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Verfahren zur Herstellung neuer Oktapeptide
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4. N-Carbobenzyloxy-L-asparaginyl-nitro-L-arginyl-L-valyl-L-tyrosin (VII).
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- 5. N-Carbobenzyloxy-L-asparaginyl-nitro-L-arginyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-isoleucyl-L-histidyl- - L-prolyl-L-phenylalanin-methyl-ester (IX).
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7. L-Asparaginyl-L-arginyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-isoleucyl-L-histidyl- - L-prolyl-L-phenylalanin (XI).
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Wasser gewaschen.
(Volumen der wässerigen Lösungen je 60 ml, immer mit Natriumsulfat gesättigt).
Nach Trocknen mit festem Natriumsulfat und Eindampfen im Vakuum erhält man 9, 9 g einer grösstenteils kristallinen Masse. Sie wird mit 100 ml heissem Wasser zerrieben, erkalten gelassen und filtriert. Der Rückstand (III) wiegt nach Trocknen im Hochvakuum bei 800 5,95 g (= 33% d. Th.) und weist einen Smp von 150 bis 1650 auf. b) Modifikation : Die Kondensation kann auch in Dioxan, ohne Gegenwart von Diäthylphosphit, ausgeführt werden.
Das bei der Bildung des Diäthylphosphitamids von Nitro-L-arginin-methylester entstan- deneTriäthylammoniumchlorid wird abfiltriert und das Filtrat direkt mit N-Carbobenzyloxy-L-asparagin kondensiert : Das Gemisch wird 2 h unter Rückfluss erhitzt, wobei ein Teil der Substanz als ölige Bodenschicht ungelöst bleibt.
Die Ausbeute beträgt, bei gleichen Mengen wie unter a), 6, 10 g Dipeptid vom Smp zirka 145-1600 (34go d. Th.).
Beispiel 2 : N-Carbobenzyloxy-L-asparaginyl-nitro-L-arginin (IV).
4,74 g (0,0099 Mol) N-Carbobenzyloxy-L-asparaginyl-nitro-L-arginin-methylester (III) vom Smp 165 - 1700 wird mit 11,0 ml In-Natronlauge versetzt und bei 220 1 h geschüttelt. Nach zirka 15 min ist die Hauptmenge gelöst. Nach weiteren 15 - 20 min beginnt Abscheidung eines voluminösen Niederschlages (Natriumsalz von IV). Der Niederschlag wird zum Schluss durch Zugabe von 20 ml Wasser gelöst, von einer Spur ungelöstem Material abfiltriert und dann CO2 eingeleitet bis das PH der Lösung = 8, 5 ist.
Die wässerige Phase wird sodann zweimal mit je 80 ml Essigester gewaschen und die Essigesterlösungen werden einmal mit wenig Natriumbicarbonatlösung gewaschen.
Die wässerige Phase und die Waschbicarbonatlösung werden vereinigt, mit 2n-Salzsäure auf PH = 1 gebracht, wobei sich amorphes Material abscheidet. Letzteres wird durch einmaliges Ausziehen mit je 250 ml Essigester in Lösung gebracht ; die Essigesterlösungen werden zweimal mit wenig Natriumsulfatlösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und geben beim Eindampfen 4,46 g teilweise kristallinen Rückstand. Durch Kristallisation aus Acetonitril werden insgesamt 3, 26 g N-Carbobenzyloxy-
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L-asparaginyl-nitro-L-arginin(c = 1, 4 in Methanol).
Die Kristalle sind löslich in Methanol, Dimethylformamid, heissem Acetonitril und heissem Wasser, schwer löslich in kaltem Wasser und Acetonitril, Essigester, Tetrahydrofuran, Aceton ; leicht löslich in gesättigter Natriumbicarbonatlösung.
Be is p i el 3 : N-Carbobenzyloxy-L-asparaginyl-nitro-L-arginyl-L-valyl-L-tyrosin-methylester (VI).
3, 72 g (13 mMol) frisch bereiteter L-Valyl-L-tyrosin-methylester (V) und 5, 47 g (11,8 Mol) Carbobenzyloxy-L-asparaginyl-nitro-L-arginin (IV) werden in 35 mIDimethylformamid gelöst und 2, 52 g (12, 3 mMol) 1,3-Dicyclohexylcarbodiimid zugegeben. Nach 24 h bei 210 wird der ausgeschiedene Dicyclohexylharnstoff abgenutscht und das Filtrat bei 0, 1 mm Hg und 45 Badtemperatur vollständig vom Dimethylformamid befreit. Das hinterbleibende Öl wird zuerst mit Petroläther, dann unter Eiskühlung mit verdünnter Bicarbonatlösung, Wasser, verdünnter Salzsäure und Wasser gewaschen, wobei das anfänglich ölige Produkt langsam körnig wird. Das Rohprodukt (8,79 g) wird zur weiteren Reinigung aus heissem Methanol umgefällt und das in Methanol unlösliche Pulver mit heissem Aceton verrieben.
Dabei werden 2, 91 g (33%) Carbobenzyloxy-L-asparaginyl-nitro-L-arginyl-L-valyl-L-tyrosin-methylester (VI) vom Smp
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Der als Ausgangsmaterial verwendete L-Valyl-L-tyrosin-methylester (V) wird wie unten (Beispiel 9) beschrieben, bereitet.
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(VI) werden gelöst in 30 ml Dimethylformamid und innerhalb 15 min insgesamt 100 ml 1/lOn-Natronlauge in mehreren Anteilen zugegeben, wobei darauf geachtet wird, dass das PH der Lösung 11 nicht über-
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Flocken abfiltriert und das klare Filtrat unter Kühlung mit 2n-Salzsäure angesäuert. Das ausgeschiedene, zähe Produkt wird beim Verreiben (unter Eiskühlung) fest. Das Rohprodukt (2, 14 g) wird in heissem Methanol gelöst und durch Zugabe von Acetonitril ausgefällt.
Es werden 1, 77 g (70%) Carbobenzoxy-L-aspa- raginyl-nitro-L-arginyl-L-valyl-L-tyrosin (VII) als Pulver erhalten, Smp zirka 175 - 1830 (Aufschäumen) ;
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gelöst in 15 ml Dimethylformamid und eine Lösung von 0,62 g (2,62 mMol) 1-Cyc1ohexyl-3-morpholi - nyläthyl-carbodümid zugegeben. Die Lösung wird 21 h bei 200 belassen, hierauf das Dimethylformamid im Hochvakuum entfernt und das zurückbleibende 01 mit Wasser unter Eiskühlung zerrieben, wobei es allmählich körnig wird. Das Pulver wird mehrmals mit Wasser, dann mit verdünnter Bicarbonatlösung und Wasser gewaschen und getrocknet.
Das Rohprodukt (3, 70 g) wird zur weiteren Reinigung mit Aceton und Methanol gewaschen und ergibt 0, 68 g N-Carbobenzyloxy-L-asparaginyl-nitro-L-arginyl-L-valyl-L-tyro-
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(c = 0,52 in Dimethylformamid). Das Produkt ist schwerlöslich in den gebräuchlichen organischen Lösungsmitteln ausser in Dimethylformamid ; löslich in sehr verdünnter Salzsäure.
Der als Ausgangsmaterial verwendete L-Isoleucyl-L-histidyl- L-prolyl-L-phenylalanin-methylester (VIII) wird wie unten (Beispiel 15) beschrieben bereitet.
Be is p i el 6 : L-Asparaginyl-L-arginyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-isoleucyl-L-histidyl- -L-prolyl-L-phenylalanin-methylester (X).
