PT95766A - Processo para a preparacao de derivados do acido aspartico e glutamico com actividade antigastrina - Google Patents

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ROTTA RESEARCH LABORATORIUM SPA "PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE DERIVADOS DO ÁCIDO ASPÁRTICO E GLUTÂMICO COM ACTIVIDADE ANTIGASTRINA" A presente invenção tem por objecto os derivados do ácido glutâmico e aspártico e a sua utilização para a preparação de medicamentos para o tratamento terapêutico de perturbações induzidas por hipergastrinémia. Estes derivados são representados pela fórmula geral

CO OH

I

I (CH2)n (I) (*) CH-NH~CO-R1 CO-NH-R2 na qual n representa 1 ou 2, R-^ representa um grupo fenilo mono- ou dissubstituído com átomos de cloro, ou grupos metilo ou nitro, de tal modo que o átomo de hidrogénio ou o grupo nitro podem estar presentes nas posições 2 e 6 do núcleo fenílico e o átomo de hidrogénio, cloro ou o grupo metilo podem estar presentes nas posições 3 e 5, e em que R2 representa uma cadeia -2-

alquilo linear ou ramificada ou um grupo cicloalquilo com 5 a 9 átomos de carbono, sendo DL ou D a estereo-química do centro quiral marcado com um asterisco na fórmula (X), incluindo os seus sais aceitáveis sob o ponto de vista farmacei-tico.

Em particular, os compostos preferidos no âmbito da presente invenção são os especificamente descritos nos Quadros A e D adiante e os seus sais aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico, sendo os compostos mais preferidos aqueles em que n representa 2, R-^ representa um grupo 3-clorofenilo ou 3,5-diclorofenilo e R.2 representa um grupo 3,3-dimetilbutilo, 4,4-dimetilfenilo ou 3,3-metiletilpentilo.

Os compostos da presente invenção apresentam forte activi-dade antagonística relativamente à gastrina ("pequena gastrina" ou G-17) e relativamente a pentagastrina que e a sua sequência peptídica terminal biologicamente activa. A gastrina ê uma hormona polipeptídica segregada pelas células das mucosas antral e duodenal, sendo a sua secreção induzida, em particular, por um mecanismo nervoso através de excitação do vago. -3-

Uma vez segregada, a gastrina fluí, através da circulação do sangue para as células parietais situadas, principalmente, na mucosa fúngica e, por ligação aos receptores das membranas das células, activa-os. Esta activação inicia a formação de HC1 e a sua secreção na cavidade gástrica. A hiperactividade deste sistema origina a hiper-secreção de ácido gástrico que pode ter consequências prejudiciais para o organismo.

Os compostos da presente invenção pertencem a uma classe mais geral de derivados do ácido glutâmico e aspártico que estão, em geral, descritos na patente de invenção norte-americana Δ-4 791 215 em nome da requerente. Entre as várias actividades mencionadas relativamente ã classe de compostos que é o objectivo da patente anterior, os relacionados com a sua poderosa actividade na inibição da colecistocinina (CCK) em vários modelos experimentais foram de valor particular. Por exemplo, o composto designado C-7 (lorglumida) inibia a contracção induzida por CCK-8 (lOng/ml) em vesículas biliares de cobaias, in vitro, era 50%, a uma concentração de 0,06 mcg/ml, a qual é aproximadamente 15 vezes superior à do antagonista. Os compostos especificamente descritos na patente de invenção anterior eram, contudo, inactivos ou apenas ligeiramente activos como inibidores de pentagastrina (ver, por exemplo Eur. J. Med. Chem., 21 (1986) 9-20) mesmo apesar da gastrina estar intimamente relacionada com CCK, uma vez que, o pentapeptído Gly-Trpt-Met-Asp-PhenE^ C-terminal é comum aos dois polipeptídos. Isto leva a supôr que eles interagem, principalmente, com a sequência tripeptídica CCK-(29-33) sem interferirem com a estrutura receptora que é responsável pela interacção com a sequência pentapeptídica terminal CCK-(29-33) que é comum às duas hormonas CCK e gastrina, o que é assim oposto do que ocorre com os compostos da presente invenção, que possuem actividade anti-gastrina forte e pequena ou nenhuma actividade contra CCK. A presente invenção relaciona-se, assim, com as considerações seguintes: as actividades anti-CCK dos compostos da patente de invenção atrás referida são devidas â presença simultânea de um grupo ácido que actua como um solubilisador e de 3 unidades liofílicas de tamanho adequado e espaçadas de forma adequada, isto á, dois substituintes alquilo (correspondendo a dois grupos representados por na formula geral I) e um núcleo fenílico adequadamente substituído (correspondente ao substituinte representado por R^ na fórmula geral I).

