Verfahren zur Herstellung eines neuen Dekapeptids
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines Dekapeptids, das eine gleichartige blutdrucksteigernde Wirkung wie Hypertensin, aber von längerer Dauer, aufweist und das sich durch Hydrolyse in dieses überführen lässt. Damit ist auch die erstmalige Synthese dieses Hormons offenbart. Aus dieser Tatsache ergibt sich allein schon die Bedeutung der vorliegenden Erfindung, insbesondere wenn man bedenkt, dass Hypertensin bis jetzt nur mittels eines komplizierten Extraktionsverfahrens aus Blut isoliert werden konnte ; und zwar erhielt man aus 100 kg Blut nur etwa 5 mg dieses Polypeptids.
Das neue Dekapeptid ist L-Asparaginyl-L-arginyl- L-valyl-L-tyrosyl-L-valyl-L-histidyl-L-prolyl-L-phenyl- alanyl-L-histidyl-L-leucin der Formel
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Es unterscheidet sich vom Hypertensin dadurch, dass in seinem Molekül der Rest des Asparagins an Stelle desjenigen der Asparaginsäure vorhanden ist.
Wie aus der obigen Formel hervorgeht, besteht eine grosse Anzahl von Möglichkeiten, das neue Polypeptid zu synthetisieren.
Das neue erfindungsgemässe Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass man ein L-Asparaginyl nitro-L-arginin, das eine mittels hydrierender Mittel abspaltbare a-Amino-Schutzgruppe aufweist, mit Estern die folgenden Aminosäuren : L-Valin, L-Tyrosin, L-Valin, L-Histidin, L-Prolin, L-Phenylalanin, L-Histidin, L-Leucin in der angegebenen Reihenfolge kondensiert oder einen Teil oder alle der genannten Säuren zuerst miteinander und dann mit dem genannten Dipeptid kondensiert und schliesslich die Nitrogruppe des Argininrestes und die a-Amino-Schutzgruppe des Asparaginrestes mittels hydrierender Mittel abspaltet und die Estergruppe des Leucinrestes mit alkalischen Mitteln verseift.
Wenn erwünscht, kann die Carbonylamidgruppe des Asparaginrestes in eine freie Carboxylgruppe überführt werden.
So kann man ein L-Asparaginyl-nitro-L-arginin, das eine durch Hydrierung abspaltbare a-Amino- Schutzgruppe aufweist, mit einem L-Valyl-L-tyrosyl L-valyl-L-histidyl-L-prolyl-L-phenylalanyl-L-histidyl- L-leucin-ester zum Dekapeptidester kondensieren.
Man kann aber auch ein L-Asparaginyl-nitro-L-argi- nin mit einem L-Valyl-L-tyrosyl-L-valyl-L-histidin- ester zu einem Asparaginyl-nitro-L-arginyl-L-valyl-L- tyrosyl-L-valyl-L-histidinester kondensieren und nach Verseifung der Estergruppe mit einem L-Prolyl-Lphenylalanyl-L-histidyl-L-leucinester zum Dekapeptidester umsetzen.
Ferner ist es möglich, einen L-Valyl L-tyrosyl-L-valyl-histidinester mit einem L-Asparaginyl-nitro-L-arginin zu acylieren und das durch Verseifung der Estergruppe erhaltene L-Asparaginyl-nitro L-arginyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-valyl-histidin mit einem L-Prolyl-L-phenylalaninester zum Octapeptidester umzusetzen, der sich nach Verseifung der Estergruppe zur Acylierung eines L-Histidyl-L-leucin-esters unter Bildung des Decapeptidesters verwenden lässt. Schliesslich wird der Dekapeptidester mit alkalischen Mitteln verseift.
Die bei der Acylierung erwähnten Zwischenprodukte können nach verschiedenen Möglichkeiten erhalten werden. So lässt sich vorerst L-Valin mit L-Tyrosin zum L-Valyl-L-tyrosin kondensieren, das L-Valin mit L-Histidin zum L-Valyl-L-histidin, L-Prolin mit L-Phenylalanin zum L-Prolyl-L-phenylalanin und schliesslich das L-Histidin mit einem L-Leucin-ester zu einem L-Histidyl-L-leucin-ester. Das so erhaltene L-Valyl-L-histidin wird dann mit dem L-Valyl-L-tyrosin zum L-Valyl-L-tyrosyl-L-valyl-L-histidin acyliert.
Man kann aber auch das L-Valin mit dem L-Valyl-Ltyrosin zum L-Valyl-L-tyrosyl-L-valin und dieses dann mit L-Histidin kondensieren. Das L-Prolyl-L- phenylalanin lässt sich mit einem L-Histidyl-L-leucinester zu einem Prolyl-L-phenylalanyl-L-histidyl-L-leucin-ester verbinden. Das gleiche Polypeptid wird auch erhalten, wenn man L-Histidin mit L-Prolyl-L-phenylalanin acyliert und dieses Tripeptid mit einem L-Leu- cin-ester umsetzt.
Bei den obigen Acylierungen können die bekannten Verfahren zur Herstellung von Polypeptiden Anwendung finden. Dabei müssen an der Reaktion nicht beteiligte freie Aminogruppen vorübergehend geschützt werden, insbesondere mittels durch Hydrolyse abspaltbare Reste, wie z. B. durch den Carbobenzyloxyrest. Die zu acylierenden Aminosäuren werden in Form ihrer Ester verwendet. Als Acylierungsmethoden seien insbesondere erwähnt die Reaktion einer Säure mit dem Amin in Gegenwart eines Carbodiimids, wie in Anwesenheit des 1-Cyclohexyl-3- (2-morphinyl- [4]-äthyl)-carbodi- imids, und die Umsetzung eines Amins mit einem aktivierten Ester, in dem als aktivierender Substituent in der Alkoholkomponente vorteilhaft die Cyanoder Nitrogruppe vorhanden ist.
Die Umwandlung einer geschützten Aminogruppe in eine freie Aminogruppe sowie die Überführung einer funktionell abgewandelten Carboxylgruppe in eine freie Carboxylgruppe im Verlaufe des Verfahrens zur Herstellung der verschiedenen Polypeptide und insbesondere in dem verfahrensgemäss erhaltenen Decapeptid erfolgt nach an sich bekannten Methoden durch Behandlung mit hydrolysierenden bzw. mit hydrierenden Mitteln.
In dem erhaltenen Verfahrensprodukt kann die freie Carboxylgruppe funktionell abgewandelt, insbesondere in Ester bzw. Amide übergeführt werden.
Ferner ist es möglich, freie Aminogruppen zu substituieren, wie z. B. zu alkylieren oder acylieren. Das Verfahrensprodukt lässt sich auch in Form seiner Salze gewinnen bzw. verwenden.
Eine spezielle Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens, wie sie im ersten Beispiel beschrieben ist, wird im folgenden Formelschema unter 3 bis 7 dargestellt : la. a. Diathylphosphitamid von Nitro-L-argininmethylester (II)
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1 b. N-Carbobenzyloxy-L-asparaginyl-nitro-L-argininmethylester (V)
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2. N-Carbobenzyloxy-L-asparaginyl-nitro-L-arginin (VI)
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3. N-Carbobenzyloxy-L-asparaginyl-nitro-L-arginyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-valyl-L-histidinmethylester (VIII) 85
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4. N-Carbobenzyloxy-L-asparaginyl-nitro-L-arginyl-L-valyl-L-tyrosyl-L valyl-L-histidin (IX)
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5.
N-Carbobenzyloxy-L-asparaginyl-nitro-L-argifayl-L-valyl-L-tyrosyl-L-valyl-L-histidyl-L-prolyl-L-phenyl- alanyl-L-histidyl-L-leucin-methylester (XI)
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6. L-Asparaginyl-L-arginyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-valyl-L-histidyl-L-prolyl-L-phenylalanyl-L-histidyl-L- leucin-methylester (Xll)
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7. L-Asparaginyl-L-arginyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-valyl-L-histidyl-L-prolyl-L-phenylalanyl-L-histidyl-L- leucin (XIII)
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Das verfahrensgemäss erhaltene Polypeptid kann als Zwischenprodukt zur Herstellung von Arzneimit- teln oder auch selbst als Heilmittel in Form von pharmazeutischen Präparaten Verwendung finden.
Diese enthalten das Peptid in Mischung mit einem für die enterale, parenterale oder lokale Applikation geeigneten pharmazeutischen organischen oder anorganischen Trägermaterial.
In den nachfolgenden Beispielen sind die Temperaturen in Celsiusgraden angegeben.