370 mg (0, 3 mMol) Carbobenzyloxy-L-asparaginyl-nitro-L-arginyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-isoleucyl- - L-histidyl-L-prolyl-L-phenylalanin-methylester (X) werden in 15 ml Methanol suspendiert und durch Zugabe von 1, 0 ml 1, 24n (4 Aeq.) Salzsäure in Methanol in Lösung gebracht. Eine Spur Flocken wird durch Filtration entfernt und die Lösung in Gegenwart von 100 mg Palladiumkohle (10go Pd) bei Zimmertemperatur und Normaldruck hydriert (unter Verwendung eines zweiten, mit verdünnter Natronlauge gefüllten Hydriergefässes zur Absorption des entwickelten C02). Die Hydrierung ist nach 13 h und Aufnahme von etwas mehr als der berechneten Menge Wasserstoff beendet. Die Lösung wird hierauf vom Katalysator abfiltriert. und im Vakuum zur Trockene eingedampft.
Der Rückstand (Harz) wiegt 310 mg (berechnet für ein Gemisch aus äquimolaren MengenTrihydrochlorid und Ammoniumchlorid = 360 mg). Das Produkt (X) wird ohne Reinigung weiterverarbeitet. Es ist leicht löslich in Wasser, aber schwerlöslich in wässerigem Alkali ; löslich in Methanol, unlöslich in Äther.
Beispiel 7 : L-Asparaginyl-L-arginyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-isoleucyl-L-histidyl- - L-prolyl-L-phenylalanin.
Zur Lösung von 256 mg (25 mMo1) L-Asparaginyl-L-arginyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-isoleucyl-L-histidyl- - L-prolyl-L-phenylalanin-methylester in 12, 0 ml 66%Methanol wird in mehreren Anteilen 0, 1n-Natron-
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gebracht, eine flockige Fällung (25 mg) durch Filtration entfernt und das Filtrat im Vakuum von Methanol befreit. Die wässerige Lösung (Volumen 15 ml) wird mit einigen ml verdünnter Sodalösung versetzt und bei PH = 9 viermal mit je 100 ml wassergesättigtem n-Butanol ausgeschüttelt. Die Butanol-Auszüge werden einmal mit 8 ml verdünnter Natriumsulfatlösung gewaschen, mit Natriumsulfat getrocknet und geben beim Eindampfen 195 mg Rohprodukt. Dieses wird dreimal mit je 5 ml trockenem n-Butanol gewaschen, wodurch sich 30 mg leichter lösliche Anteile entfernen lassen.
Die Hauptmenge (135 mg) L-Asparaginyl-L-arginyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-isoeucyl-L-histidyl-L-propyl-L-phenylalanin ist in trockenem Butanol schwerlöslich und wird in Form eines farblosen, feinkörnigen Beschlages erhalten. Das Produkt ist löslich in Wasser und Methanol.
Das Rohprodukt (135 mg) wird einer 32stufigen multiplikativen Verteilung (Craig-Grundprozess) im System n-Butanol-Wasser unterworfen. Die Hauptmenge (75 mg) des wirksamen Materials befinden sich in den Fraktionen 9 - 21 mit einem Maximum bei Fraktion 15 (G = 0,89). Die Fraktionen 0 - 8 enthalten 45 mg einer langsamer wandernden, inaktiven Verunreinigung ; die Fraktionen 22 - 32 enthalten zirka 20 mg inaktives Material. Eine Probe der Substanz aus Fraktion 15 wirkt an der Ratte in der Versuchsanordnung von Peart zweimal so stark wie Noradrenalin (0, 25 y/kg in 0, 1 ml physiologischer Kochsalzlösung intravenös entsprechen 0, 5 y Noradrenalin).
Das Material aus den Fraktionen 9 - 21 wird vereinigt und nochmals gleich wie oben verteilt. Aktivität findet sich wiederum in den Fraktionen 9 - 22, welche insgesamt 32 mg'Material enthalten (Maximum in Fraktion 16). Die'Fraktionen. 0 - 8 enthalten noch 20 mg inaktives Material, die Fraktionen 23 bis 32 noch zirka 15 mg inaktives Material.
Eine Probe der Substanz aus Fraktion 16 erweist sich im obigen Test als fünf- bis zehnmal stärker wirksam als Noradrenalin.
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Das Material aus den Fraktionen 9 - 22 wird wieder vereinigt und im System n-Butanol-4% Essigsäure in 30 Schritten verteilt (Craig-Grundprozess). Nach Beendigung des 30. Verteilungsschrittes wird das PH aller Fraktionen durch Zugabe von etwas methanolischer Ammoniaklösung auf 5,5 - 6,0 gebracht, die Lösungen bei 400 und vermindertem Druck zur Trockene verdampft und die Eindampfrückstände zur Entfernung von Ammoniumacetat 8 h bei 500 und 0,01 mm Hg getrocknet. Die Fraktionen 0 - 6 enthalten insgesamt 30 mg Substanz (Maximum bei Fraktion 1, K = 0, 051) ; die Fraktionen 7-30 enthalten. keine wägbaren Anteile. Die experimentell gefundene Gewichtsverteilungskurve in den Fraktionen 0 - 6 stimmt mit der theoretisch berechneten überein.
Eine Probe der Substanz aus Fraktion 1 zeigt im oben angegebenenTest von Peart eine fünfmal stärkere Wirksamkeit als Noradrenalin. Das so gereinigte L-Asparaginyl-L-arginyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-isoleucyl-L-histidyl-L-prolyl-L-phenylalanin wird in Form eines farblosen Pulvers erhalten ; Smp (nach Trocknen im Hochvakuum) 195 - 2050 (Zers.). Im Papierchromato-
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tiven Substanzen nachweisbar.
Beispiel8 :L-Asparagyl-L-arginyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-isoleucyl-L0histidyl- - L-prolyl-L-phenylalanin.
5 mg L-Asparaginyl-L-arginyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-isoleucyl-L-histidyl-L-prolyl-L-phenylalanin (XI) werden in 0, 1 ml konz. HCI gelöst und 100 min bei 390 stehen gelassen. Dann wird die Lösung im Hochvakuum zur Trockene verdampft, der Rückstand pulverisiert und bei 400 im Hochvakuum getrocknet. Das
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Eine Lösung von 68, 1 g (0, 275 Mol) Carbobenzyloxy-L-valin und 50,9 g (0,261 Mol) L-Tyrosin-methylester in 1 l Tetrahydrofuran werden versetzt mit 59,2 g 1, 3-Dicyclohexylcarbodiimid und die Lösung 16 h bei 21 belassen. Hierauf wird der ausgeschiedene Dicyclohexylharnstoff abgenutscht (46,0 g entsprechen 77% d. Th.) (Smp 218-224 ) und das Filtrat zur Trockne verdampft. Der Rückstand (zähes Öl) wird mit 300 ml heissem Petroläther zerrieben, bis Kristallisation eintritt. Die Kristalle werden abgenutscht, mit viel heissem Petroläther gewaschen. Umkristallisation aus Aceton-Petroläther ergibt insge-
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(c = 1, 06 in Chloroform).
Aus der Petroläther-Lösung sowie aus der Mutterlauge obiger Kristalle werden insgesamt 17 g eines Nebenproduktes gewonnen, Smp 128-130 (aus Petroläther). Es handelt sich dabei um l- (Carbobenz-
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3-dicyclohexylharnstoff.sin-methylester werden in 200 ml einer l. ln-Lösung von Bromwasserstoff in Eisessig gelöst. Nach 1 h bei 210 wird das Gemisch im Vakuum bei 450 Badtemperatur zur Trockne eingedampft und das hinterbleibende Öl mit viel Äther verrieben, wobei es erstarrt.
Der Rückstand wird mit Äther gewaschen ; man erhält 17,26 g (98%)L-Valyl-L-tyrosin-methylester-hydrobromid; Smp 206 - 2080. Beim Umkristallisieren aus Methanol-Äther werden Nadeln vom Smp 208-2090 erhalten ; 1 (x-ID = +31 4 (c = 1, 08 in Methanol). b) L-Valyl-L-tyrosin-methylester : 5,63 g (15 mMol) des unter a) erhaltenen Hydrobromids werden in 80 ml Essigester suspendiert und 2, 1 ml (15 mMol) Triäthylamin zugegeben. Die ausgefallenen Kristalle von Triäthylaminhydrobromid werden nach 10 min abgenutscht (2, 68 g entsprechen 99% d. Th.) und das Filtrat zur Trockne verdampft. Der zurückbleibende L-Valyl-L-tyrosin-methylester (Harz 4, 61 g) wird sofort wie in Beispiel 3 angegeben, weiterverarbeitet.