Contudo, para se obterem compostos com actividade anti--gastrina elevada, como no caso dos compostos desta invenção, é ainda necessária a presença do grupo ácido e no núcleo fenílico (R^) com substituintes adequados (que não coincidem, contudo, com os de outras séries, isto é, com os compostos anti-CCK), embora a presença de, apenas, um grupo alquilo hidrófobo de -5- comprimento e volume espacial adequados seja essencial em

Um outro objecto da presente invenção é a utilização dos derivados de fórmula geral (I), na qual n, R^ e R2 têm os significados definidos antes, e os seus sais aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico, para a preparação de um medicamento para o tratamento terapêutico de estados induzidos por hipergas-trinêmia.

Como já se referiu, os compostos possuem actividade anti--gastrina forte e específica em vários modelos experimentais, tanto in vivo como m vitro. De facto, para concentrações ligeira mente superiores a nanomolares, o composto mais poderoso inibe a ligação de triciato de pentagastrina às glândulas da mucosa gástrica de porcos da índia e âs membranas cortiçais de ratos.

In vivo, apresentam actividades elevadas contra a secreção de ácido, e bloqueamento dos estímulos secretários induzidos pela pentagastrina, de uma forma dependente da dose. Esta actividade ê específica, uma vez que os compostos que são objecto desta invenção não bloqueiam as secreções induzidas, por exemplo, por carbacol ou histamina.

Os compostos podem, assim, utilizar-se, com vantagem, no tratamento e prevenção de várias perturbações no homem, nas quais é vantajoso bloquear a actividade estimulante da gastrina, -6- úlceras ou gastro-duodenites resultantes da secreção gástrica excessiva induzida por um estado hipergastrinémico, no síndroma de Zollinger-Ellison, ou no tratamento de várias formas de tumor que são favorecidas pela hipergastrinémia.

Com base na sua forte actividade como inibidores da ligação de gastrina ao nível do SNC, os compostos em questão podem também apresentar actividade relativamente a algumas espécies de perturbações mentais atribuídas a um desequilíbrio nos níveis de neujrónios fisiológicos de gastrina ou outros peptídos bioactivos relacionados. 0 processo para a preparação dos derivados desta invenção com centros quirais na forma DL é caracterizado pelos passos seguintes que se podem representar por : a) reacção de um anidrido interno de fórmula geral CO---------- I i (ΟΗ«)η I 0 CH-NH-CO-R-^

CO -7- / .¾ na qual n e R-^ tem os significados definidos antes, com uma amina primária de fórmula geral na qual R-2 tem o significado definido antes, em uma relação molar compreendida entre 1 e 5, no seio de um dissolvente, tal como, água, acetato de etílo, dioxano, acetonitrilo, tetra-hidrofurano ou uma sua mistura, a uma temperatura compreendida entre -20°C e 30°C, e recuperação dos compostos de fórmula geral (I) a partir da massa reaccional, por cristalização fraccionada ou outros métodos convencionaos.

Os exemplos seguintes são apresentados a fim de ilustrarem melhor a invenção.

Preparação de ácido (+)-A-[(3-clorobenzoil)-amino]-5-(3,3-dimetil-butilamino)-5-oxopentanóico (composto A-5 no Quadro Z)

Introduzem-se 26,8 g (0,1 mole) de anidrido 3-clorobenzoil-glutâmico num reactor e fez-se a suspensão em 100 ml de água. Arrefeceu-se a suspensão a aproximadamente 5°C e adicionaram-se, gota a gota, 25,3 g (0,25 mole) de 3,3-dimetilbutilamina, durante um período de aproximadamente 15 minutos. Deixou-se a mistura reagir durante 3 horas a esta temperatura e, depois, acidificou-se com ácido acético glacial. Filtrou-se lavou-se com água até ficar neutra e secou-se. Cristalizou-se o produto bruto obtido, em uma mistura de álcool/água (3:2). Obtiveram-se 19,6 g. Rendimento -8- / 53%; p.f. : 194°-195°C. TLC (álcool isoamílico-acetona-água; 5/2/1, v/v) : R£. 0,78. 0 Quadro A adiante apresenta, a título de exemplo, muitos exemplos destes compostos com algumas das suas características de identificação, assim como os rendimentos obtidos. QUADRO A: derivados (séries.DL) de fórmula geral 8 íP Pd I O O i