Beispiel 1 a) N-Carbobenzyloxy-L-asparaginyl-nitro-L-arginyl- L-valyl-L-tyrosyl-L-valyl-L-histidinmethylester (Vlll)
Zu einer Lösung von 2, 07 g (4, 43 m Mol) N Carbobenzyloxy-L-asparaginyl-nitro-L-arginin (VI) (F. = 98-103 ) und 1, 20 g (5, 07 mMol) 1-Cyclo- hexyl-3- (2-morpholinyl- (4)-äthyl)-carbodiimid in 5 ml Dimethylformamid wird eine Lösung von 2, 05 g (3, 87 mMol) L-Valyl-L-tyrosyl-L-valyl-L-histidin- methylester (VII) (F. = 191-193 ) in 3 ml Dimethylformamid gegeben. Nach 24 Stunden bei 22 wird das Dimethylformamid im Hochvakuum bei 50 Badtemperatur abdestilliert und der Rückstand mit 8 ml Wasser verrieben.
Das unlösliche Pulver wird genutscht und mit wenig Wasser gewaschen. Es wird sodann in 6 ml 1-n. HC1 suspendiert, wobei sich ein schwer filtrierbarer, gelatinöser Niederschlag (Hydrochlorid von VIII) bildet. Dieser wird zentrifugiert und im Zentrifugenglas einmal mit wenig 1-n. Salzsäure, zweimal mit wenig Wasser und verdünnter Sodalösung, dann wieder mit Wasser und schliesslich mit Aceton gewaschen und zum Schluss in Aceton abgenutscht und getrocknet. Es wird 1, 22 g (32 /o der Theorie) VIII als schwach bräunliches Pulver vom F. = 170-180 erhalten. Die Substanz ist löslich in Dimethylformamid, etwas löslich in Methanol, schwer löslich in Aceton und Wasser.
Das Pulver kann in Lösung gebracht werden durch Zugabe von wenig ver dünnter Salzsäure und viel Wasser und wird aus dieser Lösung durch Zugabe von stärkerer (z. B. 2-n.) Salzsäure als Hydrochlorid wieder ausgefällt. b) N-Carbobenzyloxy-L-asparaginyl-nitro-L-arginyl-
L-valyl-L-tyrosyl-L-valyl-L-histidin (IX)
800 mg (0, 82 m Mol) VIII werden durch Erwär- men in 8, 0 ml Dimethylformamid gelöst, auf Zimmertemperatur gekühlt und 2, 5 ml 1-n. LiOH in Wasser zugegeben. Nach 90 Minuten bei Zimmertemperatur wird von einer Spur ungelöstem Material abfiltriert, mit wenig Dimethylformamid gewaschen und 2, 5 ml
1-n. Salzsäure zugegeben (pH ¯ 3).
Die Lösung wird dann im Hochvakuum bei 50 Badtemperatur zur Trockne verdampft und das verbleibende Harz mit wenig Methanol verrieben. Das unlösliche Pulver wird abgenutscht, mit wenig Methanol gewaschen und getrocknet. Es werden 350 mg (44 /o der Theorie) IX als farbloses Pulver ; F. 185-195 erhalten.
Das Produkt ist etwas löslich in Wasser und Methanol, schwer löslich in Aceton. Beim Versetzen mit 1-n. Sodalösung wird eine klare Lösung erhalten. c) N-Carbobenzyloxy-L-asparaginyl-nitro-L-arginyl- L-valyl-L-tyrosyl-L-vctlyl-L-histidyl-L-prolyl-L-phe- nylalanyl-L-histidyl-L-leucinmethylester (XI)
350 mg (0, 36 m Mol) IX werden durch Erwär- men in 4 ml Dimethylformamid gelöst, auf Zimmertemperatur gekühlt und eine Lösung von 110 mg (0, 46 m Mol) 1-Cyclohexyl-3-(2-morpholinyl-(4) äthyl)-carbodiimid in 0, 5 ml Dimethylformamid zugegeben. Hierauf werden auf einmal 216 mg (0, 41 rn Mol) L-Prolyl-L-phenylalanyl-L-histidyl-L-leucin- methylester (X) (amorph) zugegeben und die Lösung 24 Stunden bei 30 belassen.
Hierauf wird von einer Spur ungelöstem Material abfiltriert, das Dimethylformamid im Hochvakuum vollständig abdestilliert und der trockene Rückstand (Harz) mit wenig 1-n.
Sodalösung und dann mit wenig Wasser gewaschen und getrocknet. Das trockene Pulver wird hierauf weiter dreimal mit wenig Methanol gewaschen. Nach dem Trocknen wird 100 mg XI als schwach bräunliches Pulver erhalten ; F. (Sinten ab etwa 160 ) = 185 bis 195 (Ausbeute 19 /o).
Das Produkt ist löslich in Dimethylformamid, etwas löslich in Methanol und Wasser ; löslich in 1-n.
Salzsäure. d) L-Asparaginyl-L-arginyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-valyl L-histidyl-L-prolyl-L-phenylalanyl-L-histidyl-L- leucinmethylester (XII)
60 mg XI (0,041 m Mol) werden gelöst in 2 ml 0, 1-n. HC1 in Methanol und die Lösung in Gegenwart von 50 mg Palladiumkohle (100/o Pd) bei Zimmertemperatur und Normaldruck während 15 Stunden in einer Wasserstoffatmosphäre geschüttelt. Hierauf wird vom Katalysator abfiltriert, mit etwas Methanol gewaschen und zur Trockne verdampft. Zum Rückstand werden mehrere Male kleine Mengen Methanol zugegeben und wieder zur Trockne verdampft. Nach Trocknen im Hochvakuum wiegt der Rückstand (Harz) 67 mg (berechnet für Tetrahydrochlorid von XII = 61 mg).
Das Produkt ist leicht löslich in Methanol und Wasser. Die wässrige Lösung gibt mit Silbernitrat einen Niederschlag von Silberchlorid ; beim Versetzen mit 2-n. Sodalösung bildet sich kein Niederschlag. e) L-Asparaginyl-L-arginyl-L-aalyl-L-tyrosyl-L-vclyl- L-histidyl-L-prolyl-L-phenylalanyl-L-histidyl-L- leucin (XIII)
52 mg (etwa 0, 035 m Mol) rohes, amorphes Tetrahydrochlorid von XII werden in 0, 25 ml Wasser gelöst und 0, 25 ml 1, 0-n. NaOH (entsprechend 7 Aquivalenten) zugegeben. Die trübe Lösung wird ll/o Stunden bei Zimmertemperatur belassen (pH der Lö sun-zum Schlug = 10, 5) und dann mit 0, 25 ml 1, 0-n.
HCI versetzt (pH der Lösung etwa 3, 5). Dabei fällt flockiger Niederschlag aus. Er wird abzentrifugiert, das Sediment. zweimal mit 0, 5 ml Wasser (Zentrifugieren) gewaschen. Das ausgefallene Material wiegt nach dem Trocknen 4 mg. Die wässrige Lösung und die Waschwasser werden vereinigt; durch trofenweisen Zusatz von 0, 1-n. NaOH auf pH = 6, 5 gebracht (Endvolumen 3, 8 ml).
Eine Probe der Lösung wird mit der 100fachen Menge physiologischer Kochsalzlösung verdünnt, 0, 1 ml dieser Lösung bewirkt bei der Injektion in Ratten eine starke blutdrucksteigernde Wirkung, die ungefähr zweimal so lange anhält wie die durch Hy pertensin erzeugte Blutdrucksteigerung.
Die Hauptmenge der Lösung wird in einem Eis Kochsalz-Bad gefroren und bei 0, 1 mm Hg lyophili- siert. Das als Rückstand erhaltene Decapeptid (31 mg) ist ein farbloses Pulver, das sich leicht in Wasser löst, im Gegensatz zu Hypertensin jedoch in Methanol ziemlich schwer löslict ist.
Die p-Carbonamidgruppe des Asparaginylrestes lässt sich durch hydrolytische Mittel, wie z. B. Salzsäure, zur Carboxylgruppe verseifen.
Das als Ausgangsmaterial verwendete N-Carbo benzoxy-L-asparaginyl-nitro-L-arginin (VI) kann wie folgt hergestellt werden :
1. Diatltylphosphitamid von Nitro-L-argirzinmethyl- ester (III)
Zu einer Lösung von 8, 50 g (0, 037 Mol) Nitro L-argininmethylester (II) und 8, 0 ml (0, 057 Mol) Tri äthylamin in 100 ml absolutem Dioxan bei 5 wird auf einmal die gekühlte Lösung von 9, 00 g 75 /o (0, 042 Mol) Diäthylchlorphosphit (I) in 20 ml absolutem Dioxan zugegeben. Dabei fällt sofort ein dicker Niederschlag von Triäthylaminhydrochlorid aus. Die Kristalle werden nach 1 Stunde bei 20 abgenutscht und mit wenig absolutem Dioxan nachgewaschen.
Die Dioxanlösung hinterlässt nach Eindampfen und Trocknen 12, 52 g rohes Diäthylphosphitamid (III) des Ni tro-L-argininmethylesters als zähes, farbloses 01, das, wie unten beschrieben, sofort weiterverarbeitet wird.