Beispiel11 :N-Carbobenzyloxy-L-isoleucyl-L-histidin-methylester-hydrochlorid.
Zu einer Lösung von 44, 0 g (0, 26 Mol) L-Histidin-methylester in 50 ml Acetonitril werden 55, 5 g (0, 27 Mol) Dicyclohexyl-carbodiimid, gelöst in 100 ml Essigester, und 71, 5 g (0, 27 Mol) N-Carbobenzyloxy-L-isoleucin, gelöst in 700 ml Essigester, zugefügt. Es tritt sofort leichte Erwärmung und bald darauf Abscheidung von kristallinem Dicyclohexylharnstoff ein. Es wird kurze Zeit mit Eis gekühlt, so dass
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5 ml Eiswasser dazu, lässt 3 min reagieren und stellt die salzsaure Azidlösung mit 3 ml gesättigter Kaliumcarbonatlösung phenolphthalein-alkalisch. Die wässerige Lösung wird noch zwei weitere Male unter Eiskühlung mit viel Essigester extrahiert und die organischen Phasen mit Wasser neutral gewaschen.
Die eiskalte über Natriumsulfat getrocknete Azidlösung filtriert man in die frisch bereitete, auf 00 gekühlte und vom Triäthylaminhydrochlorid befreite Lösung von L-Prolyl-L-phenylalanin-methylester ; hergestellt aus 1, 24 g (0, 004 Mol) L-Prolyl-L-phenylalanin-methylester-hydrochlorid und 0, 55 ml (0,004 Mol) Triäthylamin in 15 ml abs. Essigester.
Man lässt 18 h bei 0 - 50 und 2 h bei Zimmertemperatur reagieren, dampft das Lösungsmittel bei 40 im Vakuum auf die Hälfte ein und wäscht mit ln-Salzsäure, eiskalter 2n-Sodalösung und mit Wasser neutral ; trocknet über Natriumsulfat und verdampft den Essigester im Vakuum.
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in Methanol).
Der N-Carbobenzyloxy-tetrapeptidester ist in den meisten organischen Lösungsmitteln, ausser Äther und Petroläther gut löslich.
Beispiel 16 : L-Isoleucyl-L-histidyl-L-prolyl-L-phenylalanin-methylester. a) Dihydrobromid : 1, 72 g (2, 61 mMol) N-Garbobenzyloxy-L-isoleucyl-L-histidyl-L-prolyl-L-phenyl- alanin-methylester werden versetzt mit 8, 3 ml1, ln-Bromwasserstoff in Eisessig, worauf alsbald Lösung eintritt. Nach zweistündigem Stehen bei 210 wird der Eisessig bei 0, 1 mm Hg und 250 vollständig abdestilliert und das zurückbleibende Harz mit Äther zerrieben, wobei es körnig wird.
Das rohe L-Isoleucyl- - L-histidyl-L-prolyl-L-phenylalanin-methylester-dihydrobromid wiegt 1,79 g, Smp 130-1400. b) freier Ester : 1,96 g (2,85 mMol) L-Isoleucyl-L-histidyl-L-prolyl-L-phenylalanin-methylester-dihydrobromid wird in wenig Wasser gelöst, eine geringe Trübung durch Waschen mit etwas Essigester entfernt, die wässerige Lösung mit 50 ml Chloroform versetzt und unter Eiskühlung gesättigte Pottaschelösung zugegeben, bis das PH der wässerigen Phase 10 beträgt. Der ausgeschiedene Ester löst sich beim Umschütteln glatt in der Chloroformphase. Die Chloroformlösung wird einmal mit wenig gesättigter Natriumsulfatlösung gewaschen ; Pottasche-und Natriumsulfatlösung werden mit weiteren 30 ml Chloroform nach- gewaschen.
Die Chloroformlösungen hinterlassen nach Trocknen mit Natriumsulfat und Eindampfen 1,31 g L-Isoleucyl-L-histidyi-L-prolyl-L-phenylalanin-methylester (VIII) als Harz, das sofort weiterverarbeitet wird (vgl. Beispiel 5) ; Ausbeute 88"/0.
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Eine Lösung von 467 mg (1 mMol) N-Carbobenzyloxy-L-asparaginyl-nitro-L-arginin und 272 mg (0,35 Mol) L-Valyl-L-tyrosyl-L-valyl-L-histidyl-L-prolyl-L-phenylalanin-methylester in 2, 5 ml Dimethylformamid wird mit 237 mg (1 mMol) l-Cyclohexyl-3-morpholinyläthyl-carbodiimid versetzt.
Nach 24stündigem Stehen bei Zimmertemperatur wird die Reaktionslösung bei 0, 1 mm Hg und 350 vom Dimethylformamid befreit. Der Rückstand wird mit Eiswasser verrieben und das abgeschiedene feste Material mit Wasser gewaschen und im Vakuum bei 300 getrocknet. Das Rohprodukt wird mit Aceton verrieben, darauf mit siedendem Aceton extrahiert und schliesslich mit eiskaltem Methanol gewaschen. Das so gereinigte Material (289 mg, 67%) ist ein schwach gelbliches Pulver vom F 207 - 2100.
Zur weiteren Reinigung wird die Substanz im Gegenstrom zwischen n-Butanol und 0,1%figer Essigsäure über 30 Schritte verteilt (K = 4, 17). Die Fraktionen 23 - 28 liefern 132. mg reines Produkt und die ein Nebenprodukt enthaltenden Fraktionen 17 - 22 (74 mg) ergeben nach nochmaliger Verteilung weitere 34 mg reines Material ; insgesamt 166 mg (39%). Nach zweimaligem Umfällen aus Methanol schmilzt
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; [a] -L-histidyl-L-prolyl-L-phenylalanin-methylester werden in 10 ml Methanol suspendiert, durch Zugabe von 0, 3 m Äquivalenten methanolischer Salzsäure in Lösung gebracht und in Gegenwart von 0, g Palla- diumkohle (10% Pd) bei Zimmertemperatur und Normaldruck während 15 h in einer Wasserstoffatmosphäre geschüttelt.
Die neutrale Lösung wird vom Katalysator abfiltriert und im Vakuum eingedampft. Das halb-
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feste Reaktionsprodukt wird mit Aceton gewaschen und ergibt nach Umfällen aus Methanol-Äther 51 mg (63%) Tri-Hydrochlorid des Oktapeptid-methylesters.
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allmählich mit 0,3 ml ln-Natronlauge (zirka 7 Äquivalente) versetzt, so dass die Lösung stets ein PH zwischen 10,5 und 11,5 zeigt. Nach weiteren 30 min wird die Lösung im'Vakuum bei Raumtemperatur vom Methanol befreit, mit ln-Essigsäure auf pH 7, 4 eingestellt und lyophilisiert. Das als Rückstand erhaltene Gemisch von freiem Peptid und anorganischen Salzen (79 mg) wird durch Gegenstrom-Verteilung im System Butanol/0, ln-Ammoniumhydroxyd fraktioniert.
Das reine Oktapeptid wird als farbloses Pulver erhalten, das in Wasser und Methanol löslich ist, schwerer in Äthanol und unlöslich in Aceton. b) 400 mg roher Oktapeptid-methylester (enthaltend zirka 3 Mol HCI+ 1 Mol NH C1) werden in 4 ml
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enthält, mit 4n-HCI auf pH = 6 eingestellt, mit Aceton-C02 gefroren und über Nacht im Hochvakuum lyophilisiert. Man erhält dabei 930 mg eines bräunlichen Pulvers, das neben dem Peptid zirka 590 mg KC1 enthält.