CM

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Δ sequência dos passos do processo de acordo com a presente invenção é ilustrada, como um1'todo, pelo esquema seguinte : C00CHo-^Õ^ C00CH7-^Õ^

, 2·\ / W ! - ! (CH2) 2 Ãmidação -> (CH2) 2 1 1 CH-NH-CO-O- 1 1 CH^ÕV \_/ 1 - CH-NH-CO-O j \_/ COOH CO-NH-R2 (passo a) III Hidrogenação COOH 1 Acilação COOH 1 1 (CH2)2 í R^-CO-Cl 1 (CH2> 2 1 (passo b) I CH-NH2 1 (*) CH-NH-CO-R 1 1 CO-NH-R2 (passo c) { CO-NH-R2 (*) centro quiral na forma D. 0 passo de amidaçao (a) efectua-se a uma temperatura compreendida, de preferência, entre -15°C e -10°C durante um período de 1 a 24 horas, de preferência durante 6 horas, com os

tf reagentes numa relação estequiométrica. 0 dissolvente preferido para a reacção é seleccionado entre clorofórmio, dioxano e tetra-hidrofurano. 0 passo de hidrogenação (b) efectua-se, de preferência, na presença de uma quantidade compreendida entre 0,02 e 0,001 átomos de paládio por mole de composto (III), sobre um suporte de carvão, numa solução metanólica, à temperatura e pressão ambientes, numa corrente de hidrogénio e durante um período de 1 a 12 horas, de preferência durante 3 horas. O passo de acilação (c) efectua-se de preferência, a uma temperatura de, aproximada-mente 5°C, durante um período de 1 a 24 horas, de preferencia durante 12 horas.

Os exemplos seguintes são apresentados para melhor ilustrar esta invenção. EXEMPLO 2

Preparação do éster benzilico do ácido D-4-carbobenzoxiamino--5-(3,3-dimetilbutilamino)-5-oxopentanóico (composto B-^ do Quadro B).

Dissolveram-se 37,1 g (0,1 mole) do éster gama-benzílico do ácido N-carbobenzoxi-D-glutâmico em 250 ml de tetra-hidrofurano anidro, arrefeceu-se a solução a -10°C e adicionaram-se 10,1 g 14- (0,1 mole) de trietilamina, sob agitação. Adicionaram-se, depois, 10,8 g (0,1 mole) de clorocarbonato de etilo, ainda a -10°C. Manteve-se a temperatura a -10°C durante 20 minutos e, depois, adicionaram-se 10,1 g (0,1 mole) de 3,3-dimetilbutilamina. Deixou-se ficar a mistura, sob agitação, durante mais 6 horas, até retomar a temperatura ambiente; evaporou-se a mistura até â secura e retomou-se o resíduo com acetato de etilo.

Lavou-se com ácido clorídrico 2N, hidrogenocarbonato de sódio e, finalmente, água e, depois, secou-se sobre Na2SO^ anidro. Por concentração até um volume pequeno, obteve-se um resíduo oleoso (p.m. 454,5) que cristalizou, espontaneamente, em repouso. Cristalizou-se o produto bruto obtido, em uma mistura de dioxano--água (1:1). TLC: Rf 0,78 [cloreto de metileno-álcool 9/1 (v/v)]. Ponto de fusão : 104°-106°C.

Obteve-se 35,0 g rendimento de 77%.

Todos os compostos de fórmula geral (III) foram sintetizados pelo mesmo método (ver os esquemas anteriores). 0 Quadro B adiante apresenta alguns dos compostos assim obtidos com algumas das suas características de identificação.

-15 M QUADRO B Derivados de fórmula geral

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Cloreto de metileno/álcool (9:1) cu P C3 CU 3 rH Φ cs -16- ,-/

EXEMPLO 3

Preparação de ácido D-4-amino-5-(3,3-dimetilbutil-5-oxopenta-nóico (composto C-^ no Quadro C).

Dissolveram-se 45,4 g (0,1 mole) do éster benzílico do ácido D-4-carbobenzoxiamino-5-(3,3-dimetilbutil)-5-oxopentanóico (composto B-j^) em 300 ml de metanol, ao qual se tinha adicionado 1 g de paládio a 10% sobre carvão, e hidrogenou-se â temperatura ambiente com uma corrente de hidrogénio durante 3 horas.