2. N-Carboben4yloxy-L-asparaginyl-nitro-L-arginin- methylester (V)
12, 52 g (etwa 0, 035 Mol) rohes, öliges Diäthyl- phosphitamid (III) des Nitro-L-argininmethylesters werden in 40 ml Diäthylphosphit gelöst und 8, 00 g (0, 030 Mol) gut getrocknetes, feingepulvertes N Carbobenzyloxy-L-asparagin (IV) zugegeben. Die klare Lösung wird 2 Stunden bei 80 gehalten und dann das Diäthylphosphit im Hochvakuum möglichst vollständig entfernt. Der Rückstand wird mit 30 ml Wasser versetzt, wobei sich ein dickes Öl abscheidet.
01 und wässrige Phase passieren vier Scheidetrichter mit je 250 ml Essigester, wobei sich das ölige Material langsam in Essigester löst. Die Essigesterlösungen werden der Reihe nach mit wenig verdünnter Salzsäure, Natriumsulfatlösung, Sodalösung und Natriumsulfatlösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und geben bei Eindampfen 7, 00 g Harz. Durch Umkristallisation aus Wasser erhält man 3, 63 g V in Nadeln vom Schmelzpunkt 150-165 ; Ausbeute 25 der Theorie. Aus der Mutterlauge können keine weiteren Kristalle erhalten werden.
Die Rohkristalle schmelzen nach mehrfachem Umkristallisieren aus Wasser bei 170-173 ; [a] D + 5 + 2 (c = 2, 0 in Eisessig). Das Produkt ist löslich in Methanol, Dimethylformamid und heissem Wasser, schwer löslich in kaltem Wasser, Essigester und Tetrahydrofuran.
3. N-Carbobenzyloxy-L-asparaginyl-nitro-L-arginin (VI)
4, 74 g (0, 0099 Mol) V vom Schmelzpunkt 165 bis 170 wird mit 11, 0 ml 1-n. Natronlauge versetzt und bei 22 1 Stunde geschüttelt. Nach etwa 15 Minuten ist die Hauptmenge gelöst. Nach weitern 15-20 Minuten beginnt Abscheidung eines voluminösen Nie derschlages (Natriumsalz von VI). Der Niederschlag wird zum Schluss durch Zugabe von 20 ml Wasser gelöst, von einer Spur ungelöstem Material abfiltriert und dann CO2 eingeleitet, bis der pH der Lösung = 8, 5 ist.
Die wässrige Phase wird sodann zweimal mit je 80 ml Essigester gewaschen, und die Essigesterlösungen werden einmal mit wenig Natriumbicarbonatlösung gewaschen.
Die wässrige Phase und die Wasch-bicarbonatlösung werden vereinigt, mit 2-n. Salzsäure auf pH= 1 gebracht, wobei sich amorphes Material abscheidet.
Letzteres wird durch viermaliges Ausziehen mit je 250 ml Essigester in Lösung gebracht ; die Essigesterlösungen werden zweimal mit wenig Natriumsulfatlösung gewaschen, über Na2SO4 getrocknet und geben beim Eindampfen 4, 46 g teilweise kristallinen Rück- stand. Durch Kristallisation aus Acetonitril werden insgesamt 3, 26 g VI in Nadeldrusen vom F. = 94 bis 98 erhalten (71 I/o der Theorie). Nach zweimaligem Umkristallisieren aus Acetonitril schmelzen sie bei 98 bis 101 ; Hp = 10 4 (c = 1, 4 in Methanol).
Die Kristalle sind löslich in Methanol, Dimethylformamid, heissem Acetonitril und heissem Wasser, schwer löslich in kaltem Wasser und Acetonitril, Essigester, Tetrahydrofuran, Aceton ; leicht löslich in gesättigter Natriumbicarbonatlösung.
Der als Ausgangsmaterial verwendete L-Valyl-Ltyrosyl-L-valyl-L-histidinmethylester kann wie folgt bereitet werden :
4. N-Carbobenzyloxy-L-valyl-L-tyrosin-äthylester a) mittels Carbodiimid.
Eine Lösung von 50, 2 g (0, 2 Mol) Carbobenzyloxy-L-valin und 41, 8 g (0, 2 Mol) L-Tyrosinäthylester in 400 ml Acetonitril wird mit 45, 3 g (0, 22 Mol) 1, 3 Di-cyclohexyl-carbodiimid versetzt und 5 Stunden bei Zimmertemperatur stehengelassen. Das ausgeschiedene Gemisch von Di-cyclohexyl-harnstoff und dem Reaktionsprodukt wird abfiltriert und das Dipeptidderivat aus diesem Gemisch mit Essigester extrahiert.
Die ursprüngliche Reaktionslösung wird im Vakuum eingedampft, der Rückstand in Essigester gelöst, diese Lösung mit 2-n. Salzsäure, 2-n. Natrium-hydrogencarbonat-Lösung und Wasser gewaschen, getrocknet und mit der obigen Essigesterlösung des ursprünglich ausgeschiedenen Reaktionsprodukts vereinigt. Der beim Eindampfen im Vakuum erhaltene Rückstand kristallisiert bei Zugabe von Ather und liefert 74, 5 g (84 /o) Carbobenzyloxy-L-valyl-L-tyrosin-äthylester vom F.
= 142-145 . Durch Umkristallisieren aus Aceton Ather werden 68, 6 g reines Material vom F. = 148 bis 149 erhalten ; [a] D =---33 1 (c = 3, 96 in Chloroform). fi) iiber p-Nitrophenylester.
20 g (0, 08 Mol) Carbobenzyloxy-L-valin werden in 25 ml trockenem Pyridin gelöst und mit 26, 6 g (0, 082 Mol) Di-p-nitro-phenyl-sulfit versetzt. Die Lösung wird über Nacht bei 30 stehengelassen und darauf im Vakuum vom Lösungsmittel befreit. Zum Rückstand werden etwa 50 g Eis gegeben, und das Gemisch wird mit 2-n. Salzsäure angesäuert (pH 1) ; nach 10 Minuten wird mit 500 ml Ather extrahiert, und die Atberlösung wird mit 2-n. Salzsäure, Eiswas- ser, eiskalter verdünnter Natronlauge und wiederum Eiswasser gewaschen, getrocknet und eingedampft..
Der ölige Rückstand (25 g) ergibt nach Kristallisation aus Ather-Petroläther 22, 7 g (= 76 /o) Carbobenzyloxy-L-valin-p-nitrophenylester vom F. = 63-64 .
1, 12 g (0, 003 Mol) dieses Esters und 0, 63 g (0, 003 Mol) L-Tyrosinäthylester werden in 3 ml Tetrahydrofuran gelöst, und die Lösung wird 48 Stunden bei Zimmertemperatur stehengelassen. Nach Entfernung des Lösungsmittels im Vakuum wird das Reaktionsprodukt in Essigester aufgenommen und die Essigesterlösung mit 2-n. Salzsäure, gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung und Wasser gewaschen, getrocknet und im Vakuum eingedampft. Bei Zugabe von Ather scheiden sich 0, 90 g (67 /o) fester Carbo benzyloxy-L-vall-L-tyrosin-äthylester ab, der nach Umkristallisieren aus Aceton-Ather bei 145-147' schmilzt ; [a] = + 34 l" (c = 4, 03 in Chloroform).
5. N-Carbobenzyloxy-L-valyl-o-benzoyl-L-tyrosin- äthylester 372 mg (0, 001 Mol) des unter 4 ss) beschriebenen Carbobenzyloxy-L-valin-p-nitrophenylesters werden in 1 ml Essigester gelöst und mit 1 ml einer Lösung, enthaltend 0, 0013 Mol o-Benzoyl-L-tyrosinäthylester (frisch aus dem Hydrochlorid bereitet), in Essigester versetzt. Beim Stehen der Lösung bei Zimmertemperatur beginnt sich das Reaktionsprodukt als festes Material auszuscheiden. Nach 22 Stunden wird abfiltriert (466 mg), und das Filtrat wird nach Waschen mit 2-n.
Salzsäure, 2-n. Natriumhydrogencarbonat-Lösung und Wasser eingedampft und liefert beim Versetzen mit Äther weitere 56 mg Substanz ; total 522 mg (95 /o). Nach zweimaligem Umkristallisieren aus Aceton-Ather schmilzt der N-Carbobenzyloxy-L-valyl-obenzoyl-L-tyrosin-äthylester bei 173-175 ; [a] 2D = +34n + 2O (c= 1, 51 in Chloroform).
6. N-Carbobenzyloxy-L-valyd-L-tyrosin a) aus N-Carbobenzyloxy-L-valyl-L-tyrosinäthylester.
70, 7 g (0, 16 Mol) Carbobenzyloxy-L-valyl-L-tyro sin-äthylester werden in 300 ml Methanol gelöst und unter Rühren innert 15 Minuten bei etwa 10 mit 400 ml l-n. Natronlauge versetzt. Die klare Reaktionslösung wird 2 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen, dann im Vakuum von Methanol befreit und wenig festes Material abfiltriert. Beim Ansäuern des Filtrats mit verdünnter Salzsäure scheidet sich das Carbobenzyloxy-L-valyl-L-tyrosin in kristalliner Form aus und wird abfiltriert, mit Wasser gewaschen und im Vakuum bei 50 getrocknet ; F = 161-163 ; [a]22D = + 26 # 1 (c = 4,01 in Pyridin). Die Ausbeute beträgt 64,01 g (97%).
ss) aus N-Carbobenzyloxy-L-valyl-o-benzoyl-L tyrosin-äthylester.
