DE1793827A1

DE1793827A1 - Neue aminoschutzgruppen, ihre verwendung bei peptidsynthesen und verfahren zur herstellung der entsprechend geschuetzten aminosaeuren und peptide

Info

Publication number: DE1793827A1
Application number: DE19681793827
Authority: DE
Inventors: Beat Dr Iselin; Peter Sieber
Original assignee: Ciba Geigy AG
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 1967-01-25
Filing date: 1968-01-16
Publication date: 1976-05-13
Also published as: GB1218251A; DE1668876B2; NL6801063A; FR1554051A; DE1668876A1

Description

CIBA-GEiGY AG, CH-4002 Sase! */ I : ».-·-{ \ "**«* <-»

Case 4-6106/1-3/b

DEUTSCHLAND ·

Neue Aminoschutzgrupp-en,- ihre Verwendung bei Peptidsynthesen und Verfahren zur Herstellung der entsprechend geschützten Aminosäuren und Peptide,

Gegenstand der Erfindung ist ein neues Verfahren zum vorübergehenden Schutz von Aminogruppen bei Peptidsynthesen durch Acylierung der Aminogruppe und nachträgliche Abspaltung der eingeführten Acylgruppe.

Bekanntlich müssen bei der Synthese von Peptiden durch Kupplung von Aminosäuren oder Peptiden im allgemeinen die an. der Kupplungsreaktion nicht beteiligten funktionellen

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Gruppen, beispielsweise die terminals Amino- oder die termi-• nale Carboxylgruppe, die Amino- und Carboxylgruppen der Seitenketten und gegebenenfalls weitere Gruppen,wie Herkapto-, Guanidino- oder Hydroxylgruppen blockiert werden. Es stehen heute zwar eine grb'ssere Anzahl von Schutzgruppen zur Verfügung, doch vermögen sie noch nicht völlig zu befriedigen, ·; insbesondere.nicht,.wenn es sich um die Synthese langkettiger .'und empfindlicher Peptide handelt. Das Problem liegt vor ··■ allem darin, dass'in solchen Fällen hydrogenolytische Ab-..'Spaltung oit nicht möglich, ist".'(wegen vorhandener s'chwefel-'· 'haltiger Aminosäuren) und. dass die Peptide gegenüber hydrolytisch '-wirkenden sauren oder insbesondere alkalischen Agenzien nicht stabil genug sind, so" dass die hydrolytische Abspaltung sämt-'licher Schutzgruppen auf der letzten Synthesestufe mit grossen · Verlusten kostbaren Materials verbunden ist. . "-■'·" · '. ■ ·".·..- Eine weiters Schwierigkeit besteht darin/ dass die .am-Kupplungsende befindliche Schutzgruppe "nach jeder Kupplungcreaktion wieder abgespalten werden muss, während die übrigen :Schutsgruppen bis.zum .Schluss der Synthese beibehalten wer-· · .den sollen..Diese beiden Arten von Schutzgruppen müssen also einerseits selektiv gegeneinander abspaltbar sein, anderer- ■ seits aber müssen .beide Arten unter milden Bedingungen entfernt werden können. . ·■ · ·'"■··■ '·.'·.· ·.." ■ · ".'···- '"· · ■.■^: ····.' · ■ ' -.^: · "^: . ": - -·■ " '■'".' '" ·" ■ .

·· .·-■; " · ...Als unter milden sauren Bedingunen abspaltbare '" Seitenketten-Schutzgruppen haben sich vor.allem die tert.Butyl-

. · ; . 609820/-1 19S'.. .· *'. ".

oxycarbonyl (BOC)-Gruppe zum Schutz der Aminogruppen und die tert.-Butylester (tßu)-Gruppe zum Schutz der Carboxylgruppen bewährt; hinzu kommt.die tert.-Butyläthergruppe zum Schutz von Hydroxygruppen. Neben diesen Gruppen kann die Tritylgruppe, z.B.· als a-Aminoschutzgruppe, selektiv entfernt werden, da sie in schwach saurem Medium sehr viel schneller abspaltbar ist, beispielsweise in 80 £?iger Essigsäure bei Zimmertemperatur 20 000 mal schneller. Leider ist aber die Anwendbarkeit der Tritylgruppe als Aminoschutzgruppe sehr beschränkt. Wegen sterischer Hinderung kann sie bei der Kupplung nach der Methode der aktivierten Ester und der gemischten Anhydride nicht verwendet werden (ausser beim Glycin) und führt auch bei-der". Carbodiimidmethode zu schlechten Ausbeuten. Sie kommt daher bei der Synthese von Peptiden vom Carboxylende her, z.B. nach dem neuen Verfahren der Feststoffträgersynthese, (vgl. Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 8j5, 2149 (1963)) nicht in Betracht. Auch sonst weist die Tritylgruppe als Aminoschutsgruppe Nachteile auf, denn sie 'ist schwierig einzuführen und die.Trityl-geschützten Verbindungen sind wenig stabil.· Es wurde nun gefunden, dass Schutzgruppen der Formel

R₁ .

worin R, für Niederalkyl,-Rp für Niederalkyl oder Phenyl und R-, für Phenyl steht, bei der Synthese langkettiger empfindlicher Peptide vorteilhaft und bekannten Schutzgruppen, wie s.B,

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der Tritylgruppe überlegen sind. Die Phenylreste in obiger Formel stehen für einen unsubstltulerten oder einen durch eine oder zwei Niederalkyl-, Phenyl- oder Niederalkylphenylgruppensubstituierten Phenylring. Die Substituenten befinden sich vor allem in para-Stellung, sie können auch in ortho- oder ortho- und para-Stellung stehen. Die Niederalkylreste weisen höchstens 5 Kohlenstoffatome auf; sie sind in erster Linie Methyl oder Aethyl, ferner z.B. Propyl oder Butyl. Die Niederalkylgruppen sind geradkettig, können aber auch - insbesondere im Falle der Phenylsubstituenten - verzweigt sein,

Die neuen Gruppen zeichnen sich dadurch aus, dass sie unter sehr milden sauren Bedingungen,.. z.B. bei Zimmer-' temperatur in ca. 6Ö - 90 ^iger wässeriger Essigsäure, Chlor-"essigsäure oder Ameisensäure oder einem Gemisch von mindestens zwei dieser Säuren mit 10- 40 % Wasser abgespalten · werden. Da ihre Abspaltungsgeschwindigkeit mehr als βΟΟ mal grosser als diejenige der BOC-Gruppe ist, lassen sie sich selektiv gegenüber dieser Gruppe abspalten, ferner auch gegenüber der tert.-Butylestergruppe, der tert.-Butyläthergruppe und der Trityl-Mercaptoschutzgruppe. Sie sind daher besonders geeignet als cc-Aminoschutzgruppen bei der Synthese von empfindlichen Peptiden,'welche säure-labile Seitenkettenschutzgruppen, wie die genannten Gruppen, aufweisen. Da sie keinerlei ste-■rische Hinderung zeigen, lassen sie sich bei jeder Kupplungsmethode und insbesondere auch bei der Feststofftragersynthe.se . verwenden. ' ' ·

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BAD ORIGINAL

Die Einführung der neuen Gruppen erfolgt nach an sich bekannten Methoden, analos der Einführung der BGC-Cruppe, beispielsweise mittels der Azidrnethode oder der Kethode der aktivierten Ester (z.B. Phenylester, p-Nitrophenylester, Hydroxysuccinimidester) oder durch Umsetzung von Carbinolen der Formel '

■■'."· R₁R₂R C-OH

mit den Aminosäuren entsprechenden Isocyanatsäureestern, : . In den folgenden Beispielen wird die Einführung und die Abspaltung der neuen Gruppen an einigen natürlichen α-Aminosäuren und aus natürlichen α-Aminosäuren aufgebauten Peptiden gezeigt, In gleicher V/eise werden die Gruppen auch bei anderen Aminosäuren und Peptiden angevrendet« Die Temperaturen sind in Celsiusgraden angegeben.

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- c ~ ■.

