DE69015208T2

DE69015208T2 - Glutamin- und asparginsäurederivate mit antigastrinwirkung und verfahren zu deren herstellung.

Info

Publication number: DE69015208T2
Application number: DE69015208T
Authority: DE
Inventors: Francesco Makovec; Angelo Rovati; Claudio Rovati
Original assignee: Rotta Research Laboratorium SpA
Current assignee: Rottapharm SpA
Priority date: 1989-11-02
Filing date: 1990-10-25
Publication date: 1995-05-04
Anticipated expiration: 2010-10-26
Also published as: WO1991006529A1; CA2067569A1; PT95766A; IT1238664B; IT8967937A0; ES2066232T3; DE69015208D1; EP0498830B1; EP0498830A1; JPH05501411A; IT8967937A1; ATE115550T1; AU6637690A

Description

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Glutaminsäure- und Asparaginsäure-Derivate sowie deren Verwendung für die Herstellung von Arzneimitteln zur therapeutischen Behandlung von Störungen, die durch Hypergastrinämie verursacht sind. Diese Derivate werden durch die allgemeine Formel dargestellt, die im folgenden angegeben ist:
in welcher n 1 oder 2 bedeutet, R&sub1; eine Phenylgruppe, die mit Chlor-, Methyl- oder Nitrogruppen mono- oder di-substituiert ist, darstellt, wobei Wasserstoff oder die Nitrogruppe in den Positionen 2 und 6 der Phenylgruppe und Wasserstoff, Chlor oder eine Methylgruppe in den Positionen 3 und 5 vorliegen können, und in welcher R&sub2; eine lineare oder verzweigte Alkylkette oder eine Cyclo-Alkylgruppe mit 5 bis 9 Kohlenstoffatomen bedeutet, wobei die Sterochemie an dem mit einem Asterix in Formel (I) markierten chiralen Zentrum DL oder D ist, inklusive ihrer pharmazeutisch verwendbaren Salze.
Insbesondere sind die bevorzugten Verbindungen innerhalb des Rahmens der Erfindung jene, die speziell in den folgenden Tabellen A und D beschrieben sind, sowie deren pharmazeutisch verwendbare Salze, wobei die am meisten bevorzugten Verbindungen jene sind, in welchen n für 2 steht, R&sub1; ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus 3-Chlorphenyl und 3,5- Dichlorphenyl und R&sub2; ausgewählt ist aud der Gruppe bestehend aus 3,3-Dimethybutyl, 4,4-Dimethylpentyl und 3,3-Methylethylpentyl.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen entfalten kräftige antagonistische Wirkungen gegenüber Gastrin ("kleines Gastrin" oder G-17) sowie gegenüber Pentagastrin, welches dessen biologisch aktive terminale Peptidsequenz ist.
Gastrin ist ein Polypeptidhormon, das von den Zellen der antralen und duodenalen Schleimhäute ausgeschieden wird, wobei dessen Ausscheidung insbesondere durch einen Nervenmechanismus über die Vagusanregung induziert wird.
Sobald das Gastrin einmal ausgeschieden ist, strömt es über den Blutstrom zu den parietalen Zellen, die hauptsächlich in der Fundus-Schleimhaut angeordnet sind und aktiviert sie, indem es sich an die Membranrezeptoren der Zellen bindet. Diese Aktivierung regt die bildung von HCl und dessen Ausscheidung in den Magenhohlraum an.
Hyperaktivität dieses Systems führt zu der Hypersekretion von Magensäure, die für den Organismus schädliche Folgen haben kann.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen gehöhren zu einer allgemeineren Klasse von Glutaminsäure- und Asparaginsäure-Derivaten, die allgemein in der US-PS A-4 791 215, die auf den Namen der Anmelderin lautet, beschrieben sind. Unter den verschiedenen Wirkungen, die bezugnahmend auf die Klasse von Verbindungen, die Gegenstand des obigen Patentes sind, erwähnt werden, sind jene von besonderem Wert, die sich auf die kräftigen Wirkungen bei der Inhibierung von Cholecystokinin (CCK) inverschiedenen Versuchsmodellen beziehen. Zum Beispiel inhibierte die mit C-7 (Lorglumid) bezeichnete Verbindung die in den Gallenblasen von Meerschweinchen durch CCK-8 (10 ng/ml) induzierte Kontraktion in vitro um 50 % bei einer Konzentration von 0,06 mog/ml, was etwa 15 mal mehr als die Inhibierung des Antagonisten ist. Die in dem obigen Patent zpeziell beschriebenen Verbindungen waren jedoch inaktiv oder nur schwach aktiv als Inhibitoren von Pentagastrin (vgl. zum Beispiel Eur. J. Med.Chem. (1986)-21, S. 9-20), obwohl das Gastrin mit CCK nahe verwandt ist, da das C-terminale Pentapeptid Gly-Trpt- Met-Asp-PheNH&sub2; den beiden Polypeptiden gemeinsam ist. Das führte zu der Annahme, daß sie hauptsächlich mit der der Tripeptidsequenz CCK-(26-28) in Wechselwirkung treten, ohne die Rezeptorstruktur zu stören, die für die Wechselwirkung mit der terminalen Pentapeptidsequenz CCK-(29-33) verantwortlich ist, die den beiden Hormonen CCK und Gastrin gemeinsam ist, was somit das Gegenteil dessen ist, das bei den erfindungsgemäßen Verbindungen stattfindet, die kräftige Antigastrin-Wirkungen und geringe oder keine Wirkung gegen CCK aufweisen.