546 mg (0, 001 Mol) Carbobenzyloxy-L-valyl-obenzoyl-L-tyrosin-äthylester werden in 20 ml heissem Methanol gelöst, und die Lösung wird rasch gekühlt und sofort mit 4 ml 1-n. Natronlauge versetzt. Nach 2 Stunden wird wie oben beschrieben aufgearbeitet, wobei 380 mg (97"/t) kristallines Material vom F. 161 bis 163 erhalten werden, das mit dem unter a) beschriebenen Carbobenzyloxy-L-valyl-L-tyrosin identisch ist.
7. N-Carbobenzyloxy-L-valyl-L-histidinmethylester
Eine Lösung von 25, 1 g (0, 1 Mol) Carbobenzyloxy-L-valin und 16, 7 g (0, 1 Mol) L-Histidinmethylester in 100 ml Acetonitril wird bei etwa 10 mit 26, 1 g 1-Cyclohexyl-3-morpholinyläthyl-carbodiimid (0, 11 Mol) versetzt und bei Zimmertemperatur stehengelassen. Nach etwa 1 Stunde beginnt die Abscheidung eines gelatineartigen Produkts, das nach 15 Stunden abfiltriert und mit Acetonitril gewaschen wird : 30, 8 g (77 /o) ; F. 152-156 . Der aus Aceton-Ather umkristallisierte Carbobenzyloxy-L-valyl-L-histidinmethylester schmilzt bei 161-163 ; [a] 2D=22} + 20 (c = 2, 04 in Athanol).
8. L-Valyl-L-histidinmethylester
10 g (0, 025 Mol) Carbobenzyloxy-L-valyl-L-histi- dinmethylester werden in 100 ml Methanol gelöst, mit einer Lösung von 0, 03 Mol Salzsäure-Gas in Methanol versetzt und in Gegenwart von 2 g Palladiumkohle (10 O/o Pd) bei Zimmertemperatur und Normaldruck hydriert (gebildetes CO. gleichzeitig in Natronlauge absorbiert). Nach Aufnahme der berechneten Menge Wasserstoff kommt die Hydrierung nach l Stunde zum Stillstand. Der Katalysator wird abfiltriert und die Reaktionslösung im Vakuum eingedampft.
Das als 01 (8, 7 g) erhaltene Hydrochlorid der Base wird in wenig Wasser gelöst und nach Uberschichten der Lösung mit Essigester unter Umschütteln bei 0"mit ge sättigter Pottasche-Lösung stark alkalisch gestellt. Die das Reaktionsprodukt enthaltende Essigesterphase wird getrocknet und im Vakuum eingedampft, und der als öliger Rückstand erhaltene L-Valyl-L-histidinmethylester (6, 5 g) wird direkt weiter umgesetzt.
9. N-Carbobenzyloxy-L-valyl-L-tyrosyl-L-valin- methylester a) mittels Carbodiimid.
Eine Lösung von 53, 8 g (0, 13 Mol) N-Carbobenzyloxy-L-valyl-L-tyrosin und 17, 0 g (0, 13 Mol) L Valin-methylester (frisch aus dem Hydrochlorid bereitet) wird unter Kühlen mit 30 g (0, 15 Mol) N, N' Dicyclohexyl-carbodiimid versetzt und während 4 Stunden bei Zimmertemperatur stehengelassen. Das ausgeschiedene feste Material, bestehend aus einem Gemisch des Tripeptid-Derivats und Di-cyclohexyl-harnstoff, wird abfiltriert, mit Tetrahydrofuran extrahiert, die ungelöste Harnstoffverbindung abfiltriert, das Filtrat im Vakuum eingedampft und der Rückstand mit Ather versetzt, wobei 42, 1 g gelatineartiges Material vom F. = 177-179 erhalten wird. Die ursprüngliche Reaktionslösung wird ebenfalls im Vakuum eingedampft, der Rückstand in viel Essigester aufgenommen und die Essigester-Lösung mit 2-n.
Salzsäure, 2-n. Natriumhydrogencarbonatlösung und Wasser gewaschen, getrocknet und eingedampft. Nach Zugabe von Ather zum Rückstand lassen sich weitere 13, 3 g Material vom F. = 170-172 isolieren. Ausbeute total : 55, 4 g (81 /o). Umkristallisation aus Aceton Ather ergibt 51, 4 g (75 /o) N-Carbobenyloxy-L- valyl-L-tyrosyl-L-valin-methylester vom F. = 194 bis 196 ; [a] D =-24 1 (c = 4, 08 in Eisessig).
ss) mittels aktiviertem Ester.
0, 83 g (0, 002 Mol) N-Carbobenzyloxy-L-valyl-Ltyrosin wird in einem Gemisch von 5 ml Essigester und 0, 32 ml (0, 004 Mol) Pyridin gelöst, mit 0, 69 g (0, 002 Mol) Di-p-nitrophenylsulfit versetzt und wäh- rend 8 Stunden auf 50 erwärmt. Beim Kühlen scheidet sich ein Teil (0, 14 g) des Reaktionsproduktes aus, während die Hauptmenge (0, 50'g) nach Waschen der Reaktionslösung mit verdünnter Salzsäure, ges.
Natriumhydrogencarbonatlösung und Wasser, Trocknen, Eindampfen und Kristallisation des Rückstandes aus Ather erhalten wird (F. 175-176 ). Ausbeute 0, 64 g (60"/o). Nach Umkristallisieren aus Aceton-Äther schmilzt der Nitrophenylester bei 176-177 ; [a] 2D =2 + 1 (c = 4, 07 in Aceton) ; er besteht aus einem Gemisch von N-Carbobenzyloxy-L-valyl-L- tyrosinester und N-Carbobenzyloxy-L-valyl-D-tyrosinester.
Eine Lösung von 535 mg (0, 001 Mol) des erhaltenen N-Carbobenzyloxy-dipeptid-p-nitrophenylesters und 131 mg (0, 001 Mol) L-Valin-methylester in 2 ml Tetrahydrofuran wird 48 Stunden bei Zimmertemperatur stehengelassen und darauf im Vakuum vom Tetrahydrofuran befreit. Bei Zugabe von Essigester kristallisieren 261 mg des Reaktionsprodukts (F. 172 bis 174 ), und nach Aufarbeiten der Essigesterlösung wie unter a) werden durch Kristallisation aus Ather weitere 170 mg (total 431 mg = 82 /o) gewonnen.
Die aus Aceton-Ather umkristallisierte Substanz vom F. 173-1753 ist ein Gemisch von N-Carbobenzyl oxy-L-valyl-L-tyrosyl-L-valin-methylester und N Carbobenzyloxy-L-valyl-D-tyrosyl-L-valin-methylester.
Die Drehung ist nur wenig niedriger als bei dem unter a) erhaltenen Produkt.
10. N-Carbobenzyloxy-L-valyl-L-tyrosyl-L-valin
Eine Lösung von 47, 5 g (0, 09 Mol) N-Carbobenzyloxy-L-valyl-L-tyrosyl-L-valin-methylester in 350 ml Methanol wird bei etwa 10 unter Rühren mit 250 ml l-n. Natronlauge versetzt und 2 Stunden bei Zimmertemperatur stehengelassen. Das Methanol wird darauf im Vakuum abdestilliert und die wässrige, schwach trübe Lösung filtriert, auf 0 gekühlt und mit Salzsäure angesäuert. Das ausgeschiedene feste Material wird abfiltriert, mit Wasser gewaschen, in feuchtem Zustande in 1 Liter 0, 5-n. Natriumhydrogencarbonat-Lösung gelöst, von etwa 0, 8 g unlöslichem Material abfiltriert und wiederum durch Zugabe von überschüssiger Salzsäure gefällt und mit Wasser gewaschen.
Die getrocknete Substanz schmilzt bei 218 bis 220. Ausbeute : 37, 1 g (= 80 /o). Umkristallisation aus Athanol-Wasser ergibt 32, 1 g (= 70 /o) reines N Carbobenzyloxy-L-valyl-L-tyrosyl-L-valin vom F. = 222-224 ; [a] 23 =-26- lu (c = 4, 16 in Atha- nol).
