IT8967937A1 - Derivati degli acidi glutammico ed aspartico ad attivita' antigastrinica e procedimento per la loro preparazione - Google Patents

Derivati degli acidi glutammico ed aspartico ad attivita' antigastrinica e procedimento per la loro preparazione Download PDF

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Description

DESCRIZIONE
La presente invenzione ha per oggetto derivati dell'acido glutammico ed aspartico e il loro impiego per la preparazione di medicamenti per il trattamento terapeutico di affezioni indotte da iperagastrinemia , Tali derivati sono rappresentati dalla formula generale sotto indicata :
in cui n ? uguale ad 1 oppure a ? un fenile mono o disostituito con gruppi cloro, metile o nitro, in modo tale che nelle posizioni 2 e 6 del. fenile possono essere presenti idrogeno o il gruppo nitro e nelle posizioni 3 e 5 possono essere presenti idrogeno cloro o il gruppo metile ed in cui. R2, ? una catena alchilica lineare, ramificata oppure cicloalchilica contenente da 5 a 9 atomi di carbonio, la stereochimica sul centro chiralico asteriscato in formula (I) essendo DL. oppure D, inclusi i loro sali farmaceuticamente accettabili.
In particolare composti preferiti nell' ambito dell'invenzione sono quelli specificatamente descritti nelle tabelle A e D che seguono, e i loro sali farmaceuticamente accettabili; i composti maggiormente preferiti essendo quelli in cui n ? uguale a 2, R1 ? scelto dal gruppo che consiste di 3-cloro-fenil e 3,5-diclorofenil ed ? scelto dal gruppo che consiste 3,3-dimetilbutil , 4,4-di metil -pentil e 3,3-metil.etil-pentil.
I composti oggetto della presente invenzione dimostrano di possedere una potente attivit? antagonista della gastrina ("little gastrin" o G?17) e della pentagastrina che ? la sequenza peptidica terminale biologicamente attiva.
La gastrina ? un ormone polipeptidico secreto dalle cellule della mucosa antrale e duodenale, secrezione indotta soprattutto con un meccanismo nervoso tramite eccitazione vagale.
Una volta secreta la lastrina raggiunge per via ematica le cellule parietali situate principalmente nella mucosa fundica e, legandosi ai recettori di membrana delle cellule stesse, le attiva. Tale attivazione avvia il processo di formazione di HC1 ed la sua secrezione nel lume gastrico.
Una iperattivit? di questo sistema comporta uno stato di ipersecrazione acida gastrica con possibili conseguenze dannose per l'organismo.
I composti oggetto della presente invenzione appartengono ad una classe pi? generale di derivati dell'acido glutammico ed aspartico genericamente descritta nel brevetto US-A-4 791 215
Tra le varie attivit? menzionate riferentesi alla classe di composti oggetto del brevetto sopracitato, di particolare valore era quella che si riferiva alla loro potente attivit? inibente la colecistochinina (CCK) in diversi modelli sperimentali. Ad esempio il composto siglato come C-7 (lorglumide) inibiva del 50% la contrazione indotta dalla CCK-8 (10 ng/ml) della cistifellea di cavia in vitro ad una concentrazione di 0.06 mcg/ml, concentrazione di circa appena 15 volte pi? elevata dell' agonista. I composti specificatamente descritti nel brevetto sopracitato risultavano peraltro essere inattivi o scarsamente attivi quali inibitori della pentagatrina (cfr? ad. esempio Eer.J. Med.Chem. (1936) -21 , pagg .9-20) anche se la gastrina ? fortemente correlata con la CCK poich? il pentapeptide C-terminale Gly-Trpt-Met -Asp-PheNH2 ? comune ai due polipeptidi . Ci? fece supporre che essi interagissero principalmente con la sequenza tripeptidica CCK-(26-28) senza interferire con la struttura recettoriale che ? responsabile per l'interazione con la sequenza pentapeptidica terminale CCK-(29-33) comune ai due ormoni CCK e gastrina, al contrario quindi di quanto avviene per i composti in oggetto che esplicano una potente attivit? antigastrinica ed una scarsa o nulla attivit? anti-OCK .