Die vorliegende Erfindung beruht daher auf den folgenden Überlegungen: die Anti-CCK-Wirkungen der Verbindungen des oben erwähnten Patentes beruhen auf der gleichzeitigen Anwesenheit einer sauren Gruppe, die als Lösungsvermittler dient, und von 3 lipophilen Einheiten, die geeignete Größen und geeignete Abstände aufweisen, das heißt zwei Alkylsubstituenten (entsprechend den beiden R&sub2;-Gruppen in Formel I) und ein geeignet substituierter Phenylring (entsprechend den Substituenten R&sub1; in Formel I).
Zur Gewinnung von Verbindungen mit hohen Antigastrin- Wirkungen sind jedoch, wie im Fall der erfindungsgemäßen Verbindungen, die Anwesenheit der saueren Gruppen und des Phenylrings (R&sub1;) mit geeigneten Substituenten (die jedoch nicht mit jenen der anderen Serie zusammenfallen, das heißt, mit den Anti-CCK-Verbindungen) immer noch notwendig, wogegen die Anwesenheit von nur einer hydrophoben Alkylgruppe geeigneter Länge und sterischer Größe bei R&sub2; wesentlich ist.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der Derivate der Formel (I), in welcher n, R&sub1; und R&sub2; die oben angegebenen Bedeutungen haben, sowie ihrer pharmazeutisch verwendbaren Salz für die Herstellung eines Arzneimittels zur therapeutischen Behandlung von durch Hypergastrinämie induzierten Zuständen.
Wie bereits erwähnt, haben die erfindungsgemäßne Verbindungen kräftige und spezifische Antigastrin-Wirkungen in verschiedenen Versuchsmodellen, sowohl in vivo als auch in vitro. Tatsächlich inhibieren die kräftigsten dieser Verbindungen bei wenig mehr als nanomolaren Konzentrationen die Bindung von Pentagastrin-Tritiat an die Magenschleimhautdrüsen von Meerschweinchen und an die Corticalmembranen von Mäusen.
In vivo zeigen sie hohe Wirkungen gegen die Säureausscheidung, indem sie den durch Pentagastrin induzierten sekretorischen Stimulus in einer dosisabhängigen Weise blockieren. Diese Wirkung ist spezifisch, da die erfindungsgemäßen Verbindungen jene Sekretionen nicht blockieren, die zum Beispiel durch Carbachol oder Histamin induziert werden.
Die Verbindungen können daher mit Vorteil in der Behandlung und Prevention verschiedener Störungen beim Menschen verwendet werden, bei welchen es vorteilhaft ist, die stimulierende Wirkung von Gastrin zu blockieren, zum Beispiel bei Geschwüren oder Gastro-Duodenitis, die auf einer durch einen hypergastrinämischen Zustand induzierten übermäßigen gastrischen Sekretion, dem Zollinger-Ellison-Syndrom, beruhen, oder bei der Behandlung verschiedener Tumor-Formen, die durch Hypergastrinämie unterstützt sind.
Auf der Basis ihrer kräftigen Wirkungen, die sie als Inhibitoren der Bindung von Gastrin im Bereich des CNS entfalten, könnten die in Rede stehenden Verbindunge auch eine Wirkung gegenüber manchen Arten mentaler Störungen entfalten, die auf das Ungleichgewicht in den physiologischen Neurongehalten von Gastrin oder anderen damit verwandten bioaktiven Peptiden zurückzuführen sind.
Das Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Derivate mit den chiralen Zentren in der DL-Form ist gekennzeichnet durch die folgenden Stufen, die dargestellt werden können durch:
a) Umsetzung eines internen Anhydrids der Formel:
worin n und R&sub1; die oben angegebene Bedeutung haben, mit einem primären Amin der Formel R&sub2;-NH&sub2;, worin R&sub2; die oben angegebene Bedeutung hat, in einem Molverhältnis von 1 bis 5 in einem Lösungsmittel, wie etwa in Wasser, Ethylacetat, Dioxan, Acetonitril, Tetrahydrofuran oder einer Mischung derselben, bei einer Temperatur zwischen -20ºC und 30ºC und Gewinnung der Verbindungen der Formel I aus der Reaktionsmasse durch fraktionierte Kristallisation oder andere übliche Verfahren.
Das folgende Beispiel ist zur besseren Erläuterung der Erfindung angegeben.