Beispiel 1:

Ei η f üb run -ζ, 6. e r_ 2 - P hon V₁I₁-J s pprορ y I ο :cy na r b ο ny_l gruppe l) · 5/35 S Isocyanatessigsäureäthylester (41,5 mMol), 4 ml Pyridin und 5,64 g Phenyldimethylcarbinol (41,5 mMol) 'werden 38 Stunden auf 50° erhitzt. Die gelbe Lösung v^ird in βθ ml Aether aufgenommen, bei 0 mit 1-M, Citronensäure und mitV/asser ausgeschüttelt, über Natriumsulfat getrocknet und 'im Vakuum vollständig eingedampft. Den Rückstand verreibt man . mit P.etrolävher, filtriert die feste Substanz ab und kocht • -sie am Rückfluss in 70 ml He:-:an, Man filtriert das ungelöste Material ab, engt das Piltrat auf die Hälfte ein, fii-... · ' - -.* · ' ·

: triert· über 0,5g Aktivkohle-und. lässt den■'N-(2rPhenyl'*-isopropyl' " oxycarbonyl)-glycin-äthylester auskristallisieren. P. 69-70°. Pas Produkt ist im Dünnschichtchromatografie in Chloroform •einheitlich, Rf « 0,4. · · ·

..·*·-* . 675 mg (2,55 RiMoI) des Esters werden in 10 ml Diozan gelöst, mit 1,47 ml 1,91-N: HaOH versetzt und 1 1/2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die klare Lösung wird mit 20 ml Wasser verdünnt, zweimal mit Aether extrahiert, dieser noch mit wenig V/asser gewaschen. Die vereinigten wässrigen Lösungen werden bei 0° mit Citronensäure auf pH 2 angesäuert, zweimal mit Aether extrahiert, dieser neutral gewaschen, getrocknet und filtriert. Zur Aetherlösung.wird' nun Dicyclohexylamin bis zur alkalischen Reaktion zugegeben, worauf beim Kratzen

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. . . BAD ORIGINAL

das Salz zu kristallisieren beginnt. Die Aethorlo'sung wird noch auf etwa 10 ml eingeengt, einige Stunden bei 0° kristallisieren gelassen, dann die Kristalle von N-(2-PhenylisopropyI~ öxyearbonylj-glycin-dicyclohexyl-arnmoniumsalz abfiltriert .und rait Aether gewaschen. F: I62-I63⁰ (unter schwacher Zers.). 2) " 60 g Phenyldimethylcarbinol (0,^ιΛ Mol) in ^50 ml absolutem Methylenchlorid und 53 ^m^· absolutem Pyridin (0,66 Mol) werden bei -5 in J)O Minuten'mit 6? ml Chlorkohlensäurephenylester (0,53 Mol) in 250 ml absolutem Methylenchlorid versetzt.

■ Es entsteht eine dicke Suspension. Diese wird noch weitere • . 20 Stunden bei 0 gerührt, dann auf wenig Eis und 100 ml ■ ■ Methylenchlorid aufgetragen. Die erhaltene Methylenchlorid·*

■ lösung wird bei 0 mehrmals mit Viasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum bei 20° zur Trockene ver-

.. -dampft. Das erhaltene, unbeständige gemischte Carbonat wird. . -. sofort in l80 ml Methanol gelöst, unter Eiskühlung mit 52 ml ■' Hydrazinhydrat (ΐ,Οδ Mol) versetzt und bei Raumtemperatur 20 Stunden stehen gelassen. Die Lösung wird mit 600 ml Aether Verdünnt _f bei 0° mit Wasser, fünfmal mit 0,5~N. Katronlauge "

und mit Wasser bis neutral gewaschen, getrocknet über Natriumsulfat und im Vakuum bei 50° zur Trockene verdampft, Der Rücl:- , stand (6lg) wird im Hochvakuum destilliert und ergibt 5²,1 g

2-Phenyl-isopropyloxycarbonyl-hydrazid in Form eines färb-"•losen, viskosen OeIs. Kp: 95-98°/lO mm Hg. "

■ ■ 20,6 g dieses Hydrasids (0,106 Mol) werden in 320 ml . Dimethylformamid gelöst, auf -20° bis -3O⁰ gekühlt und mit .. ^:- 6 09820 / 1 1.95

■ « 8 ^

ΙβΟ ml 1,94-Ν» Salzsäure versetzt, wobei die Temperatur unter ' . -20° gehalten wird. Anschliessend werden 2J, 2 ml 5-M. Natriumnitritlb'sung bei -15 bis -10 zugetropft. Nun wird noch '15 .Minuten bei gleicher Temperatur gerührt, dann mit gesättigter Kaliumcarbonatlö'sung auf pH 6-7 gestellt. Das Gemisch wird mit 800 und 400 ml Aether extrahiert, die" beiden - Aetherlösungen bei 0 dreimal mit Wasser gewaschen, vereinigt, ■ über Natriumsulfat getrocknet' und im Vakuum bei J>Q zur φ Trockene verdampft. Der Rückstand wird vorsichtig im Hochvakuum destilliert und gibt 17,5 S ^öes Azids als eines ". · gelblichen OeIs vom Kp 4J-51⁰/ 0,005 mm Hg..Das IR.-Spektrum

weist die erwarte'ten .Banden auf. (Azid-Bande'bei 4,6 und 4,7 μ •-.[aufgespalten]; Carbonyl-Bande bei 5,8 μ).

'..·'; _;. . 2,45 g (12 mMol) 2-Phenylisopropyloxycarbonyl-azid • '· in 14 ml Dimethylformamid werden mit 5,75 6 N -tert.-Butyloxy-.-carbonyl-L-lysin-me'thylester-acetat (18 mMol) und 2 ml Dl- · methylformamid versetzt. Unter Rühren wird bei 0° in 1 1/2

• Stunden 4,15 ml Triäthylamin langsam zugetropft. Die klare Lösung wird nun 3 Tage im Kühlschrank stehen gelassen. Nach Verdünnen mit 50 ml Aether wird bei 0 mehrmals mit 0,l*-M,

. Citronensäurelösung, dann mit Wasser bis neutral ausgeschüttelt, getrocknet über Natriumsulfat und zur Trockene verdampft."

' · Der Rückstand wird am Hochvakuum bis zur Gewichtskonstanz ·

.'_: '.·*!" · ßAD ORIGINAL

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■ - 9 -

getrocknet und bildet ein Chromatographiecn einheitliches, viskoses OeI. [a]„ = + 6° + 0,5° (c = 2 in Chloroform) Ausbeute: 4,8j5 g = 95 £ d. Th, N -^-Phersyliscpropyloxy- carbonyl)-Y& -tert.-butyloxycarbonyl-L-lysin-methylester,

. · . Auf gleicher V/eise wie unter 1) beschrieben kann. man die para-Diphenylisopropyloxycarbotiylgruppe in Glycinäthylester einführen. Man erhält so den N-(2-p~Diphenyliso~ propyloxycarbonyl)-glycinäthylester_J der aus Methanol kri-■stallisiert. P.' 122°. .-·■-■ "

Beispiel 2:

Einführun.g der 2"p-Tolyl~isopropyl·ox^^ί^carbρηylf?rupΏe

':.;'.'■ 6,22'g p-Tolyl-dimethylcarbinol (^1,5 mMol), 4 ml

absolutes Pyridin und 5,35 g (41,5 isMol) Isocyanatessissäure-■ " äthylester werden 38 Stunden bei ;}0" gehalten und v,^rie im Beispiel 1 beschrieben aufgearbeitet. Ι·:-\;ι erhält 9,8 g N-(2-•p-Tolyl-isopropyloxycarbonyl)-glycinäthylester als gelbes OeIj Kf a 0,25-0',35 in Chloroform. Zwecks Verseifung wird .der Ester in 100 nil 80#igein Methanol gelöst, am pH-Meter ir.it 24 ml 1,9-N. Natronlauge rasch versetzt, wobei das pH auf _ 11,8 steigt. Nach 7 Minuten wird 2-N. Salzsäure zugegeben bis

- ·
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pH 8,5· Die erhaltene Lösung wird im Vakuum auf etwa die Hälfte eingeengt, noch mit 50 ml Wasser versetzt und zweimal mit Aether extrahiert. Die Aetherlösungen werden noch zweimal mit'Wasser gewaschen, die vereinigten wässrigen Lösungen bei 0 mit Citronensäure auf pH 2 angesäuert und mit Aether ■extrahiert. Die Aetherlösung wird nach dem Neutralwaschen, Trocknen mit Natriumsulfat und Filtrieren mit Dicyclohexylamin alkalisch gestellt, auf ca. JO ml eingeengt, mit gleichviel' Petroläther versetzt. .^r2nd kristallisieren gelassen. Kan "erhält 8,4 g des N-(2~p-Tolyl-isopropyloxycarboxyl)-glycindicyclohexylammoniumsalzes vom F.. 145-14.7°. Nach Umkristalli "sation aus Essigester schmilzt die Substanz bei 147-148° (u,Zers. )·'"·'■. · : - . · · ■■··.-■ ■"'".." ... . ■