La presente invenzione scaturisce quindi dalle seguenti considerazioni: l'attivit? anti-CCK dei composti oggetto del brevetto precedentemente citato ? dovuta alla presenza contemporanea di un gruppo acido che funziona da solubilizzante e da 3 unit? lipofile dimensionate e distanziate opportunamente e cio? due sostituenti alchilici (corrispondenti a due gruppi nella formula I) ed un anello fenilico opportunamente sostituito (cor? rispondente al sostituente R1 della formula I). Al contrario per ottenere dei composti con un'elevata attivit? antigastrinica come nel caso dei composti in oggetto ? sempre necessaria la presenta del gruppo acido dell'anello fenilico (R1) con sostituenti opportuni (che peraltro non coincidono con quelli dell'altra serie cio? dei composti anti-CCK), mentre in R2 ? indispensabile la presenta di un solo gruppo alchilico idrofobico di lunghezza ed ingombro sterico opportuni.
Costituisce quindi un ulteriore oggetto della presente invenzione l'impiego dei derivati di formula (I) in cui nr R ed R2 hanno il significato precedentemente definito e dei loro sali farmaceuticamente accettabili per la preparazione di un medicamento per il trattamento terapeutico di affezioni indotte da ipergastrinemia-Come gi? sopra menzionato i composti oggetto dell'invenzione presentano una potente e specifica attivit? antigastri nica su diversi modelli sperimentali sia in vivo che in vitro. I pi? potenti fra loro inibiscono infatti a concentrazioni di poco superiori a quelle nanomolari il binding della pentagastrina triziata alle ghiandole mucosali gastriche di cavia ed alle membrane corticali di topo .
In vivo essi, dimostrano di possedere una elevata attivit? antisecretiva acida bloccando in modo dose dipendente lo stimolo secretorio indotto dalla pentagastrina , Tale attivit? ? specifia poich? i composti in oggetto non bloccano ad esempio le secrezioni indotte dal carbacolo od istamina.
I suddetti composti possono quindi essere impiegati con vantaggio nella terapia e nella prevenzione di diverse malattie dell'uomo nelle quali sia di vantaggio un blocco delle attivit? stimolanti della gastrina, ad esempio ulcere o gastroduodeniti derivanti da eccessiva secrezione gastrica indotta da uno stato di ipergastrinemia, nella sindrome di ZollingerEllison oppure nel trattamento di alcune forme tumorali sostenute da ipergastrinemia.
Sulla base della potente attivit? da loro esplicata quali inibitori il binding della gastrina a livello del SNC, i composti in oggetto potrebbero inoltre dimostrarsi attivi in alcune forme di disordini mentali attribuibili a scompensi dei livelli fisiologici neuronali della gastrina o di altri peptidi bioattivi ad essa correlati.
Il procedimento per la preparazione dei derivati oggetto dell'invenzione aventi il centro chi? ralico nella forma DL ? caratterizzato dalle seguenti operazioni, che si possono cos? schematizzare:
a) far reagire un'anidride interna di formula:
in cui n ed R1 hanno il significato sopra riportato con un'animine primaria di formula in cui R2 ha il significato sopra riportato, in un rapporto molare da 1 a 5 in un solvente come acqua, etile acetato- diossano, acetonitrile, tetroidrofurano o loro miscele e ad una temperatura compresa fra -20 ?C e 30 ?C e recuperando i composti, di formula I dalla massa di reazione per cristallizzazione frazionata od altri metodi convenzionali.
Il seguente esempio viene qui di seguito riportato per meglio illustrare l'invenzione.
Preparazione dell'acido ( ?) -4-C C 3- clorobenzoil) -amino]-5-(3,3-dimetil butil amino)-5-oxo-pentanoico (composto A-5 di tabella Z)
26.8 g (0.1 moli) di anidride 3-cloro-benzoil--glutamica sono caricati in un reattore e sospesi in 100 ml di acqua. Si raffredda a circa 5 ?C e si aggiungono goccia a goccia in un tempo di circa 15 minuti 25.3 g (0.25 moli) di 3 ,3-dimetil-butilammina. Si lascia reagire per 3 ore a questa temperatura e si acidifica con acido acetico glaciale. Si filtra, si lava al neutra con acqua e si essicca. Si cristallizza il prodotto grezzo cosi ottenuto da . Si ottengono cos? 19,6 g. Resa 53% P.f.: 194-195 ?C. TLC (alcol isoamilico-
Nella seguente tabella A vengono riportati a titolo esemplificativo numerosi esempi di questi composti con alcune caratteristiche che li identificano, nonch? le rese ottenute.