11. N-Carbobenzyloxy-L-valyl-L-tyrosyl-L-valyl-L- histidinmethylester a) aus Dipeptid-Derivaten mittels Carbodiimid.
Eine Lösung von 9, 94 g (0, 024 Mol) Carboben- zyloxy-L-valyl-L-tyrosin in 100 ml Acetonitril wird mit 6, 64 g (0, 28 Mol) l-Cyclohexyl-3-morpholinyl- äthyl-carbodiimid und darauf mit 6, 5 g (0, 024 Mol) L-Valyl-L-histidin-methylester versetzt. Nach 15 Stunden wird das ausgeschiedene Reaktionsprodukt abfiltriert und mit Acetonitril gewaschen. Das Rohprodukt (11, 2 g = 70 /o) vom F. 208-211 wird in 500 ml heissem Methanol gelöst, die Lösung auf 100 ml ein geengt und mit dem gleichen Volumen Ather versetzt.
Der ausgeschiedene reine Carbobenzyloxy-L-valyl-Ltyrosyl-L-valyl-L-histidin-methylester schmilzt bei 222 bis 224 ; [a] 24 =-27 2 (c = 2, 00 in Eisessig). aus Dipeptid-Derivaten iiber aktivierten Ester.
539 mg (0, 001 Mol) des unter 6, 83 beschriebenen Carbobenzyloxy-dipeptid-p-nitrophenylesters und 270 mg L-Valyl-L-histidinmethylester werden in 4 ml Tetrahydrofuran gelöst. Beim Stehen der Lösung beginnt schon nach 30 Minuten die Ausscheidung des Reaktionsproduktes, das nach 24 Stunden abfiltriert wird : 462 mg (= 70 /o) Substanz vom F. 208-211 .
Das aus Methanol-Äther umkristallisierte Tetrapeptid Derivat zeigt einen etwas niedrigeren Schmelzpunkt (219-221 ) als das unter a) beschriebene Material und ebenfalls eine wenig erniedrigte Drehung. Der Mischschmelzpunkt der nach a) und erhaltenen Produkte weist keine Depression auf, obwohl nach ) nicht der reine Carbobenzyloxy-L-valyl-L-tyrosyl-L valyl-L-histidin-methylester erhalten wird, sondern ein Gemisch mit Carbobenzyloxy-L-valyl-D-tyrosyl-L-valyl-L-histidin-methylester. y) aus Tripeptid-Derivat mittels Carbodiimid.
Eine Lösung von 28, 22 g (0, 055 Mol) N-Carbobenzyloxy-L-valyl-L-tyrosyl-L-valin und 10, 14 g (0, 06 Mol) L-Histidin-methylester in 300 ml Tetrahydrofuran wird bei etwa 10 mit einer Lösung von 14, 22 g (0, 06 Mol) l-Cyclohexyl-3-morpholinyl-äthyl-carbodiimid in 100 ml Acetonitril versetzt, und das Gemisch wird 15 Stunden bei Zimmertemperatur stehengelassen, wobei sich das Reaktionsprodukt in fester Form. abscheidet. Dieses wird abfiltriert (16, 0 g, F. 213 bis 216 ), und aus der Mutterlauge wird nach Einengen eine weitere Fraktion isoliert (6, 35 g ; F. 207-210 ).
Die vereinigte Substanz (22, 35 g = 61 /o) wird wie unter a) aus Methanol-Äther umkristallisiert und ergibt 18, 5 g (= 50 OIG) des Tetrapeptid-Derivats vom F. 225-228 ; [a] 2E0 =-28" 2 (c = 2, 02 in Eisessig).
12. N-Carbobenzyloxy-L-valyl-L-tyrosyl-L-valyl-L- histidin
Eine Suspension von 3, 32 g (0, 005 Mol) Carbobenzyloxy-L-valyl-L-tyrosyl-L-valyl-L-histidin-methylester in 30 ml Methanol wird bei etwa 10 mit 15 ml I-n. Natronlauge versetzt, worauf das Ausgangsmaterial rasch in Lösung geht. Die Reaktionslösung wird 2 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen, darauf im Vakuum vom Methanol befreit und-nach Abtrennung einiger Flocken durch Filtration-mit 20 ml 2-n. Essigsäure angesäuert. Das ausgeschiedene gallertartige Material wird abzentrifugiert, mehrmals in H20 suspendiert und wiederum abzentrifugiert und schliesslich mit Aceton und Methanol gewaschen und im Vakuum bei 40 getrocknet.
Das Carbobenzyloxy L-valyl-L-tyrosyl-L-valyl-L-histidin wird in einer Aus beute von 2, 74 g (84 /ff) erhalten und schmilzt nach Waschen mit heissem Methanol bei 236-238 ; [a] 23 =-10 2 (c = 2, 10 in Eisessig) ; es ist unlöslich in allen gebräuchlichen organischen Lösungsmitteln ausser in Dimethylformamid und Eisessig.
13. L-Valyl-L-tyrosyl-L-valyl-L-histidin-methylester
3, 32 g (0, 005 Mol) Carbobenzyloxy-L-valyl-Ltyrosyl-L-valyl-L-histidin-methylester werden fein verrieben, in 100 ml absolutem Methanol suspendiert und in Gegenwart von 1, 0 g Palladiumkohle (10 /o Pd) hydriert (gebildetes CO2 in Natronlauge absorbiert).
Nach Aufnahme von etwas mehr als der berechneten Menge Wasserstoff kommt die Hydrierung zum Stillstand. Die vom Katalysator abfiltrierte Lösung wird im Vakuum eingedampft, der Rückstand mit Aceton verrieben und das feste Material abfiltriert. Der so erhaltene L-Valyl-L-tyrosyl-L-valyl-L-histidin-methylester (2, 02 g = 76 /o) schmilzt unscharf bei 190 und ist für weitere Umsetzungen genügend rein.
Der unter c) als Ausgangsmaterial verwendete L Prolyl-L-phenyl-alanyl-L-histidyl-L-leucinmethylester (X) kann wie folgt hergestellt werden : 14. N-Carbobenzyloxy-L-prolyl-L-phenylalanin- methylester a) über gemischtes Anhydrid.
Zur Lösung von 1 g (0, 004 Mol) kristallinem N Carbobenzyloxy-L-prolin in 15 ml absolutem Tetra hydrofuran gibt man bei-10 0, 61 ml (0, 0044 Mol) Triäthylamin und nach 5 Minuten bei der gleichen Temperatur 0, 42 ml (0, 0044 Mol) Chlorameisen säureäthylester. Das Triäthylamin-hydrochlorid fällt sofort als weisser kristalliner Niederschlag aus.
Die gleichzeitig bereitete und vom Triäthylamin- hydrochlorid filtrierte Lösung vom L-Phenylalanin- methylester, aus 1, 1 g (0, 0051 Mol) Phenylalanin- methylesterhydrochlorid und 0, 71 ml 0, 0055 Mol) Triäthylamin wird ebenfalls auf-10 gekühlt und zur Lösung des gemischten Anhydrids gegeben. Nach zweistündigem Stehen bei Zimmertemperatur filtriert man vom Niederschlag ab und verdampft das Lösungsmittel im Vakuum bei 40-45 . Den wasserklaren Rückstand nimmt man in Essigester auf, wäscht viermal mit je 5 ml 1-n. HCl-Lösung, zweimal mit Wasser, viermal mit je 2 ml 2-n. Natriumhydrogencarbonatlösung und zum Schluss mit Wasser neutral.
Die Essigesterlösung hinterlässt nach Eindampfen und Trocknen 1, 8 g gelbliches Ö1, das noch wenig Lösungsmittel enthält. Der rohe Carbobenzyloxy-L-prolyl-L-phenylalaninmethylester wird sofort zum N Carbobenzyloxy-L-prolyl-L-phenylalanin verseift.
ss) über aktiven Ester.
5 g (0, 02 Mol) N-Carbobenzyloxy-L-prolin und 6, 5 g (0, 02 Mol) Di-p-nitrophenylsulfit lässt man in 8 ml abs. Pyridin während 23 Stunden bei Zimmertemperatur stehen, saugt darauf das Pyridin im Vakuum ab und versetzt den Eindampfrückstand mit Eis und 2-n. HCl bis pH = 1. Das ausgeschiedene 01 erstarrt nach einstündigem Stehen im Eiskasten zu einem amorphen Produkt. Es wird filtriert und mit viel Wasser und Ather gewaschen. Das amorphe Produkt wiegt nach dem Trocknen 2, 9 g.
Die ätherische Mutterlauge wird im Eisraum unter dauernder Eiskühlung zweimal mit 2-n. HCl-Lösung, zweimal mit Wasser, anschliessend alternierend viermal mit l-n. NaOH und HSO ausgeschüttelt, und zum Schluss mit Wasser neutral gewaschen. Verdampfen der getrockneten Lösung gibt 3, 5 g gelbliche Kristalle. Die Ausbeute nach einmaligem Umlösen der beiden Fraktionen aus viel Ather ist 5, 9 g (80 /o) N-Carbobenzyloxy-L-prolin-p-nitro-phenylester vom F. 94-95 .