ν Beispiel 3:

^g der 2-Phenyl-isopropyl oxy carbonyl gruppe"

1) ' · . 4l8,β mg N-(2~Phenylisopropyloxycarbonyl)-glycin-.' dicyclohexylammoniumsalz v^erden bei Raumtemperatur in 4,2 ml

..einer Mischung aus 7 Vol. Eisessig, i Vol. 82,8 % Ameisen- ^:·"säure und 2 Vol.. Wasser gelöst. Nach 4 Stunden zeigt eine .;.. "dünnschichtchrpniatographische Analyse, dass etwa 95 S gespalten ''^ ist. Nach 6-stündigem Stehen bei Raumtemperatur wird mit 20 ml ' . ■ · ■ ■ . ·. ■ ■

. -.Aceton versetzt, das ausgefallene Glycin abfiltriert und mit Aceton gut gewaschen. Es ist klar wasserlöslich und chromato-

*0 M

"~ 1 j. —

graphisch einheitlich. Ausbeute: 68,5 mg = 91.»^Ji .$ der Theorie. Unter gleichen Bedingungen bleibt tert.-Butyloxycarbonylglycin-äthylester unverändert.

2) - 71,7 mg (0,27 mMol)-.N-(2-Phenylisopropyloxycarbonyl)-glycinäthylester werden bei 25 in 1,35 ml 80 zeiger Essigsäure gelöst. Nach verschiedenen Zeiten werden Proben von 0,20 ml entnommen, in h ml Dimethylformamid gegeben und mit 0, l~n. Perchlorsäure in Eisessig titriert (Titration des freigesetzten Glycin-äthylesters). Die Halbwertszeit für die Abspaltung der Schutzgruppe beträgt ca. 2 Stunden. Nach 24 Stunden ist die Abspaltung quantitativ. Auch im Dünnschichtchromatogramm lässt sich keine Spur Ausgangsmaterial mehr nachweisen. Unter den'gleichen Bedingungen bleibt die N-Schutzgruppe von N-tert.-Butyloxycarbonyl-glycin-äthylester unverändert.

Auf gleiche Weise wird N-(2-p~Diphenylisopropyloxycarbonyl)-glycin-äthylester in 3 l/² Stunden quantitativ gespalten.

3) 68,8 mg N-(2-Phenylisopropyloxycarbonyl)-glycinäthylester werden in 2,6 ml 60 $iger Chloressigsäure bei Raumtemperatur gelöst. Nach verschiedenen Zeiten werden Proben von 0,20 ml entnommen, in h ml' Dimethylformamid gegeben und mit 0,1-n. Perchlorsäure in Eisessig titriert. Nach 15 Minuten.ist die Verbindung quantitativ gespalten. Die BOC-Gruppe wird ca. I9OO mal langsamer abgespalten. In der folgenden Tabelle sind die Spaltgeschwindigke'iten für verschiedene Säuren bzw.

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•saure' Gemische angegeben.

Hydrolyse-Medium . . ~ '	7:1:2-	quantitative Spaltung nach	Stunden	Stunden
60 $> Essigsäure . .. ·. '■·."	7:1:2	12	Stunden	Stunden
90 ⁽ß> Essigsäure ■ _t - '·.. . ■		50	momentan
75 ⁽fi Ameisensäure . · ■ '"-'■."·;.	11	Minuten
Methanol-82,S^ Ameisensäure lsi' '	4 1/2
Eisessig-82,8# Ameisensäure-V/asser
Eisessig~82, S??' Ameisensäure-V/asser	40
+ Natriumchlorid

• 4)" ':'·.':■' 4J9,7 mg (1,04 mMol) N -(2-Phenylisopropyloxycar-

• ' ".bonylJ'-N^-.tert.butyloxycarbonyl-L-lysin-methylester vferden

■; ' JLn 4_;4 ml 80^iger Essigsäure gelöst und 48 Stunden bei Raum*

;-■' temperatur aufbewahrt. Eine'dlinnschichtchromatographische / . Analyse nach dieser Zeit zeigt, ,dass die N -Schutzgruppe ■ ·. ■· .praktisch quantitativ, die".Ir«tert.-Butyloxycarbony!gruppe _v ' nicht abgespalten ist. Die Lösung wird im Vakuum zur Trockene

eingedampft, der Rückstand irn Hochvakuum bei 45°setrocknet,. ■;·. . "dann in wenig. Aether gelöst, wobei'langsam Kristallisation

'"eintritt.!Zur Vervollständigung derselben wird.noch ca» · gleich· ".-". viel Petroläther zugesetzt, einige Stunden bei 0° stehen ge~

'.."■lassen und. filtriert. Es werden 269-mg kristallisiertes N-*- '·.;. tert.-Butyloxycarbonyl-L-lysin-methylester-acetat erhalten,.,.

. *"■ p"i 80-81°. Die Mutterlauge enthält noch weiteren N^-tert.-'Butyloxycarbonyl-lysin-methylester', ·':'■ ...",^:..·■'·? · "■ "". .· ··-■··/ '·.··"·; ■ .'·. ·'"·.·■ ·· ■· ■ ■

• ^; ■ ■ 6038207Γ195 '■'.

BAD ORIGINAL

. " ■ Beispiel h :

Abspaltung der 2~p-Tolyl-isopropyloxycarbonylgruppe

1) . 432,6 mg (1 mMol) N-(2-p-Tolyl-isopropyloxycarbony]}-glyein-dicyclohexylammoniumsalz v?erden in ^,3 nil einer Mischung von 7 Vol. Eisessig, 1 Vol. 82,8 % Ameisensäure und 2 Vol. Wasser gelöst und bei Raumtemperatur gerührt» Nach 15 Minuten und nach 30 Minuten wird eine dünnschichtchromatographische Analyse durchgeführt, welche zeigt, dass nach 15 Minuten ca. 95 Joige und nach 30 Minuten quantitative Spaltung eingetreten ist. Ebenfalls nach 30 Minuten wird die Lösung mit 20 ml Aceton versetzt, kurze. Zeit bei 0 kristallisieren gelassen, dann das Glycin abfiltriert und gut mit Aceton gewaschen. Ausbeute: 69,5 mg = 92*7 % kristallisier tes Glycin. ■ .--..-.

2) Wenn man N-(2-p-Tolyl~isopropyloxycarbonyl)-glycinäthylester wie für die entsprechende S-Phenylisopropyloxy- ■ carbonylverbindung. in Beispiel 3 unter 2) beschrieben bei 25° mit 80 i&Lger Essigsäure behandelt, wird die Schutzgruppe in 1 1/2 Stunden quantitativ abgespalten.

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Beispiel 5 J

Einführung der 2-p-Biphenylylisopropyloxycarbonylgruppe

a) Mit dem Azid in Aminosäureester

.. · 106 g (0,5 Mol) p-Biphenylyl-dimethylcarbinol in 500 ml Kethylenchlorid und βθ ml Pybidin werden in 30 Minuten bei -5° niit einer Lösung von 76 ml Chlorkohlensäure~ phenylester in 250 ml Kethylenehlorid versetzt. Die ent- Etandene Suspension wird 14 Stunden bei 0° gerührt, wobei

ο eine fast klare Lösung entsteht. Diese Lösung wird bei 30 am Rotationsverdampfer im Vakuum zur Trockene verdampft und der kristalline Rückstand bestehend aus 2-(Biphenylyl)-isopropyl'oxycarbonyl-phenylester noch 1 Stunde am Hochvakuum bei .Raumtemperatur getrocknet. Dann wird mit 200 ml Dimethylformamid und 125 rnl Hydrazinhydrat versetzt und unter Kühlen mit kaltem V.'asser β Stunden gerührt. Die klare Lösung wird lang-'sam unter Eiskühlung mit 1 Liter Wasser versetzt, über Nacht ■bei 0° kristallisieren gelassen, die Kristalle abfiltriert ■ und mit 1-N. Natronlauge und Wasser gewaschen. Nach dem Trock-

nen im Vakuum bei 50 wird das 2-(p-Biphenylyl)-isopropyloxycarbonylhydrazid aus 200 ml Tetrachlorkohlenstoff und 40 rnl Petroläther umkristallisiert. Man erhält 103,0 g {76 % der Theorie); P. 108 - IO9⁰. * · . -^;