Filtrou-se o catalisador e destilou-se o metanol sob vazio. Obteve-se um resíduo oleoso (p.m. 286,4) que cristalizou em repouso e que possuía uma pureza cromatográfica superior a 95%. TLC: Rf 0,62 [n-butanol/ácido acético/água 5/2/2 (V/V)3. Ponto de Fusão : 132°-133°C.

Produziram-se 18,6 g. Rendimento de 81%.

Todos os compostos de fórmula geral (II) foram sintetizados pelo mesmo processo (ver esquema). 0 Quadro C adiante apresenta os compostos assim obtidos com algumas das suas características de identificação. -17- ·· QUADRO C Derivados de fórmula geral

CO CO CO CO <d o o o o CM CM CM CM t> 5 w S S (NI -d- CD CM QÍ CM CM CM CM O w tn w W t—1 CM CO CM t—1 rH t—1 rH U o o υ * CM cn VD cO m vD CO Λ *\ A m O o O o Pi o o CG m 0 o V4 ÍCtí h o CO 0 O) O S 0 00 o CD cti co CN s r—1 0 rH 0 0 o 1 1 Ό o o •H o •rl CM rH <r rH O OO Ό CM iO 4-> i—1 co rH CD s o (¾ o rH O •H O »—1 4-1 t—I •t-l PJ «p| 4-1 cu 4-> tí (¾ b CU 1 rO (¾ i—1 1 1 •rH O 1—1 rH 4-1 rH •H •H CU •H CM 4-1 4-1 1 4-1 Pi d) CU rH P· 0 0 •»H CU 1 1 4-1 Λ *H •H CU s 1 O 1 1 1—1 CO CO o •c •v •rH CO <r . co o co O H co I—1 CN cn o o o o o P-i a o o eluente: n-butanol/ácido acético/H^o (5/2/2/V:V) EXEMPLO 4

Preparação do ácido D-4-(3-clorobenzoilamino)-5-(3,3-dimetil-butilamino)-5-oxopentanóico (composto D-l no Quadro D).

Fez-se a suspensão de 23,0 g (0,1 mole) de ácido D-4-amino--5-(3,3-dimetilbutilo-5-oxopentanóico (composto CL) em 300 ml de água e, depois, dissolveu-se, sob agitação, por adição de 10,6 g (0,1 mole) de carbonato de sódio. Adicionaram-se, depois, 17,5 g (0,1 mole) de cloreto de 3-clorobenzoilo durante um período de 1 hora a 0°C, sob agitação.

Deixou-se a mistura reagir durante 12 horas.

Acidificou-se até obter o vermelho do Congo com ácido clorídrico diluído e filtrou-se o precipitado assim formado. Cristalizou-se com éter isopropílico/acetato de etilo (3:2). P.F.: 129°-132°C. TLC (álcool isoamílico/acetona/água : 5/2/1): Rf 0,78.

Obtiveram-se 29,5 g (p.m. 368,9). Rendimento de 80%.

Rotação específica: = 1,90° (c = 4,0% em metanol).

Todos os compostos de fórmula geral (I) (ver esquema) foram sintetizados pelo mesmo processo. -19- 0 Quadro D adiante apresenta os compostos assim obtidos com algumas das suas características de identificação, assim como com os rendimentos obtidos.

Para verificar a pureza õptica dos compostos obtidos pela síntese é estéreo-conservativa atrás descrita, efectua-se a análise de HPLC utilizando uma coluna de Macherey-Nagel Resolvosil/-BSA 7 como fase estacionária e tampão fosfato 0,1 M (pH 8) + 5% de n-propanol como fase móvel.

Os compostos apresentados no Quadro D revelaram uma pureza óptica superior a 95% em todos os casos. Os tempos de retenção apresentam-se no Quadro. -20- • i QUADRO D: Derivados (série D) de fórmula geral o CS o B I B <N B 1 o ^ g5 CS 1 1 o B B O u— -u—u- -ϋ cd p o s •H| O Ό P Pi Pi a) cu U g cd \—l 3 g n tO m o CMQ , ° 1 7 !Cd*rl « O O o g ίϋ cd cu cd CU 4-1 +j PP O CU O Mt4 B cu <p g 0 '-s i cd cd Tempc de O o 3 p CU 3 4-J S CU ·γ-4 Pt g O cu icd 4-) Ol Pi cd cu N olv de •iH rH tf CG 4-1 CD CD •H P Pt o O o •Μ λ\ l Oj « Ο 3 Ph B u o <S) B w o H co o CM s o u

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As actividades anti-secreção de ácido dos compostos desta invenção, apresentadas através de um mecanismo antigastrina, foram analisadas por meio de uma série de ensaios farmacológicos, in vitro e in vivo e indicam-se adiante.