Herstellung von (+ )-4-[(3-Chlorbenzoyl)-amino]-5-(3,3-dimethylbutylamino)-5-oxopentansäure (Verbindung A-5 in Tabelle Z)

26,8 (0,1 Mol) 3-Chlorbenzoyl-glutaminsäure-Anhydrid wurden in einen Reaktor eingebracht und in 100 ml Wasser suspendiert. Die Suspension wurde auf etwa 5ºC abgekühlt und es wurden 25,3 g (0,25 Mol) 3,3-Dimethylbutylamin tropfenweise während eines Zeitraums von etwa 15 Minuten zugesetzt. Die Mischung wurde 3 Stunden bei dieser Temperatur reagieren gelassen und dann mit Eisessig angesäuert. Sie wurde filtriert, mit Wasser bis zu neutralem pH gewaschen und getrocknet. Das erhaltene Rohprodukt wurde aus Alkohol/H&sub2;O (3:2) kristallisiert. Es wurden 19,6 g erhalten. Ausbeute 53 %. Schmp.: 194-195ºC. TLC (Isoamylalkohol-Aceton-H&sub2;O:5/2/1 - V/V); Rf: 0,78.
Die folgende Tabelle A zeigt in beispielhafter Weise viele Ausführungsformen dieser Verbindungen mit einigen ihrer identifizierenden Merkmale ebenso wie mit den erhaltenen Ausbeuten. TABELLE A: Derivate ( -Serie) der Formel VERBINDUNGEN SCHMELZPUNKT KRISTALLISATION LÖSUNGSMITTEL FORMEL AUSBEUTE 3-Chlor-phenyl Pentyl 3-Methylbutyl (isopentyl) Hexyl 4-Methylpentyl (isohexyl) 3,3-Dimethylbutyl 3-Methylpentyl Cyclohexyl Heptyl 4,4-Dimethylpentyl 3,3-Dimethylpentyl 3-Ethylpentyl Alkohol TABELLE A - Fortsetzung VERBINDUNGEN SCHMELZPUNKT KRISTALLISATION LÖSUNGSMITTEL FORMEL AUSBEUTE 3-Chlor-phenyl 3-Methylphenyl 3,5-Dichlorphenyl 3,5-Dimethylphenyl 2-Nitro-5-chlor-phenyl Cycloheptyl 3,3-Methylethylpentyl 3,3-Diethylpentyl 2-(Dicyclo[2.2.1]heptylethyl 3,3-Methylethyl-4-methylpentyl Pentyl Hexyl Cyclohexyl 3,3-Dimethylpentyl 3,3-Methylethylpentyl Cycloheptyl Methanol Alkohol(*) Eluiermittel: Isoamylalkohol/Aceton/Wasser :5/2/1-V/V
Das Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Derivate mit chiralen Zentren in der D-Form ist durch die folgenden Stufen gekennzeichnet, die dargestellt werden können durch:
a) Umsetzung des Gamma-Benzylesters der N-Carbobenzoxy-D- glutaminsäure mit einem Amin der Formel R&sub2;-NH&sub2;, in welcher R&sub2; die oben angegebene Bedeutung hat, nach der Methode der gemischten Anhydride in einem inerten wasserfreien Lösungsmittel bei einer Temperatur zwischen -15ºC und +15ºC zur Gewinnung von Verbindungen der Formel (III); (vgl. folgendes Scheme)
b) Debenzylierung und Decarbobenzoxylierung der Verbindung der Formel (III), die in einem inerten Lösungsmittel gelöst ist, durch Reaktion derselben mit Wasserstoff bei Raumtemperatur und Atmosphärendruck in Gegenwart einer katalytisch wirksamen Menge eines Hydrierungskatalysators zur Gewinnung von Derivten der Formel (II) (vgl. das folgende Scheme);
c) Umsetzung der Derivate der Formel (II) unter Schotten- Baumann-Bedingungen mit einer äquivalenten Menge eines Acylchlorids der Formel R&sub1;-COCl, in welcher R&sub1; die oben angegebene Bedeutung hat, bei einer Temperatur von 0ºC bis 15ºC und Gewinnung des D-4-Acylamino-5-alkylamino-5-oxopentansäure-Derivates der Formel (I) aus der Reaktionsmasse.
Die Abfolge der Stufen des erfindungsgemäßen Verfahrens ist als Ganzes in dem folgenden Scheme dargestellt: HYDRIERUNG ACYLIERUNG (Stufe) (*) chirales Zentrum in der D-Form.
Die Amidierungsstufe (a) wird bei einer Temperatur von vorzugsweise zwischen -115ºC und -10ºC während eines Zeitraums von 1 bis 24 Stunden, vorzugsweise während 6 Stunden, durchgeführt, wobei die Reagenzien in stoichiometrischem Verhältnis vorliegen. Das bevorzugten Lösungsmittel für die Reaktion wird ausgewählt aus Chloroform, Dioxan und Tetrahydrofuran.
Der Hydrierungsschritt (b) wird vorzugsweise in Gegenwart einer Menge zwischen 0,02 und 0,001 Grammatomen Palladium pro Mol der Verbindung (III) auf einem Kohlenstoffträger in methanolischer Lösung bei Raumtemperatur und -druck in reinem Wasserstoffstrom während eines Zeitraums von 1 bis 12 Stunden, vorzugsweise 3 Stunden, durchgeführt. Die Acylierungsstufe (c) wird vorzugsweise bei einer Temperatur von etwa 5ºC während eines Zeitraums von 1 bis 24 Stunden, vorzugsweise während 12 Stunden, durchgeführt.
Die folgenden Beispiele sind zur besseren Erläuterung der Erfindung angegeben.

Beispiel 2

Herstellung des Benzylesters der D-4-Carbobenzoxyamino-5-(3,3-dimethylbutylamino)-5-oxopentansäure (Verbindung B&sub1; der Tabelle B).
37,1 g (0,1 Mol) des Gamma-Benzylesters der N-Carbobenzoxy-D-glutaminsäure wurden in 250 ml wasserfreiem Tetrahydrofuran gelöst, die Lösung wurde auf -10ºC abgekühlt und es wurden 10,1 g (0,1 Mol) Triethylamin unter Rühren zugesetzt. Anschließend wurden 10,8 g (0,1 Mol) Ethylchlorocarbonat zugesetzt, immer noch bei -10ºC. Die Temperatur wurde 20 Minuten bei -10ºC gehalten und dann wurden 10,1 g (0,1 Mol) 3,3-Dimethylbutylamin zugesetzt. Die Mischung wurde weitere 6 Stunden gerührt, wobei die Temperatur auf Raumtemperatur anstieg; die Mischung wurde zur Trockene eingedampft und der Rückstand in Ethylacetat aufgenommen.
Es wurde mit 2N HCl, Natriumbicarbonat und schließlich mit Wasser gewaschen und dann über wasserfreiem Na&sub2;SO&sub4; getrocknet. Durch Einengung auf ein kleines Volumen wurde ein öliger Rückstand erhalten (MG 454,5), der beim Stehen spontan kristallisierte. Das erhaltene Rohprodukt wurde aus Dioxan- Wasser (1:1) kristallisiert. TLC: Rf 0,78 [Methylenchlorid-Alkohol 9/1 (V/V)]. Schmp.: 104-106ºC.
Es wurden 35,0 g produziert. Ausbeute 77 %.
Alle Verbindungen der Formel III wurden durch das gleiche Verfahren (vgl. obige Schemata) synthetisiert. Die folgende Tabelle B zeigt einige der so erhaltenen Verbindungen mit manchen ihrer identifizierenden Merkmale. TABELLE B: Derivate der Formel VERBINDUNG SCHMELZPUNKT FORMEL 3,3-Dimethylbutyl 4,4-Dimethylpentyl 3,3-Methylethylpentyl Cyclopentyl wachsartiger Feststoff (1) Eluiermittel: Methylenchlorid/Alkohol (2) Eluiermittel: Chloroform/Ethylacetat