27 g (0,1 KoI) dieses Hydrazids werden in 270 ml Acetonitril gelöst und unter Rühren bei -25° wit einer Lo-

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BAD ORIGINAL

sung von 50 ml β-Ν, Salzsäure in' 100 rl Acetonitril, dann mit 22 ßl 5~M. Katriumnitriulösung versetzt. Nach 15 minütigeni Rühren bei -15° wird mit 2-Ii. Sodalösung auf pH 6 - 7 gestellt- und die Lösung auf viel Eiswasser aus ge trager,. Nach kurzem Rühren wird das Azid fest. Es wird abfiltriert und mit Eiswasser gewaschen. Der Rückstand wird in Aether gelöst, das Wasser abgetrennt, die Aetherlösung über Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel im Vakuum bei Raumtemperatur verdampft. Man erhält 28,3g (100 % der Theorie) des Azids in Form eines kristallinen, gelblichen Pulvers .vom P. kB - 52°. ' ·

3j37 S (20 mMol) L-Valin-methylester-hydrochlorid .- in 10 ml Dimethylformamid werden unter Rühren bei 0° mit 2,8 ml Triethylamin, 6,2 g des obigen Azids und 5 ml Dirne-' thylformamid versetzt. Nach 10 Minuten werden weitere 2,8 ml Triethylamin zugegeben, darauf wird über Nacht bei Raumtemperatur weitergerührt, Das Reaktionsgemisch wird mit 100 ml Aether verdünnt, bei 0° mehrmals mit 0,1-M. Zitronensäure~ lösung und V/asser ausgeschüttelt, über Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum zur Trockne verdampft. Der erhaltene Ester wird direkt verseift. Zu diesem Zweck löst man das Rohprodukt in 75 ml Isopropanol, versetzt mit 12 ml 2~N. Natronlauge und rührt 2 1/2 Stunden bei ^tO⁰. Dann gibt man Aether .und Wasser zu der Lösung, trennt die wässrige Lösung ab und versetzt noch ein zweites Mal mit Wasser . Die vereinigten wässrigen Lösungen werden mit Aether überschichtet, bei 0

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mit 1-m. Zitronensäure auf pH 2 gestellt und mit Aether extrahiert. Die Aetherlösung wird nach dem Neutralwaschen und Trocknen mit Cyclohexylamin alkalisiert, wobei das Cyclohexylammoniumsalz kristallin ausfällt. Man engt die Aetherlösung auf ca. 50 ml ein, versetzt mit 50 ml Petroläther und lässt bei 0° kristallisieren. Das kristalline Produkt wird abfiltriert und mit Aether-Petrolather (1:1) gewaschen. Man erhält 6,5 g des N-2-(p-Biphenylyl)-isopropyloxycarbonyl-L-valin-cyclohexylammoniumsalzes vom F. 178 - I80 (Zersetzung). ~*^: . ' ■ · ' ■ b) Mit dem Azid in Aminosäuren · ■· ' · ■ .

1,17 g L-Valin (10 mMol) werden warm in 9,1 g einer 10 ^igen wässrigen Lösung von Tetramethylammonium-•hydroxid gelöst. Die Lösung wird im Vakuum bei 80 eingedampft, der Rückstand noch dreimal in 5 ml Dimethylformamid aufgenommen und im Vakuum eingedampft. Den kristallinen Rückstand rührt man mit 20 ml Dimethylformamid bei Raumtemperatur, versetzt mit 2,8 g 2-p-Biphenylyloxycarbonylazid, dann mit 3 ^ml Triethylamin und rührt die Suspension 1 Stunde bei Raumtemperatur. Nach Versetzen mit Aether und Wasser wird die wässrige Lösung abgetrennt, die Aetherlösung noch zweimal mit wenig Wasser nachextrahiert und die vereinigten wässrigen Lösungen bei 0 . auf pH 2 angesäuert. Nach Extraktion mit Aether und Neutralwaschen der Aetherauszüge wird mit Natriumsulfat getrocknet, filtriert und mit Cyclohexylamin alkalisiert. Das Cyclohexylammoniumsalz beginnt sofort

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zu kristallisieren. Es wird auf gleiche Weise wie unter a) beschrieben isoliert. Man erhält 2,96 B N--2-ip-Biphenylyl)-isopropyloxycarbonyl-L-valin-cyclohexylammoniumsalz vom P. 178 - 18O° (Zersetzung).
c) Mit aktiviertem Ester in Aminosäuren

1,17 g L-VaIin (10 mMol) werden in ^, 55 ^l einer 2,2-n. methanolischen Lösung von Benzyltrimethylammoniumhydroxid gelöst, im Vakuum zur Trockne verdampft, nochmals in 10 ml Dimethylformamid gelöst und erneut im Vakuum verdampft. Der Rückstand wird in 5 ml Dimethylformamid auf genommen, mit *!·, 0 g 2-(p-Biphenylyl)-isopropyloxycarbonylphenylester versetzt und h Stunden bei 50° gerührt. Die klare Lösung wird mit -30 ml Wasser und J>0 ml Aether versetzt und ausgeschüttelt, die wässrige Phase abgetrennt und bei 0 mit Zitronensäure auf pH 2 angesäuert. Nach Extrahieren mit Aether wird die ätherische Lösung neutral gewaschen, getrocknet, filtriert und mit 1,9 rol Cyclohexylamin versetzt. Sofort beginnt das CyelohexylammoniumsaLζ des N-2-(p-Biphenylyl)-isopropyloxycarbonyl-L-valins zu"kristallisieren. Es wird auf gleiche Weise wie unter a) beschrieben isoliert. Die Ausbeute beträgt 3*15 BS F· 178 l80° (Zersetzung). '

In gleicher Weise können die folgenden N-2-(p-BiphenyIyl)-ispropyloxycarbony!-Derivate hergestellt werden:

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Derivat	F.	(Zers.)
Glycin-dicyclohexylammoniumsalz	I92 - 193°	(Zers. )
L-Leucin· . " ·	227 - 230°	(Zers, )
L-Prolin-dieyclohexylammoniumsalz	173 - 175°
N^-tert.-Butyloxycarbonyl-L-lysin-di- . cyclohexylammoniumsalz	amorph	(Zers. ) 158°
L-Tyrosin-cyclohexylammoniumsalz	248 - 252⁰ sintert bei	(Zers.) i"
L-Phenylalanin-dicyclohexylammonium- salz · . .	116 - 119°	(Zers.)
L-Glutaminsäure-7-tert.-butylester- cyclohexylamnioniurnsalz ' · '	174 - 175°	(Zers.)
L-Serin-tert«-butyläther-cyclohexyl- .ammoniurnsalz ■ . -	180 - 181°
L-Methionin-dicyclohexylammoniumsalz	142 - 143°

Der 2-(p-Biphenylyl)-isopropyloxycarbonyl-phenylester wird wie folgt hergestellt:

21,2 g p-Biphenylyl-dimethylcarbonil (0,1 Mol) in 100 ml Methylenchlorid und 12 ml Pyridin werden bei -5° in 30 Minuten mit einer Lösung von 18,8 g Chlorkohlensäurephenylester in 50 ml Methylenchlorid versetzt. Anschliessend rührt man noch l8 Stunden bei 0°, giesst dann auf Eiswasser aus, trennt die organische Phase ab, wäscht mehrmals mit Wasser, trocknet und verdampft das Lösungsmittel im Vakuum bei 30 . Nach Umkristallisieren aus Essigester wird das Kri-

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- 3.9 -

■stallisat mit Essigester-Petroläther '2;l) gewaschen und im Vakuum bei Raumtemperatur getrocknet, Man erhält 25,8 g

des 2~(p~Biphenylyl)-isopropyloxycarbonyl-phenylesters vom P. -115 - 116° (Zersetzung). ■ -

Beispiel 6 :

Abspaltung der N-2-(p-Biphenylyl) -isopropyloxycarbonyl-gruppe aus verschiedenen Aminosäuren

90,9 mg (0,20 mMol) N-2-(p-Biphenylyl)-isöpropyloxycarbonyl-L-valin-cyclohexylamrnoniur.isalz werden bei 25 in 2,0 ml 80 ^iger Essigsäure gelöst. Nach verschiedenen Zeiten Werden Proben von 0,20 ml entnommen, in 4 ml Dimethylformamid gegeben und mit 0,1-n. Perchlorsäure in Eisessig titriert. In 3 1/2 Stunden ist die Schutzgruppe quantitativ, abgespalten.

