DE2162745A1

DE2162745A1 - Verfahren zur Bestimmung des Ausreichens der Galle im Organismus

Info

Publication number: DE2162745A1
Application number: DE19712162745
Authority: DE
Inventors: Anthony Rocco Westerville Ohio Imondi (V.StA.)
Original assignee: Rohm and Haas Co
Current assignee: Rohm and Haas Co
Priority date: 1970-12-18
Filing date: 1971-12-17
Publication date: 1972-06-22
Also published as: CA984750A; GB1382240A; BE776873A; FR2118178A1; NL7117216A; US3806592A; FR2118178B1

Description

Die Erfindung betrifft einen neuen diagnostischen Test zur Bewertung des Ausreichens der Galle im tierischen oder menschlichen Organismus.

Die Verdauung von Nahrungsmitteln erfolgt primär in den oberen Bereichen des Dünndarmes, wo sich Pankreassaft und Galle mit dem Speisebrei vermischen, der aus dem Magen kommt. In diesem Verdauungsprozeß liefert der Pankreassaft die Verdauungsenzyme, die für den Abbau von Proteinen, Kohlenhydraten und Fett verantwortlich sind, während die Galle Gallensalze liefert, die syner-

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Poitsdiecfc: Frankfurt/Main 6763 Bank: Dresdner Bank AG, Wiesbaden, Konto-Nr. 276 807

gistisch mit der Pankreaslipase zusammenarbeiten, um Triglyceride aufzuspalten. Somit führt die Abwesenheit entweder von Pankreassaft oder von Galle zu einer anormalen Konzentration von unzersetztem Fett in den Ausscheidungen.

Galle wird von der Leber ausgeschieden und in der Gallenblase gelagert. Wenn der Speisebrei in den oberen Dünndarm eintritt, wird der Gallenfluß in den Darm stimuliert. Normalerweise werden die Gallensalze in dem Krummdarm erneut absorbiert und durch ^ die Leber derart rezirkuliert, daß nur eine sehr kleine Menge der Gallensalze aus dem Organismus austritt.

Galleninsuffizienz im Darm kann aus einer beeinträchtigten Leberfunktion, aus einer Versperrung der Gallenwege oder aus irgendeiner Störung der normalen enterohepatisehen Zirkulation der Gallensalze resultieren, was beispielsweise nach einer operativen Entfernung des Krummdarmes auftreten kann. Wenn intraluminale Gallensalzkonzentrationen entweder wegen Versperrung der Gallenwege oder wegen einer Leberkrankheit abnehmen, kann eine _Ä Diagnose oftmals mit einem klinischen Routinetest gemacht werden.

In einigen Fällen jedoch, wie beispielsweise wenn der gesamte Gallensalzvorrat vermindert ist, war bisher eine Intubation und Analyse des Darminhaltes auf Gallensalze die einzige praktisch durchführbare diagnostische Methode.

Es wurde festgestellt, daß das Ausreichen von Pankreasenzym in einem tierischen oder menschlichen Organismus durch innere Verabreichung einer wirksamen Menge des Polypeptide bewertet werden kann, das durch ein oder mehrere der Pankreasendopeptidasen hydrolysierbar ist und einen Rest ergibt, der vom Organismus

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absorbiert und wiedergewonnen wird. Dieser Rest wird absorbiert und anschließend im Urin ausgeschieden, wo mit Hilfe einer Analyse die Anwesenheit oder Abwesenheit dieses Restes bestimmt werden kann. Bei Tieren mit normaler Pankreasfunktion wird das Peptid hydrolysiert, um eine Aminosäure oder einen anderen Rest freizusetzen, die dann absorbiert, ausgeschieden und analytisch bestimmt werden können. Bei Tieren mit anormaler Pankreasfunktion bleibt das Peptid im wesentlichen unhydrolysiert und führt somit

im
zu einem bei der Urinanalyse/wesentlichen nicht feststellbaren i Rest. Diese Testmethode und die zu ihrer Durchführung brauchbaren Peptide sind in einer schwebenden USA-Patentanmeldung beschrieben. Dieser Test wird gelegentlich als Greenberger-deBenneville-Test bezeichnet.

Ester von Fluorescein wurden ebenfalls bereits in der Literatur für die Verwendung als Diagnostikum für Pankreasinsuffizienz vorgeschlagen. In diesem Versuch werden die Fluoresceinester hydrolytisch in Gegenwart bestimmter Pankreasenzyme gespalten und ergeben Fluorescein, das absorbiert und ausgeschieden wird und λ

Ά dann im Urin analysiert werden kann. Es wurde nun jedoch gefundan, daß die Anwesenheit von Galle sowie der Pankreasenzyme erforderlich ist, um diese Spaltung zu bewirken. So kann die Abwesenheit von Fluorescein im Urin nach der Verabreichung des Fluoresceinesters entweder eine Pankreasenzyminsuffizienz oder eine Galleninsuffizienz oder beides anzeigen.

Es wurde nun gefunden, daß das Ausreichen von Galle in einem tierischen Organismus bewertet werden kann, indem man dem Tier sowohl ein für hydrolytische Spaltung in Anwesenheit von Pankreas-

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enzymausscheidungen empfindliches Peptid als auch einen für hydrolytische Spaltung in Anwesenheit von Gallen- und PankreasenzymausScheidungen empfindlichen Fluoresceinester verabreicht. Nach der Erfindung wird dieser Gallensuffizienztest in der Weise durchgeführt , daß man innerlich, vorzugsweise oral, einem Tier oder Menschen eine wirksame Menge eines Peptide der allgemeinen Formel Q-NHQ¹CO-Q" (I) verabreicht, worin Q eine Amino blockierende Gruppe, NHQ¹CO eine in Anwesenheit einer Pankreasendopeptidase hydrolytisch von dem Peptid abspaltbare Aminosäuregruppe und Q" eine in Anwesenheit einer Pankreasendopeptidase hydrolytisch von dem Peptid unter Bildung einer analysierbaren Verbindung, die vom Tier absorbiert und ausgeschieden werden kann, abspaltbare, pharmakologisch verträgliche analysierbare Gruppe bedeutet, weiterhin dem Tier innerlich eine wirksame Menge eines (^CA~^ciß)~ Dialkylesters, vorzugsweise eines (C_ß-C.₂)-Dialkylesters von Fluorescein verabreicht, danach den Urin des Tieres genügend lange sammelt, um eine Ansammlung der analysierbaren Verbindung und von Fluorescein zu gestatten, und sodann durch Analyse in dem gesammelten Urin die Menge der analysierbaren Verbindung und die Menge des Fluoresceins bestimmt.

In Tieren mit normaler Pankreasfunktion und normaler Gallensekretion wird die Urinanalyse sowohl Fluorescein wie auch den analysierbaren Rest des Peptide zeigen. In Tieren mit normaler Pankreasfunktion, aber anormaler Gallensekretion wird die Urin^analyse den analysierbaren Rest zeigen, aber es wird eine bedeutsame Fluoresceinkonzentration fehlen. In Tieren mit anormaler Pankreasfunktion wird die Urinanalyse weder Fluorescein noch den analysierbaren Rest zeigen, und es werden weitere Tests erfor-

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derlich, um die Gallensuffizienz zu bestimmen. Somit liefert das Verfahren der Erfindung nicht nur ein Mittel zur Entdeckung von Galleninsuffizienz in Tieren mit normaler Pankreasfunktion, sondern vereinigt auch in relativ einfacher Weise Tests für Pankreas- und Gallensuffizienz.