1 g (0, 0046 Mol) L-Phenylalaninmethylester-hy- drochlorid wird in 20 ml Essigester aufgeschlämmt, mit 0, 7 ml (0, 005 Mol) Triäthylamin versetzt und unter öfterem Umschütteln 15 Minuten bei Zimmertemperatur stehengelassen. Dazu gibt man 1, 72 g (0, 0046 Mol) Carbobenzyloxy-L-prolin-p-nitrophenylester in 5 ml Essigester und lässt das Ganze 72 Stunden bei 20 reagieren. Die Reaktionslösung wird dreimal mit 2-n. HCI, zweimal mit H2O, viermal alternierend mit 2-n. Sodalösung und Wasser behandelt und zum Schluss neutral gewaschen. Man erhält 1, 9 g rohen Carbobenzyloxy-dipeptidester, der noch wenig Lösungsmittel enthält. Dieses Produkt wird direkt für die Weiterverarbeitung verwendet.
15. N-Carbobenzyloxy-L-prolin-L-phenylalanitt
1, 8 g (etwa 0, 004 Mol) roher Carbobenzyloxy-Lprolyl-L-phenylalaninmethylester werden in 5 ml Methanol mit 4, 4 ml l-n. NaOH 11MX Stunden bei Zimmertemperatur stehengelassen, dann mit 25 ml Wasser versetzt und die wässrig alkalische Lösung zweimal mit frischem Essigester extrahiert. Beim Ansäuern mit l-n. HCl bis zur congosauren Reaktion scheidet sich das Carbobenzyloxy-L-prolyl-L-phenylalanin als zähes farbloses 01 ab. 01 und wässrige Phase werden dreimal mit frischem Essigester in drei Scheidetrichtern extrahiert, die Essigesterlösungen mit Wasser neutral gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck abgedampft.
Es bleiben 1, 4 g farbloser Schaum. Dieser, in 2 ml Aceton gelöst und mit 10 ml Ather versetzt, ergibt nach portionenweisem Versetzen mit Petroläther bei 0 1, 3 g (82 /o) kristallines Carbobenzyloxy-L-prolin-L-phenylalanin vom F. 121-123 ; [a] 23 =49f) (c = 1, 215 in Chloroform).
Die Verseifung des nach 14 ss) erhaltenen Produktes mit 1-n. Natronlauge in Methanol ergibt 1 g (63 i'o) kristallines N-Carbobenyloxy-L-prolyl-L-phenylala- nin vom F. 121-124 [a],, -31o in Chloroform.
16. N-Carbobenzyloxy-L-prolyl-L-phenylalanin-p nitrophenylester
In 16 ml abs. Pyridin werden 10 g (0, 025 Mol) N-Carbobenzyloxy-L-prolyl-L-phenylalanin warm gelöst. Die Lösung wird wieder auf Raumtemperatur ab gekühlt und mit 8, 14 g (0, 025 Mol) Di-p-nitrophenyl- sulfit versetzt. Nach einstündigem Stehen ist der ganze Kolbeninhalt erstarrt. Man gibt nochmals 10 ml Pyridin dazu und belässt das Reaktionsgemisch total 5 Stunden. Das Pyridin wird zum grössten Teil im Vakuum abgesaugt und der kristalline Rückstand mit viel Ather versetzt. Die Kristalle (9 g ; F. 146-147 ) werden abgenutscht und mit viel Ather-gewaschen.
Die konzentrierte Mutterlauge wird mit verdünnter Salzsäure, Natriumbicarbonat und Wasser gewaschen.
Nach Verdampfen des getrockneten Athers verbleiben 1, 7 g kristalliner N-Carbobenzyloxy-L-prolyl-L-phe- nylalanin-p-nitro-phenylester, der dreimal aus Essigester umkristallisiert F. 155 zeigt. Die Totalausbeute ist 10, 2 g (79 /o).
17. N-Carbobenzyloxy-L-prolyl-L-phenylalanyl-L- histidinmethylester
3 g (0, 0124 Mol) L-Histidinmethylester-dihydrochlorid geben beim Umsatz mit 2 Aquivalenten Natriummethylat in Methanol 2, 5 g rohen L-Histidinmethylester. Dieser wird in 5 ml abs. Tetrahydrofuran gelöst und mit der Lösung von 4 g (0, 078 Mol) N Carbobenzyloxy-L-prolyl-L-phenylalanin-p-nitrophenylester in 25 ml absolutem Tetrahydrofuran während 64 Stunden bei Zimmertemperatur stehengelassen.
Nach 40 Minuten beginnt die Abscheidung von N Carbobenzyloxy-L-prolyl-L-phenylalanyl-L-histidinmethylester. Man erhält so 2, 5 g kristallinen Carbobenzyloxy-tripeptidester. Die Mutterlauge wird im Vakuum zur Trockne verdampft, der ölige Verdamp fungsrückstand in Essigester aufgenommen und sechsmal mit je 3 ml 5-n. HCl ausgeschüttelt. Die salzsaure Lösung bringt man mit fester Pottasche auf pH 8-9 und zieht das ausgeschiedene 01 dreimal mit frischem Essigester aus. Nach Verdampfen der neutral gewaschenen und über Natriumsulfat getrockneten Essig esterlösung bleiben 1, 55 g öliger Carbobenzyloxy-tri- peptidmethylester, der für die Weiterverarbeitung ge nügend rein ist.
Die Gesamtausbeute ist 4, 05 g (= 92 /o).
18. N-Carbobenzyloxy-L-prolyl-L-phenylalanyl-L- histidin
1, 6 g (0, 0029 Mol) roher Carbobenzyloxy-L-prolyl-L-phenylalanyl-L-histidinmethylester werden in 5 ml Methanol mit 2, 9 ml 1-n. NaOH 1 Stunde bei 200 verseift. Anschliessend wird das Methanol teilweise bei Raumtemperatur abgesaugt und zum Rückstand 5 ml Wasser gegeben. Zur Entfernung der unverseiften Produkte wäscht man die wässrige Lösung zweimal mit Essigester und die Essigesterphasen zweimal mit 3 ml Wasser. Beim Ansäuern der vereinigten Wasser mit 2, 9 ml l-n. Salzsäure scheidet sich das Carbobenzyloxy-L-prolyl-L-phenylalanyl-L-histidin als gelbliches 01 ab. Dieses ist in Essigester unlöslich und wird daher dreimal mit frischem Chloroform extrahiert.
Die neutral gewaschene und getrocknete Chloroformlösung wird auf ein kleines Volumen eingedampft und das Carbobenzyloxy-tripeptid mit viel Essigester ausgefällt. Die Ausbeute ist 1, 2 g (78 /ff). Zweimaliges Ausfällen aus Chloroform/Essigester liefert ein Produkt vom F. 128-135 , das sehr hygroskopisch ist und sofort weiterverwendet wird.
19. N-Carbobenzyloxy-L-prolyl-L-phenylalanyl-L- histidyl-leucin-methylester a) aus Dipeptid-Derivaten mittels Carbodiimid.
2 g (0, 0048 Mol) Carbobenzyloxy-L-histidyl-Lleucin-methylester [hergestellt nach R. W. Holley & E. Sondheimer ; J. Am. Chem. Soc. 76, 1326 (1954)] werden in 30 ml absolutem Methanol und 2 Aquivalenten Salzsäure in Gegenwart von 600 mg 10 /oigem Pd auf Kohle bis zum Stillstand hydriert. Nach 70 Minuten sind 121 ml Wasserstoff aufgenommen (theor. 120 ml). Die vom Katalysator befreite Lösung wird im Vakuum bei 40 zur Trockne eingedampft.
Der Rückstand wird in 2 ml Wasser gelöst, mit 10 ml Essigester überschichtet und bei 0 mit 5 ml eiskalter 50 /o iger Kaliumcarbonatlösung versetzt. Verdampfen der mit MgSOs getrockneten Lösung ergibt 1, 1 g (82 /o) L-Histidyl-L-leucin-methylester als O1.
Die Lösung von 1, 1 g (0, 0039 Mol) frisch bereitetem L-Histidyl-L-leucinmethylester in 5 ml abs.
Acetonitril vereinigt man mit der Lösung von 1, 54 g (0, 0039 Mol) N-Carbobenzyloxy-L-prolyl-L-phenylalanin in 10 ml abs. Acetonitril und versetzt mit 890 mg (0, 0044 Mol) Dicyclohexyl-carbodiimid. Nach fünfstündigem Stehen bei Zimmertemperatur gibt man 0, 2 ml Eisessig zur Reaktionslösung und filtriert nach 15 Minuten vom ausgeschiedenen Harnstoff ab. Das Acetonitril wird bei 40 im Vakuum verdampft und der Rückstand in Essigester gelöst. Die Essigesterlösungen werden viermal mit je 3 ml l-n. HC1 und anschliessend sechsmal mit je 5 ml 5-n. HC1 ausgezogen.