Estudos da ligação a glândulas de estômago de porcos da índia

Avaliou-se a capacidade de alguns compostos, que são objecto desta invenção, para inibirem a ligação de pentagastrina-[beta--alanil-3-3H(N)] aos sítios receptores de gastrina nas membranas de células parietais da mucosa fundica de um estômago de porco da Índia, por comparação com o deslocamento da pentagastrina induzido por proglumina, que é um composto antigastrina de referência, por lorglumida, que é um antagonista de CCK poderoso anteriormente mencionado, e com o composto D5 que é o antípoda óptico (o enantiómero da série L) do composto Dl.

Utilizaram-se cobaias machos pesando, aproximadamente, 400-500 g. Depois de se matarem as cobaias,removeram-se os seus estômagos e colocaram-se em tampão SPB oxigenado a 37°C (SPB = = tampão de fosfato salino: NaCl 149,6 mM, Κ2ΗΡ0^ 3mM, NaEyPO^ 0,64 mM, pH 7,3).

Depois de lavagem no tampão, colocou-se o estômago numa placa de Petri e regeitou-se a parte antral.

Removeu-se a mucosa da parte remanescente, da parte muscular subjacente e, depois, cortou-se em pedaços e transferiu-se para um frasco que continha uma solução de digestão de colagenase, 0,1% de BSA e 0,2% de glucose. Incubou-se a solução a 37°C durante 10 minutos, com agitação e sob uma corrente de oxigénio.

Durante o período de incubação, passou-se o tecido, várias vezes, através de uma série de pipetas com diâmetros decrescentes a fim de facilitar a sua digestão. Ao fim deste período removeu-se o tecido e centrifugou-se a 1000 rpm. Regeitou-se o líquido sobrenadante resultante da centrifugação e lavou-se o agregado várias vezes com um tampão de lavagem contendo EDTA, para remover a colagenase.

Isolaram-se então as glândulas do tecido não digerido, por técnicas convencionais, suspenderam-se em tampão Hepes para ligação e incubaram-se em conjunto com um marcador radioactivo e com os compostos em ensaio, durante 30 minutos a 25°C.

Depois de se ter removido o líquido sobrenadante, por centrifugação, determinou-se a radioactividade associada ao agregado com um cintilador líquido. Determinou-se a ligação específica como a diferença entre a ligação na ausência e na — fi presença de pentagastrina 10” M.

Os resultados obtidos apresentam-se no Quadro 1 que dá a CI50, isto é, a concentração (em moles/lítro) do antagonista capaz de deslocar 50% do triciato de pentagastrina, do receptor. -23- -23- Cd 5 ϋ W cd bb <cd cd 4-1 § P< 0) 0 icd U< cd

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Nota (1): ensaiaram-se estes compostos para -^24-

Pode verificar-se nos dados apresentados no Quadro que os compostos que são objecto desta invenção antagonizam a ligação de pentagastrina em 50%, a concentrações molares compreendidas -5 -8 entre 10" e 10 , de acordo com as suas estruturas.

Os compostos mais activos atingem esta actividade a uma concentração molar de, aproximadamente, 5 x 10 e, assim, aproximadamente 100 vezes superiores â do antagonista específico (pentagastrina fria), apresentando, portanto, uma especificidade de acção elevada. A proglumida, que é um fármaco de referência da antigastrina, é, aproximadamente, 10000 vezes menos activa do que os compostos mais potentes da série, embora a lorglumida, que é um antagonista específico de CCK, seja aproximadamente 200 vezes menos activa. 0 composto D5, que é um derivado da série L, é, aproximadamente, 10 vezes menos activo do que o composto Dl correspondente, que é o seu enantiómero da série D. ESTUDOS DE LIGAÇÃO ÃS MEMBRANAS DO CÓRTÉX CEREBRAL DE RATOS.