Auf gleiche V/eise werden die Spaltzeiten in 80 $iger Essigsäure von folgenden Verbindungen bestimmt:

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N-2-(p-BiphenyIyI)-isopropyloxycarbony1- Aminosäure	Quantitative Ab spaltung in Stun den
Glycln-dlcyclohexylammoniumsalz	3 1/2
L-Leuclri · .·	3
!,-Prolin-dicyclohexylamrnoniumsalz	3 2/3
N^-tert.-Butyloxycarbonyl-L-lysin-di-
cyclohexylammoniumsalz	4 2/3
L-Tyrosin-cyclohexylammoniumsalz	2 1/3
L-Phenylalanin-dicyclohexylammoniumsalz	3 1/2
L-Glut.aminsäure~7-tert.-butylester-cyc-
lohexylanimoniumsalz · .	4 1/5
L-Serin-tert.-butyläther-cyclohexyl-.
ammoniumsalz .	3

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Beispiel 7 :

Abspaltung der N-2- (p-Biphenylyl) - isopropyloxy carbony !-Gruppe aus N -2-(p-Diphenyl)-lsopropyloxycarbonyl-Ir·~BGC-L~lysyl-N^-BOC-L-lysln-methylester

a) 2.60,0 mg N ~2~(p~ßiphenylyl)-isopropyloxycai:bonyl-• N^-BOC-L-lysyl-N^-BOC-L-lysin-msthylesfcer werden in 2,2 ml eines Geraisches aus Eises53ig-82,8 % Ameisensäure-Wasser* (.7:1:2, Vol.Teile) gelöst. Nach verschiedenen Zeiten werden Proben von 0,30 ^ra^ entnommen, in 4 ml Dimethylformamid gegeben und mit 0,1-N. Perchlorsäure in Eisessig titriert. Nach 55 Minuten ist die N^a-Schr.!:.sgruppe quantitativ abgespalten, während die N-BOC-Grvnpen nicht angegriffen sind.

b) 2^0 mg des obigen Dipeptidderivates werden in 1,7 ιώΙ Methylenchlorid gelöst und b^i ^ax^.tempsratur mit 1,5 inl einer Lösung von 57/5 S Chlor: ?sl>; säure in 12,5 nil '»vasser versetzt. Aus der homogenen Lb'£v/i:;·? wei'den nach ver-schiedsncn Zeiten Proben von 0,5 ml entnommen in 1,5 nil Methanol gegeben und sofort im System see.-Butanol-Eisessig-V/asser (67:10:-23) an Silieagel chromatographiert» Es zeigt sich,

cc

dass nach 15 Minuten die N -Schutzgruppe.voll-t^nc^g abgespalten ist und'die K^-B00~Grupp&n nicht ana.eiriffen si^cU Bas Ausgangsmaterlal .kc.nr. >'is folgt hergestellt

, ,Of-

an-ac:;i

809820/1185

Dimethylformamid werden bei -15° mit 0,125 ml. Pivaloylchlorid versetzt. Nach 15 minütigem Rühren bei -10° wird eine Lösung von 3²O mg (1 mMol) N -BOC-lysin-methylesteräoetat in 3 ml Dimethylformamid zugefügt und 2 Stunden bei 0° gerührt. Das Reaktionsgemisch v;lrd in Essigester aufgenommen, bei 0° mehrmals mit 0,1-M. Zitronensäurelösung, 2-N. Sodalösung und V'asser gewaschen, dann getrocknet und im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird in wenig Aether gelöst, worauf rasche Kristallisation einsetzt» Man. erhält 6j>2 mg N^a-2-(p~Biphenylyl)-isopropyloxycarbonyl- ' N^-BOC-lysyl-N^£-EOC-lysin-methylester vom P. 87 - 89° (Zersetzung). Nach !!^kristallisation aus Essigester-Petroläther verändert sich der P. nicht.

Beispiel 8 :

Abspaltung der N-2-(p~Biphenylyl)-isopropyloxycarbonyl-Gruppe aus N-2-^p~Biphenylyl)-isopropyloxycarbonyl-L-prolyl-L-leucyl-L-(γ-tert.-butylester)-glutamyl-L-phenylalanin-tert.-butylester

1,10 S N~2~(p-Biphenylyl)-isopropyloxycarbonyl-Pro-Leu-Glu(OtBu)~Phe-OtBu werden mit 6,5 ^ einer Mischung aus Eisessig-82,8 % Ameisensäure-V/asser (7:1:2) (Vol.) während 2 l/^]\ Stunden gerührt. Unter Eiskühlung wird mit

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gesättigter Pottaschelösung alkalisiert, mit Essi^ester extrahiert, neutral gewaschen, getrocknet und irr. Vakuum zur Trockne eingedampft. Der'Rückstand wird mit wenig Petroläther verrieben, dann aus 75 tigern Methanol u.~kristallisiert. Man erhält 0,65 S H~Pro-L-3U~Glu(OtBu)-Phe-OtBu vorn P. 188 - I9O⁰.

Das Ausgangsmaterial kann -wie folgt hergestellt werden: '.

5,35 g (10 mMol) N-2~(p-Biphenylyl)-isopropyloxycarbonyl-Prolin-dicyclohexylammoniurrjsalz in hO ml Dimethyl· formamid v.'erden bei -15° mit 1,25 ml Pivaloylehlorid versetzt. Nach 15 minütigem Rühren bei -10° wird eine Lösung ' von 5,8 g K-Leu-Glu(OtBu)-Phe-OtBu-acetat in 30 ml Dimethylformamid zugetropft und die Mischung 2 Stunden bei ■ 0° reagieren gelassen. Dann verdünnt man mit Essigester und schüttelt die Lösung bei 0 je zweimal mit Wasser, 0,1~M. Zitronensäurelösung, 2-N. Sodalösung und Wasser aus. Die Essigesterlösung wird nach dem Trocknen über Natriumsulfat zur Trockne eingedampft, der Rückstand in Aether gelöst und zur Kristallisation gebracht. Man erhält so 6,75 β N-2-(p-Biphenylyl)-isopropyloxycarbonyl-Pro-Leu~Glu(OtBu)-Phe~OtBu, das nach Umkristallisieren aus 85 tigern Methanol bei 188° (Zersetzung) schmilzt.

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-■ ?J\ -

Beispiel' 9 :

Anwendung der K-2-(p-Biphenylyl)-isöpropyloxycarbonyl-Gruppe •bei der Peststoffträger-Synthese

Herstellung von Carbobenzoxy-L-phenylalanyl-L-CN^-tert.-butyloxycarbonyl)-lysyl-glycin-hydrazld

• " 2,15 g BOC-Glycinharz (Styrol-Divinylbenzol-Copolymer enthaltend 0,25 w Aeq BOC-Glycin/g Harz = 0,5 mMol) werden 3 Minuten mit 10 ml Dioxan gerührt, dann filtriert. Nach Zugabe von 10 ml 4-N. Salzsäure in Dioxan wird J>0 Minuten bei Raumtemperatur gerührt und je dreimal mit 10 ml Dioxan und Methylenchlorid gewaschen, wobei jeweils 3 Minuten mit dem Lösungsmittel gerührt wird. Nun wird 10 Minuten mit 10 ml eines Gemisches von Methylenchlorid-Triäthyl« amin (9:1) gerührt und sechsmal mit 10 ml Methylenchlorid nachgewaschen, Das H-Glycin-Harz wird unter Methylenchlorid aufbewahrt.