Beispiel 3

Herstellung der D-4-Amino-5-(3,3-dimethylbutyl-5-oxopentansäure (Verbindung C&sub1; in Tabelle C).
45,4 g (0,1 Mol) des Benzylesters der D-4-Carbobenzoxy-amino-5-(3,3-dimethylbutyl-5-oxopentansäure (Verbindung B&sub1;) wurden in 300 ml Methanol gelöst, worauf 1 g 10 % Palladium auf Kohle zugesetzt wurde und die Mischung bei Raumtemperatur mit einem Wasserstoffstrom während 3 Stunden hydriert wurde. Der Katalysator wurde abfiltriert und das Methanol unter Vakuum destilliert. Ein öliger Rückstand (MG 286,4) wurde erhalten, der beim Stehen kristallisierte und eine chromatographische Reinheit von mehr als 95 % aufwies. TLC: Rf 0,62 [n-Butanol-Essigsäure-H&sub2;O 5/2/2 (V/V)]. Schmp.: 132-133ºC.
Es bildeten sich 18,6 g. Ausbeute 81 %.
Alle Verbindungen der Formel II wurden auf die gleiche Weise synthetisiert (vgl. Scheme).
Die folgende Tabelle C zeigt die so erhaltenen Verbindungen mit einigen ihrer identifizierenden Merkmale. TABELLE C Derivate der Formel: VERBINDUNG SCHEMLZPUNKT FORMEL 3,3-Dimethylbutyl 4,4-Dimethylpentyl 3,3-Methlethylpentyl Cycloheptayl wachsartiger Feststoff amorpher (*) Eluiermittel: n-Butanol-Essigsäure-H&sub2;O (5-2-2/V:V)

Beispiel 4

Herstellung von D-4-(3-Chlorbenzoylamino)-5-(3,3-dimethylbutylamino)-5-oxopentansäure (Verbindung D-1 in Tabelle D).
23,0 G (0,1 Mol) D-4-Amino-5-(3,3-dimethylbutyl-5- oxopentansäure (Verbindung C1) wurden in 300 ml Wasser suspendiert und dann unter Rühren und Zusatz von 10,6 g (0,1 Mol) Natriumcarbonat gelöst. 17,5 g (0,1 Mol) 3-Chlorbenzoylchlorid wurden dann während eines Zeitraumes von 1 Stunde bei 0ºC unter Rühren zugesetzt.
Die Mischung wurde 12 Stunden reagieren gelassen.
Sie wurde mit verdünnter HCl auf Kongorot angesäuert und der so gebildete Niederschlag wurde abfiltriert. Die Kristallisation wurde mit Isopropylether/Ethylacetat (3:2) durchgeführt.
Schmp.: 129-132ºC. TLC (Isoamylalkohol-Aceton-H&sub2;O: 5/2/1): Rf 0,78,
29,5 g wurden erhalten (MG 368,9). Ausbeute 80 %.
Drehvermögen: [alpha]²&sup0;D = 1,90º (c = 4,0 % in Methanol).
Alle Verbindungen der Formel I (vgl. Schema) wurden nach dem gleichen Verfahren synthetisiert.
Die folgende Tabelle D zeigt die so erhaltenen Verbindungen mit einigen ihrer identifizierenden Merkmale ebenso wie mit den erhaltenen Ausbeuten.
Zur Prüfung der optischen Reinheit der durch die oben beschriebene stereo-konservative Synthese hergestellten Verbindungen wurde eine HPLC-Analyse unter Verwendung einer Macherey-Nagel Resolvosil/-BSA 7 Säule als stationäre Phase mit 0,1 M Phosphatpuffer (pH 8) + 5 % n-Propanol als mobile Phase durchgeführt.
Die in Tabelle D angegebenen Verbindungen zeigten in allen Fällen eine optische Reinheit von mehr als 95 %. Die Retentionszeiten sind in der Tabelle angegeben. TABELLE D: Derivate (D-Serie) der Formel: VERBINDUNGEN SCHMELZPUNKT (ºC) KRISTALLISATION LÖSUNGSMITTEL HPLC RETENTIONSZEIT (Min.) DREHVERMÖGEN [alpha] in Methanol FORMEL AUSBEUTE ANMERKUNG 3,3-Dimethylbutyl 4,4-Dimethylpentyl 3,3-Methylethylpentyl Cycloheptyl Isopr. ether/Et Acetat Alkohol-H&sub2;O (1) Isoliert als das Kalziumsalz. (2) Zum Vergleich gezeigte L-Serie.
Die Anti-Säuresekretionswirkungen der erfindungsgemäßen Verbindungen, die bei einem Antigastrin-Mechanismus entfaltet werde, wurden mit Hilfe einer Reihe pharmakologischer Tests, sowohl in vitro als auch in vivo analysiert und im folgenden dokumentiert.