TABELLA A: derivati di formula (serie DL)
?
Il procedimento per la preparazione dei derivati oggetto dell ' invenzione aventi il centro chialico nella forma D caratteri zzato dalle seguenti operazioni che si possono cos? schematizzare:
a) far reagire il -benzil estere dell'acido N-carbobenzossi-D-glutamico con un'ammina di formula signifi catro sopra riportato, secondo il metodo dell'anidride mista, in un solvente inerte anidro ad una temperatura compresa tra i -15? e i 15? a dare i composti di formula (III); (vedasi schema seguente)
b) debenzilare e dacarbobenzossilare il composto di formula (III) sciolto in un solvente inerte facendolo reagire con idrogeno a temperatura ambiente e pressione atmosferica in presenza di una quantit? cataliticamente efficace di un catalizzatore di idrogenazione per ottenere i derivati di formula (II) (vedasi schema seguente)
c) far reagire i derivati, di formula (II) nelle condizioni di Schotten-Bauman con una quantit? equivalente di un cloruro acilico di formula in cui ha il significato sopra riportato ad una temperatura da 0 a 15 ?C e recuperare dalla massa di reazione i derivati 4-acilammino-5-al chilammino-5-oxo-pentanoici (D ), di formula (I).
La serie di operazioni del procedimento secondo l'invenzione ? illustrato nella sua intierezza nello schema seguente:
(*)centro chiralico in forma D
La fase (a) di amidazione ? effettuata ad una temperatura preferibilmente compresa tra -15 ?C e -10 ?C per un tempo da 1 a 24 ore, preferibilmente per 6 ore con un rapporto stechiometrico tra i reagenti. Il solvente preferito per l'effettuazione della reazione ? scelto tra cloroformio, diossano e tetraidrofurano.
La fase (b) di idrogenazione viene effettuata preferibilmente in presenza di una quantit? di palladio supportato su carbone compresa tra 0.02 e 0.001 atomi di palladio per mole di composto (III ), in soluzione metanolica , a temperatura e pressione ambiente in corrente di idrogeno, per un tempo da 1 a 12 ore, preferibilmente 3 ore. La fase (c) di acilazione ? effettuata prefer ibilmente ad una temperatura di circa 5 ?C per un tempo da 1 a 24 ore, preferibilmente 12 ore.
I seguenti esempi vengono riportati per meglio illustrare l'invenzione.
Esempio H
Preparazione del benzilestere dell'acido 4-carbobenzossi-ammino-5-(3,3-dimetilbutilamino )-5-oxopentanoico, (D) (composto B1 di tabella B).
37.1 g (0,1 moli) di -benzileste re dell'acido N-carbobenzossi-D-glutammico vengono sciolti in 250 ml di tetraidrofurano anidro, si raffredda la soluzione a -10 ?C e si aggiungono sotto agitazione 10.1 g (0.1 moli) di trietilammina : si addizionano quindi sempre a -10 ?C 10.0 q (0.1 moli) di clorocarbonato di etile. Si mantiene la temperatura a -10 ?C per 20 minuti e poi si aggiungono 10.1 g (0.1 moli) di 3,3-dimetilbutilammina. Si lascia sotto agitazione ancora per 6 ore facendo salire la temperatura fino a quella ambiente; si tira a secchezza ed il residuo viene ripreso con acetato di etile.
Si lava con HC1 2N, bicarbonato sodico ed infine con 9 acqua; poi si anidrifica su anidro. Per concentrazione a piccolo volume si ottiene un residuo oleoso (pm 454.5) che cristallizza spontaneamente per riposo. Si cristallizza il prodotto grezzo cos? ottenuto da diossano-acqua (1:1) TLC: Rf 0.78 Ccloruro di metilene-alcol 9/1 (V/V)]. Punto di fusione: 104-106 ?C.