Eine große Vielzahl von Peptiden kann bei dem Verfahren nach der Erfindung verwendet werden, und jedes Peptid, das drei wesentliche Komponenten enthält, kann benutzt werden. Die erste wesentliche Komponente ist eine Aminosäuregruppe, die in Gegenwart einer der Pankreasendopeptidasen hydrolytisch abgespalten wird. Das zweite wesentliche Element ist eine blockierende Gruppe an der Aminofunktion dieser Aminosäuregruppe. Das dritte wesentliche Element ist eine pharmakologisch verträgliche analysierbare Gruppe, die in Gegenwart eines Pankreasenzyms von dem Polypeptid hydrolysiert wird und eine Verbindung bildet, die im Körper absorbiert und eliminiert wird und die durch quantitative analytische Methoden leicht bestimmbar ist. Polypeptide, die diesen Anforderungen genügen, können durch die allgemeine Formel Q-NHQ¹CO-Q" (I) wiedergegeben werden, worin Q eine Amin blockierende Gruppe, NHQ¹CO die hydrolysierbare Aminosäuregruppe und Q" die analysierbare Gruppe bedeutet.

In den Peptiden der Formel I kann jede Aminosäuregruppe verwendet werden, die mit einer der Pankreasendopeptidasen hydrolysiert wird. Bei einer Ausfuhrungsform der Erfindung ist die Aminosäuregruppe eine solche, die in Gegenwart irgendeiner Gruppe der Pankreasenzyme, allgemein als Chymotrypsin bezeichnet, hydrolysierbar ist. Beispielsweise verursacht Chymotrypsin eine Spaltung

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einer inneren -CONH- oder -COO-Gruppe, wenn die -CO-Funktion von L-Phenylalanin, einem Derivat von L-Phenylalanin, wie L-Tyrosin, L-Leucin, L-Methionin oder L-Tryptophan, kommt. So kann als Aminosäuregruppe (NHQ¹CO in Formel I) für das in dem Test verwendete Peptid jede dieser Aminosäuren ausgewählt werden. Da außerdem die Anwesenheit des Pankreasenzymtrypsins zu einer hydrolytischen Spaltung einer inneren -CONH- oder -CÖO-Bindung führt, wenn die -CO-Funktion von L-Lysin oder L-Arginin kommt, kann auch jede dieser beiden Aminosäuren als Aminosäuregruppe in dem Testpeptid ausgewählt werden.

Eine große Vielzahl blockierender Gruppen (Q in der Formel I) kann benutzt werden, um die Aminofunktion in der Aminosäuregruppe zu blockieren. Allgemein wird-eine Acylgruppe, wie eine Alkylcarbonylgruppe, eine Arylcarbonylgruppe, eine Aralkylcarbonylgruppe, eine Alkarylcarbonylgruppe, eine Arylsulfonylgruppe, eine Alkylsulfonylgruppe, eine Alkylcarbamoylgruppe, eine Arylcarbamoylgruppe, eine Alkoxycarbonylgruppe, eine Aryloxycarbonylgruppe o.dgl. ausgewählt.

Die analysierbare Gruppe (Q" in Formel I) muß verschiedenen Anforderungen genügen. Erstens muß sie pharmakologisch verträglich sein. D.h. sie darf keine unerwünschten Wirkungen im tierischen Organismus, an den das Peptid verabreicht wird, verursachen. Zweitens muß sie von dem Peptid hydrolysiert werden und eine Substanz ergeben, die im Körper absorbiert und dann im Urin ausgeschieden wird und zwar vorzugsweise relativ schnell. Drittens muß die hydrolysierte Substanz durch guantative analytische Methoden bestimmbar sein. Als analysierbare Gruppe kann jede Gruppe verwen-

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det werden, die diesen Anforderungen genügt. Die analysierbare Gruppe kann entweder einen Ester oder ein Amid mit der Carboxylgruppe der Aminosäuregruppe bilden.

Eine bevorzugte Gruppe von Peptiden, die in der Testmethode nach der Erfindung brauchbar ist, hat die folgende allgemeine Formel RCO-A_n-NHR¹CO-B_1nNHZ (II) , worin R ein Wasserstoff atom, eine Phenylgruppe, eine durch ein oder mehrere Halogenatome, (C₁-C^)-Alkylgruppen, Hydroxylgruppen, (C₁-C₄)-Alkoxygruppen, (Cj-C.)-Alkoxycarbonylgruppen oder ähnliche Substituenten, die die Testwirksamkeit des Polypeptide nicht stören, substituierte Phenylgruppe, eine (C₁-C,_O)-Alkylgruppe, vorzugsweise eine (Ci~C_g)-Alkylgruppe, eine mit ein oder mehreren Halogenatomen, (C₁-C._)-Alkoxygruppen, Hydroxylgruppen, Acyloxygruppen, vorzugsweise (C₁-C.)-Alkanoyloxy- oder Benzyloxygruppen, Polyalkoxyalky!gruppen, Phenylgruppen oder ähnliche Substituenten, die die Testwirksamkeit des Polypeptids nicht stören, substituierte (C₁-C₁₂J-Alkylgruppe, eine (C₁-C₁₂)-Alkoxygruppe, vorzugsweise eine (Cj-Cg)-Alkoxygruppe, eine Aryloxygruppe mit bis zu 10 Kohlenstoffatomen, eine zweibindige Alkylengruppe mit bis zu 6 Kohlenstoffatomen bedeutet, wobei in diesem Fall die Formel II die Bedeutung R(-CO-A -NHR¹CO-B -NHZ)₀ (Ha) hat oder, wenn die blockierende Gruppe sich von Oxalsäure herleitet, die Bedeutung

(C0-A„-NHR¹CO-B-NHZ)₀ (Hb) hat, NHR¹CO eine Aminosäuregruppe η zn ^

bedeutet, die sich von L-Phenylalanin, L-Lyrosin, L-Leucin, L-Methionin, L-Tryptophan, L-Arginin oder L-Lysin herleitet, Z eine Gruppe der allgemeinen Formel

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YR"

bedeutet, worin R" eine Hydroxylgruppe, eine (C₁-C₄)-Alkoxygruppe, eine (C,-C^)-Alkoxyalkoxygruppe, eine (C₁-Cg)-AmXnOaIkoxygruppe, eine Aminogruppe, eine (C₁-C₄)-Monoalkylaminogruppe, eine (C₁-C₄)-Dialkylaminogruppe, eine Gruppe der Formel _ -NHCH₀COR", oder ein Salz, wie ein Natrium-, Kalium, oder Ammo-

niumsalz der Gruppe, in der R" eine Hydroxylgruppe bedeutet, ist, Y eine Gruppe der Formel -CO- oder -SO^-j X eine Hydroxylgruppe, eine (C₁-C₄)-Alkylgruppe, ein Halogenatom, eine (C₁-C₄)-Alkoxygruppe oder einen ähnlichen Substituenten bedeutet, der die Testwirksamkeit des Polypeptids nicht stört, und n¹ 0, 1 oder 2 bedeutet, A und B die Reste niedermolekularer Aminosäuren, wie defl Glycyl-, Alanyl-, Glycylglycyl- oder ähnlichen Rest bedeuten und η und m 0, 1 oder 2 sind.