Untersuchung der Bindung an isolierte Meerschweinchen-Magendrüsen

Die Kapazität einiger der Verbindungen, die Gegenstand der Erfindung sind, zur Inhibierung der Bindung von Pentagastrin-[beta-Alanyl-3-3H(N)] an die Gastrin-Rezeptorstellen in den parietalen Zellmembranen der Fundus-Schleimhaut eines Meerschweinchen-Magens wurde durch Vergleich mit der Verdrängung von Pentagastrin bewertet, wobei diese durch Proglumid, eine Referenz-Antigastrin-Verbindung, durch Lorglumid, welches ein oben erwähnter kräftiger CCK-Antagonist ist, und durch die Verbindung D5, die der optische Antipode (das Enantiomer der L-Serie) der Verbindung D1 ist, induziert wird.
Männliche Meerschweinchen mit einem Gewicht von etwa 400-500 g wurden verwendet. Nach dem Töten des Meerschweinchens wurde dessen Magen entnommen und in oxigenierten SPB- Puffer bei 37ºC eingebracht (SPB = Salz-Phosphat-Puffer: 149,6 mM NaCl, 3 mM K&sub2;HPO&sub4;, 0,64 mM NaH&sub2;PO&sub4;, pH 7,3).
Nach dem Waschen in dem Puffer wurde der Magen auf eine Petri-Schale gelegt und der antrale Teil verworfen.
Die Schleimhaut des verbleibenden Teils wurde von dem darunterliegenden Muskelteil abgetrennt und dann zerkleinert und in einen Kolben übertragen, der eine Collagenase-Verdauungslösung, 0,1 % BSA und 0,2 % Glukose enthielt. Die Lösung wurde bei 37ºC 10 Minuten unter Rühren und unter einem O&sub2;-Strom inkubiert.
Während der Inkubationszeit wurde das Gewebe mehrere Male durch eine Reihe von Pipetten mit abnehmenden Durchmessern hindurch geschickt, um die Verdauung desselben zu erleichtern. Am Ende dieses Zeitraums wurde das Gewebe entfernt und bei 1000 Upm zentrifugiert. Die beim Zenrifugieren entstehende überstehende Flüssigkeit wurde verworfen und das Pellet mehrere Male zur Entfernung von Collagenase mit einem EDTA-enthaltenden Waschpuffer gewaschen.
Die Drüsen wurden dann aus dem unverdauten Gewebe durch übliche Verfahren isoliert, in Hepes-Puffer zur Bindung suspendiert und gemeinsam mit einem radioaktiven Tracer und den zu untersuchenden Verbindungen 30 Minuten bei 25ºC inkubiert.
Nachdem die überstehende Flüssigkeit durch Zentrifugieren entfernt worden war, wurde mit Hilfe eines Flüssigs- Scintillators die mit dem Pellet verbundene Radioaktivität bestimmt. Die spezifische Bindung wurde als der Unterschied zwischen der Bindung in Abwesenheit und in Anwesenheit von 10&supmin;&sup6; M Pentagastrin bestimmt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt, die die IC50-Werte angibt, das heißt die Konzentration (in Molen/Liter) des Antagonisten, der 50 % des Pentagastrin-Tritiats von dem Rezeptor verdrängen kann. TABELLE 1 : Inhibierung der Bindung von Pentagastrin [beta-Alnyl-3-3H(N)] - an isolierte gastrische Drüsen des Meerschweinchens VERBINDUNG IC50 (Mole/Liter) Pentagastrin Proglumid Lorglumid (1): Diese Verbindungen wurden zum Vergleich untersucht.
Es ist aus den in der Tabelle angegebenen Daten ersichtlich, daß die erfindungsgemäßen Verbindungen die Bindung von Pentagastrin um 50 % in molaren Konzentrationen zwischen 10&supmin;&sup5; und 10&supmin;&sup8; in Abhängigkeit von ihrer Struktur antagonisieren.
Die aktivsten Verbindungen erreichen diese Wirkung bei einer molaren Konzentration von etwa 5 x 10&supmin;&sup8; und sind somit 100 mal wirksamer als der spezifische Antagonist (kaltes Pentagastrin), wodurch sie eine hohe Spezifität der Wirkung zeigen. Proglumid, das ein Antigastrin-Referenz-Arzneimittel darstellt, ist etwa 10.000 mal weniger aktiv als die wirksamsten Verbindungen der Serie, während Lorglumid, das ein spezifischer Antagonist von CCK ist, etwa 200 mal weniger aktiv ist. Die Verbindung D5, die ein Derivat der L-Serie ist, ist etwa 10 mal weniger wirksam als die entsprechende Verbindung D1, die dessen Enantiomer der D-Serie ist.

Untersuchung der Bindung an Membranen des cerebralen Cortex von Mäusen

Die Verdrängungskapazitäten einiger erfindungsgemäßer Verbindungen, die am aktivsten in dem oben beschriebenen Vesuchsmodell waren, sollten in diesem Fall durch Verwendung des zentralen Gastrinrezeptors als Substrat bewertet werden. Es wurden daher Membranen des cerebralen Cortex verwendet und Pentagastrin-Tritiat wurde neuerlich als Ligand eingesetzt.
Mäuse-Cortexgewebe wurde kalt in 20 Volumsteilen Tris-Puffer (pH 7,7) homogenisiert. Nach dem Waschen und Zentrifugieren wurde das endgültige Pelet in 20 Volumsteilen Bindungspuffer, der unter anderem TRIS, BSA und Bacitracin enthielt, suspendiert, 0,4 ml der so erhaltenen Membran wurden dann mit einem radioaktiven Tracer und mit den zu untersuchenden Verbindungen 40 Minuten lang bei 37ºC inkubiert.
Nachdem die überstehende Flüssigkeit durch Zentrifugieren abgetrennt worden war, wurde die mit dem Pellet in Verbindung stehende Radioaktivität ebenfalls wieder mit einem Flüssig-Scintillator bestimmt. Die spezifische Bindung ist die Differenz zwischen der Bindung in Abwesenheit und in Anwesenheit von 10&supmin;&sup6; M Pentagastrin.
Die erhaltenen Ergebisse sind in Tabelle 2 gezeigt. Auch hier sind die IC50-Werte der untersuchten Verbindungen angegeben, wobei sie die oben angegebene Bedeutung haben.
Es ist aus den in Tabelle 2 angegebenen Daten ersichtlich, daß die aktivsten erfindungsgemäßen Verbindungen IC50-Werte der Größenordnung von 10&supmin;&sup8; M aufweisen. Ihre relativen Potenzen sind gleich jenen, die oben für die Bindung an die gastrischen Drüsen beschrieben wurden. Tatsächlich sind die aktivsten Verbindungen etwa 100 mal weniger kräftig als der spezifische Antagonist (Pentagastrin) und etwa 100 mal kräftiger als der CCK-Antagonist Lorglumid. In diesem Fall sind die Derivate der D-Serie (Verbindung D1) wieder etwa 10 mal aktiver als die entsprechenden L-Enantiomeren (Verbindung D5). Diese Ergebnisse helfen aufzuzeigen, daß die zentralen und peripheren Gastrinrezeptoren eine gemeinsame Struktur zu haben scheinen, und gleichzeitig können diese Tatsachen von praktischem Interesse sein, da sie einen möglichen günstigen Einsatz für die erfindungsgemäßen Produkte bei der Behandlung cerebraler Störungen, die auf Ungleichgewichte in den physiologischen Neurongehalten von Gastrin zurückzuführen sind, vorhersagen. TABELLE 2 : Inhibierung der Bindung von Pentagastrin [beta-Alanyl-3-3H(N)] - an Corticalmembranen der Maus VERBINDUNG IC50 (Mole/Liter) Pentagastrin Proglumid (1) Lorglumid (1) (1) : Diese Verbindungen wurden zu Vergleichszwecken untersucht.
Zur Bestätigung der Antigastrin-Wirkung, die durch diese in vitro-Studien gezeigt wurde, wurden die erfindungsgemäßen Verbindungen auch in vivo nach dem im folgenden beschriebenen Versuchsmodell untersucht.