Avaliaram-se as capacidades de deslocamento de alguns dos compostos desta invenção que eram os mais activos no modelo experimental atrás descrito, mas, neste caso, com a utilização dos receptores de gastrina centrais como substrato. Utilizaram-se, assim, membranas de córtex cerebral e utilizou-se, de novo, triciato de pentagastrina como ligante. -25-

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Homogeneizou-se tecido de córtex de ratos em 20 volumes de tampão Tris (pH 7,7). Depois de lavagem e centrifugação, fez-se a suspensão, de novo, do agregado final, em 20 volumes de tampão ligante contendo, inter alia, TRIS, BSA e bacitrina. Incubaram-se 0,4 ml da membrana, assim obtida, com um marcador radioactivo e com os compostos em ensaio durante 40 minutos a 37°C.

Depois de se ter removido o líquido sobrenadante por centrifugação, determinou-se novamente a radioactividade associada ao agregado, com um líquido cintilador. A ligação específica é a diferença entre a ligação na ausência e na presença de penta--6 gastrina 10" M.

Os resultados obtidos apresentam-se no Quadro 2. De novo, este apresenta as CI50 dos compostos ensaiados com os significados atrás apresentados.

Pode verificar-se, dos dados apresentados no Quadro 2, que o composto mais activo desta invenção tem uma CI50 da ordem de grandeza de 10" M. As suas potências relativas sao iguais as descritas atrás para a ligação às glândulas gástricas. De facto, os compostos mais activos são aproximadamente 100 vezes menos potentes do que o antagonista específico (pentagastrina) e aproximadamente 100 vezes mais potentes do que o antagonista CCK, lorglumida. Neste caso, os derivados das séries D (composto Dl) são, de novo, aproximadamente 10 vezes mais activos do que os enantiómeros L correspondentes (composto D5). Como uma ajuda para mostrar que os receptores gastrina centrais e periféricos parecem ter uma estrutura comum, estes resultados podem ser de interesse prático, uma vez que eles prevêm uma utilização possível favorável para os produtos desta invenção no tratamento de perturbações cerebrais atribuídas ao desequilíbrio nos níveis de neurõnios fisiológicos de gastrina. /27- W ο 4J cdu Q) Td cd5u 4-1 W cd M cd 4-)s tx 0) nd 0 1 cd o cd bO •H i-l cd τ)

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Para confirmar a actividade antigastrina apresentada por estes estudos in vitro, estudaram-se também os compostos desta invenção in vivo, através do modelo experimental descrito adiante.

ACTIVIDADE ΑΝΤΙ - SECKETÕRIA EM RATAZANAS ANESTESIADAS

Determinou-se a actividade anti-secretória em ratazanas, com a utilização de animais machos pesando aproximadamente 200 g, anestesiados com uretana. Estimulou-se secreção gástrica com pentagastrina. Utilizou-se o método de K. S. Lai, Gut, _5 (1964) 327-341, com ligeiras modificações.

Depois de traqueotomia, inseriram-se cânulas no isófago e no duodeno. Aspergiu-se uma solução tépida (37°C) -de hidroxido de sódio 0,25 mM através do estômago por intermédio de uma bomba peristáltica a um caudal constante de 1 ml/minuto. Depois de estabilização, durante 20 minutos, aspergiu-se a dose do estimulante, indicada no Quadro 3, dissolvida numa solução fisiológica, durante 120 minutos a um caudal de 0,95 ml/hora. Depois de 60 minutos de aspersão (estimulação básica), administraram-se os produtos em ensaio, por via intravenosa (I.V.), ao mesmo tempo que se continuou a aspersão do estimulante durante mais 60 minutos. Registou-se a secreção ácida, continuamente, em função do tempo.

Avaliou-se a actividade do produto como a redução na acidez da secreção, depois da administração do produto, como uma percen- -29- tagem da acidez básica medida durante os primeiros 60 minutos de recolha, durante os quais apenas estava presente pentagastrina.

Administraram-se os compostos antagonistas de ensaio em diferentes doses, de tal forma, que se pôde calcular uma DI50, que é a dose (em mg/kg I.V.) que pode inibir o efeito da pentagas trina em 50%.