Die gesamte Menge wird über 30 StufenverteiltimSystemn-Butanol-0, 33m-NH COOH (Ammo- niumformiat)'in H 0 (pH 6,5). Phasenvolumen je 10 ml.
Das freie Oktapeptid zeigt G = 0, 17 und wird aus den vereinigten Röhrcheninhalten 0 - 8 isoliert durch dreimaliges Extrahieren mit je 400 ml eines Butanol-Methanol-Gemisches (3 : 1), und zweimaliges Waschen der organischen Lösung mit je 30 ml 55to NFLCOOH (Ammoniumformiat) in H20. Nach Eindampfen bei 450 (11- mm Hg) und Trocknen im Hochvakuum (8 h bei 400) erhält man insgesamt 190 mg eines weissen, in Wasser leicht löslichen Pulvers, das im biologischen Test an der nierenlosen Ratte eine zwanzigmal stärkere Wirkung als Noradrenalin zeigt.
Im Papierchromatogramm erweist sich die Substanz als einheitlich, mit einem Rf-Wert = 0, 19 im System sek.-Butanol-3oNH (120 : 44).
Als 2. Fraktion erhält man bei der Verteilung aus den Rohren 18-30 (G = 42) noch 140 mg unverseiftes Ausgangsmaterial zurück (-Oktapeptid-methylester). Rf-Wert im obigen System = 0,30. c) 500 mg Oktapeptid-methylester (gleiches Ausgangsmaterial wie bei a)) werden in 2 ml HC1 konzentriert gelöst und 100 min bei 390 stehen gelassen. Dann wird die Lösung im Hochvakuum zur Trockene eingedampft, der Rückstand fein pulverisiert und nochmals einige Stunden bei 400 im Hochvakuum getrocknet. Man erhält so 510 mg eines hellbraunen Rohproduktes, das an der nierenlosen Ratte bereits die zwanzigfache Wirkung von Noradrenalin aufweist.
Zur Reinigung werden 300 mg davon in 2 ml Wasser gelöst, mit 2n-NaOH auf PH 6 neutralisiert und über 30 Stufen verteilt im System n-Butanol-Methanol-0, 33m-NH COOH - 3 : 1 : 4 (PH 6,5), mit je 10 ml Phasenvolumen. Aus den Röhrchen 5 - 14 können durch Aufarbeitung wie unter a) 170 mg Hydrolysat als farblose, in Wasser lösliche Substanz gewonnen werden, die sich an der nierenlosen Ratte als zwanzigbis fünfundzwanzigmal aktiver als Noradrenalin erweist. Im Papierchromatogramm tritt im System sek.-Butanol-3%NH (120 : 44) eine Aufspaltung in 2 Verbindungen ein, mit den Rf- Werten 0, 13 und 0, 19. Der 2. Fleck zeigt die grössere Farbintensität mit Ninhydrin.
Die Verbindung mit dem Rf-Wert 0, 13 stellt das L-Asparagyl-L-arginyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-valyl-
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das Oktapeptid mit dem Asparaginylrest handelt.
Die Röhrchen 15 - 19 der Craig-Verteilung enthalten 55 mg Mischfraktion, während aus Röhrchen 20-29 22 mg Ausgangsmaterial regeneriert werden können (Rf = 0,30).
Ausser durch Craig-Verteilung über viele Stufen, lassen sich die beiden Hydrolyseprodukte (Asparaginyl-und Asparagyl-Verbindungen) auch durch Chromatographie an eine Säule aus Papierpulver mit ge-
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B. BuOH-MeOH-NHCOOH,1, 95 g (0,003 Mol) Carbobenzyloxy-L-valyl-L-tyrosyl-L-valyl-L-histidin werden in 10 ml Dimethylformamid suspendiert und mit 0, 83 g (0, 003 Mol) L-prolyl-L-phenylalanin-methylester und 0, 84 g : 0, 0035 Mol) 1-Cyclohexyl-3-morpholinyl-Äthyl-carbodiimid versetzt. Nach 1 h ist das Ausgangsmaterial vollständig gelöst. Die Reaktionslösung wird über Nacht bei Zimmertemperatur stehen gelassen, dann
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bei 0, 1 mm Hg vom Dimethylformamid befreit und der Rückstand mit Eiswasser versetzt.
Das ausgeschiedene feste Material wird zweimal mit 2n-Salzsäure gewaschen (wobei das Reaktionsprodukt ein Hydrochlorid bildet, das in Wasser löslich ist, jedoch nicht in 2n-Salzsäure), durch Behandlung mit 0, 5nKaliumcarbonat-Lösung wieder in die basische Form übergeführt, mehrmals mit Wasser gewaschen und im Vakuum bei 350 getrocknet. Das erhaltene Rohprodukt (2, 40 g) wird in 100 ml Aceton aufgenommen, von unlöslichem Material (0, 30 g) abfiltriert und im Vakuum eingedampft. Der Rückstand ergibt nach Verreiben mit Essigester 1, 57 g (58go) festes Material vom F 151 - 1560.
1 g dieser Substanz wird zur weiteren Reinigung durch Gegenstrom-Verteilung im System MethanolWasser 4 : 1/Chloroform-Tetrachlorkohlenstoff 1 : 1 über 48 Schritte verteilt. Die Hauptmenge des Materials (0, 84 g) befindet sich in Fraktionen 15 - 28 mit einem Gewichtsmaximum in Fraktion 21 (K = 0, 78).
Diese Fraktionen ergeben nach Umfällen aus Aceton 0, 66 g amorphes Material vom F 158 - 1620. Nach nochmaligem Umfällen aus viel Aceton zeigt die Substanz F 161 - 1630 und [a] p-56 2 (c = 1, 38 in Äthanol).
Das als Ausgangsmaterial verwendete Carbobenzyloxy-L-valyl-L-tyrosyl-L-valyl-L-histidin wird wie unten beschrieben (Beispiele 21/22) dargestellt.
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21 : L-Valyl-L-tyrosyl-L-valyl-L-histidyl-L-prolyl-L-phenylalanin-methylester.- methylester werden mit 1 ml Eisessig verrieben, bis eine einheitliche Lösung entsteht und mit 1, 9 ml 1, 6n-Bromwasserstoff (3 mMol) in Eisessig versetzt. Beim Stehen bei Zimmertemperatur beginnt sich das Reaktionsprodukt nach 10 min als Öl auszuscheiden. Das Gemisch wird während 2, 5 h geschüttelt und darauf bei 0, 1 mm Hg und 300 vollständig eingedampft. Der Rückstand ergibt nach Waschen mit Äther und Aceton 648 mg Di-Hydrobromid des Hexapeptid-methylesters als fast farbloses Pulver.
Zur Überführung in den freien Ester wird eine Lösung von 562 mg (0,6 Mol) dieser Substanz in 2 ml Wasser bei 00 mit gesättigter Kaliumcarbonatlösung stark alkalisch gestellt und viermal mit je 20 ml kal- tem Chloroform extrahiert. Die Chloroform-Auszüge werden mit wenig Wasser gewaschen, getrocknet und im Vakuum eingedampft. Der ölige Rückstand liefert beim Verreiben mit Äther 272 mg (59go) des Peptidesters als schwach gelbes Pulver, das direkt weiter umgesetzt wird.
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L-Valyl-L-histidin-methylester versetzt. Nach 15 h wird das ausgeschiedene Reaktionsprodukt abfiltriert und mit Acetonitril gewaschen.
Das Rohprodukt (11, 2 g = 7fi1/0) vom F 208 - 2110 wird in 500 ml heissem Methanol gelöst, die Lösung auf 100 ml eingeengt und mit dem gleichen Volumen Äther versetzt. Der ausgeschiedene reine Carbobenzyloxy-L-valyl-L-tyrosyl-L-valyl-L-histidin-methylester schmilzt bei 222 bis 2240. Nach Gegenstrom-Verteilung im System Methanol-Wasser 4 : 1/Chloroform - Tetrachlorkohlen-
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Das als Ausgangsmaterial verwendete N-Carbobenzyloxy-L-valyl-L-tyrosin wird nach Beispielen 24/25, der L-Valyl-L-histidin-methylester nach Beispielen 26/27 gewonnen.