Antisekretorische Wirkung in anästhesierten Ratten

Die antisekretorische Wirkung wurde an Ratten unter Verwendung von männlichen Tieren mit einem Gewicht von etwa 200 g, die mit Urethan anästhesiert waren, bestimmt. Die gastrische Sekretion wurde mit Pentagastrin stimuliert. Es wurde das Verfahren von K.S. Lai (Gut 5, (1964), 327-341) mit geringen Modifikationen verwendet.
Nach der Tracheotomie wurden Kanülen in die Speiseröhre und den Zwölffingerdarm eingesetzt. Eine lauwarme Lösung (38ºC) von 0,25 mM NaOH wurde mit Hilfe einer peristaltischen Pumpe in einer konstanten Strömungsgeschwindigkeit von 1 ml/Minute durch den magen strömen gelassen. Nach einer Stabilisationszeit von 20 Minuten wurde die Dosis des Stimulans nach den Angaben von Tabelle 3, gelöst in einer physiologischen Lösung, 120 Minuten mit einer Geschwindigkeit von 0,95 ml/Stunde hindurchströmen gelassen. Nach 60 Minuten Perfusionszeit (Grundstimulierung) wurden die zu untersuchenden Produkte intravenös (I.V.) in einem Bolus verabreicht, während die Perfusion des Stimulans weitere 60 Minuten fortgesetzt wurde. Die Säureausscheidung wurde kontinuierlich als eine Funktion der Zeit aufgezeichnet.
Die Wirkung des Produkts wurde als Herabsetzung der ausgeschiedenen Acidität nach Verabreichung des Produkts als Prozentsatz der Grund-Acidität bewertet, die während der ersten 60 Minuten Auffangzeit gemessen wurde, während welcher nur Pentagastrin anwesend war.
Die untersuchten antagonistischen Verbindungen wurden in unterschiedlichen Dosen verabreicht, sodaß eine ID50 (das ist jene Dosis (in mg/kg I.V.), die die Wirkung des Pentagastrins um 50 % inhibieren kann, bereichnet werden konnte.
Die so erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle angegeben, in der die Wirkungen der Verbindungen als ID50-Werte unter dem Stimulus von Pentagastrin mit 30 mcg/kg/h ausgedrückt sind. TABELLE 3 : Antagonistische Wirkung (ED50 mg/kg IV) gegenüber der durch Pentagastrin (30 mcg/kg/h) induzierten gastrischen Säuresekretion VERBINDUNG Proglumid Lorglumid
Die Antigastrin-Wirkung war im Fall der Glutaminsäure-Derivate (n = 2), wenn R&sub1; für 3-Chlorphenyl oder 3,5- Chlorphenyl steht, oder wenn die Alkylgruppe in R&sub2; eine Länge von höchstens 4 oder 5 Kohlenstoffatomen hatte und an ihrem (distalen) Ende im Abstand von der sekundären Amidgruppe ausreichend verzweigt war, besonders günstig.
Es sei festgehalten, daß die erfindungsgemäßen Vervindungen, die bei diesem Versuchsmodell am wirksamsten waren, etwa 15 mal wirksamer als die Antigastrin-Vergleichsverbindung Proglumid waren. Es ist auch interessant festzuhalten, daß der CCK-Antagonist Lorglumid bis zu einer Dosis von 100 mg/kg vollständig wirkungslos war.
Die Wirkung dieser Verbindungen gegen gastrische Sekretion ist insbesondere an ihre Antigastrin-Wirkung gebunden. Tatsächlich zeigen sie keine anticholinergische oder Antihistamin-Wirkung (Anti-H&sub2;), da sie vollständig inaktiv waren, wenn in dem oben beschriebenen Versuchsmodell Carbachol (30 mcg/kg/h) oder Histamin (2,3 mg/kg/h) als Stimulans verwendet wurden.
Die Wirkung der erfindungsgemäßen Verbindungen scheint sogar noch bemerkenswerter, wenn man ihre niedrige Toxizität in Betracht zieht. Zum Beispiel hat die Verbindung D1 einen LD50-Wert IV bei Mäusen von etwa 600 mg/kg. Die toxische Dosis (LD50) liegt in diesem Fall etwa 20 mal höher als die Antigastrin-Dosis (ID50).

Anticholecystokinin (Anti-CCK) Wirkung

Zur Überprüfung der Hypothese, daß die molekulare Übereinstrimmung der gegenständlichen Verbindungen geeignet ist, um ihnen spezifische antagonistische Wirkungen gegenüber Gastrin und nicht gegenüber CCK zu verleihen, wurde die antikontrahierende Wirkung einiger erfindungsgemäßer Verbindungen an Meerschweinchen-Gallenblasen, die in vitro durch CCK-8 simuliert wurden, untersucht.
Ein Längsstreifen einer Meerschweinchen-Gallenblase wurde in ein Bad für isolierte Organe in Anwesenheit von Krebs bei einer Temperatur von 32ºC eingebracht und wurde kontinuierlich mit einer Mischung von Sauerstoff und CO&sub2; (95-5 V/V) oxigeniert.
Die isometrischen Kontraktionen wurden mit Hilfe eines Kraftüberträgers bestimmt und aufgezeichnet.
Die Gallenblase wurde unter Verwendung einer Konzentration von 10 ng/ml CCK-8 kontrahiert; die antagonistische Wirkung der Verbindungen gegenüber der Kontraktionswirkung des CCK wurde unter Verwendung verschiedener Konzentrationen bestimmt und auf diese Weise wurde der IC50-Wert, das heißt die Konzentration in mcg/ml der Verbindung, die zur 50%igen Antagonisierung der Kontraktionswirkung des CCK befähigt ist, bestimmt.
Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle angegeben, in welcher die untersuchten Verbindungen und die IC50, die nach der Regressionsmethode an einer Reihe von mindestens 3 Test für jede untersuchte Verbindung berechnet wurden, angeführt sind. Tabelle 4: Anti-CCK-Wirkung (Konzentration 10 ng/ml), ausgedrückt als IC50 in mcg/ml an Meerschweinchen-Gallenblasen in vitro VERBINDUNG IC50 WIRKUNG (mcg/ml) Lorglumid
Eine Prüfung der Tabelle zeigt, daß die beanspruchten Verbindungen die kontrahierende Wirkung von CCK-8 bei einer solchen Konzentration antagonisieren, daß die kontrahierende Wirkung des aktivsten der untersuchten Derivate, der Verbindung A13, etwa 500 mal größer war als die von Lorglumid, was zeigt, daß sie nur wenig oder keine Anti-CCK-Wirkung aufweisen.

