim Kristallisieren aus Chloroform/Äther
erhält man praktisch reinen N-o-Nitrophenylsulfenyl-S-acetamidomethylcystein-p-nitrophenylester.
Dieses Beispiel zeigt die Abspaltung der S-Acetamidomethyl-Schutzgruppe
in der Stufe c) des erfindungsgemäßen Verfahrens:
96 mg (0,5 Millimol) S-Acetamidomethylcystein werden
in 5 ml Wasser gelöst und die Lösung wird mit 0,25η Chlorwasserstoffsäure auf pH 4 eingestellt Dazu gibt
man eine Lösung von 159 mg (03 Millimol) Quecksiiber(H)-acetat
in 5 ml Wasser, welches zuvor auf pH 4 eingestellt worden war. Beim Mischen bildet sich sofort
ein Niederschlag. Der pH fällt und wird 1 Stunde lang auf pH 4 eingeregelt Während der Umsetzung
entnimmt man in 15minütigen Abständen 2 ml Proben.
Zu jeder Probe gibt man Schwefelwasserstoff, um die Reaktion abzubrechen. Die klare, überstehende Flüssigkeit
wird abdekantiert und ein Dünnschicht-Chromatogramm wird von jeder Probe in einem Butanol-Essig-
säure-Wassersystem durchgeführt. Die nach 30 und 45 Minuten gezogenen Proben enthalten kein S-Acetamidomethylcystein.
Sie enthielten nur Cystein und Cystin.
Im folgenden wird die Verwendung der S-Acetamido-Schutzgruppe bei der Gesamt-Synthese eines Cystein
enthaltenden Peptids beschrieben.
Synthese von Oxytocin
2 Millimol Propyl-leucyl-glycinamid und 20 ecm Kaliumborat-Puffer (pH 10,2) werden in einem Waring-Mischer
bei 00C gefüllt. Dazu gibt man unter Rühren
einen 1 °/oigen molaren Überschuß an S-Acetamidomethylcysteirt-N-carboxyanhydrid.
Der pH wird mit konzentrierter Schwefelsäure auf 3,0 eingestellt und das System wird 15 Minuten zur Entfernung von Kohlendioxid
mit Stickstoff gespült. Der pH wird dann mit 50%igem Kaliumhydroxid auf 10,2 erhöht und ein
2%iger molarer Überschuß Asparagin-N-carboxyanhydrid zugefügt. Der pH wird auf 3,0 mit konzentrierter
Schwefelsäure eingestellt und das System wird wiederum mit Stickstoff gespült Man erhöht den pH dann auf
10,2 mit 5O°/oigem Kaliumhydroxid und gibt einen 3%igen Überschuß Glutamin-N-cabonsäureanhydrid
zu. Der pH wird mit konzentrierter Schwefelsäure auf 3 erniedrigt und das System mit Stickstoff gespült. Der pH
wird dann mit 5O°/oigem Kaliumhydroxid auf 10,2 erhöht
und ein 5%iger Überschuß Isoleucin-N-carboxyanhydrid
zugegeben. Dann wird der pH mit konzentrierter Schwefelsäure auf 3 eingestellt und das System wird
wieder zur Entfernung von Kohlendioxid mit Stickstoff gespült. Dann wird der pH wieder auf 10,2 mit 50%igem
Kaliumhydroxid erhöht und ein 5%iger Überschuß Tyrosin-N-carboxyanhydrid zugegeben. Der pH wird
mit konzentrierter Schwefelsäure auf 3 eingestellt und
ίο das System wird wiederum zur Entfernung von
Kohlendioxid mit Stickstoff gespült. Der pH wird dann auf 8,0 mit 5O°/oigem Kaliumhydroxid erhöht und ein
10%iger molarer Überschuß von N-t-Butoxycarbonyl-S-acetamidomethylcystein-N-hydroxysuccinirnidester
wird zugegeben. Der pH wird zur Entfernung der tert.-Butoxycarbonylgruppe mit konzentrierter Schwefelsäure
auf 1 erniedrigt und 15 Stunden dabei gehalten. Dann wird der pH auf 4 eingestellt und ein 10%iger
molarer Überschuß einer wäßrigen Lösung von QuecksilberiJO-acetat wird zu der Reaktionsmischung
zugegeben. Der pH wird durch Zugabe von Schwefelsäure auf 4 gehalten. Zur Entfernung der Quecksilber-Ionen
wird Schwefelwasserstoffgas in die Reaktionsmischung eingeleitet und zur Oxidation des Produktes zum
2r> Oxytocin wird Luft durch die Reaktionsmischung
geleitet. Das Produkt wird chromatographisch über Kieselgel gereinigt.
Claims (1)
1. Verfahren zur Herstellung von einen Cysteinrest
enthaltenden Peptiden, dadurch gekennzeichnet, daß maii
a) die Mercaptogruppe des Cysteinrestes mit einer Schutzgruppe der allgemeinen Formel
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