Os resultados, assim obtidos, apresentam-se no Quadro seguinte no qual as actividades dos compostos são expressas como DI50ssobo estimulo de penta gastrina a 30 mcg/kg/h. ,,-30- v QUADRO 3 : Actividade antagonista (DE50 mg/kg XV) relativa cd3u u co cd hOcd 4J§ μo (¾ cd •ri o ccdcdυ •rl H U co ccd (30 o i cd O)cuuocu CQ /cd

A actividade anti-gastrina é particularmente favorável no caso dos derivados do ácido glutâmico (n = 2) , quando R^ representa um grupo 3-clorofenilo ou 3,5-clorofenilo, ou quando o grupo alquilo representado por ^ tem um comprimento de, no máximo 4 ou 5 átomos de carbono e é suficientemente ramificado na sua extremidade mais distante (distai) do grupo amida secundária. É de notar que os compostos desta invenção que eram os mais activos nestes modelos experimentais são aproximadamente 15 vezes mais activos que o composto anti-gastrina de referência, proglu-mida. É também interessante notar que o antagonista de CCK, lorglumida, era completamente inactivo até uma dose de 100 mg/kg. A acção destes compostos contra a secreção gástrica está especificamente ligada â sua actividade anti-gastrina. De facto, eles não têm qualquer actividade anti-colinérgica ou anti-hista-mínica (anti-E^), uma vez que são completamente inactivos quando se utiliza carbacol (30 mcg/kg/h) ou histamina (2,3 mg/kg/h) como estimulante no modelo experimental atrás descrito. A actividade dos compostos desta invenção parece ser mais notável se se tiver em conta a sua baixa toxicidade. Por exemplo, o composto Dl tem uma DL50 IV em ratos, de cerca de 600 mg/kg. A dose tóxica (DL50) neste caso é, assim, aproximadamente 20 vezes superior ã dose anti-gastrina (DI50). ACTIVIDADE ANTI-GQLECISTOCININA (ANTI-CCK)

Para verificar a hipótese de que a conformação molecular dos compostos desta invenção é adequada para lhes proporcionar uma actividade antagonista específica relativamente à gastrina e não relativamente â CCK, ensaiou-se a actividade anti-contracção de alguns dos compostos desta invenção em vesículas biliares de cobaias estimuladas in vitro por CCK-8.

Colocou-se uma tira longitudinal de vesícula biliar de cobaia num banho para orgãos isolados, na presença de Krebs, â temperatura de 32°C, continuamente oxigenado por uma mistura de oxigénio-C02 (95-5 V/V).

Detectaram-se as contracções isométricas por meio de um transdutor de força e registaram-se.

Fez-se contrair a vesícula biliar mediante utilização de uma concentração de 10 ng/ml de CCK-8; determinou-se a actividade antagonista dos compostos relativamente ao efeito de contracção da CCK com a utilização de diferentes concentrações e determinou-se assim o valor CI50, que é a concentração em mcg/ml do composto que é susceptível de antagonizar o efeito de contracção da CCK em 50%.

Os resultados obtidos apresentam-se no Quadro adiante que apresenta os compostos ensaiados e as GI50 que se calcularam pelo método de regressão numa série de, pelo menos, três ensaios para cada composto investigado. COMPOSTO Actividade CI50 (mcg/ml) AI >100 A7 >100 AI 3 32 A20 >100 Dl 83 Lorglumida 0,06

Um exame do Quadro mostra que os compostos reivindicados antagonizam a actividade de contracção da CCK-8 a uma concentração tal que a actividade de contracção do derivado mais activo ensaiado, o composto A13, foi aproximadamente 500 vezes superior ã da lorglumida, o que mostra que eles possuem pequena ou nenhuma actividade anti-CCK.

O EFEITO DE INIBIÇÃO DA TAXA DE CRESCIMENTO DE CÉLULAS NORMAIS E DE TOMOKES DO CÕLON INDUZIDO POR PENTAGASTRINA A gastrina possui um efeito trófico no epitélio digestivo. -34- η

V // ι A administração crónica de gastrina (ou pentagastrina, a parte biologicamente activa da hormona fisiológica) em ratazanas provoca hiperplasia da mucosa fundica e da mucosa do cólon. Demonstrou-se recentemente que a gastrina estimula o crescimento de um tumor do cólon dos ratos transplantado produzido por indução química [Winsell et al., Surgical Forum, 33, (1982) 384].

Com base nesta premissa, era desejável investigar se os antagonistas específicos da gastrina desta invenção podiam antagonizar o crescimento de tumores gastrointestinais induzidos experimentalmente.

Seleccionou-se para este fim um antagonista da gastrina, de acordo com a presente invenção, que era um dos compostos mais activos nos ensaios atrás descritos, isto é, o composto A-5. Inocularam-se ratos machos pesando 20-25 g por via subcutânea, na região inter-escapular, com uma suspensão de 8 x 10^ células de tumor de um adenocarcionoma do cólon do rato.