0,83 g N -2-(p-Biphenylyl)-isopropyloxycarbonyl-N&-BOC~lysin~dicyclohexylammoniumsalz (1,25 mMol) werden in Methylenchlorid gelöst, bei 0° dreimal mit 0,2-M. Zitronensäurelösung und dreimal mit Wasser ausgeschüttelt. Die Methylenchloridlösung wird getrocknet, filtriert und im Vakuum auf wenige ml eingeengt. Diese Lösung wird zum obigen Harz gegeben, 5 Minuten gerührt, dann werden 290 mg Dicyclohexylcarbodiimid, gelöst in wenig Methylenchlorid,

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ORiGlNAu

zugefügt. Nach 3 stündigeni Rühren wird filtriert und je dreimal mit je 10 ml Methylenchlorid, Dimethylformamid, Dimethylformamid-Methanol (1:1) und Methylenchlorid gewaschen. Hierauf wird das N -2-(p-Biphenylyl)-isopropyloxycarbonyl-N^-BOC-Lys-Gly-Harz in 5 ml Methylenchlorid suspendiert und mit 3,7 ^l einer Lösung von 37/5 S Chloressigsäure in 12,5 nil V/asser versetzt« Es wird noch 1 1/2 Stunden gerührt, darauf wie oben mit Methylenchlorid, Dioxan, Methylenchlorid, Methylenchlorid-Triäthylamin (9:1) und Methylenchlorid gev.'aschen, Das erhaltene K-Lys (BOC)-GIy-Harz wird nach Zugabe von 0,37 g Carbobenzoxy-L-phenylalanin .. (Z-Phe-OH) in 8 ml Methylenchlorid 5 Minuten gerührt, dann mit 290 mg DicyclOhexylcarbodiimid in wenig Methylenchlc-■ rid versetzt und 3 Stunden gerührt. Das Z-Phe-Lys(BOC)-GIy-Harz wird wiederum wie oben filtriert und mit Methylenchlorid, Dimethylformamid, Dimethylformamid-Methanol (1:1), Methanol und Aethanol gewaschen. Hierauf wird das Harz mit 10 ml Aethanol-Hydrazinhydrat (3:1) 15 Stunden gerührt, abfiltriert und mehrmals mit Aethanol gewaschen. Die ver~' einigten Filtrate werden im Vakuum zur Trockne eingedampft und der Rückstand zur Entfernung des Hydrazinhydrats im Hochvakuum bei 50° über konzentrierter Schwefelsäure getrocknet. Den Rückstand löst man in 5 ml siedendem Aethanol, filtriert von wenig unlöslichem Material ab und versetzt in der*Wärme mit ca. I5 ml Wasser. Nach Animpfen

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lässt man langsam auf Raumtemperatur abkühlen. Das auskristallisierte Produkt wird abfiltriert und mit Aethanol-Wasser (1:3) gewaschen. Man erhält I85 mg Z-Phe-Lys(BOC)-GIy-NHNH₀ vom F. 163 -

Beispiel 10 :

Herstellung von L-Prolyl-L-tyrosyl~(Nr-tert.-butyloxycarbonyl)-L-rlysyl~L-methionin-hydrazid unter Verwendung der 2-p-Biphenj¹· Iy lisopropyloxy carboxylgruppe

a) 6,7 g (10 mMol) N^a-2-(p-Biphenylyl)~isopropyloxy~ earbonyl-NS-BOC-L-lysin-dicyclohexylammoniumsalz in ¹IO ml Dimethylformamid werden bei -15° unter Rühren mit 1,25 ml Pivaloylchlorid versetzt und 5 Minuten bei -10° gerührt. Darauf werden unter Ueberleiten von Stickstoff 2,0 g L-Methionin-methylester-hydrochlorid und 1,4 ml Triäthylamin zugefügt und 3 Stunden bei 0° gerührt. Man verdünnt mit Essigester, schüttelt bei 0 je dreimal mit 0,1-m. Zitronensäurelösung und bei Raumtemperatur mit 2-n. Kaliumcarbonatlb'sung und V/asser aus, trocknet und verdampft im Vakuum zur Trockne. Das Rohprodukt (6,5 g) wird in Chloroform durch eine Säule aus 150 g Kieselgel filtriert. Man erhält so 4,7 g N^a-2-(p-Biphenylyl)-isopropyloxycarbonyl-N -BOC-L-lysyl-L-methionin-methylester in Form eines farblosen Harzes, Rf = 0,55 in Chloroform-Aceton $$§£2 Q / 1 1 9 S

— T7 —

b) 3>15 g (5 ίηΜοΙ) dieses Dipeptide.?-ters werden mit ;;'O ml eines Gemisches aus Eisessig-32,8 £?iger Ameisensäure-Wasser (7;1:2; YoI) 1 1/2 Stunden gerührt, dann in eine Mischung von 50 ml Essigester und 20 ml gesättigter Kaliumcarbonatlösung bei 0° gegossen. Die Essigesterlösung wird mit Wasser gewaschen, getrocknet und schonend eingedampft. Der erhaltene N^BOC-L-lysyl-L-methionin-methylester ist unbeständig und muss sofort v:eiterverarbeitet werden.

c) Zu diesem Zweck wird der Rückstand unter Stickstoff bei 0 in 18 ml Acetonitril gelöst, mit einer Lösung von 2_Λ10 g (5 mMol) N^-Cp-Biphenylyl^isopropyloxycarbonyl-L-tyrosin (aus

■ dem Cyclohexylammoniumsalz mit Zitronensäure freigesetzt) in " 2 ml Dimethylformamid und 1,15 g Dicyclohexylcarbodiimid versetzt und 20 Stunden bei 0° gerührt. Der ausgefallene Dicyclohexylharnstoff wird abfiltriert, das Filtrat eingedampft, der Rückstand mit Aether-Petroläther verrieben, abfiltriert und aus Essigester-Petroläther umgefällt. Man erhält 2,8 g N-2-(p-Biphenylyl)-isopropyloxycarbonyl-L-tyrosyl-N -BOC-L-lysyl-L-methionin-methylester als dünnschichtchromatographisch ein-

heitliches Pulver; Rf = 0,2 in Chloroform-Aceton (8:2).

d) 2,38 S (3 mMol) dieses Tripeptidesters werden mit 30 ml eines Gemisches aus Eisessig-82,8 iuiger-Ameisensäure-Wasser (7:1:2; VoI) 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Die Lösung wird in Eiswasser -gegossen, zweimal mit Aether extrahiert, die wässrige "Lösung mit gesättigter Kaliumcarbonatlösung alkalisiert und mit Essigester extrahiert. Nach Ver-

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dampfen des Essigesters hinterbleiben 1,33 S L-Tyrosyl-N*- BOC-L-lysyl-L-methionin-methylester in Form eines farblosen Schaumes, Rf = 0,5 in Chloroform-Methanol (85:15).

e) 1,11 g (2 rnMol) dieses Tripeptidesters werden mit

0,?l g· (2 mHol) N-2-(p-Biphenylyl)-isopropyloxycarbonyl-L-prolin (aus dem Dicyclohexylammoniumsalz freigesetzt) in 6 ml Acetonitril gelöst, bei 0 mit Λ50 mg· Dicyclohexylcarbodiimid versetzt und l8 Stunden bei 0 gerührt. Der ausgefallene Dicyclohexylharnstoff wird abfiltriert, das Filtrat mit Essigester verdünnt, bei 0 dreimal mit 0,1-m. Zitronensäure, bei Raumtemperatur mit 2-n. Kaliumcarbonatlösung und Wasser ausgeschüttelt, getrocknet und im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der N-2-(p-Biphenylyl)~isopropyloxycarbonyl-L-prolyl-L-tyrosyl-N^-BOC-L-lysyl-L-methionin-methylester wird in quantitativer Ausbeute (1,8 g) erhalten.

f) Er wird mit 22 ml eines Gemisches aus Eise'ssig-82,8 J&Lger-Ameisensäure-Wasser (7:1:2) 1 Stunde· gerührt. Die Lösung versetzt man mit Eiswasser, extrahiert zweimal mit Aether, stellt die wässrige Lösung mit gesättigter Kaliumcarbonatlösung alkalisch und extrahiert, mit Essigester. Nach dem Trocknen verdampft man den Essigester im Vakuum vollständig. Zurück bleiben 1,02 g L-Prolyl-L-tyrosyl-N^-BOC-L-lysyl-L-methionin-methylester, Rf = 0,25 in Chloroform-Methanol (85:15). Das Produkt kann aus Acetonitril kristallisiert werden; P. 177 - l80°.