Im allgemeinen wird der Test durch eine relativ hohe Löslich-

keit des Peptids in dem Körpersystem erleichtert. Folglich sind jene Peptide mit relativ niedrigem Molekulargewicht und jene mit einer freien Carboxygruppe oder einem Salz einer Carboxygruppe besonders bevorzugt. Repräsentative Beispiele geeigneter RCO-Gruppen sind Benzoyl, Adipoyl, Malonyl, Succinoyl, Formyl, Acetyl, Propionyl, Butyryl, Hexanoyl, Heptanoyl, Octanoyl, Dodecanoyl, Acetosalicylyl, Oxalyl, Äthoxycarbonyl, Benzyloxycarbonyl, Chlorbenzoyl, Jodbenzoyl, Toluoyl, Äthylbenzoyl, Anisoyl, Chloracetyl, Äthoxypropionyl, Hydroxybutyryl, Phenylacetyl u.dgl.

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Repräsentative Beispiele geeigneter Gruppen -NHZ sind jene Gruppen, die sich von p-Aminobenzoesäure, m-Aminobenzoesäure, 4-Araino-3-jodbenzoesäure, 4-Amino-2-hydroxybenzoesäure, 4-Amino-3-methy!benzoesäure, 4-Amino-2,6-dimethy!benzoesäure, 4-Aminohippursäure, p-Aminobenzolsulfonsäure, 4-Amino-2-äthylbenzoesäure, 4-Amino-2-buty!benzoesäure, 4-Amino-2-brombenzoesäure, 4-Amino-2-äthoxybenzoesäure, 3-Amino-4-hydroxybenzoesäure, 3-Amino-4-methy!benzoesäure, 3-Amino-4-chlorbenzoesäure, m-Aminobenzolsulfonsäure, Anthranilsäure, 4-Amino-3-methylbenzolsulfonsäure, 4-Amino-3-hydroxybenzolsulfonsäure u.dgl., den Salzen, wie dem Natrium-, Kalium- oder Ammoniumsalz, solcher Säuren, den (Cj-C₄)-Alkylestern, wie Methyl-, Äthyl-, n-Propyl-, Isopropyl-, η-Butyl-, Isobutyl- und tert-Buty!estern solcher Säuren, den (C,-C.)-Alkoxyalkylestern, wie Jlthoxyäthyl- und Methoxyäthylestern solcher Säuren, den £:,-Cg)-Aminoalkylestern, wie den Ν,Ν-Dimethylaminoäthyl-, Morpholinoäthyl-, Piperidinoäthyl-, Piperazinoäthyl- und N,N-Diäthylaminomethy!estern solcher Säuren, den Amiden solcher Säuren und den Alky!amiden, wie den N,N-Diäthylamiden, solcher Säuren herleiten. Die freien Säuren und ihre Salze sind bevorzugt.

Repräsentative Beispiele von Peptiden der Formel II, die bei dem Test nach der folgenden Erfindung brauchbar sind, sind folgende:

Äthyl-N-benzoyl-DL-phenylalanyl-p-aminobenzoat Äthyl-n-benzoyl-L-phenylalanylglycyl-p-aminobenzoat Methyl-N-benzoyl-L-phenyialanyl-p-aminohippurat Methyl-N-benzoyl-DL-phenylalanyl-p-aminohippurat

Methyl-N-benzoyl-L-phenylalanylglycylglycyi-p-aminohippurät

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Äthyl-N-benzoyl-L-phenylalanyl-p-aminobenzoat

Ammonium-N-benzoyl-L-phenylalanylglycylglycyl-p-aminohippurat

N-Benzoyl-DL-phenylalanyl-p-aminobenzoesäure N-Benzoyl-L-phenylalanyl-p-aminobenzoesäure N-Benzoyl-DL-phenylalanyl-p-aminohippursäure N-Benzoyl-L-phenylalanyl-p-aminohippursäure

Diammoniumadipoyl-bis-iL-phenylalanyl-p-aminobenzoat)

Natrium-N-benzoyl-L-phenylalanyl-p-aminobenzoat Natrium-N-benzoyl-L-phenylalanyl-p-aminohippurat Dinatriumadipoyl-bis-(L-phenylalanyl-p-aminobenzoat) Natrium-N-acetyi-L-phenylalanyl-p-aminohippurat N-Benzoyl-L-phenylalanyl-p-aminobenzolsulfonamid Natrium-N-benzoyl-L-tyrosyl-p-aminobenzoat Dinatritunadipoyl-bis-CL-tyrosyl-p-aminobenzoat) Natrium-N-acetyl-L-tyrosyl-p-aminobenzoat Natrium-N-propionyl-L-tyrosyl-p-aminobenzoat Natrium-N-butyryl-L-tyrosyl-p-aminobenzoat Natrium-N-benzoyl-L-tryptophyl-p-aminobenzoat NatriuiÄ-N-äthoxycarbonyl-L-tyrosyl-p-aminobenzoat Natrium-N-benzoyl-L-tyrosyl-o-aminobenzoat Natrium-N-benzoyl-L-tyrosyl-m-aminobenzoat Natrium-N-benzoyl-L·-tyrosyl-4-amino-3-Inethylbenzoat Natrium-N-benzoyl-L-leucyl-p-aminobenzoat Natrium-N-benzoyl-L-methionyl-p-aminobenzoat

Obwohl nur das L-Isomer eines Peptids nach der Erfindung tatsächlich in Gegenwart der Pankreasenzyme gespalten wird, können auch racemische Gemische der Peptide verwendet werden, ohne dass

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das Testverfahren oder dessen Ergebnisse gestört werden. Im allgemeinen muß jedoch, wenn ein racemisches Gemisch verwendet wird, eine doppelte Dosis des Peptids gegeben werden.

Die bei dem Verfahren nach der Erfindung brauchbaren Peptide werden allgemein in der Weise hergestellt, daß man zunächst die Aminogruppe der Aminosäure mit irgendeinem der geeigneten Blockierungsmittel blockiert. Verschiedene präparative Methoden zur Durchführung dieser Blockierungsstufe sind in der Technik bekannt und können bei der Herstellung der Peptide nach der Erfindung befolgt werden. Eine brauchbare Methode besteht darin, daß man die Aminosäure mit dem Säurechlorid der blockierenden Gruppe in Gegenwart eines basischen Katalysators oder eines basischen Spülmittels entweder in einem wäßrigen oder einem nicht wäßrigen Lösungsmittelsystem umsetzt. Die analysierbare Gruppe wird dann durch Amidierung oder Veresterung der blockierten Aminosäure angefügt. Es können verschiedene präparative Methoden zur Herstellung der Amide oder Ester angewendet werden, und diese Methoden sind dem Fachmann bekannt. Eine brauchbare neue Methode besteht darin, daß man ein gemischtes Anhydrid der blokkierten Aminosäure mit der aminohaltigen analysierbaren Gruppe umsetzt. Das gemischte Anhydrid kann bequem hergestellt werden, indem man die blockierte Aminosäure mit Äthylchlorformiat in Gegenwart eines tertiären Amins umsetzt. Allgemein wird das gemischte Anhydrid dann mit einem Ester umgesetzt, der die freie Aminogruppe enthält. Spezielle Ausführungsformen geeigneter Methoden zur Herstellung der in der Testmethode nach der Erfindung brauchbaren Peptide sind in den nachfolgenden Beispielen aufgeführt.

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Die Fluoresceinester, die bei der Testmethode nach der Erfindung brauchbar sind, sind bekannte und leicht erhältliche Verbindungen. Im allgemeinen bereitet man diese Ester durch Umsetzung des Dinatriumsalzes von Fluorescein mit einem geeigneten Säurechlorid. Geeignete synthetische Methoden zur Herstellung dieser Ester sind beschrieben in J.G. Meyer-Bertenrath, Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem., 349, Seiten 728 bis 729 (1968) und in den dort angegebenen Literatureteilen.