Utilizaram-se 5 grupos de 10 animais, isto é: um grupo de animais de controlo, um grupo de animais tratados com 250 mcg/ml de pentagastrina, duas vezes por dia, e dois grupos de animais tratados com o composto A-5 em doses compreendidas entre 15 e 30 mg/kg i.p., respectivamente, duas vezes por dia, mais pentagas trina na forma atrás descrita. -35-

Depois de 20 dias, mataram-se os animais e removeram-se a mucosa fundica e os tumores, pesaram-se e extraíram-se para se determinar o seu teor de DNA. Os resultados obtidos apresentam-se no Quadro seguinte. -36- r

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Claims (4)

1. •38- V REIVINDICAÇÕES 1,- Processo para a preparação de derivados do acido aspãrtico e glutâmico de formula geral CO OH (I) Wn (*) CH-iJH-CO-R, CO-NH-R2 na qual n representa 1 ou 2, ^ representa um um gru po fenilo mono- ou dissubstituído com um átomo de cloro ou um grupo metilo ou nitro, de tal modo que o átomo de hidrogénio ou o grupo nitro podem estar pre sentes nas posições 2 e 6 do grupo fenilo e, indepen dentemente, o átomo de hidrogénio ou de cloro ou o -39- -39- ./ ί

   / grupo metilo podem estar presentes nas posiçoes 3 e 5, e Rj representa um grupo alquilo de cadeia linear ou ramificada ou um grupo cicloalquilo com 5 a 9 ãto mos de carbono, em que os substituintes no centro de quiralidade (marcado com um asterisco) têm a conforma ção DL, caracterizado pelo facto: a) de se fazer reagir um anidrido interno de fórmula ge ral CO Ι ) 0 I / (IX) <CH2>n CH-NH-CO-R^ CO------τ- na qual n e R^ têm os significados definidos antes, com uma amina secundária de fórmula geral R2-NH2, na qual R2 tem os significados definidos antes, em uma proporção molar compreendida entre 1 e 5, a uma temperatura compreendida'entre -10° e 10°C, e de se isolarem os compostos de fórmula geral I a partir da massa reaccional.
2. 2.- Processo para a preparação de um derivado de ácido glutâmico ou aspártico de fórmula geral I na qual n, R1 e R2 têm os significados definidos antes, e os substituintes no cen tro de quiralidade (marcado com ura asterisco na fórmula geral I) têm a conformação D, caracterizado pelo facto: ί -40 ί .·? a) de se fazer reagir o éster gama-benzllico do acido N-carbobenzoxi-D-glutâmico com uma amina de formula geral H2“NR2f na qual R2 tein os significados definidos antes, pelo método do anidrido misto, a uma temperatura compreendida entre -15° e +15° e no seio de um dissolvente anidro inerte e de se isolarem os compostos de fórmula geral III a partir da massa reaccional:

   (III)

   CH-NE-C0-0-CH2- co-nh-r2 b) de se desbenzilar e descarbobenzoxilar o composto de fórmula geral (III) dissolvido no seio de um dissolvente inerte, tal como o metanol, mediante reacção com um átomo de hidro gênio à temperatura e pressão ambientes na presença de uma quantidade cataliticamente eficaz de catalisador de hidrogena-çao e de se isolarem os compostos de fórmula geral II a partir da massa reaccional: COOH

   CH-NH2 CO-NH-R (II) '2 -41- / .¾ c) de se fazer reagir os derivados de fórmula geral II sob condições de Schotten-Baumann com uma quantidade equimole cular de um cloreto de acilo de formula geral R^-CO-Cl, na qual R^ tem os significados definidos antes, a uma temperatura compreendida entre 0 e 15°C e de se isolarem os derivados de fórmula geral (I) com a configuração D a partir da massa reaccional.
3. 3. - Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, pa ra a preparação de compostos de fórmula geral I na qual Rn i seleccionado de entre o grupo constituído pelos radicais 3* jIo rofenilo e 3,5-diclofenilo, R^ é seleccionado de entre o grupo constituído pelos radicais 3,3-dimetilbutilo, 4,4-dimetilpenti lo e 3,3-metil-etil'pentilo, caracterizado pelo facto de se uti lizarem compostos iniciais correspondentemente, substituídos.
4. 4. - Processo para a preparação de composições farmacêu ticas, caracterizado pelo facto de se incorporar, como ingrediente activo, uma quantidade eficaz de um derivado do ácido as pártico ou glutâmico ou de um seu sal farmaceuticamente aceita vel, quando preparado pelo processo de acordo com a reivindica' ção 1.