Der inhibierende Einfluß auf die Geschwindigkeit des durch Pentagastrin induzierten Wachstums von normalen und tumorösen Dickdarmzellen

Gastrin hat eine trophische Wirkung auf das Verdauungsepithel. Die chronische Verabreichung von Gastrin (oder Pentagastrin, dem biologisch wirksamen Teil des physiologischen Hormons) an Ratten verursacht daher Hyperplasie der Fundusschleimhaut und der Schleimhaut des Dickdarms. In neuerer Zeit wurde gezeigt, daß Gastrin das Wachstum eines transplantierbaren Maus-Dickdarmtumors, der durch chemische Induktion hervorgerufen wird, stimuliert (Winsell et al. Surgical Forum, 33, 384 (1982).
Auf der Basis dieser Voraussetzung war es wünschenswert zu untersuchen, ob die spezifischen Gastrin-Antagonisten gemäß der Erfindung das Wachstum von experimentell induzierten gastrointestinalen Tumoren antagonisieren können.
Ein erfindungsgemäßer Gastrin-Antagonist, der einer der aktivsten in den oben beschriebenen Tests war, nämlich die Verbindung A5, wurde für diesen Zweck ausgewählt. Männliche Mäse mit einem Gewicht von 20-25 g wurden subcutan im Interscapular-Bereich mit einer Suspension von 8 x 10&sup4; Tumorzellen eines Maus-Dickdarm-Adenokarzinoms inokuliert.
Es wurden jeweils 5 Gruppen von 10 Tieren verwendet, das heißt: eine Kontrollgruppe von Tieren, eine Gruppe von Tieren, die mit 250 mcg/ml Pentagastrin zweimal pro Tag behandelt wurden, und zwei Gruppen von Tieren, die mit der Verbindung A5 in Dosen von 15 bzw. 30 mg/kg i.p. zweimal pro Tag und zusätzlich mit Pentagastrin in der oben beschriebenen Weise behandelt wurden.
Nach 20 Tagen wurden die Tiere getötet und die Fundus-Schleimhaut sowie die Tumoren wurden entfernt, gewogen und extrahiert, um ihren DNA-Gehalt zu bestimmen. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle angegeben. TABELLE 6 : Antagonistische Wirkung der Verbindung A-5 auf das Pentagastrin-induzierte tumoröse Dickdarmwachstum GRUPPEN ANZAHL d. TIERE GEWICHT DER FUNDUSSCHLEIMHAUT (mg) Student FUNDUS DNA GEWICHT DES COLON-TUMOR (mg) TUMORÖSE DNA (mg) Vergleich Pentagastrin (*) : P < 0.01 (**) : P < 0.001
Die Daten in Tabelle 6 zeigen, daß Pentagastrin eine signifikante Hyperplasie der Fundus-Schleimhaut sowie eine signifikante Zunahme des Gewichts des Dickdarmtumors und dessen DNA-Gehalts verursacht. Die Verbindung A5 kann beide oben erwähnten trophischen Effekte von Pentagastrin in einer signifikanten und dosisabhängigen Weise inhibieren.

Claims

1. Glutaminsäure- und Asparaginsäure-Derivate der allgemeinen Formel

in welcher n 1 oder 2 bedeutet, R&sub1; eine Phenylgruppe, die mit Chlor-, Methyl- oder Nitrogruppen mono- oder disubstituiert ist, darstellt, wobei Wasserstoff oder die Nitrogruppe in den Positionen 2 und 6 der Phenylgruppe und, unabhängig voneinander, Wasserstoff, Chlor oder die Methylgruppe in den Positionen 3 und 5 vorliegen können, und in welcher R&sub2; eine lineare oder verzweigte Alkylkette oder eine Cycloalkylgruppe mit 5 bis 9 Kohlenstoffatomen bedeutet, wobei die Stereochemie an dem mit einem Asterix in Formel (I) markierten chiralen Zentrum DL oder D ist, sowie deren pharmazeutisch verwendbare Salze.

2. Ein Derivat der Glutaminsäure nach Anspruch 1, worin R&sub1; ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus 3-Chlorphenyl und 3,5-Dichlorphenyl und R&sub2; ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus 3,3-Dimethylbutyl, 4,4-Dimethylpentyl und 3,3- Methylethylpentyl, wobei die Stereochemie des chiralen Zentrums DL oder D ist, sowie deren pharmazeutisch verwendbare Salze.