Unter den Fluoresceinestern, die bei der ersten Methode nach der Ψ Erfindung brauchbar sind, befinden sich Fluoresceindibutyrat, Fluoresceindihexanoat, Fluoresceindiheptanoat, Fluoresceindioctanoat, Fluoresceindinonanoat, Fluoresceindidecanoat, Fluoresceindilaurat, Fluoresceindimyristat, Fluoresceindipalmitat usw.

Der Gallensuffizienztest wird durch innerliche Verabreichung, im allgemeinen orale Verabreichung, einer wirksamen Dosis eines der gegen Pankreasenzym empfindlichen Peptide und einer wirksamen Dosis eines der Fluoresceinester durchgeführt. Das Peptid und der Ester können entweder gleichzeitig oder nacheinander verabreicht werden. Wenn sie nacheinander verabreicht werden, kann entweder das Peptid oder der Ester zunächst gegeben werden. Danach wird der Urin während einer geeigneten Zeitdauer aufgefangen und analysiert, um die Menge des entsprechenden Peptidfragmentes und die vorhandene Fluoresceinmenge zu bestimmen. Allgemein wurde gefunden, daß ein Sammeln des Urins während etwa 4 bis 10 Stunden,und vorzugsweise während etwa 5 bis 7 Stunden, nach Verabreichung der Testverbindungen einen geeigneten Test liefert. Wenn das Penkreas normal Enzyme abscheidet, verursacht

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die Anwesenheit der Pankreasenzyme eine Spaltung des Peptids, und dann wird eine große Menge des analysierbaren Restes in dem Urin entdeckt. Wenn die Enzymsekretion des Pankreas normal und die Gallensekretion ebenfalls normal ist, verursacht die Anwesenheit von Pankreasenzymen eine Spaltung des Fluoresceinesters, und dann ist die Anwesenheit einer wesentlichen Menge freien Fluoresceins in dem Urin feststellbar. Wenn jedoch die Enzymsekretion des Pankreas normal ist, wie durch die Anwesenheit des analysierbaren Peptidrestes im Urin bestätigt wird, die Gallensekretion aber anormal ist, wird der Fluoresceinester nicht leicht gespalten, und es treten keine wesentlichen Mengen an freiem Fluorescein in dem Urin auf. In Abwesenheit normaler Pankreasfunktion werden weder das Peptid noch der Fluoresceinester leicht gespalten, und es ist im Urin dann nur eine kleine Menge des analysierbaren Restes oder des Fluoresceins feststellbar.

Es sei festgestellt, daß der Gallensuffizienztest nach der Erfindung entweder in einer einzelnen Stufe oder in zwei Stufen durchgeführt werden kann. D.h. das Peptid und der Ester können etwa gleichzeitig verabreicht werden, und die Analyse auf den analysierbaren Rest und das Fluorescein, die mit dem gesammelten Urin durchgeführt wird, kann ebenfalls gleichzeitig erfolgen, oder es kann zunächst das Peptid verabreicht? der Urin gesammelt und sodann eine erste Analyse vorgenommen werden, worauf nach geeignetem Zeitabstand oder vorher die gleiche Testfolge mit dem Fluoresceinester durchgeführt wird.

Die Peptidmenge, die dem Tier verabreicht wird, muß ausreichen, um einen analysierbaren Rest im Urin eines normalen Tieres zu

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produzieren. Allgemein ist eine Menge von etwa 2 mg bis etwa 50 mg des Peptids je Kilogramm Körpergewicht des Tieres wirksam bei der Durchführung des Testes nach der Erfindung. Eine bevorzugte Dosierung liegt bei etwa 5 mg/kg bis etwa 10 mg/kg des Peptids. Bei Menschen ist im allgemeinen eine Dosierung von etwa 350 mg bis etwa 700 mg, wie beispielsweise von etwa 500 mg, wirksam.

Die Menge an Fluoresceinester, die dem Tier verabreicht wird, muß ausreichen, um einen analysierbaren Rest im Urin eines normalen Tieres zu produzieren. Allgemein ist bei der Durchführung des Testes nach der Erfindung eine Mente von etwa 2 mg bis etwa 50 mg des Esters je Kilogramm Körpergewicht des Tieres wirksam. Eine bevorzugte Dosierung liegt bei etwa 5 mg/kg bis etwa 10 mg/kg des Esters. Bei Menschen ist allgemein eine Dosierung von etwa 300 mg bis etwa 7OO mg, wie beispielsweise von etwa 500 mg, wirksam.

Es kann eine große Variationsbreite von Testprogrammen angewendet werden, um den Gallensuffizienztest nach der Erfindung durch-

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zuführen. Das folgende Verfahren ist ein Beispiel hierfür, das

angewendet werden kann:

Der Test sollte am Morgen nach einem leichten, fettfreien Frühstück durchgeführt werden. Vor Beginn des Testes sollte die Harnblase entleert werden.

Die Testperson erhält eine geeignete orale Dosis eines gegen Pankreasenzym empfindlichen Peptids, wie beispielsweise beim Menschen eine orale Dosis von 0,5 g, und eines Fluoresceinesters,

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wie beispielsweise beim Menschen eine orale Dosis von 0_f5 g, und der gesamte Urin wird in den folgenden 6 Stunden aufgefangen und gesammelt. Es sollte Sorge getragen werden, daß man eine Urinprobe zwischen der 5. und 6. Stunde erhält. Während der Testperiode können Wasser oder Koffein verabreicht werden, um die Urinabscheidung einzuleiten, aber andere Diuretika und Drogen sollten im allgemeinen vermieden werden. Ein kleiner Imbiß oder eine leichte, fettfreie Mahlzeit kann eingenommen werden.

Das gesamte Urinvolumen wird bestimmt, und entweder es wird die gesamte Probe oder ein Teil hiervon gekühlt oder eingefroren bis zur chemischen Analyse.

Der Urin wird dann auf die analysierbare Gruppe und auf Fluorescein analysiert. Wenn beispielsweise die analysierbare Gruppe ein aromatisches Amin ist, kann die Bratton-Marshall-Methode unter Verwendung von p-Aminobenzoesäure als Standard verwendet werden. Wenn die analysierbare Gruppe p-Aminobenzoesäure ist, scheiden Menschen oder Tiere mit normaler Pankreassekretion allgemein wenigstens 25 % der eingenommenen p-Aminobenzoesäure oder etwa 40 mg p-Aminobenzoesäure während der 6-stündigen Testdauer nach Korrektur bezüglich der im Grundurin vorliegenden aromatischen Amine aus. Der Grundgehalt kann bei einem während 6 Stunden gesammelten Urin an einem Tag vor dem Test bestimmt werden, oder es kann ein Wert von 3 mg/6 Std. angenommen werden.

Fluorescein im Urin kann nach der Methode von Kaffarnik und Meyer-Bertenrath (Klin. Wschr. 47, 4, Seiten 221 bis 223, 1969) analysiert werden, wobei der Urin alkalisch gemacht wird, worauf man eine Absorptionsmessung bei 492 nm vornimmt. Der im Urin

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enthaltene Fluoresceingrundgehalt liegt allgemein bei 0 und braucht nicht beachtet zu werden. Eine Gewinnung von 15 % des als Teil des Esters verabreichten Fluoresceins oder von etwa 40 mg im Urin während der Testperiode wäre ein Anzeichen für normale Gallensekretion.

Die Entdeckung eines unüblich kleinen Prozentsatzes, wie beispielsweise von weniger als etwa 2 % der verabreichten Dosierung an Fluoresceinester und einer normalen Menge der analyiserbaren Verbindung im Urin zeigt eine wesentliche Insuffizienz der Gallensekretion.