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g) . 326 mg (0,5 niMol) des. Tetrapeptidesters "werden in 1 ml heissem Methanol gelöst, unter Ueberleiten von Stickstoff bei Raumtemperatur mit 0,25 nil Hydrazinhydrat versetzt und verschlossen l8 Stunden stehen gelassen. Das auskristallisierte Produkt v/ird abfiltriert und. mit V/asser gewaschen. Man erhält 225 mg L-Prolyl-L-tyrosyl-N -BOC-L-lysyl-L-methioninhydrazid vom F. 206 - 207°.

Beispiel 11 :

Herstellung von L-Prolyl-L-tyrosyl-L-(N*-tert.-butyloxycarbonyl)· lysyl-L~methionin-hydrazid nach der Feststoffträgersynthese unter Verwendung der 2-(p- Biphenylyl)-isopropyloxycarbonylgruppe.

a) ^,9 S BOC-Methioninharz (Styrol-Divinylbenzol-Copolymer enthaltend 0,18 m Aeq. BOC-inethionin/g Harz = 0,88 mMol) vierden in einem 50 ml Reaktionsgefäss nach Merrifield unter Stickstoff nacheinander mit folgenden Reagenzien geschüttelt, die jeweils wieder abfiltriert werden:

1. mit 25 ml Dioxan während 4 Minuten;

2. mit 20 ml 4-n. HCl in Dioxan während βθ Minuten;

3. 3 mal mit je 20 ml Dioxan je 3 Minuten; ' . ■

¹I. 3 mal mit je 20 ml Aethanol je 3 Minuten; ·

5. 3 mal mit je 20 ml Chloroform je 3 Minuten;

6. mit 20ml Chloroforrn-Triäthylamin (9:1) während 10 Minuten;

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7. 3 roal mit je 20 ml Chloroform je 3 Minuten;

8. 4 mal mit je 20 ml Methylenchlorid je 3 Minuten.

Das erhaltene Methioninharz wird methylenchloridfeucht aufbewahrt (enthält total 17 ml Methylenchlorid). Aus 1j87 g N -2-(p-Biphenylyl)-isopropyloxycarbonyl-N -tert.-butyloxycarbonyl-L-lysin-dicyclohexylammoniumsalz wird_ wie im Beispiel .9 beschrieben das geschützte L-Lysin freigesetzt. Die erhaltene Methylenchloridlösung wird zum obigen Harz gege-

ben, 10 Minuten geschüttelt, dann eine Lösung von 730 mg Dicyclohexylcarbodiimid in 3 ^ml Methylenchlorid zugefügt und das Ganze während ¹I Stunden geschüttelt. Das Harz wird darauf wie folgt unter Schütteln gewaschen:

3 mal mit je 20 ml Methylenchlorid (je 3 Minuten); 3 mal mit je 20 ml Methanol (je 3 Minuten) und 3 mal mit je 20 ml Methylenchlorid (je 3 Minuten).

Das erhaltene N^a-2-(p-Biphenylyl)-isopropyloxycarbonyl-N^£-BOC-L-lysyl-L-methionin-harz (enthält I7 rrl Methylenchlorid) wird zur Abspaltung der N^a-2-(p-Diphenyl)-isopropyloxycarbonyl-gruppe mit 12,6 ml einer 75 ^igen wässrigen Chloressigsäurelösung versetzt und 1 1/2 Stunden geschüttelt. Das Harz wird abfiltriert und unter Schütteln wie folgt gewaschen:

3 mal mit je 20 ml Methylenchlorid (je 3 Minuten);

4 mal mit je 20 ml Aethanol (je 3 Minuten); 1 mal mit 25 ml Chloroform (3 Minuten); 1 mal mit 20 ml Chloroform-Triäthylaiiiin (9:1) (10 Minuten);

609820/1195 " '

3 mal mit je 20 ml Chloroform (je 3 Minuten); 3 mal mit je 20 ml Methanol (je 3 Minuten) und 3 mal mit je 20 ml Methylenchlorid (je 3 Minuten).

Das erhaltene N^-BOC-L-lysyl-L-methioninharz wird nun auf analoger V/eise wie oben mit N-2-(p- Biphenylyl)-isopropyloxycarbonyl-L-tyrosin umgesetzt. Zu diesem Zweck werden 1,6 g des Cyclohexylammoniurnsalzes dieser Verbindung bei 0° mit 25 ml Essigester und 20 ml 1-m, Zitronensäurelösung gerührt, bis alles gelöst ist. Die wässrige Schicht wird abgetrennt, die Essigesterlösung gewaschen, getrocknet und im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der kristalline Rückstand wird in 1 ml Dimethylformamid gelöst, mit 10 ml Methylenchlo-rid verdünnt und die Lösung zum obigen Harz gegeben. Gleichzeitig werden noch 710 mg Hydroxysuccinimid zugefügt. Nach . 10 minütigem Schütteln wird eine Lösung von 700 mg Dicyclohexylcarbqdiiinid in 5 ml Methylenchlorid zugegeben und 4 Stunden geschüttelt. Anschliessend wäscht man das Harz wie oben beschrieben mit Methylenchlorid, Methanol und Methylenchlorid» Auch zur Abspaltung der N-2-(p-BiphenyIyI)-isopropyloxycarbonylgruppe mit Chloressigsäure verfährt man genau nach dem

obigen Verfahren. Man erhält so das L-Tyrosyl-N -BOC-L-lysyl-L-methioninharz, das mit N-2-(p-Diphenyl)-isopropyloxycarbonyl-L-prolin in Methylenchlorid (erhalten aus einer Lösung von 1,3^ S des Dicyclohexylammoniumsalzes in Methylenchlorid durch Freisetzen mit Zitronensäure) kondensiert wird. Die erhaltene Methylenchlori'dlösung wird 10 Minuten mit dem Harz geschüttelt, dann eine Lösung von 580 mg Dicyclohexyl-

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carbodiimid in 5 nil Methylenchlorid zugegeben und 18 Stunden

geschüttelt. Man filtriert das Harz ab, wäscht gleich aus wie oben beschrieben und spaltet die N~2-(p-Biphenylyl)-isopropyloxycarbonylgruppe mit Chloressigsäure ab. Nach den üblichen Waschprozessen wird das erhaltene L-Prolyl~L-tyrosyl~ N^-BOC-L-lysyl-L-methionin-harz mit 20 ml Aethanol geschüttelt, filtriert und unter einem schwachen Stickstoff-Strom mit 7 nil Aethanol und 3 nil Hydrazinhydrat während 17 Stunden gerührt. Das Harz wird abfiltriert und zehnmal mit je 10 ml 95 tigern Aethanol ausgewaschen. Die vereinigten Filtrate dampft man im Vakuum bei 50° ein und trocknet den Rückstand im Hochvakuum über Schwefelsäure, Man löst das Rohprodukt in 25 nil 0,1-η. : Essigsäure und 80 ml Essigester, und schüttelt die wässrige Lösung noch zweimal mit je 50 ml Essigester aus. Die drei Essigesterlösungen extrahiert man noch zweimal mit je 10 ml 0,1-n. Essigsäure. Alle drei wässrigen Extrakte werden vereinigt und lyophilisiert. Die weitere Reinigung erfolgt, durch Chromatographie an 7 g CM-Sephadex mit Hilfe eines Gradienten, bestehend aus je 300 ml 0,01-m. und 0,05-m. Ammoniumacetat vom pH 6,5· Die reinen Fraktionen werden vereinigt und lyophilisiert. Man erhält 3^0 mg des Acetates von L-Prolyl-L-tyrosyl-N^·- BOC-L-lysyl-L-methionin-hydrazid. Das Produkt ist vollständig identisch mit dem im Beispiel 10 beschriebenen Produkt. Rf =.0,35 im Dünnschichtchromatografie im System s-Butanol-Eisessig-Wasser (57:10:23). Nach Freisetzen aus dem Acetat mit Kaliumcarbonatlösung kristallisiert das Produkt aus wässrigem Methanol, F. 206 - 207° (Zers.).

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Beispiel 12 :

Herstellung von N-2-(p-Biphenylyl)-isopropyloxycarbonyl-L-leucyl'-L-valyl-S-trityl-L-cysteinyl-glycyl-L-glutaminsäure-ditert.-butylester.