Ottenuti 35.0 g. Resa 77%
Tutti i composti di formula III vengono sintetizzati impiegando la medesima procedura (vedi schema precedente). Nella seguente tabella B vengono riportati alcuni dei composti cos? ottenuti con alcune caratteristiche che li identificano.
Esempio 3
Preparazione dell'acido 4-ammino-5- (3,3-dimetilbutil )-5-oxo-pentanoico (D) (composto di tabella C).
45.4 g (0.1 moli) del benzilestere dell 'acido 4-carbobenzossi-ammino-5-(3,3-dimetilbuttil )-5-oxo pentanoico (D) (composto B1) vengono sciolti in 300 ml di metanolo addizionati di 1 g di carbone palladiato al 10% ed idrogenati a temperatura ambiente con corrente di idrogeno per 3 ore. Si filtra via il catalizzatore e si distilla sotto vuoto il metanolo. Si ottiene un residuo oleoso (pm 286.4) che cristallizza per riposo, con una purezza cromatografica maggiore del 95% TLC Rf 0.62 [n-Butanolo-Acido acetico-H2O 5/2/2 (V/V)3. Punto di fusione 132?133 ?C.
Ottenuti 16.6 g. Resa 61%.
Tutti i composti di formula 12 vengono sintetizzati impiegando la medesima procedura (vedi, schema).
Nella seguente tabella C vengono riportati i composti cos? ottenuti con alcune caratteristiche che li identificano.
Esempio A
Preparazione dell'acido 4 - (3-cloro-benzoilamino) - 5 - (3,3-dimetilbutilamino) - 5- oxo -pentanoico (D) (Composta D-1 di tabella D).
23.0 g (0.1 moli) di acido-4-ammino-5-(3,3-dimetilbutil )-5-oxo-pentanoico (D) (composto C1), vengano sospesi in 300 ml di acqua e quindi disciolti sotto agitazione per aggiunta di 10.6 g (0.1 moli) di carbonato sodico. Successivamente si aggiungono in 1 ora a 0? C sotto agitazione 17.5 g (0.1 moli) di 3-clorobenzoil cloruro.
La miscela viene lasciata 12 ore a reagire Si acidifica al rosso congo con HC1 diluito e si filtra il precipitato cos? formatosi. Si cristallizza ad etere isopropilico/Etil acetato (3:2) P.f.: 129-132?- - -C - TLC - (alcol isoamilico-acetone-H2O: 5/2/1): Rf 0.78
Ottenuti 29.5 g (pm 368.9). Resa 80%.
Potere rotatorio: 1.90? C (c = 4.0% in metanolo) .
Tutti i composti di formula I (vedi schema) vengano sintetizzati impiegando la stessa procedura.
Nella seguente tabella D vengono riportati i composti cos? ottenuti con alcune caratteristiche che li identificano, nonch? le rese ottenute.
Onde verificare la purezza ottica dei composti ottenuti per la via di sintesi stereo conservativa sopra descritta si ? utilizzata l'analisi HPLC impiegando come fase stazionaria una colonna Resolvosil/?BSA 7 della Macherey-Nagel, fase mobile tampone fosfato 0.1 M (?? 8) 5% n-propanolo.
I composti ripartati in tabella I) dimostrano di avere in tutti i casi una purezza ottica superiore Al 95%. I tempi di ritenzione sono riportati in tabella.
L'analisi dell'attivit? antisecretiva acida esplicata attraverso un meccanismo d'azione antigastrinico da parte dei composti oggetto dell'invenzione ? stata eseguita con una serie di esperienze farmacologiche condotte sia in vitro che in vivo e viene qui di seguito documentata.
Studi di b iding su ghiandole isolate di stomaco di cavia.
Si ? valutato la capacit? di inibire il binding della pentagastrina al recettore gastrinico sito sulle membrane delle cellule parietali della mucosa fundica dello stomaco di cavia da parte di alcuni composti oggetto dell'invenzione, confrontandoli con lo spiazzamento indotto dalla pentagastrina, dalla proglumide , un composto antigastrinico di riferimento, dalla lorglumide un potente antagonista della CCK precedentemente citato e dal composto D5, antipode ottico (enanziomero della serie L) del composto D1.