Es kann irgendeine analytische Methode verwendet werden, die quantitativ die Anwesenheit der hydrolysierten analysierbaren Gruppe (-Q" in der Formel I oder -NHZ in Formel II) in dem gesammelten Urin bestimmt. Wenn die analysierbare Gruppe der Rest einer Aminobenzoesäure oder einer Aminobenzolsulfonsäure oder irgendeines Derivates hiervon ist, ist die Methode nach Bratton-Marshall, beschrieben in Journal of Biological Chemistry, 128, Seite 537 (1939) und in J.A.O.A.C., 51, Seite 612 (1968) eine geeignete analytische Methode. Die analysierbare Gruppe kann auch markierte Atome enthalten. Wenn somit diese Gruppe Atome

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von I oder I enthält,kann als analytische Methode die Auszählung von jT-Strahlen verwendet werden. Auch kann die analysierbare Gruppe eine Farbstoff bildende Substanz sein,und in diesem Fall kah ihre Anwesenheit in dem Urin durch kollorimetrische und entsprechende analytische Methoden bestimmt werden. Außerdem kann jede der bekannten Methoden zur quantitativen Bestimmung · der Anwesenheit von Fluorescein bequem angewendet werden.

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Die Verbindungen, Peptide und Ester, die bei der Durchführung des Gallensuffizienztestes nach der Erfindung brauchbar sind, können bequem zusammengestellt und in verschiedenen Formen, pharmazeutischer Präparate verabreicht werden. Die pharmazeutischen Präparate umfassen ein nicht giftiges pharmakologisch verträgliches Trägermaterial oder Verdünnungsmittel und ein oder mehrere der in der Testmethode nach der Erfindung verwendeten Verbindungen. Das Peptid und der Fluoresceinester können entweder zusammen in einer Einheit oder bevorzugt getrennt in verschiedenen Einheiten eingearbeitet werden. Es kann entweder ein festes oder ein flüssiges Trägermaterial benutzt werden. Unter den festen Trägermaterialien, die benutzt v/erden können, finden sich Lactose, Terra alba, Sucrose, Talkum, Gelatine, Stärke, Agar, Pectin, Akaziengummi, Calciumphosphat, Magnesiumstearat, Stearinsäure u.dgl. Unter den flüssigen Trägermaterialien, die benutzt werden können, sind Sirup, Erdnußöl, Olivenöl, Sesamöl, Wasser u.dgl. zu nennen. Außerdem können die Trägermaterialien oder Verdünnungsmittel irgendwelche in der Technik bekannten, die Abgabe verzögernden Materialien enthalten, wie Glycerylmonostearat, Glyceryldistearat u.dgl., entweder allein oder in Kombination mit einem Wachs. Andere pharmakologisch verträgliche Materialien, wie Süßungsmittel, geschmacksverbessernde Mittel, Färbemittel oder Farbstoffe, Emulgatoren, Dispergiermittel, Suspendiermittel, Verdickungsmittel, Bindemittel, Schutzstoffe, Antioxidantien, inerte Verdünnungsmittel u.dgl., können ebenfalls, wenn erwünscht, in die pharmazeutischen Präparate eingearbeitet werden. Obwohl die Mehrzahl der pharmakologisch verträglichen Ma te-

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rialien inert ist, kann es unter bestimmten Umständen vorteilhaft sein, in die Verbindungen nach der Erfindung auch andere therapeutische Mittel einzuarbeiten. Um den Angriff der Magensäfte auf die Peptide zu hemmen, kann es auch vorteilhaft sein, das Peptid mit einem antaciden Bestandteil, wie Natriumbicarbonat o.dgl., zu vermischen.

Die pharmazeutischen Präparate nach der Erfindung enthalten gewöhnlich etwa 250 mg bis etwa 3500 mg des Peptids und etwa 300 bis etwa 3500 mg des Esters. Eine bevorzugte Zusammensetzung

enthält etwa 350 mg bis etwa 700 mg des Peptids und etwa 300 bis etwa 700 mg des Esters. Die aktive Verbindung macht normalerweise etwa 1 bis 95 Gewichts-% der Gesamtzusammensetzung aus. Da es gewöhnlich erwünscht ist, die aktive Verbindung oder die aktiven Verbindungen in ziemlich konzentrierter Form zu verabreichen, d.h. mit nur so viel pharmazeutischem Trägermaterial, wie erforderlich oder bequem ist, um die Verabreichung zu erleichtern, umfassen die aktiven Bestandteile unter den meisten Umständen einen ziemlich hohen Anteil der Gesamtzusammensetzung.

Die Zusammensetzungen nach der Erfindung können in eine Vielzahl von Arzneimittelformen gebracht werden, in die einer Kapsel, Tablette, einer Pille, eines gepackten Pulvers oder einer flüssigen Suspension. Wenn beispielsweise ein festes Trägermaterial verwendet wird, kann das Präparat tablettiert, in Pulveroder Pelletform in eine harte Gelatinekapsel gegeben oder zu einer kugeligen oder rautenförmigen Pastille verarbeitet werden. Wenn ein flüssiges Trägermaterial verwendet wird, kann das Präparat in der Form eines Sirups, einer Lösung, einer Emulsion,

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einer weichen Gelatinekapsei, einer Ampulle oder flüssigen Suspension vorliegen. Jedes dieser Präparate kann in der Form einer Dosierungseinheit hergestellt werden, so daß ein.oder mehrere Einheiten eine bestimmte Menge Peptid oder eine bestimmte Menge Fluoresceinester enthalten, die zur Durchführung des Gallensuff izienztestes geeignet sind. Die Größe der Dosierungseinheit variiert natürlich mit der Größe des Tieres, das getestet werden soll. Beschichtete oder unbeschichtete Tabletten und Kapseln sind die bevorzugten Dosierungseinheitsformen.

Alle der pharmazeutischen Präparate nach der Erfindung können nach für den Pharmazeuten üblichen Methoden gewonnen werden, wie beispielsweise durch Vermischen, Granulieren und Komprimieren oder durch verschiedenartiges Mischen und Auflösen der Bestandteile unter Bildung des erwünschten Endproduktes.

Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung. Wenn nichts anderes angegeben ist, sind alle Teile Gewichtsteile und alle Temperaturen in ⁰C angegeben.

Beispiel 1

Herstellung von N-Benzoyl-L-phenylalanyl-p-aminobenzoesäure und deren Natriumsalz

Eine Lösung wurde aus 13,6 g Kalium-tert-butylat in 100 ml Dimethylsulfoxid hergestellt. Zu dieser Lösung wurde eine Lösung von 10 g Äthylbenzoyl-L-phenylalanyl-p-aminobenzoat in 50 ml Dimethylsulfoxid bei Raumtemperatur zugegeben. Nach 5 Stunden zeigte Dünnschichtchromatographie nichts von dem Ester mehr, und das Reaktionsgemisch wurde dann in ein Gemisch von 140 ml In HCl,

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1 1 Wasser und 1,5 kg Eis gegossen. Nach 1/2 Stunde wurde das Produkt abfiltriert, mit Wasser gewaschen und getrocknet.

Umkristallisation aus Äthanol und Wasser ergab 7 g der freien Säure, N-Benzoyl-L-phenylalanyl-p-aminobenzoesäure, Neutralisationsäguivalent 388, F. 245 bis 252° C, /J^J²³ _Ώ + 79° (1 % in DMF) .

Analyse: % C gefunden 70,8, Theorie 71,1; % H gefunden 5,4, Theorie 5,15; % N gefunden 7,0, Theorie 7.2.