Der als Ausgangsmaterial benötigte S-Trityl-L-cysteinyl-glycyl-L-glutaminsäure-di-tert.-butylester kann folgendermassen hergestellt werden: Aus Carbobenzoxy-glycin und L-GIutaminsäure-di-tert.-butylester wird mit der gemischten Anhydridmethode Carbobenzoxy-glycyl-L-glutaminsäure-ditert.-butylester erhalten, F. 74 - 76 . Der daraus durch Hydrieren gewonnene Glycyl-L-glutaminsäure-di~tert.-butylester Yfird mit N,S-Di-trityl-L-cystein und Dicyclohexylcarbodiimid umgesetzt und liefert N,S-Di-trityl-L-cysteinyl-glycyl-L-glutaminsäure-di-tert.-butylester, P. 98 - HO . Durch Abspaltung der N-Tritylgruppe mit 80 i&Lger Essigsäure erhält man S-Trityl-L-cysteinyl-glycyl-L-glutaminsäure-di-tert.-butylester.

N-2-(p-Biphenylyl)-isopropyloxycarbonyl-L-valin (aus 1,91 S (^2 mMol) des Cyclohexylammoniumsalzes mit Zitronensäure freigesetzt) löst man in 20 ml Essigester, gibt 0,59 ^m]L (4,2 mMol) Triäthylamin und, nach Abkühlen auf -10°, 0,56 ml (4,2 mMol) Chlorkohlensäure-isobutylester zu. Nach 10 minütigern Rühren bei -10° tropft man eine Lösung von 2,78 g (4,2 des obigen Tripeptiddiesters in 25 ml Essigester zu und

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rührt noch 15 Minuten bei -10° und 1 Stunde bei Raumtemperatur. Nach Verdünnen mit Essigester schüttelt man bei 0 mit 0,5-m. Zitronensäure, 1-n. Natriumhydrogencarbonat und Wasser aus., trocknet und dampft zur Trockne ein. Der Rückstand, aus Aceton-Aether kristallisiert, ergibt 2,9lSN-2-(p-Biphenylyl)-isopropyloxycarbonyl-L-valyl-S-trityl-L-cysteinyl-glycyl-L-glutaminsäure-di-tert.-butylester vom P. 184 - 186 . Rf = 0,6 in Chloroform-Methanol (95:5).

1 g (l mMol) dieses Tetrapeptidesters werden mit 10 ml einer Mischung aus Eisessig-82,8 '.$ iger Ameisensäure-Wasser (7:1:2, VoI) 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Nach Versetzen mit 10 ml V/asser und 40 ml Chloroform wird bei 0 mit konzentriertem Ammoniak alkalisiert, die Chloroformlö-. · sung abgetrennt, gewaschen, getrocknet und im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird mit Petroläther verrieben, wobei man 0,76 g L-Valyl-S-trityl-L-cysteinyl-glycyl-L-glutaminsäure-di-tert.-butylester als dünnschichtchromatographisch einheitliches OeI erhält. Rf = 0,25 in Chloroform-Methanol (95:5)· Zu 370 mg (1 mMol) N-2-(p-Biphenylyl)-isopropyloxycarbonyl-L-leucin und 768 mg des obigen Tetrapeptidesters in 7 ml Tetrahydrofuran werden bei 0° 238 mg Dicyclohexylcarbodiimid zugegeben und h Stunden bei 0 gerührt. Nach Abfiltrieren des Dicyclohexylharnstoffs wird mit Essigester verdünnt, bei 0° mit 0,5-m. Zitronensäure, 1-n. Natriumhydrogencarbonat und V/asser gewaschen, getrocknet und eingedampft. Durch Eluieren mit Essigester bei der Chromatographie

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an Sllicagel werden 775 mg N-2~(p-Bl_Phenylyl)-isopropyloxycarbonyl-L-leueyl-L-valyl-S-trityl-L-cysteinyl-glycyl-L-glutaminsäure-di-tert.-butylester als einheitliches Produkt erhalten. Rf = 0,55 in Chloroform-Methanol (9:1); Rf = 0,63 in Toluol-Aceton (1:1).*

Beispiel 13 :

Einführung der 1,1-Biphenylyl-äthoxycarbonylgruppe.

8,2 g Biphenylyl-methyl-carbinol, 5,35 g Isocyanate essigsäureäthylester und 4 ml Pyridin werden 48 Stunden auf 50 erhitzt. Die Lösung wird mit 100 ml Aether verdünnt, bei 0° mit 0,1-m. Zitronensäurelösung und V/asser ausgeschüttelt,. über Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum vollständig eingedampft,. Man erhält 10,6 g eines zähen OeIs, bestehend aus 1,1-Diphenyl-äthoxycarbonyl-glycin-äthylester; Rf = 0,7 im Dünnschichtehromatogramm in Chloroform-Methanol (95:5)·

Beispiel 14 :

Abspaltung der 1,1-Biphenylyl-äthoxy-carbonylgruppe.

207/8 mg 1, l-Biphenylyläthoxycarbonyl-glycin-äthyl-

ester werden bei 25° in 3A5 ml 8o iiiger Essigsäure gelöst.

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Nach verschiedenen Zeiten werden Proben von 0,20. ml entnommen., in 4 ml Dimethylformamid gegeben und der freigesetzte Glycinäthylester mit 0,1-n. Perchlorsäure titriert. Die Halbwertszeit für die Abspaltung der Schutzgruppe beträgt ca. Minuten. Mach 5 Stunden ist die Abspaltung quantitativ.

Beispiel 15 :

Einführung der 1,1-Bipb.enylyl-propyloxycarbonylgruppe.

3,2 g Biphenylyl-Mthyl-carbinol, 1,9 g Isocyanatesslgsäureäthylester und 1,6 ml Pyridin werden J2 Stunden auf 50° erwärmt. Die Lösung wird mit 50 ml Aether verdünnt, bei 0 mehrmals mit 0,1-m. Zitronensäurelösung und Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum "vollständig eingedampft. Nach Abtrennung von 2,3 g Biphenylyläthylcarbinol mittels Petroläther wird der 1,1-Biphenylyl-pro· pyloxycarbonyl-glycin-äthylester als OeI erhalten; Rf = 0,2 im Dünnschichtchromatogramm in Chloroform.

609820/1195 bad original

Beispiel ΐβ :

Abspaltung der 1, l-Biphenylyl-propyloxycarbonylgruppe.

^09 mg l^l-Biphenylyl-propyloxycarbonyl-glycin-äthyleste'r werden bei 22° in 80 fbiizer Essigsäure gelöst. Nach verschiedenen Zeiten werden Proben von 0,5 ml entnommen, in k ml Dimethylformamid gegeben und der freigesetzte Glycinäthylester mit 0,1-n. Perchlorsäure titriert. Die Halbwertszeit für die Abspaltung der Schutzgruppe beträgt ca..50 Minuten. Nach 8 Stunden ist die Verbindung quantitativ gespalten.

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Claims

58 - Paten bansprüf he:

1. Verbindung der Formel II

² I
R₃

worin R.. für Nioderall-ryl mit höchstens 5 Kohlenstoffatoiaen, R₂ für Niederal3:yl mit hochπtons 5 Kohlenstoffatcir.cn oder Phenyl und H₇ für Phenyl steh·; und worin die Phenylreste unsubstituiert oder durch ein oder zwei Niederalkylgruppen mit höchstens 5 Kohlenstoffatomen, Phenylgruppen oder Niederalkylpherryl gruppen r:iit höchstens 5 Kohlenstoffatomen in der Niederalkylgruppe substituiert sind und X für die Gruppe -NH-NK₂, -N- oder die Phenylcxygruppe steht.

2. Verbindungen gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass R₁ und R₂ für Methyl, R₃ für Phenyl und X für -N₃ oder die Phenyloxygruppe steht.

3. Verbindungen gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass R, und R₂ für Methyl, R₃ für den p-Biphenylyl und X für -Ν-, oder die Phenyloxy gruppe steht.

4. Verbindungen gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass R₁ und R₂ für Methyl, R₃ für den p-Tolylrest und X für -No oder die Phenyloxygruppe steht.

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5. Verwendung einer Verbindung gemäss den Ansprüchen 2 bis 4 zur Einführung der Acylgruppe der Formel I

ι¹

Κ.Λ — C "* ü ■" GO ~ j

worin R,, R~ und R„ die angegebene Bedeutung haben, als Aminoschutzgruppe.

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