Sono state usate cavie maschio, di peso 400-500 g circa. Dopo il sacrificio, lo stomaco ? prelevato e posto in tampone PBS ossigenato, a 37? C (PBS = tampone fosfato salino: NaCl 149.6 mM,
Dopo il lavaggio in tampone lo stomaco ? posto su una Petri e ne viene scartata la parte antrale. La mucosa della parte rimanente, dopo essere stata allontanata dalla parte muscolare sottostante. viene sminuzzata e poi trasferita in un matraccio 'contenente una soluzione di digestione contenente collagenasi, 0.1% BSA e 0.H7. di glucosio. La soluzione A messa ad incubare a 37? C per 10' sottoagitazione e flusso di O2 .
Durante il periodo di incubazione il tessuto ? fatto passare pi? volte attraverso una serie di pipette con diametro decrescente per facilitarne la digestione. Al termine del periodo il tessuto e prelevato e centrifugato a 1000 rpm. 11 surnatante risultante dalla centrifugazione ? scartato ed il pellet lavato pi? volte con tampone di lavaggio contenente EDTA per eliminare la collagenasi.
Successivamente le ghiandole vengono isolate dal tessuto non digerito con tecniche convenzionali, sospese in tampone Hepes per il binding ed incubate assieme al tracciante radioattivo ed ai composti in studio per 30 minuti a 35? C.
Dopo avere eliminato il surnatante per centrifugazione si determina la radioattivit? associata al pellet con uno scintillatore liquido. Il binding specifico fu determinato come differenza fra il binding in assenza ed in presenza di pentagastrina 10<-6>M.
I risultati cos? ottenuti sono mostrati, in tabella 1, in cui viene riportata la cio? la concentrazione (in moli/litro) dell'antagonista capace di spiazzare per il 50% la pentagastrina triziata dal recettore
Dai dati riportati in tabella si vede come i composti in oggetto antagonizzino del 50% il binding della pentagastrina a concentrazioni variabili in dipendenza della struttura compresa tra e molare.
I composti pi? attivi esplicano tale attivit? ad una concentrazione circa 5 x 10 molare quindi circa 100 volta superiore a quella dell'antagonista specifico (pentagastrina fredda) dimostrando quindi elevata specificit? d'azione. La proglumide, un farmaco antigastrinico di riferimento risulta essere circa 10000 volte meno attivo dei composti pi? potenti della serie, mentre la lorglumide, antagonista specifico della CCK risulta essere circa 200 volte meno attivo. Il composto D5 un derivato della serie L, risulta essere circa 10 volte meno attivo del corrispondente composto D1, enanziomero della serie D.
Studi di binding su membrane di corteccia cerebrale di topo
Si ? voluto valutare la capacit? di spiazzamento di alcuni fra i pi? attivi dei composti oggetto dell'invenzione nel modello sperimentale sopra descritto, utilizzando per? in questo caso come substrato i recettori centrali della gastrina. Sono state pertanto utilizzate membrane di corteccia cerebrale e come ligando si ? usato ancora la pentagastrina trillata.
Tessuto corticale di topo e stato omogeneizzato a fredda in 20 volumi di tampone tris (pH 7.7) Dopo lavaggi e centrifugazione il pellet finale ? stato risospeso in 20 volumi di tampone per binding contenente tra l'altro TRIS,-BSA e Bacitracina 0.4 ml di membrane cos? ottenute sono state quindi incubate assieme al tracciante radioattivo ed al composti in studio per 40 minuti a 37? C.
Dopo avere eliminato il surnatante per centrifugazione, si determina anche in questo caso la radioattivit? associata al pellet con uno scintillatore liquido. Il binding specifico ? la differenza tra il binding in assenza ed in presenza di pentagastrina
I risultati cosi ottenuti sono illustrati in tabella 2. Anche in questo caso viene riportata la IC50 dei composti saggiati, con lo stesso significato precedentemente riportato.