Das DL-Isomer wurde in ähnlicher Weise aus ftthylbenzoyl-DL-phenylalanyl-p-aminobenzoat hergestellt und ergab einen kristallinen Feststoff, F. 248 bis 252° C. Das Natriumsalz von Benzoyl-L-phenylalanyl-p-aminobenzoesäure wurde durch genaue Neutralisation der freien Säure und Gewinnung durch Lyophilisierung hergestellt.

Beispiel 2

Herstellung von N-Benzoyl-L-phenylalanyl-p-aminohippursäure und des Natriumsalzes derselben

Nach dem Verfahren des Beispiels 1 wurde Benzoyl-L-phenylalanylp-aminohippursäure durch Hydrolyse von Methylbenzoyl-L-phenylalanyl-p-aminohippurat hergestellt.

Die Umsetzung war sehr viel schneller mit den Hippursäureestern, so daß sie nach 35 Minuten bei Raumtemperatur beendet war. Das Produkt schmolz bei'205 bis 208° C, /"^?²⁴ _D + 70,5° (1 % in DMF), Neutralisationsäguivalent 460. Die DL-Form erhielt man als farblosen Feststoff, F. 200 bis 202° C, mit der korrekten Analyse. Die Umsetzung war wiederum in 35 Minuten beendet.

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- ,24 -

Die Natriumsalze der L- und DL-Säuren wurden durch genaue Neutralisation der freien Säuren und Aufarbeiten durch Lyophilisieren erhalten.

Beispiel 3

Herstellung von N-Benzoyl-L-tyrosyl-p-aminobenzoesäure Ein Gemisch von L-Tyrosin (18,1 g, 0,1 Mol), Benzoylchlorid (7/0 g, 0,05 Mol) und 200 ml Tetrahydrofuran wurde hergestellt. Nach 2-stündigem Rühren unter Rückflußbedingungen wurde das Gemisch auf Raumtemperatur abgekühlt, und der Niederschlag von Tyrosinhydrochlorid wurde abfiltriert (11 g, 46 Milliäquivalente Cl ). Das Tetrahydrofuran wurde verdampft und der Rückstand mit Cd* ( 3 mal 100 ml unter Rückflußbedingungen, dann weggeworfen) extrahiert und sodann in Äthylacetat (200 ml unter Abfiltrieren unlöslicher Bestandteile aufgelöst. Die Äthylacetatlösung wurde eingedampft und ergab 13,2 g festes Produkt, F. 159 bis 162° C (93 %). Das Tyrosin wurde durch Neutralisation mit wäßrigem Alkali aus dem Hydrochlorid gewonnen (8g). Eine in ähnlicher Weise bereitete Probe besaß ZÖC7^D ₂₄ - 76° (1 % in DMF). Analyse: % C gefunden 67,1, berechnet 67,4; % H gefunden 5,2, berechnet 5,3; % N gefunden 4,8, berechnet 4,9.

Es wurde eine Lösung von N-Benzyl-L-tyrosin (5,7 g, 20 mMol) und N-Methylmorpholin (2,04 g, 20 mMol) in 60 ml Tetrahydrofuran bei -15° C bereitet, und hierzu wurde Äthylchlorformiat (2,08 g, 20 mMol) zugegeben. Nach 12 Minuten wurde p-Aminobenzoesäure (2,74 g, 20 mMol), gelöst in 25 ml Tetrahydrofuran und 0,38 g p-Toluolsulfonsäure (2 mMol) zugegeben, und man ließ die Tempera-

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tür auf 5 C ansteigen. Nach 2 Stunden und 40 Minuten wurde das Gemisch in 1 1 0,1η HCl eingegossen, 1/2 Stunde gerührt, filtriert und getrocknet, wobei man 8,7 g erhielt. F. 192 bis 223° C. Das Produkt wurde aus 90 ml Methanol und 40 ml Wasser umkristallisiert und ergab 6 g (74 %) des Produktes N-Benzoyl-L-tyrosyl-p-aminobenzoesäure, F. 240 bis 242° C, ΛΧ/^ς + 72,3° (1 % DMF).

Analyse: % C gefunden 68,1, berechnet 68,3; H gefunden 5,1, berechnet 5,0; % N gefunden 6,7, berechnet 6,9, Neutralisationsäquivalent 413 (Theorie 404).

Beispiel 4

Herstellung von N-Benzoyl-L-methionyl-p-aminobenzoesäure L-Methionin (8,94 g) und Benzoylchlorid (4,23 g) wurden zu 75 ml Tetrahydrofuran zugesetzt, und das Gemisch wurde unter Rückfluß 2 Stunden gekocht. Das Gemisch wurde gekühlt, unlösliches L-Methioninhydrochlorid wurde abfiltriert und mit 75 ml Tetrahydrofuran gewaschen. Die Lösung wurde auf -15 C gekühlt und es wurden zu ihr schnell N-Methylmorpholin (3,03 g) und Äthylchlorformiat 13,24 g) zugesetzt. Nach 12 Minuten wurde p-Aminobenzoesäure (4,11 g) und p-Toluolsulfonsäure (0,57 g), gelöst in 30 ml Tetrahydrofuran, zugesetzt. Nach 2 Stunden bei 5° C wurde das Gemisch in 1,5 1 kalte 0,ln HCl gegossen, filtriert und aus Äthylacetat umkristallisiert und ergab 6,4 g weißen Feststoff, N-Benzoyl-L-methionyl-p-aminobenzoesäure mit einem Schmelzpunkt von 205° C, Z^.7^D ₂4 ⁺ 65,7° (1 % in Dimethylformamid).

Analyse: % C gefunden 61,5, Theorie 61,3; % H gefunden 5,4, Theorie 5,4; % N gefunden 7,3, Theorie 7,5; % s gefunden 8,7, Theorie 8,6

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Beispiel 5

Herstellung von N-Acetyl-L-tyrosyl-p-aminobenzoesäure Zu einem Schlamm von L-Tyrosin (72,4 g) in 500 ml trockenem Tetrahydrofuran wurden 15,7 g Acetylchlorid zugesetzt. Das Gemisch wurde 18 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, und das Tyrosinhydrochlorid wurde durch Filtration entfernt. Das Filtrat wurde auf -15° C gekühlt, N-Methylmorpholin (20,2 g) und Äthylchlorformiat (21,7 g) wurden zugesetzt, und 15 Minuten später wurden p-Aminobenzoesäure (27,4 g) und p-Toluolsulfonsäuremonohydrat (3,8 g) zugegeben. Nach 1/2 Stunde bei -15° C wurde das Gemisch 3 Stunden bei 5 C gerührt und dann in 6 1 kalte 0,ln HCl gegossen, filtriert und getrocknet. Das Rohprodukt (47 g) wurde zunächst aus Äthanol, Äthylacetat und Petroläther und dann aus wäßrigem Methanol umkristallisiert. Das fertige umkristallisierte Produkt, N-Acetyl-L-tyrosyl-p-aminobenzoesäure,

26 g, schmolz bei 229 bis 231° C, /c^/^D _{25 5} + 91,5° (1 % in Dimethylformamid) , Neutralisationsäquivalent 367, theoretisch 342, % Stickstoff gefunden 7,7, Theorie 8,2.