Alkalischmachen der 5-n. HCl-Auszüge mit fester getrockneter Pottasche bei 0 und Extraktion mit Essigester ergibt nach Verdampfen der über Natriumsulfat getrockneten Essigesterlösung 1, 6 g (63"/o) amorphen Carbobenzyloxy-L-prolyl-L-phenylalanyl-L-histidyl-Lleucinmethylester ; [a] 24 =-60o 4o (c = 1, 04 in Methanol).
P) aus Dipeptidderivaten über aktivierten Ester.
Zu 1, 21 g (0, 0043 Mol) L-Histidyl-L-leucinmethylester (aus 2, 16 g Carbobenzyloxy-L-histidyl-Lleucinmethylester) in 5 ml abs. Tetrahydrofuran gibt man die Lösung von 2, 06 g (0, 004 Mol) Carbobenzyl oxy-L-protlyl-L-phenylalanin-p-nitro-phenylester in 15 ml abs. Tetrahydrofuran und lässt 42 Stunden bei 20 reagieren. Das Tetrahydrofuran wird im Vakuum verdampft. Der Rückstand wird in Essigester dreimal mit je 5 ml 1-n. Salzsäure und achtmal mit je 3 ml 5-n. Salzsäure extrahiert. Alkalisieren der 5-n.
Salzsäureauszüge mit fester Pottasche bei 0 und Extraktion des ausgeschiedenen Ols mit Essigester ergeben nach einmaligem Ausfällen aus Essigester/Petroläther 1, 65 g (62 O/o) amorphes N-Carbobenzyloxy-L-prolyl L-phenylalanyl-L-histidyl-L-leucinmethylester ; [a] D =530 + 40 (c = 1, 07 in Methanol). y) aus Tripeptid-Derivat mittels Carbodiimid.
Die vereinigten Lösungen von 2 g (0, 0037 Mol) N-Carbobenzyloxy-L-prolyl-L-phenylalanyl-L-histidin in 15 ml abs. Methylenchlorid und 650 mg (0, 0045 Mol) L-Leucinmethylester in 4 ml absolutem Methylenchlorid versetzt man mit 860 mg (0, 0041 Mol) Dicyclohexylcarbodiimid und lässt 5 Stunden bei Raumtemperatur reagieren. Die Aufarbeitung wie unter a) beschrieben ergibt 1, 7 g (66 /o) amorphen N-Carbobenzyloxy-L-prolyl-L-phenylalanyl-L-histidyl-L-leucinmethylester ; [a] D =-53 4 (c = 0, 830 in Methanol).
20. L-Prolyl-L-phenylalanyl-L-histidyl-L-leucin- methylester a) durch hydrierende Spaltung.
1, 98 g (0, 003 Mol) Carbobenzyloxy-L-prolyl-L-phenylalanyl-L-histidyl-L-leucin-methylester werden in 3 0 ml Methanol gelöst, mit einer Lösung von 0, 006 Mol Salzsäuregas in Methanol versetzt und in Gegenwart von 0, 5 g Palladiumkohle (10 /o Pd) bei Zimmertemperatur und Normaldruck hydriert (unter Verwendung eines zweiten, mit verdünnter Natronlauge gefüllten Hydriergefässes zur Absorption des gebildeten Kohlendioxyds). Nach Aufnahme von etwas mehr als der berechneten Menge Wasserstoff innerhalb von 3 Stunden wird die neutrale Reaktionslösung vom Katalysator abfiltriert und im Vakuum eingedampft.
Das als feste Masse (1, 88 g) erhaltene Di-hydrochlorid der Base wird in 5 mI Wasser gelöst, wenig unlösliches Material mit Essigester extrahiert und die klare wässrige Lösung bei 0 mit überschüssiger ge sättigter Sodalösung alkalisch gestellt. Das ausgeschiedene 01 wird in Essigester aufgenommen, die Essigesterlösung mit H20 gewaschen, getrocknet und eingedampft. Der so erhaltene L-Prolyl-L-phenylalanyl-L-histidyl-L-leucin-methylester (1, 13 g = 74 /o) ist für weitere Umsetzungen genügend rein.
/ durch Spaltung mit Bromwasserstoff in Eisessig.
1, 98 g (0, 003 Mol) Carbobenzyloxy-L-prolyl-L- phenylalanyl-L-histidyl-L-leucin-methylester werden mit 1, 5 ml Eisessig fein verrieben und mit 6, 3 ml einer 1, 6-n. Lösung (0, 01 Mol) von Bromwasserstoff in Eisessig versetzt. Das Ausgangsmaterial ist nach 30 Minuten vollständig gelöst ; die Reaktionslösung wird bis zum Aufhören der Kohlensäureentwicklung bei Raumtemperatur stehengelassen (5 Stunden) und darauf im Vakuum vollständig eingedampft. Der ölige Rückstand wird beim Verreiben mit Äther fest und ergibt nach Waschen mit Essigester und Äther 2, 07 g (ber. 2, 06 g) Dihydrobromid des Tetrapeptid-methylesters als hygroskopisches Pulver.
Der freie Ester wird in der unter a) beschriebenen Weise gewonnen ; Ausbeute 1, 43 g (90 /o) ; in Wasser schwerlösliches Öl, leicht löslich in 2-n. HC1, Aceton und Chloroform.
Beispiel 2 N-Carbobenzyloxy-L-asparaginyl-L-nitroarginyl-L- valyl-L-tyrosyl-L-valyl-L-histidyl-L-prolyl-L-phenyl alanyl-L-histidyl-L-leucin-methylester a) 70 mg (1, 5 X 10-4 Mol) Carbobenzyloxy-Lasparaginyl-L-nitroarginin (vgl. Beispiel 1, Z. 3) und 154 mg L-Valyl-L-tyrosyl-L-valyl-L-histidyl-L-prolyl L-phenylalanyl-L-histidyl-L-leucin-methylester (1, 5 X 10-4 Mol) werden in 0, 3 ml Dimethylformamid gelöst, mit 48 mg (2 X 10-4 Mol) 1-Cyclohexyl-3-morpholi- nyläthyl-carbodiimid versetzt und 20 Stunden bei Zimmertemperatur stehengelassen.
Das Lösungsmittel wird darauf bei 0, 1 mg Hg entfernt, der Rückstand mit Eiswasser verrieben, filtriert und mehrmals mit Wasser gewaschen. Das Rohprodukt wird in 1 ml Wasser suspendiert, durch schwaches Ansäuern mit Salzsäure in das lösliche Hydrochlorid übergeführt, die Lösung durch Norit filtriert und das Filtrat mit gesättigter Sodalösung alkalisch gestellt. Das ausgeschiedene feste Material wird mit Wasser gewaschen, getrocknet, mit Aceton verrieben und mehrmals mit dem gleichen Lösungsmittel gewaschen. Der erhaltene Carbobenzyloxy-L-asparaginyl-L-nitroarginyl-L-valyl L-tyrosyl-L-valyl-L-histidyl-L-prolyl-L-phenylalanyl L-histidyl-L-leucin-methylester schmilzt unscharf bei 180 und ist identisch mit dem in Beispiel 1 unter c) beschriebenen Dekapeptid-Derivat.
ss) 234 mg (0, 5 m Mol) Carbobenzyloxy-L-asparaginyl-nitro-L-arginin und 185 mg (0, 18 m Mol) L-Valyl-L-tyrosyl-L-valyl-L-histidyl-L-prolyl-L-phenylala nyl-L-histidyl-L-leucin-methylester werden in 1, 5 ml Dimethylformamid gelöst, mit 119 mg (0, 5 m Mol) 1-Cyclohexyl-3-morpholinyläthyl-carbodiimid versetzt und 20 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen.
Das Lösungsmittel wird darauf bei 0, 1 mm Hg abdestilliert, der Rückstand mit Eiswasser verrieben, das feste Material abfiltriert, mehrmals mit Wasser gewaschen und bei 35 im Vakuum getrocknet. Nach mehrmaligem Verreiben des Rohprodukts mit Aceton werden 184 mg Decapeptid-Derivat als gelbliches Pulver erhalten.
Das erhaltene Produkt erweist sich bei der Gegenstromverteilung als noch sehr uneinheitlich. Durch aufeinanderfolgende Verteilungen in den Systemen a) CH30H (3), Hz0 (1)/CHCI3 (2), CC14 (1) b) CH30H (3), HO (l)/CHCl3 (2), CCI4 (2) c) CH30H (3), Hz0 (1), iCHCI (4), CC14 (1) lassen sich die Nebenprodukte weitgehend abtrennen und eine nochmalige Verteilung des Hauptproduktes (etwa 1/3 der eingesetzten Substanz) im System a) über 36 Stufen ergibt eine der theoretischen Kurve nahezu entsprechende Gewichtsverteilung in den Elementen 14-30 mit einem Verteilungskoeffizienten k = 1, 55.
Nach Umfallen aus wenig Athanol schmilzt die amorphe Substanz unscharf bei 181-184 (Zersetzung bei 187 ) ; [a] D =-55 4 (c = 0, 65 in 0, 01-n. HCl in Methanol.