Beispiel23 :N-Carbobenzyloxy-L-valyl-L-tyrosyl-L-valyl-L-histidin.
Eine Suspension von 3, 32 g (0, 005 Mol) Carbobenzyloxy-L-valyl-L-tyrosyl-L-valyl-L-histidin-me- thylester in 30 ml Methanol wird bei zirka 100 mit 15 ml ln-Natronlauge versetzt, worauf das Ausgangsmaterial rasch in Lösung geht. Die Reaktionslösung wird 2 h bei Raumtemperatur stehen gelassen, darauf im Vakuum vom Methanol befreit und-nach Abtrennung einiger Flocken durch Filtration - mit 20 ml 2n-Essigsäure angesäuert. Das ausgeschiedene gallertige Material wird abzentrifugiert, mehrmals in Wasser suspendiert und wiederum abzentrifugiert und schliesslich mit Aceton und Methanol gewaschen und im Vakuum bei 400 getrocknet. Das Carbobenzyloxy-L-valyl-L-tyrosyl-L-valyl-L-histidin wird in einer Aus-
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Lösungsmitteln ausser in Dimethylformamid und Eisessig.
Beispiel 24 : N-Carbobenzyloxy-L-valyl-L-tyrosin-äthylester.
Eine Lösung von 50, 2 g (0, 2 Mol) Carbobenzyloxy-L-valin und 41, 8 g (0, 2 Mol) L-Tyrosinäthylester
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bei Zimmertemperatur stehen gelassen. Das ausgeschiedene Gemisch von Di-cyclohexyl-harnstoff und dem Reaktionsprodukt wird abfiltriert und das Dipeptidderivat aus diesem Gemisch mit Essigester extrahiert. Die ursprüngliche Reaktionslösung wird im Vakuum eingedampft, der Rückstand in Essigester gelöst, diese Lösung mit 2n-Salzsäure, 2n-Natriumhydrogencarbonatlösung und Wassergewaschen, getrocknet
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und mit der obigen Essigesterlösung des ursprünglich ausgeschiedenen Reaktionsproduktes vereinigt.
Der beim Eindampfen im Vakuum erhaltene Rückstand kristallisiert bei Zugabe von Äther und liefert 74,5 g (84%) Carbobenzyloxy-L-valyl-L-tyrosin-äthylester vom F 142 - 1450. Durch Umkristallisieren aus Ace-
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Chloroform).
. Beispiel 25 : N-Carbobenzyloxy-L-valyl-L-tyrosin.
70,7 g (P, 16 Mol) Carbobenzyloxy-L-valyl-L-tyrosin-äthylester werden in 300 ml Methanol gelöst und unter Rühren innerhalb 15 min bei zirka 10 mit 400 ml ln-Natronlauge versetzt. Die klare Reaktionslösung wird 2 h bei Raumtemperatur stehen gelassen, dann im Vakuum von Methanol befreit und wenig festes Material abfiltriert. Beim Ansäuern des Filtrates mit verdünnter Salzsäure scheidet sich das Carbobenzyloxy-L-valyl-L-tyrosin inkristalliner Form aus und wird abfiltriert, mit Wasser gewaschen und
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beträgt 64, 01 g (9'lo).
B eis p iel 26 : N-Carbobenzyloxy-L-valyl-L-histidinmethylester.
Eine Lösung von 25, 1 g (0, 1 Mol) Carbobenzyloxy-L-valin und 16,7 g (0, 1 Mol) L-Histidinmethylester in 100 ml Acetonitril wird bei zirka 100 mit 26, 1 g 1-Cyclohexyl-3-morpholinyläthyl-carbodiimid (0,11Mol)versetztundbeiZimmerteinperaturstehengelassen.Nachzirka1hbeginntdieAbscheidung eines gelatineartigen Produktes, das nach 15 h abfiltriert und mit Acetonitril gewaschen wird : 30, 8 g (7Wo); F = : 152 - 1560. Der aus Aceton-Äther umkristallisierte Carbobenzyloxy-L-valyl-L-histidin-
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[ex] Beispiel27:L-Valyl-L-histidin-methylester.
10 g (0, 025 Mol) Carbobenzyloxy-L-valyl-L-histidin-methylesterwerden in 100 ml Methanol gelöst, mit einer Lösung von 0,03 Mol Salzsäuregas in Methanol versetzt und in Gegenwart von 2 g Palladiumkohle (10go Pd) bei Zimmertemperatur und Normaldruck hydriert (gebildetes C02 gleichzeitig in Natronlauge absorbiert). Nach Aufnahme der berechneten Menge Wasserstoff kommt die Hydrierung nach 1 h zum Stillstand. Der Katalysator wird abfiltriert und die Reaktionslösung im Vakuum eingedampft. Das als Öl (8,7 g) erhaltene Hydrochlorid der Base wird in wenig Wasser gelöst und nach Überschichten der Lösung mit Essigester unter Umschütteln bei 00 mit gesättigter Pottaschelösung stark alkalisch gestellt.
Die das Reaktionsprodukt enthaltende Essigesterphase wird getrocknet und im Vakuum eingedampft, und der als öliger Rückstand erhaltene L-Valyl-L-histidin-methylester (6,5 g) wird direkt weiter umgesetzt.
Beispiel 28 : N-Carbobenzyloxy-L-asparaginyl-nitro-L-arginyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-leucyl-
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bei Zimmertemperatur reagieren. Hierauf wird das Dimethylformamid im Hochvakuum entfernt und das zurückbleibende Öl fünfmal mit je 5 ml Wasser unter Eiskühlung verrieben, wobei es teilweise flockig wird.
Das Rohprodukt, 2, 4 g, wird zur weiteren Reinigung wiederholt mit viel eiskaltem Aceton und Methanol gewaschen und ergibt 250 mg Carbobenzyloxy-oktapeptidester. Aus den Aceton- und MethanolAuszügen werden noch weitere 180 mg Carbobenzyloxy-oktapeptidester gewonnen.
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L-prolyl-L-phenylalanin-methylester-L-histidyl-L-prolyl-L-phenylalanin-methylestes werden in 10 ml Methanol suspendiert und durch Zugabe von 1 ml l, 39n- (4 Äquivalente) Salzsäure in Methanol, in Lösung gebracht. Man filtriert die flockigen Verunreinigungen ab und hydriert die Lösung in Gegenwart von 250 mg Pd-Kohle (100/0 Pd) unter Normalbedingungen.
(Das gebildete CO, wird in einem zweiten Hydriergefäss mit verdünnter Natronlauge absorbiert.) Nach 4 1/2 h und Aufnahme von etwas mehr als der berechneten Menge Wasserstoff ist die Hydrierung beendet. Der Katalysator wird abfiltriert und die Lösung im Vakuum bei 400 zur Trockene eingedampft. Man erhält 360 mg Harz (406 mg berechnet für Trihydrochlorid und die äquimolare Menge Ammonchlorid).
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Das Produkt wird ohne weitere Reinigung weiterverarbeitet. Es ist in Wasser und Methanol gut löslich.
Beispiel 30 : L-Asparaginyl-L-arginyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-leucyl-L-histidyl- - L-prolyl-L-phenylalanin.
360 mg rohes L-Asparaginyl-L-arginyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-leucyl-L-histidyl-L-prolyl-L-phenyl- alaninester-trihydrochlorid werden in 10 ml 66%obigem Methanol gelöst und in Portionen mit 1/10n-Natronlauge versetzt, so dass der pH-Wert der Lösung während 20 min bei 10, 5 - 11 bleibt. (Totalverbrauch
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5Die wässerige Lösung wird viermal mit je 100 ml wassergesättigtem n-Butanol ausgezogen, die Buta- nol-Auszüge einmal mit 10 ml Natriumsulfatlösung gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Der
Verdampfungsrückstand wird dreimal mit je 3 ml trockenem Butanol gewaschen, wodurch sich 50 mg leicht lösliche Anteile entfernen lassen.