Beispiel 6

Herstellung von N-Propionyl-L-tyrosyl-p-aminobenzoesäure Nach dem Verfahren des Beispiels 5 erhielt man unter Ersatz des Acetylchlorids durch 18,5 g Propionylchlorid 46 g Rohprodukt. Nach zwei Umkristallisationen wie in Beispiel 5 schmolz das Produkt, N-Propionyl-L-tyrosyl-p-aminobenzoesäure, bei 241 bis 242° C, /ÖC7^D _{25 5} + 89,6 (1 % in DMF), Neutralisationsäquivalent 372, theoretisch 256; % C gefunden 63,7, Theorie 64,1; % H gefunden 5,9, Theorie 5,6; % N gefunden 7,6, Theorie 7,9.

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Beispiel 7

Herstellung von N-Äthoxycarbonyl-L-tyrosyl-p-aminobenzoesäure Ein Gemisch von L-Tyrosin (36,2 g) und Äthylchlorformiat (10,9 g) in 200 ml Tetrahydrofuran wurde 24 Stunden unter Rückfluß erhitzt. Nach Entfernung des Tyrosinhydrochlorids durch Filtration wurde die Lösung auf -15° C gekühlt, und zu ihr wurde N-Methylmorpholin (10,1 g) und Äthylchlorformiat (10,9 g) und 15 Minuten später p-Aminobenzoesäure (13,7 g) und p-Toluoläulfonsäuremonohydrat (1,9 g) zugegeben. Nach 1/2 Stunde bei -15° C ließ man das Gemisch 24 Stunden bei 5° C stehen. Es wurde dann in angesäuertes Wasser gegossen, und der gummiartige Niederschlag wurde in 1 1 Äthylacetat extrahiert. Der Extrakt wurde über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und auf etwa 100 ml konzentriert, an welchem Punkt Feststoffe ausfielen. Die Lösung wurde erwärmt, um die Feststoffe aufzulösen, und dann auf -20° C abgekühlt, wobei 20 g Rohprodukt ausfielen. Dieses wurde erneut aus 100 ml Äthylacetat umkristallisiert, auf -20° C gekühlt und ergab 16 g gereinigte N-Äthoxycarbonyl-L-tyrosy!-p-aminobenzoesäure* LQj 25 5 ⁺ ^*'³ ^¹ * **ⁿ Dimethylformamid); Neutralisationsäquivalent 379 (Theorie 372), % C gefunden 61,8, Theorie 61,3; % H gefunden 5,7, Theorie 5,4; % N gefunden 7,3, Theorie 7,5.

Beispiel 8

Herstellung von N-Benzoyl-L-tyrosyl-^-amino-S^S-dimethylbenjBoe-

säure

Benaoyl-L-tyrosin (4,27 g) wurde in 100 ml Tetrahydrofuran gelöst und auf -20° C gekühlt. N-Methylmorpholin (1,52 g) und Äthyl-

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chlorformiat (1,65 g) wurden gleichzeitig zugesetzt, und das Gemisch wurde 10 Minuten bei -15° C gerührt. Zu ihm wurden 4-Amino-3,5-dimethy!benzoesäure (2,48 g) und p-Toluolsulfonsäure (0,28 g) zugesetzt. Nach 48 Stunden bei 0° C wurde das Reaktionsgemisch in 1,5 1 kalte 0,ln HCl gegossen, der feste Niederschlag wurde abfiltriert und aus Methanol und Wasser umkristallisiert und ergab 4,77 g N-Benzoyl-L-tyrosyl^-amino-SfS-dimethy!benzoesäure, F. 244 bis 248° C, /"0^7°₂₆ - 36,9°, Neutralisationsäquivalent 426, theoretisch 432.

Beispiel 9 Bewertung der Gallensuffizienz in vivo

Bei Ratten wurde entweder ein Gallenmangel oder ein Gallen- und Pakreasausscheidungsmangel erzeugt. Der Gallenmangel wurde in der Weise erzeugt, daß man die Gallenwege zwischen der Leber und dem Pankreas abband und beschnitt. Die so behandelten Ratten werden als BDLS-Tiere bezeichnet. Der Gallen- und Pankreasmangel wurde erzeugt, indem der übliche Gallenweg an seinem Punkt des Eintritts in den Zwölffingerdarm abgeschnürt wurde. Die so behandelten Ratten werden als P-BDLS-Tiere bezeichnet. Scheinoperierte Ratten (mit Bauschnitt) dienten als Kontrolltiere.

Nach Fasten über Nacht erhielten die Ratten 3 mg Fluoresceinäquivalente je Kilogramm entweder in der Form von Fluoresceindilaurat (FDL) oder von Fluoresceindihexanoat (FDH) in 0,5 ml Olivenöl. Danach erhielten sie entweder 6 ml Wasser oder eine 33 %-ige Lösung von Schweinegalle, die aus Gallenblasen von Schweinen erhalten worden war, welche einen Bauchschnitt erhalten hatten.

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Die Ratten wurden dann ohne Zugang zu Futter in die Aufzuchtkäfige zurückgeführt. Der Urin wurde 6 Stunden lang gesammelt und auf Fluorescein analysiert.

Der Greenberger-de Benneville-Test auf exocrine Pankreasfunktion unter Verwendung des Peptids, wie oben beschrieben, wurde am nächsten Tag bei den Ratten angewendet, die Fluoresceindihexanoat erhalten hatten. In diesem Test erhielten die Ratten 31 mg Natrium-N-benzoyl-L-tyrosyl-p-aminobenzoat je Kilogramm in 1 ml Wasser sowie 4 ml 0,5 %-ige NaHCO₃. Der Urin wurde 6 Stunden gesammelt und hinsichtlich der gesamten aromatischen Amine nach der Bratton-Marshall-Methode analysiert.

Die Tabelle zeigt eine Zusammenstellung der Resultate dieser Versuche in vivo.

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Tabelle

	Chirurgischer Eingriffs	Zahl der Ratten	Behandlung Fluorescein im mit 6-stÜndigem	11,0	+	Urin ('%) nach Sammeln
	Scheinoperation	3	FDL	8,0	+	7,7
	P-BDLS	2	Na-Fluorescein		0	1,8
	P-BDLS	2	FDL	22,3	+
	BDLS	2	Na-Fluorescein	0,4 3,9 70,2	± +	6,2
20982	BDLS BDLS Scheinoperation	6 2 3	FDL FDL + Salbe FDH	0,8 1,0 4,2	± + +	0,3 0,4 2,8
6/07S7	P-BDLS BDLS BDLS	2 _ . 2 3	FDH FDH FDH + Salbe	0,5 1,0 . 2,1

PABA° im Urin (%) nach
6-stündigem Sammeln

68,0 + 5,4
4,9 + 0,3
80,5 + 1,7
40,2 + 16,1

^a) P-BDLS- gewöhnlicher Gallenweg abgeschnürt und beschnitten unter Verursachung sowohl von Pankreas·* wie auch von Galleninsuffizienz* BDLS - Galienweg abgeschnürt und beschnitten unter Bildung

von Gallenmangel, aber keiner Pankreasinstiffizienz.
PABA * p-Aminobenzoesäure.

Freies Fluorescein wurde leicht absorbiert und ausgeschieden, ungeachtet der Anwesenheit von Pankreassaft oder Galle. Es gab auch Ausscheidung von Fluorescein bei den scheinoperierten Ratten, bei denen Fluoresceindihexanoat oder Fluoresceindilaurat verabreicht worden war. Die Fluoresceinausscheidung war jedoch praktisch 0, wenn Ratten mit Gallen- und/oder Pankreassaftmangel Dialkylfluoresceinester erhielten. Der Greenberger-de Benneville-Test wurde am folgenden Tag angewendet, und die Ergebnisse zeigen, daß dieser Test spezifisch für die Anwesenheit von Pan- W kreassaft war (niedriger Wert für P-BDLS).