Dai dati riportati in tabella 2 si osserva che i pifi attivi dei composti oggetto dell'invenzione hanno una dell'ordine di grandezza La potenza relativa non ? modificata rispetto a quanto descritto precedentemente per il binding alle ghiandole gastriche. I composti pi? attivi sono infatti circa 100 volte meno potenti dell'antagonista specifico (pentagastrina) e circa 100 volte pi? potenti del CCK-antagonista lorglumide. Anche in questo caso i derivati appartenenti alla serie D (composto D1) sono circa 10 volte pi? attivi dei corrispondenti enanziomeri [ (composto D5). Tali risultati oltre a contribuire a dimostrare che i recettori centrali e periferici della gastrina sembrano avere una struttura comune, possono essere di interesse pratico in quanto fanno presagire un possibile favorevole impiego per i prodotti in oggetto nella terapia di disordini cerebrali imputabili a scompensi dei livelli fisiologici neuronali della gastrina.
Per confermare l'attivit? antigastrinica evidenziata da questi studi in vitro. i composti in oggetto sono stati studiati anche in vivo, con il modello sperimentale qui di seguito illustrato.
Attivit? antisecretiva nel ratto anestetizzato L'attivit? antisecretiva ? stata determinata nel ratto utilizzando animali maschi del peso di circa 200 g anestetizzati con uretano .La secrezione gastrica ? stata stimolata con pentagastrina. Si ? utilizzato il metodo di K.S. Lai (Gut 5, (1964), 327-341) leggermente modificato.
Dopo tracheotomia sono incannulati esofago e duodeno. Si perfonde con una soluzione tiepida (37? C) di NaOH 0.25 mM che viene fatta passare attraverso lo stomaco per mezzo di una pompa peristaltica ad un flusso costante di 1 ml/mimito. Dopo una stabilizzazione di 20 minuti. l'agente stimolante disciolto in fisiologica ? perfuso per 120 minuti alla dose indicata in tabella 3 in un volume di 0.95 ml/ora. Dopo 60 minuti di perfusione (stimolazione basale) si somministra in vena (I.V.) in bolo il prodotta in esame continuando a perfondere per altri 60 minuti, lo stimolante. La secrezione acida ? registrata in continua in funzione del tempo.
L'attivit? dal prodotto ? valutata come per? centuale di riduzione dell'acidit? secreta dopo la somministrazione del prodotto, verso l'acidit? basale misurata nei primi 60 minuti, di raccolta in cui si era in presenza della sola pentagastrina.
I composti antagonisti saggiati venivano somministrati a dosi differenti in modo da poter calcolare una ID50 cio? la dose (in mg/Kg I.V.) capace di inibire del 50% l'effetto della pentagastrina.
I risultati cos? ottenuti, sono illustrati nella tabella seguente in cui vengono riportate le attivit? dei composti espresse come ID50 sotto stimolo di 30 mcg/Kg/h di pentagastrina.
L'attivit? antigastrinica ? particolarmente favorevole nel caso dei derivati dell'acido glutammico (n = 2), nel caso in cui ? uguale a 3-cloro-fenile o 3,5-cloro-fenile o quando il gruppo alchilico in R2 abbia una lunghezza di massima di o 5 atomi di carbonio e sia sufficientemente ramificato nella sua parte terminale (distale) dal gruppo amidico secondario.
E'da notare che i pi? attivi dei composti in oggetto sono in questo modello sperimentale circa 15 volte pi? attivi del composto antigastrinico di riferimento proglumide. E' altres? interessante notare che il CCK antagonista lorglumide ? completamente inattivo fino alla dose di 100 mg/Kg.
L'attivit? antisecretiva gastrica di questi composti ? specificatamente legata alla loro attivit? antigastrinica. Essi infatti sono privi di attivit? anticolinergica e di attivit? antistaminica (anti Hg), essendo risultati completamente inattivi nello stesso modello sperimentale sopra descritto quando si sia usato come stimolante Garbacelo (30 mcg/Kg/h) o istamina (2.3 mg/Kg/h).
Tale attivit? appare ancor pi? rimarchevole se si tiene conto della bassa tossicit? dei composti, in oggetto. Ad esempio il composto D1 ha una DL50 IV nel topo d? circa 600 mg/Kg. La dosa tossica (DL50) ? quindi in questo caso circa 20 volte superiore a quella antigastrinica (ID50).