Man erhält 190 mg L-Asparaginyl-L-arginyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-leucyl-L-histidyl-L-prolyl- - L-phenylalanin, als feines leicht grau gefärbtes Pulver, das in Wasser und Methanol gut löslich ist.
Eine Probe des Rohproduktes zeigt an der Ratte eine gleich starke Wirkung wie Noradrenalin.
Beispiel 31 : L-Asparagyl-L-arginyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-leucyl-L-histidyl- - L- prolyl- L-pheny1alanin.
2,08 g (1, 75 mMol) einmal aus Methanol/Aceton umgefälltes L-Asparaginyl-L-arginyl-L-valyl- -L-tyrosyl-L-leucyl-L-histidyl-L-prolyl-L-phenylalanin-methylester-trihydrochlorid (vgl. Beispiel 28) erwärmt man in konz. HC1 während 85 min auf 370. Nach zirka 10 - 15 min tritt klare Lösung ein. Die Salzsäure wird rasch unter vermindertem Druck bei 250 abgedampft und der Rückstand über Kaliumhydroxyd und Phosphorpentoxyd im Hochvakuum getrocknet.
Die Ausbeute ist 2 g amorphes L-Asparagyl-L-arginyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-leucyl-L-histidyl-L-pro- lyl-L-phenylalanin-trihydrochlorid, das noch mit Ammoniumchlorid verunreinigt ist.
1, 26 g'des Rohproduktes werden in 20 ml Äthanol gelöst und das Peptid mit 120 ml Aceton wieder ausgefällt. Zwei weitere Umfällungen ergeben 1, 08 g weisses, körniges Oktapeptid-trihydrochlorid. Im Tierversuch zeigt das umgefällte Produkt die gleiche Aktivität wie Noradrenalin (Test nach Peart) und die doppelte Wirkung an der nierenlosen Ratte.
Eine Probe (200 mg) des umgefällten L-Asparagyl-L-arginyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-leucyl-L-histidyl- - L-prolyl-L-phenylalanin-trihydrochlorids wird nachCraig über 30 Stufen zwischen n-Butanol und 0,3 ml Ammoniumacetat 1 : 1 (PH = 6, 5 - 7) verteilt. G = 0, 67. Die Losungen dampft man im Vakuum bei 400 ein und sublimiert das Ammoniumacetat im Hochvakuum bei 400 während 30 min ab.
Die Fraktionen 7-16 (Maximum Fraktion 12) zeigen im Part-test die gleiche Aktivität wie das unverteilte Produkt.
Die Ammoniak- und Gesamtstickstoffbestimmungen zeigen, dass das Asparagin bei der sauren Verseifung zur Hauptsache zur Asparaginsäure verseift wurde. Qualitative Halogenproben zeigen, dass das Oktapeptid als Mono- oder Dihydrochlorid vorliegt.
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Die Lösung von 2, 1 g (0,005 Mol) N-Carbobenzyloxy-L-valyl-L-tyrosin in 10 ml trockenem Acetonitril versetzt man mit 1, 16 g (, Wo Überschuss) Dicyclohexylcarbodiimid und der Lösung von 2, 68 g (0, 005 Mol) L-Leucyl-L-histidyl-L-prolyl-L-phenylalanin-methylester in 10 ml Acetonitril. Dabei scheidet sich der Dicyclohexylharnstoff momentan aus. Nach zirka 5 h beginnt die Abscheidung des N-Carbobenzyloxy-hexapeptidesters als gallertige Masse. Man lässt 20 h bei Zimmertemperatur stehen und dampft anschliessend dasAcetonitril bei 400 unter vermindertem Druck ab.
Den Verdampfungsrückstand digeriert man mit 10 ml eiskaltem Methanol und wäscht fünf weitere Male mit je 1 ml gekühltem Methanol nach.
Das Methanol wird im Vakuum abgedampft und der Rückstand in Chloroform dreimal mit 2n-Salzsäure (fünf-und zweimal 2 ml), fünfmal mit je 2 ml eiskalter Natriumbicarbonatlösung und mit Wasser neutral gewaschen. Die über Natriumsulfat getrocknete Lösung wird auf die Hälfte eingeengt und einmal kurz mit Aktivkohle aufgekocht.
Vollständiges Abdampfen des Losungsmittels gibt 4, 2 g rohen N-Carbobenzyloxy-hexapeptidester, der noch mit wenig Dicyclohexylharnstoff verunreinigt ist. Der rohe Carbobenzoxyester wird in wenig kaltem Aceton gelöst, vom restlichen Dicyclohexylharnstoff abfiltriert und mit viel Äther wieder ausgefällt.
Man erhält 3, 7 g (79go) N-Carbobenzyloxy-L-valyl-L-tyrosyl-L-leucyl-L-histidyl-L-prolyl-L-phenyl- alanin-methylester.
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40 ml absolutem Äthanol gelöst, versetzt man mit 3 ml Hydrazinhydrat und lässt während 2 Tagen bei Zimmertemperatur reagieren. Das Lösungsmittel wird bei 400 im Vakuum abgedampft und der Rückstand mit 100 ml Wasser verrieben. Nach dreistündigem Stehen bei 00 filtriert man vom kristallinen Niederschlag ab, wäscht portionsweise mit 20 ml Wasser nach und trocknet das rohe Hydrazid über Schwefelsäure und Pros.
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8nur. in warmem Aceton ; in Essigester ist es unlöslich.
Beispiel 37 : N-Carbobenzyloxy-L-leucyl-L-histidin-methylester.
Zu einer Lösung von 16, 9 g (0, 1 Mol) L-Histidin-methylester und 21,6 g (0, 105 Mol) Dicyclohexyl- - carbodiimid in 100 ml absolutem Essigester und 20 ml Acetonitril werden 26, 5 g (0, 1 Mol) N-Carbo- benzyloxy-L-leucin, gelöst in 200 ml absolutem Essigester, auf einmal zugegeben und das bald zu einer Gallerte erstarrende Gemisch während 30 min bei Raumtemperatur geschüttelt. Nach Stehenlassen über Nacht wird aus der krumeligen Masse das Lösungsmittel so gut wie möglich abgesaugt (unter mehrmaligem Zerreiben des Filterrückstandes mit ein wenig frischem Essigester) und im Vakuum bei 900 getrocknet. Man erhält 47,8 g eines Gemisches von Dicyclohexyl-harnstoff und Dipeptid, aus welchem letzteres mit 3 Portionen von je 50 ml kaltem Methanol herausgelöst wird.
Die vereinigten Extrakte enthalten noch ge- ringe Mengen von Dicyc1ohexyl-harnstoff und werden durch Lösen in Methanol und erneutes Ausfällen mit Essigester-Petroläther gereinigt. Man erhält 29,3 g N-Carbobenzyloxy-L-leucyl-L-histidin-methylester (70, ff1/0 d. Th.) vom Smp 131 - 1320.
Aus dem Filtrat des Reaktionsgemisches werden durch Extraktion mit 2n-Salzsäure noch 4,0 g Dipeptid (9, ff1/0 d. Th.) vom Smp zirka 120 - 1250 gewonnen, das durch Umfällen aus Methanol-EssigesterPetroläther weiter gereinigt werden kann.
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38 : N-Carbobenzyloxy-L-asparaginyl- (NE-carbobenzyloxy)-L-lysyl-L-valyl-(vgl. Beispiel 33) und 445 mg (0, 84 mMol) N-Carbobenzyloxy-L-asparaginyl-(N#-carbobenzyloxy)-L-lysin (vgl. Beispiel 41) werden in 3 ml Dimethylformamid gelöst, 200 mg (0,84 mMol) l-Cyclohexyl-3-morpholinyläthyl-carbodiimid zugegeben und das Reaktionsgemisch 21 h bei 220 belassen.