Die Angaben in der Tabelle zeigen die Brauchbarkeit der Testmethode nach der Erfindung bei der Bewertung der Gallensuffizienz by Tieren mit normaler Pankreasenzymsekretion. Wenn andere Peptide gemäß der Formel I und/oder andere (C^-C g)-Dialkylester von Fluorescein verwendet wurden, erhielt man ähnliche Werte für die Gallensuffizienz.

Beispiel 10

fe Pharmazeutische Präparate

Nachfolgend sind Beispiele für pharmazeutische Präparate aufgeführt, die ein gegen Pankreasenzym empfindliches Peptid und Fluoresceinester enthalten. Im jedem Präparat sind die angegebenen Materialien in Gewichtsverhältnissen aufgeführt.

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Tabletten

Bestandteile Gewichtsteile

Natrium-N-benzoyl-L-phenylalanyl-p-aminobenzoat 500

Fluoresceindilaurat 500

Maisstärke 100

Äthylcellulose 20

Calciumstearat 30

Nach sorgfältigem Vermischen der obigen Bestandteile wurden Tabletten nach Standardmethoden derart hergestellt, daß sie 500 mg Peptid und 500 mg Fluoresceinester je Tablette enthielten.

Kapseln

Bestandteile Gewichtsteile

Natrium-N-benzoyl-L-tyrosyl-

p-aminobenzoat 500

Fluoresceindihexanoat 500

Maisstärke 50

Talkum 50

Die obigen Bestandteile wurden genügend miteinander verührt, um ein gleichmäßig pulverisiertes Produkt zu erhalten, das dann für das Füllen von Gelatinekapseln, sowohl hartschaliger wie auch weicher elastischer, benutzt wurde. Die Kapseln sollten so ausgewählt werden, daß sie solche Größe besitzen, daß sie eine ausreichende Menge Material aufnehmen könne, um 500 mg Peptid und 5OO mg Fluoresceinester je Einheit zu ergeben. Natürlich können auch größere oder kleinere Kapseln für verschiedene Konzentrationen an aktivem Mittel leicht verwendet werden, wenn dies erwünscht oder erforderlich ist.

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Claims

Patentansprüche

1/ Verfahren zur Bestimmung der Gallensuffizienz in einem tierischen oder menschlichen Organismus, dadurch gekennzeichnet, daß man innerlich eine wirksame Menge eines Peptids der allgemeinen Formel Q-NHQ¹CO-Q", worin Q eine Amin blockierende Gruppe, NHQ¹CO eine in Gegenwart einer Pankreasendopeptidase vom Peptid hydrolytisch abspaltbaren Aminosäuregruppe und Q" eine pharmakologisch verträgliche, analysierbare, in Gegenwart einer Pankreasendopeptidase unter Bildung einer analysierbaren Verbindung, die von dem Tier oder Mensch absorbiert und ausgeschieden werden kann, hydrolytisch von dem Peptid abspaltbare Gruppe bedeutet, außerdem innerlich eine wirksame Menge eines (C₄-C g)-Dialkylesters von Fluorescein verabreicht, den Urin des Organismus ausreichend lange sammelt, um eine Ansammlung der analysierbaren Verbindung und von Fluorescein zu gestatten, und sodann in dem gesammelten Urin durch Analyse die Menge der analysierbaren Ver-P bindung 'und die Menge von Fluorescein bestimmt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Peptid der allgemeinen Formel RCO-A-NHR¹CO-B_1n-NHZ verwendet, worin R ein Wasserstoffatom, eine Phenylgruppe, eine mit ein oder mehreren Halogenatomen, (C₁-C₄)-Alkylgruppen, Hydroxylgruppen, (C₁-C₄)-Alkoxygruppen, (C₁-C₄)-Alkanoyloxygruppen oder (C₁-C₄)-Alkoxycarbonylgruppen substituierte Phenylgruppe, eine (C.-C ₂)-Alkylgrupe, eine mit ein oder mehreren Halogenatomen, (C₁-C₄)-Alkoxygruppen, Hydroxylgruppen, (C₁-C₄)-Alkanoyloxygrup-

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pen, Polyalkoxyalkylgruppen oder Phenylgruppen substituierte (C-.-C. ₂) -Alkylgruppe, eine (C..-C ₂)-Alkoxygruppe, eine Aralkoxygruppe mit bis zu 10 Kohlenstoffatomen oder eine divalente Alkylengruppe mit bis zu 6 Kohlenstoffatomen bedeutet, NHR¹CO eine sich vom L-Phenylalanin, L-Tyrosin, L-Leucin, L-Methionin, L-Tryptophan, L-Arginin oder L-Lysin herleitende Aminosäure-Gruppe bedeutet, Z eine Gruppe der allgemeinen Formel

YR"

bedeutet, worin R" eine Hydroxylgruppe, eine (C₁-C₄)-Alkoxygruppe, eine (C₁-C₄)-Alkoxyalkoxygruppe, eine (C₁-Cg)-Dialkylaminoalkoxygruppe, eine Aminogruppe, eine (C ~C₄)-Monoalkylaminogruppe, eine (C₁-C.)-Dialkylaminogruppe, eine Gruppe der Formel -NHCH₂COR", oder ein Salz der Gruppe, in der R" eine Hydroxylgruppe bedeutet, ist, Y eine Gruppe der Formel -CO- oder -SO₃-ist, X eine Hydroxylgruppe, eine (C₁-C.)-Alkylgruppe, ein Halogenatom oder eine (C.-C₄)-Alkoxygruppe ist und n¹ 0, 1 oder 2 bedeutet, und A und B die Reste niedermolekularer Aminosäuren bedeuten und m und η 0, 1 oder 2 bedeuten.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Peptid verwendet, in dem η und m 0 sind.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Peptid verwendet, in dem R eine Phenylgruppe, eine (C₁-C₄)-Alkylgruppe oder (C₁-C₄)-Alkoxygruppe bedeutet.

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5. Verfahren nach Anspruch 3 und 4, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Peptid verwendet, in dem NHR¹CO den Phenylalanyl-, Tyrosyl- oder Tryptophylrest bedeutet.
6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man als Fluoresceinester Pluoresceindihexanoat oder Fluoresceindilaurat verwendet.
7. Verfahren nach Anspruch 3 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Peptid verwendet, in dem Z den 4-Carboxyphenylrest, das Natriumsalz des 4-Carboxyphenylrestes oder das Ammoniumsalz des 4-Carboxyphenylrestes bedeutet.
8. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Peptid verwendet, das aus N-Benzoyl-L-phenylalanyl-p-aminobenzoesäure, ihrem Natriumsalz oder ihrem Ammoniumsalz besteht.
9. Verfahren nach Anspruch 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß man als Peptid N-Benzoyl-L-tyrosyl-p-aminobenzoesäure, N-Acetyl-L-tyrosyl-p-aminobenzoesäure, N-Propionyl-L-tyrosyl-p-aminobenzoesäure, N-Butyryl-L-tyrosyl-p-aminobenzoesäure oder deren Natrium- oder Ammoniumsalze verwendet.
10. Verfahren nach Anspruch 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß man das Peptid und den Fluoresceinester in einer Menge von etwa 2 mg bis etwa 50 mg/kg Körpergewicht des menschlichen oder tierischen Organismus verabreicht.
11. Verfahren nach Anspruch 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß man den Urin des menschlichen oder tierischen Organismus etwa 4 bis 10 Stunden nach innerlicher Verabreichung des Peptids und des Esters sammelt.

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