Analyse C70H95Ot7Ntg (1474. 68) (getr. 5 St. 80 )
Ber. C 57, 01 H 6, 49 N 18, 05
Gef. C 56, 14 H 6, 49 N 17, 64
Der Dekapeptidester wird wie in Beispiel 1 unter c) bis e) beschrieben weiterverarbeitet.
Der als Ausgangsstoff verwendete L-Valyl-L-tyro syl-L-valyl-L-histidyl-L-prolyl-L-phenylalanyl-L-histi- dyl-L-leucin-methylester kann wie folgt hergestellt werden :
1. N-Carbobenzyloxy-L-valyl-L-tyrosyl-L-valyl-L- histidyl-L-prolyl-L-phenylalanyl-L-histidyl-L-leucin- methylester
1, 95 g (0, 003 Mol) Carbobenzyloxy-L-valyl-Ltyrosyl-L-valyl-L-histiden (vgl. Beispiel 1, Z. 12) werden in 10 ml Dimethylformamid suspendiert und mit 1, 58 g (0, 003 Mol) L-Prolyl-L-phenylalanyl-L-histidyl-L-leucin-methylester (vgl. Beispiel 1, Z. 20) und 0, 84g (0, 0035 Mol) 1-Cyclohexyl-3-morpholinyl-äthyl- carbodiimid versetzt. Nach 30 Minuten ist das Ausgangsmaterial vollständig gelöst.
Die Reaktionslösung wird über Nacht bei Zimmertemperatur stehengelas- sen, dann bei 0, 1 mm Hg vom Dimethylformamid befreit und der Rückstand mit Eiswasser versetzt. Das ausgeschiedene feste Material wird mit kalter 2-n.
Salzsäure verrieben, wobei sich ein anfänglich öliges Hydrochlorid des basischen Reaktionsproduktes bildet, das beim weiteren Verreiben wieder fest wird.
Nach zweimaligem Waschen mit 2-n. Salzsäure wird die Substanz durch Behandlung mit verdünnter Sodalösung wieder in die basische Form übergeführt, mehrmals mit Wasser gewaschen und im Vakuum bei Raumtemperatur getrocknet. Der rohe Carbobenzyloxy-L-valyl-L-tyrosyl-L-valyl-L-histidyl-L-prolyl-L phenylalanyl-L-histidyl-L-leucin-methylester wird in 20 ml Athanol gelöst, von wenig unlöslichem Material abfiltriert und im Vakuum eingedampft. Durch Verreiben des Rückstandes mit Essigester entsteht ein körniges Produkt, das unscharf bei 160 schmilzt. Ausbeute 2, 29 g (66 11/9).
Die Aufarbeitung des rohen N-Carbobenzyloxy octapeptid-methylester-hydrochlorids kann auch wie folgt vorgenommen werden : Man löst in 30 ml Wasser, zentrifugiert von wenig unlöslichen Bestandteilen ab und fällt aus durch Zugabe von 7, 5 ml konz. Salzsäure bei 0 (Endkonzentration etwa 2-n. Hic1). Zur Überführung in das freie Octapeptid-Derivat wird das Hydrochlorid wiederum in 30 ml Wasser gelöst und bei 0 mit 3 ml 10-n. Kaliumcarbonatlösung versetzt.
Das ausgeschiedene feste Material wird abfiltriert, mit Wasser neutral gewaschen und im Vakuum bei 35 getrocknet. Beim Verreiben mit Essigester entsteht ein amorphes Pulver, das unscharf bei 160 schmilzt. Ausbeute 2, 29 g.
Der rohe Carbobenzyloxy-L-valyl-L-tyrosyl-L-va lyl-L histidyl-L-prolyl-L-histidyl-L-leucin-methylester wird durch Gegenstromverteilung weiter gereinigt ; im
System Methanol (3), Wasser (1)/Chloroform (1), Tetrachlorkohlenstoff (2) findet sich nach 48 Verteilungsschritten etwa die Hälfte der eingesetzten Substanz in den Elementen 25-43 (Verteilungskoeffizient k = 2, 16). Eine nochmalige Verteilung dieses Materials im System Methanol (3), Wasser (1)/Chloro- form (2), Tetrachlorkohlenstoff (1) über 48 Verteilungsschritte ergibt eine der theoretischen Kurve entsprechende Gewichtsverteilung der Substanz in den Elementen 5-14 mit einem Verteilungskoeffizienten k = 0, 23.
Das gereinigte amorphe Material (Ausbeute 23"/o) schmilzt nach zweimaligem Umfällen aus Aceton bei 170-173 ; [a] 2D =-73 4 (c = 1, 01 in Athanol).
Analyse : C60H78Oj2Nt2 (1159. 38) (5 St. bei 80 getr.)
Ber. C 62, 16 H 6, 78 N 14, 50 OCH32, 67 /o
Gef. C 60, 45 H 6, 83 N 14, 24 OCH32, 60 /o
2. L-Valyl-L-tyrosyl-L-valyl-L-histidyl-L-prolyl-L- phenylalanyl-L-histidyl-L-leucin-methylester α
) Eine Lösung von 579 mg (0,0005 Mol) Carbobenzyloxy-L-valyl-L-tyrosyl-L-valyl-L-histidyl-L-pro lyl-L-phenylalanyl-L-histidyl-L-leucin-methylester wird mit 1 ml l-n. Salzsäure in Methanol versetzt und in Gegenwart von 0, 2 g Palladiumkohle (10 O/o Pd) bei 20 und Normaldruck hydriert (gebildetes C02 in Natronlauge absorbiert), wobei innert 90 Minuten etwas mehr als die berechnete Menge Wasserstoff aufgenommen wird. Der Katalysator wird darauf abfiltriert und das Filtrat eingedampft. Das erhaltene Di Hydrochlorid des Reaktionsprodukts (0, 51 g) wird mit Aceton gewaschen, darauf in wenig Wasser gelöst und die Lösung mit überschüssiger Sodalösung alkalisch gestellt.
Der als festes Material ausgeschiedene L-Va lyl-L-tyrosyl-L-valyl-L-histidyl-L-prolyl-L-phenylala nyl-L-histidyl-L-leucin-methylester wird mit Wasser gewaschen und im Vakuum bei 40 getrocknet. Ausbeute 213 mg (41"/o). Die Substanz ist löslich in Athanol, Chloroform und viel Aceton, schwer löslich in Essigester und Acetonitril.
4) Eine bessere Ausbeute wird erhalten, wenn man wie folgt vorgeht : Eine Lösung von 347 mg (0, 3 mMol) Carbobenzyloxy-L-valyl-L-tyrosyl-L-valyl-L- histidyl-L-prolyl-L-phenylalanyl-L-histidyl-L-leucinmethylester in 10 ml absolutem Methanol wird in
Gegenwart von 0, 2 g Palladiumkohle (100/o Pd) bei
20 und Normaldruck hydriert (gebiffdetes CO2 in Natronlauge absorbiert), wobei innert 90 Minuten etwas mehr als die berechnete Menge Wasserstoff aufgenom men wird. Die filtrierte Reaktionslösung wird im Va kuum eingedampft und der feste Rückstand aus Me thanol-Ather umgefällt.
Der erhaltene Octapeptid methylester (276 mg, 90%) ist löslich in Äthanol, schwer löslich in Aceton, Chloroform, Acetonitril und unlöslich in Wasser ; er lä#t sich direkt für weitere
Umsätze verwenden. y) Das Trihydrobromid kann folgendermassen dar gestellt werden : 128 mg (0, 11 mMol) Carbobenzyl oxy-L-valyl-L-tyrosyl-L-valyl-L-histidyl-L-prolyl-L- phenylalanyl-L-histidyl-L-leucin-methylester werden mit 0, 1 ml Eisessig zu einem einheitlichen 01 verrieben und mit 0, 35 ml einer 1, 6-n. Lösung (0, 55 mMol) von Bromwasserstoff in Eisessig versetzt. Aus der klaren Lösung beginnt sich nach 10 Minuten das Reaktionsprodukt als dunkles Öl auszuscheiden.
Das Gemisch wird weitere 21/2 Stunden mechanisch geschüttelt und darauf bei 0, 1 mm Hg und 35 vollständig eingedampft. Der ölige Rückstand wird beim Verreiben mit Ather fest und ergibt nach Waschen mit hei ssem Aceton 118 mg (85'Vo) des Octopeptid-methylester-trihydrobromids als schwach bräunliches Pulver, das unscharf bei 210 unter Zersetzung schmilzt. Es ist leicht löslich in Wasser, Methanol und Athanol.
Analyse : Cs2H72OloNl2 3 HBr (1268. 02)
Ber. Br 18, 91 O/o
Gef. 18, 57 /o
Der freie Octapeptid-methylester kann nur mit schlechter Ausbeute (41 /o) aus dem Trihydrobromid gewonnen werden. Er wird darum vorteilhafter nach dem unter 4) beschriebenen Verfahren hergestellt.