Attivit? anticolecistochininica tanti CCK)
Onde verificare l'ipotesi che la conformazione molecolare dei composti, in oggetto fosse adeguata a conferire loro in modo specifico un'attivit? antagonista verso la gastrina e non verso la CK si ? saggiata per alcuni dei composti oggetto dell'invenzione l'attivit? enti contratturante su cistifellea di cavia stimolata in vitro da CCK-8.
Una striscia longitudinale di cistifellea di cavia viene posta in un bagno per organi isolati in presenza di Krebs alla temperatura di 32?C , ossigenando continuamente con una miscela ossigeno-CO2 (95-5 V/V).
Le contrazioni isometriche sono state rilevate per mezzo di un trasduttore di forza e registrate.
La cistifellea viene contratta utilizzando una concentrazione di CCK-8 di 10 ng/ml; si determina l'attivit? antagonista dei composti verso l'effetto contratturante della CCK, impiegando differenti concentrazioni e determinando cos? il valore di IC50, cio? la concentrazione in mcg/ml di composto capace di antagonizzare del 50% l'effetto contratturante della CCK stessa
I risultati cos? ottenuti sono esposti nella tabella seguente dove sono riportati i composti saggiati e le IC50 ricavate che sono state calcolate con il metodo della regressione su un test di almeno 3 esperienze per ogni composto studiato.
Tabella 4: Attivit? anti-CCK (concentrazione 10 ng/ml) espressa come IC50 in mcg/ml? sucistifellea di cavia in vitro.
Dall'esame della tabella si vede che i composti rivendicati antagonizzano l'attivit? contratturante della CCK-8 ad una concentrazione tale che per il pi? attivo dei derivati testati, il composto A13, risulta essere circa 500 volte superiore a quella della lorglumide a dimostrazione della loro scarsa o nulla attivit? antagonizzante la CCK.
Azione inibitrice sulla velocit? di crescita indotta da pentaoastrina su cellule coliche normali e tumorali
La gastrina possiede un effetto trofico sull 'epitelio digestivo. Cos? la somministrazione cronica al ratto di gastrina (o di pentagastrina la parte biologicamente attiva dell'ormone fisiologica), causa un'iperplasia della mucosa fundica e della mucosa colica. Pi? recentemente ? stato evidenziato che la gastrina stimola la crescita di un tumore colica trapiantabile del topo ottenuto per induzione chimica (Winsell et al. - Surgical Forum.
33. 384 (1983)).
In base a queste premesse si ? voluto studiare se gli antagonisti specifici della gastrina oggetto dell 'invenzione potessero antagonizzare la crescita di forme tumorali gastrointestinali indotte sperimentalmente.
A questo scopo ? stato scelto uno degli antagonisti della gastrina oggetto dell'invenzione, risultato tra i pi? attivi nei tests precedentemente descritti e cio? il composto A-5. A topi maschi dal peso di 30-35 g fu inoculato per via sottocutanea nella regione interscapolare una sospensione di 8 x 104 cellule tumorali di un adenocarcinoma colico di topo.
Furono utilizzati 5 gruppi di 10 animali ciascuno e cio?: un gruppo di animali controllo, un gruppo di animali trattati con Pentagastrina 230 mcg/Kg 2 volte al giorno e due gruppi di animali trattati con il composto A-5 alle dosi rispettivamente di 15 e 30 mg/Kg i.p. 2 volte al giorno pi? pentagastrina secondo le modalit? sopra riportate.
Dopo 20 giorni gli animali furono sacrificati, la mucosa fundica ed i tumori furono prelevati, pesati ed estratti per la determinazione del DNA. I risultati ottenuti sono riportati nella seguente tabella.
I dati di tabella 6 dimostrano come la pentagastrina induca una significativa iperplasia della mucosa fundica ed un incremento significativo del peso del tumore colico e del contenuto in DNA. Il composto A-5 ? capace di inibire in modo significativo e dose dipendente entrambe le azioni trofiche sopra citate della pentagastrina.