Dann wird im Hochvakuum bei 450 zur Trockene verdampft und das hinterbleibende Öl mit kleinen Portionen Wasser, sehr verdünnter Ammoniak-Lösung und Wasser gewaschen, wobei es allmählich erstarrt. Das Pulver wird abgenutscht, getrocknet (520 mg) und weiterhin mit Aceton und schliesslich mit Methanol gewaschen,
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Oktapeptid ist in den meisten gebräuchlichen Lösungsmitteln schwer löslich, in Dimethylformamid aber leicht löslich.
Der als Ausgangsmaterial verwendete L-Valyl-L-tyrosyl-L-leucyl-L-histidyl-L-proyl-L-phenylalanin-methylester wird wie in Beispiel 33 beschrieben bereitet.
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39 : L-Asparaginyl-L-lysyl-L-valyl-L-tynsyl-L-leucyl-L-histidyl-0, 3 ml 2,5n-HBr in Eisessig und das Gemisch unter Feuchtigkeitsausschluss 1 1/2 h bei 210 gehalten, wobei das Material langsam in Lösung geht. Zum Schluss wird das HBr-Eisessig-Gemisch am Hochvakuum bei 250 Badtemperatur vollständig entfernt und das hinterbleibende Harz mit Aceton gewaschen, wobei es zu einem körnigen Pulver erstarrt. Das äusserst hygroskopische Produkt wird genutscht, mit wenig Aceton gewaschen.
Nacn dem Trocknen werden 50 mg rohes L-Asparaginyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-leucyl- - L-histidyl-L-prolyl-L-phenylalanin-methylester-trihydrobromid vom Smp zirka 180 - 2200 (Zersetzung) erhalten. Das Rohprodukt wird ohne weitere Reinigung weiter verarbeitet.
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40 : L-Asparaginyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-leucyl-L-histidyl-- L-prolyl-L-phenylalanin.
34 mg (27 Mol) L-Asparagraphl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-leucyl-L-histidiyl-L-prolyl-L-phenyl-
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schlag. Das Rohprodukt wird in dreimal 3 ml Wasser aufgenommen, wobei sich 4 mg einer in Wasser schwerlöslichen Verunreinigung abtrennen lassen. Die wässerigen Lösungen vereinigt und eingedampft geben 14 mg Rückstand. Dieser wird dreimal mit 1 ml trockenem n-Butanol gewaschen, wobei sich noch 1 mg von in n-Butanol leichter löslichen Anteilen entfernen lassen.
Beim Prüfen auf blutdrucksteigernde Wirkung an Ratten zeigt das Produkt an der nierenlosen Ratte eine sofortige, deutlich hypertensin-ähnliche Steigerung des Blutdruckes. Die Stärke der Wirkung ist verglichen mit Noradrenalin zirka 1/10 - 1/15.
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Zu einer auf 00 gekühlten Lösung von 12, 0 g (0, 041 Mol) NE-Carbobenzyloxy-L-lysin-methylester und 8,6 ml (0,061 Mol) Triäthylamin in 60 ml absolutem Toluol wird innerhalb 15 min unter Feuchtigkeitsausschluss die ebenfalls auf 00 gekühlte Lösung von 7, 4g 90ToDiäthylchlorphosphit (0,048 Mol) in ml absolutem Toluol eingetropft.
Das Reaktionsgemisch wird sodann 2 h bei Zimmertemperatur gehalten; hierauf wird vom ausgeschiedenen Triäthylamin-hydrochlorid abgenutscht, mit wenig absolutem Toluol nachgewaschen und dasToluolfiltrat im Vakuum zur Trockene verdampft, wobei das Diäthylphosphitamid des NE-Carbobenzyloxy-L-lysin-methylesters als zähes Harz erhalten wird (Gewicht 17,0 g). Es wird in 60 ml Diäthylphosphit gelöst, 10,9 g trockenes, fein gepulvertes N-Carbobenzyloxy-L-asparagin (0, 041 Mol) zugegeben und das Gemisch 1 h auf 800 erwärmt, wobei das N-Carbobenzyloxy-L-asparagin nach wenigen Minuten in Lösung geht.
Nach 1 h wird das Diäthylphosphit unter vermindertem Druck vollständig abdestilliert, das zurückbleibende Harz in viel Essigester aufgenommen und die Essigesterlösung mit verdünnter Salzsäure, Wasser, verdünnter Sodalösung und Wasser gewaschen. Die Essigesterphase hinterlässt nach Trocknen mit Na SO und Eindampfen 13, g rohen \i-Carbobenzyloxy-L-asparaginyl- - (N-carbobenzyloxy)-L-lysin-methylester als gallertige Masse.
Nach zweimaligem Umfällen aus Methanol-Äther werden 8, 5 g des Produktes als flockiger Niederschlag erhalten ; Smp 152-161 , Ausbeute 38% der Theorie.
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vom Smp 152 - 1610 werden gelöst in 60 ml Dimethylformamid und portionsweise O. ln-Natronlauge zugegeben, bis der pH-Wert der Lösung während 20 min bei 10 - 10, 5 bleibt (insgesamt 140 ml 0, ln-NaOH zugegeben). Hierauf wird durch Zugabe von etwas festem C02 auf pH = 8 gebracht und das Dimethylformamid-Wasser-Gemisch erst im Vakuum, dann im Hochvakuum auf ein kleines Volumen eingeengt, Der Rückstand wird mit Wasser versetzt, wobei das Natriumsalz von N-Carbobenzyloxy-L-asparaginyl- - (Ns-carbobenzyloxy)-L-lysin als dicke, gallertige Masse ausfällt.
Es wird. durch Zugabe von viel Wasser (zirka 200 ml) in Lösung gebracht, von etwas Ungelöstem abfiltriert und das Filtrat unter Eiskühlung mit konzentriertem HC1 tropfenweise auf PH = 1 gebracht. Die flockige Fällung wird abgenutscht, mit Eis-
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(Ausbeute 74% der Theorie). Das Produkt ist löslich in sehr verdünnten Alkalien, mit 2n-Natronlauge oder Sodalösung entsteht ein gallertiges, schwerlösliches Natriumsalz.
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Zur Lösung von 802 mg (1 mMol) L-Leucyl-L-tyrosyl-L-isoleucyl-L-histidyl-L-prolyl-L-phenylalanin-methylester (vgl. Beispiel 49) in 6 ml frisch destilliertem Dimethylformamid gibt man 360 mg (1,5 mMol) Dicyclohexyl-carbodiimid und nach kurzer Zeit 710 mg 91,5 mMol) N-Carbobenzyloxy- - L-asparaginyl-nitro-L-arginin (vgl. Beispiel 2) in 6 mg Dimethylformamid.
Man lässt über Nacht bei Zimmertemperatur reagieren, filtriert vom Dicyclohexyl-harnstoff ab und dampft das Lösungsmittel im Hochvakuum bei 400 ab. Den schaumigen Rückstand trocknet man noch eine weitere Stunde bei 400 und 0, 01 mm Hg, zerreibt ihn anschliessend mit viel Essigester und trocknet das pulverige Produkt wieder im Hochvakuum. Zur weiteren Reinigung wird das Rohprodukt wiederholt mit viel Aceton und eiskaltem Metha-
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leucyl-L-histidyl-L-prolyl-L-phenylalanin-methylester werden in 30 ml absolutem Methanol in Gegenwart von 4 Äquivalenten Salzsäure und 200 mg Pd-Kohle (10go Pd) unter Normalbedingungen hydriert.