3. Verbindungen nach Anspruch 1, und zwar:

DL-4-[(3-Chlorbenzoyl)-amino]-5-(pentylamino)-5-oxopentansäure,

DL-4-[(3-Chlorbenzoyl)-amino]-5-(methylbutylamino)-5-oxopentansäure,

DL-4-[(3-Chlorbenzoyl)-amino]-5-(hexylamino)-5-oxopentansäure,

DL-4-[(3-Chlorbenzoyl)-amino]-5-(3,3-dimethylbutylamino)-5- oxopentansäure,

DL-4-[(3-Chlorbenzoyl)-amino]-5-(3-methylpentylamino)-5-oxopentansäure,

DL-4-[(3-Chlorbenzoyl)-amino]-5-(cyclohexylamino)-5-oxopentansäure,

DL-4-[(3-Chlorbenzoyl)-amino]-5-(heptylamino)-5-oxopentansäure,

DL-4-[(3-Chlorbenzoyl)-amino]-5-(4,4-dimethylpentylamino)-5- oxopentansäure,

DL-4-[(3-Chlorbenzoyl)-amino]-5-(3,3-dimethylpentylamino)-5- oxopentansäure,

DL-4-[(3-Chlorbenzoyl)-amino]-5-(3-ethylpentylamino)-5-oxopentansäure,

DL-4-[(3-Chlorbenzoyl)-amino]-5-(cyclopentylamino)-5-oxopentansäure,

DL-4-[(3-Chlorbenzoyl)-amino]-5-(4-methylpentylamino)-5-oxopentansäure,

DL-4-[(3-Chlorbenzoyl)-amino]-5-(3,3-methylethyl-pentylamino)- 5-oxopentansäure,

DL-4-[(3-Chlorbenzoyl)-amino]-5-(3,3-diethylpentylamino)-5- oxopentansäure,

DL-4-[(3-Chlorbenzoyl)-amino]-5-(2-(dicyclo[2.2.1]-heptyl)- ethylamino)-5-oxopentansäure,

DL-4-[(3-Chlorbenzoyl)-amino]-5-(3,3-methyl-4-methylpentylamino)-5-oxopentansäure,

DL-4-[(3,5-dichlorbenzoyl)-amino]-5-(3,3-dimethylbutylamino)- 5-oxopentansäure,

DL-3-[(3-Chlorbenzoyl)-amino]-4-(3,3-methylethylpentylamino)- 4-oxopentansäure,

DL-3-[(3-Chlorbenzoyl)-amino]-4-(cycloheptylamino)-4-oxobutansäure,

D-4-[(3-Chlorbenzoyl)-amino]-5-(3,3-dimethylbutylamino)-5-oxopentansäure,

D-4-[(3-Chlorbenzoyl)-amino]-5-(4,4-dimethylpentylamino)-5- oxopentansäure,

D-4-[(3-Chlorbenzoyl)-amino]-5-(3,3-methylethylpentylamino)-5- oxopentansäure,

D-4-[(3-Chlorbenzoyl)-amino]-5-(cycloheptylamino)-5-oxopentansäure,

und deren pharmazeutisch verwendbare Salze.

4. Eine pharmazeutische Zusammensetzung, die mindestens eine der Verbindungen nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder ein pharmazeutisch verwendbares Salz derselben als Wirkstoff und einen pharmazeutisch verwendbaren Träger enthält.

5. Die Verwendung von Glutaminsäure- und Asparaginsäure-Derivaten nach Anspruch 1 oder eines pharmazeutisch verwendbaren Salzes derselben zur Herstellung eines Arzneimittels zur therapeutischen Behandlung von Störungen, die durch Hypergastrinämie hervorgerufen sind.

6. Die Verwendung eines Derivates nach Anspruch 1 zur Herstellung eines Arzneimittels für die therapeutische Behandlung von Ulcera.

7. Die Verwendung eines Derivates nach Anspruch 1 zur Herstellung eines Arzneimittels für die therapeutische Behandlung von tumorösen Zuständen, die durch Gastrin oder andere damit verwandte bioaktive Polypeptide unterstützt sind.

8. Die Verwendung eines Derivates nach Anspruch 1 zur Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung von pathologischen Zuständen des CNS im Zusammenhang mit einem Ungleichgewicht in den physiologischen Neurongehalten von Gastrin oder anderen damit verwandten bioaktiven Polypeptiden.

9. Ein Verfahren zur Herstellung eines Glutaminsäure- oder Asparaginsäure-Derivates der Formel (I), worin n, R&sub1; und R&sub2; die in Anspruch 1 angegebenen Bedeutungen haben und worin Substituenten an dem chiralen Zentrum (mit einem Asterix markiert) die DL-Konfiguration aufweisen, dadurch gekennzeichnet, daß es folgende Stufen umfaßt:

a) Umsetzung eines internen Anhydrids der Formel (IV)

worin n und R&sub1; die oben angegebene Bedeutung haben, mit einem primären Amin der Formel R&sub2;-NH&sub2;, worin R&sub2; die oben angegebene Bedeutung hat, in einem Molverhältnis von 1 bis 5 bei einer Temperatur von -10ºC bis 10ºC und Gewinnung der Verbindungen (I) aus der Reaktionsmasse.

10. Ein Verfahren zur Herstellung eines Glutaminsäue- oder Asparaginsäure-Derivates der Formel (I), in welcher n, R&sub1; und R&sub2; die in Anspruch 1 angegebenen Bedeutungen haben und in welcher die Substituenten an dem chiralen Zentrum (mit einem Asterix in Formel (I) markiert) die (D)-Konfiguration haben, dadurch gekennzeichnet, daß es die folgenden stereokonservativen Stufen umfaßt:

a) Umsetzung des gamma-Benzylesters der N-Carbobenzoxy-D- glutaminsäure mit einem Amin der Formel H&sub2;NR&sub2;, in welcher R&sub2; die oben angegebene Bedeutung hat, nach der Methode der gemischten Anhydride bei einer Temperatur zwischen -15ºC und +15º in einem inerten wasserfreien Lösungsmittel und Gewinnung der Verbindungen (III) aus der Reaktionsmasse;

b) Debenzylierung und Decarbobenzoxylierung der Verbindung der Formel (III), die in einem inerten Lösungsmittel, wie Methanol, gelöst ist, dadurch Reaktion derselben mit Wasserstoff bei Raumtemperatur und Druck in Gegenwart einer katalytisch wirksamen Menge eines Hydrierungskatalysators und Gewinnung der Verbindungen (II) aus der Reaktionsmasse;

c) Umsetzung der Derivate der Formel (II) unter Schotten- Baumann-Bedingungen mit einer äquimolaren Menge eines Acylchlorids der Formel R&sub1;-CO-Cl, in welcher R&sub1; die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung hat, bei einer Temperatur von 0 bis 15ºC und Gewinnung der Derivate der Formel (I) mit der D-Konfiguration aus der Reaktionsmasse.