Claims (1)

  1. RIVENDICAZIONI 1 Derivati dell'acido glutammico ed aspartico di formula generale (*>
    in cui n ? eguale ad 1 oppure a 2. R???un fenile mono o disostituito con gruppi cloro, metile o nitro, in modo tale che nelle posizioni 2 e 6 del fenile possono essere presenti idrogeno a il gruppo nitro e, indipendentemente, nelle posizioni 3 e 5 possono essere presenti idrogeno, cloro o il gruppo metile ed in cui R2 ? una catena alchilica lineare, ramificata oppure cicloalchilica contenente da 5 a 9 atomi di carbonio} la stereochimica sul centro chiralico asteriscato nella formula (1) essendo DL oppure D, e i loro sali farmaceuticamente accettabili. 3. Composto derivato dell'acido glutammico secondo la rivendicazione 1 in cui R 1 ? scelto dal gruppo che consiste di 3-clorofenil e 3,5-diclorofenil, e scelto dal gruppo che consiste di 3,3-dimetilbutil , 4,4-dimetilpentil e 3,3-metil, etil-pentil, la stereochimica del centro chiralico essendo DL o D e i loro sali farmaceuticamente accettabili.
    4. Composizione farmaceutica comprendente come agente attivo almeno uno dei composti secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 3 o un loro sale farmaceuticamente accettabile e un veicolo farmaceuticamente accettabile. 5. Impiego di derivati dell'acido glutammico ed aspartico seconda la rivendicazione 1 o di un suo sale farmaceuticamente accettabile, per la preparazione di un medicamento per il trattamento terapeutico di affezioni indotte da ipergastrinemia . 6. Impiego di un derivato secondo la rivendicazione 1 per la preparazione di un medicamento per il trattamento terapeutico dell'ulcera . 7. Impiego di un derivato secondo la rivendicazione 1 per la preparazione di un medicamento per il trattamento terapeutico di affezioni tumorali sostenute dalla gastrina e da altri polipeptidi bioattivi ad essa correlati. 8. Impiego di un derivato seconda la rivendicazione 1 per la preparazione di un medicamento per il trattamento di situazioni patologiche del SNC legati a scompensi dei livelli fisiologici neuronali della gastrina o di altri polipeptidi bioattivi ad essa correlati. 9. Procedimento per la preparazione di un derivato dell'acido glutammico o dell'acido aspartico aventi formula (1) in cui n, ed hanno il significato riportato nella rivendicazione 1, e in cui sostituenti sul centro chiralico (asteriscato) hanno la conformazione DL, caratterizzato dal fatto che comprende l'operazione di: a) far reagire l'anidride interna di formula (2) (3E) In cui n ed hanno il significato sopra riportato con un'ammina secondaria di formula in cui ha il significato sopra riportato, in rapporto molare da 1 a 5 ad una temperatura da -10?C a 10?C e recuperare i composti (1) dalla massa di reazione . 10. Procedimento per la preparazione di un derivato dell'acido glutammico o dell'acido aspartico aventi formula (1) in cui n, ed hanno il significato riportata nella rivendicazione 1, ed in cui i sostituenti sul centro chiralico (asteriscato in formula (1)) hanno la conformazione (D), caratterizzato dal fatto che comprende le seguenti operazioni stereo conservative: a) far reagire secondo il metodo dell'anidride mista, il gamma-benzilestere dell'acido N-carbobenzossi-D-glulammico con un'ammina di formula in cui ha il significata sopra riportato ad una temperatura da -15?C a 15?C in un solvente inerte anidro e recuperare i composti (III) dalla massa di reazione
    b) debenzilare e decarbobenzossilare il composto di formula (III) sciolto in un solvente inerte, quale metanolo, facendolo reagire a temperatura ed a pressione ambiente con idrogeno, in presenza di una quantit? cataliticamente efficace di un catalizzatore di idrogenazione e recuperare i composti (II) dalla massa di reazione, c) far reagire i derivati di formula (II) nelle condizioni di Shotten-Bauman con una quantit? equimolecolare di un cloruro acilico di formula in cui ha il significato riportato nella rivendicazione 1, ad una temperatura da 0 a 13?C e recuperare dalla massa di reazione i derivati di formula (I) nella conformazione D
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