(Das gebildete CO wird in einem zweiten HydriergefÅass mit verdünnter Natronlauge absorbiert). Nach zirka 17 h ist etwas mehr als die berechnete Menge Wasserstoff aufgenommen. Der Katalysator wird ab- filtriert, die Lösung bei 400 auf ein kleines Volumen eingedampft und mit viel Äther versetzt. Dabei scheidet sich das Trihydrochlorid des Oktapeptidesters neben Ammoniumchlorid als weisses körniges Produkt ab. Ausbeute 240 mg (270 mg berechnet fur Trihydrochlorid und äquimolare Menge Ammoniumchlorid).
Das Produkt wird ohne weitere Reinigung weiter verarbeitet. Es ist in Methanol, Äthanol und Wasser gut löslich.
Beispiel45 :L-Asparagyl-L-arginyl-L-leucyl-L-tyrosyl-L-isoleucyl-L-histidyl- -L-prolyl-L-phenylalanin.
100 mg L-Asparaginyl-L-arginyl-L-leucyl-L-tyrosyl-L-isoleucyl-L-histidyl-L-prolyl-L-phenylalanin- - methylester werden in 2 ml konzentrierter reiner Salzsäure 85 min bei 37 gehalten. Die Salzsäure wird rasch im Vakuum bei 250 abgedampft und der Rückstand über Natriumhydroxyd und Phosphorpentoxyd getrocknet.
Zur Reinigung löst man das schaumige Rohprodukt unter gelindem Erwärmen in 1, 5 n. l Äthanol und fällt das Oktapeptid-trihydrochlorid mit 8 ml Aceton aus. Abzentrifugieren und Nachwaschen mit zwei Portionen zu je 2 ml Aceton ergeben 90 mg L-Asparagyl-L-arginyl-L-leucyl-L-tyrosyl-L-isoleucyi- - L-histidyl-L-prolyl-L-phenylalanin-trihydrochlorid.
An der nierenlosen Ratte zeigt es die zwanzigfache Aktivität von Noradrenalin.
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940 mg (3,5 mMol) N-Carbobenzyloxy-L-leucin löst man in 10 ml absolutem Tetrahydrofuran, gibt 800 mg (10% Überschuss) Dicyclohexyl-carbodiimid zu und anschliessend 690 mg (3,5 mMol) Tyrosinmethylester, gelöst in 15 ml absolutem Tetrahydrofuran. Man lässt über Nacht reagieren, filtriert vom ausgeschiedenen Dicyclohexyl-harnstoff ab und dampft das Lösungsmittel im Vakuum bei 400 ab. Den Verdampfungsrückstand wäscht man in Essigester mit In-Salzsäure, Wasser, 2n-Natriumbicarbonatlösung und Wasser neutral ; trocknet die Essigesterlösung über Natriumsulfat und verdampft das Lösungsmittel im Vakuum. Man isoliert 1,4 g (90'/0) rohenCarbobenzoxy-dipeptidester.
Zweimaliges Umfällen des Rohesters aus Essigesteeetroläther ergibt reinen, aber amorphen N-Carbobenzyloxy-L-leucyl-L-tyrosinmethy lesler.
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Zu 2,37 g (5,3 mMol) N-Carbobenzyloxy-L-leucyl-L-tyrosin-methylester gibt man 13,5 ml In-NaOH, schüttelt bis zur vollständigen Lösung durch (5 min) und verseift 1 h bei Zimmertemperatur.
Die alkalische Lösung wird einmal mit 5 ml Essigester ausgezogen, die organische Phase noch einmal mit wenig Wasser gewaschen und die vereinigten wässerigen Lösungen am Vakuum während 10 min vom Essigester befreit. Mit 13,5 ml1n-HCl wird das Carbobenzoxy-dipeptid als klebrige Masse ausgefällt, die im Eiskasten erstarrt, bei Zimmertemperatur aber wieder zerfliesst. Man dekantiert von der Mutterlauge ab, wäscht den gummiartigen Riickstand dreimal gut mit Wasser durch und trocknet über KOH und Phosphorpentoxyd im Hochvakuum. Man erhält 1, 9 g (80'/0) amorphes Carbobenzyloxy-L-leucyl-L-tyrosin, das nicht kristallisiert werden konnte.
Die multiplikative Verteilung (Craig-Grundprozess) über 30 Stufen zwischen 80% gem Methanol als Oberphaje und Chloroform : Tetrachlorkohlenstoff 1 : 1 als untere Phase (K = 1, 54) ergibt ebenfalls ein nicht kristallines Produkt.
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nitril versetzt man mit 520 mg (5% Überschuss) Dicyclohexyl-carbodiimid und der Lösung von 1, 38 g (2,5 mMol) L-isoleucyl-L-histidyl-L-prolyl-L-phenylalanin-methylester (vgl. Beispiel 16) in 10 ml
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Acetonitril. Dabei scheidet sich der Dicyclohexyl-harnstoff momentan aus. Nach zirka 6 h beginnt die Abscheidung des N-Carbobenzoxy-hexapeptidesters als gallertige Masse. Man lässt 2 Tage bei Zimmertemperatur in der Dunkelheit stehen und dampft anschliessend das Acetonitril bei 400 unter vermindertem Druck ab.
Den Rückstand digeriert man mit 5 ml eiskaltem Methanol, filtriert vom Dicyclohexylharnstoff ab und wäscht drei weitere Male mit je 1 ml eiskaltem Methanol nach. Das Methanol wird am Vakuum abgedampft und der Rückwand in Chloroform dreimal mit 2 ml 2n-Salzsäure, fünfmal mit 2 ml eiskalter Natriumbicarbonatlösung und mit Wasser gewaschen.
Die über Natriumsulfat getrocknete Lösung wird kurz mit wenig Aktivkohle aufgekocht, filtriert und das Chloroform vollständig abgedampft. Einmaliges Umfällen aus Chloroform/Äther ergeben 1, 7 g (76%) Carbobenzoxy-hexapeptid-methylester.
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- 1410,Beispiel 49 : L-Leucyl-L-tyrosyl-L-isoleucyl-L-histidyl-L-prolyl- - L-phenylalanin-methylester.
1, 2 g (1,28 mMol) N-Carbobenzyloxy-L-leucyl-L-tyrosyl-L-isoleucyl-L-historyl-L-propyl-L-phenyl- alanin-methylester werden in 20 ml absolutem Methanol, die 2 Äquivalente Salzsäure enthalten, in Ge- genwart von 300 mg Pd-Kohle (10% Pd) hydrogenolytisch gespalten. Nach 2 h ist etwas mehr als die be- rechnete MengeWasserstoff aufgenommen. Die vom Katalysator befreite Lösung dampft man im Vakuum bei 400 zur Trockene ein, löst den Rückstand in 10 ml eiskaltem Wasser und gibt zur klaren Lösung 2, 6 mMol Natriumcarbonat, gelöst in 10 ml Wasser. Der ausgeschiedene Hexapeptidester wird mit 25 ml und zweimal mit 10 ml n-Butanol/Chloroform 1 : 1 extrahiert, die wässerigen Phasen dreimal mit 5 ml Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum auf ein kleines Volumen eingeengt.
Durch
Zugabe von viel Äther fällt der Hexapeptidester quantitativ aus. Einmaliges Umfällen aus Chloroform/ Äther ergibt 840 mg (81ale) amorphes Produkt, F = 130 - 1400. Das Produkt ist für die Weiterverarbeitung genügend rein.
PATENTANSPRÜCHE :
1. Verfahren zurHerstellung neuerOktapeptide mit derAminosäuresequenz L-Asparagin, L-a- (Ami- noalkyl)-amino-essigsäure mit 1-4 C-Atomen im Alkylrest, L-a-Amino-alkyl-essigsäure mit 1 - 4 CAtomen im Alkylrest, L-Tyrosin, L-ct-Amino-alkyl-essigsäure mit 1-4 C-Atomen im Alkylrest, L-Histidin, L-Prolin, L-Phenylalanin und ihrer Derivate unter Anwendung an sich bekannter Verknüpfungsmethoden, dadurch gekennzeichnet, dass man von L-Asparagin oder seinen funktionellen Säurederivaten, in denen die a-Aminogruppe geschützt ist, ausgeht.