DE1793789A1

DE1793789A1 - Verfahren zur herstellung von einen cysteinrest enthaltenden peptiden

Info

Publication number: DE1793789A1
Application number: DE19681793789
Authority: DE
Inventors: Ralph Franz Hirschmann; John David Milkowski; Daniel Frank Veber
Original assignee: Merck and Co Inc
Current assignee: Merck and Co Inc
Priority date: 1967-08-07
Filing date: 1968-08-05
Publication date: 1975-01-16
Also published as: DE1793119B2; US3560521A; DE1793119A1; NL166254C; CH498088A; GB1225019A; DE1793789B2; NL166254B; FR1576147A; JPS538687B1; DE1793789C3; GB1225018A; NL6810421A

Description

Verfahren zur Herstellung von einen Cysteinrest enthaltenden Peptiden

Peptide, die Cystein enthalten, werden im allgemeinen synthetisiert unter Schutz der funktionellen Mercaptogruppe durch eine geeignete Gruppe. Es sind verschiedene Schutzgruppen bekannt, die für die Synthese von Cysteinreste enthaltenden Peptiden brauchbar sind, aber viele der bekannten Schutzgruppen werden während des Endstadiums der Synthese unter Schwierigkeiten entfernt oder sie sind gegen einige der im allgemeinen bei Peptidsynthesen verwendeten Reagenzien instabil.

Zu den Peptiden und Proteinen, die Schwefel enthalten, gehören

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Verbindungen, die Cystein mit der freien Mereaptogruppe enthalten, beispielsweise Glutathion, und Verbindungen mit einer Disulfidbrücke, die aus der Dehydrierung von zwei Cysteinresten unter Bildung von Cystin stammt, per Cysteinrest kann zu derselben Peptidkette gehören, wie beispielsweise in Oxytocin, Vasopressin und Ribonuclease, oder sie können verschiedenen Peptidketten angehören, wie beispielsweise im Insulin.

Peptide, welche Cystein mit ungeschützten Mercaptogruppen enthalten, sind bisher kaum synthesiert worden wegen, der Schwierigkeit beim Trennen der erhaltenen Verbindungen von den durch die Oxidation gebildeten Nebenprodukten. Während der Synthese des Peptids mit der ungeschützten Mercaptogruppe findet sehr leicht eine Dehydrierung unter Bildung der Cystinderivate statt und dies hat oftmals weitere Komplikationen zur Folge. Cystein wird darum fast ausschliesslich in Form seiner S-geschützten Form bei der Synthese von Cysteinreste enthaltenden Peptiden eingesetzt und es ist darum wünschenswert, eine geeignete Schutzgruppe zu haben, die leicht während der Synthese entfernt werden kann, die aber auch gegenüber den bei Peptidsynthesen angewendeten Reagenzien und Umsetzungsbedingungen stabil ist.

Durch die Erfindung wird die Synthese von Peptiden mit einem oder mehr Cysteinresten, wie bei Glutathion, Insulin, Oxytocin oder Ribonuclease, erleichtert.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von einen Cysteinrest enthaltenden Peptiden, das dadurch gekennzeichnet ist, dass die Mereaptogruppe des Cysteinrestes mit einer Schutzgruppe der allgemeinen Formel

R-C-NH-CH₂-

geschützt wird, in welcher R Niedrigalkyl, Acetonyl, Benzyl-

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oxy oder Aryl bedeutet, indem man den Cysteinrest mit einem N-Hydroxymethylalkyl- oder -arylamid umsetzt und anschliessend die freie Sulfhydrylverbindung bildet, indem man die Schutzgruppe unter kontrollierten pH-Bedingungen in der letzten Stufe der Synthese entfernt mit einer Verbindung aus der Gruppe Schwermetallsalze, Organometallsalze von Schwermetallen, Hydrazin, Phenylhydrazin und Bromwasserstoffsäure.

Von vielen Peptiden ist es bekannt, dass sie biologisch aktiv sind, einige sind nützlich für das Studium und für die Analyse von Proteinen, insbesondere für Studien, die angestellt werden, um einen Einblick in die physiologische Wirkung von Enzymen, Hormonen und anderen Proteinen mit wichtigen Punktionen im Körperm erhalten. Insulin hat beispielsweise die Schlüsselposition bei der Hormonregulierung des Zuckergleichgewichts inne und ein Mangel an Insulin verursacht das metabolische Krankheitsbild diabetes mellitus. Oxytocin, ein cyclisches Nonapeptid mit einem 20-gliedrigen Disulfidring stimuliert den Milchausstoss aus der Milchdrüse und wir häufig therapeutisch angewendet, um V/ehen einzuleiten. Vasopressin wurde schon als Ersatzheilmittel bei diabetes insipidus zur Behandlung von Anenteroneurie angewendet.

Die am häufigsten angewendete Schutzgruppe für die Mercaptogruppe ist die S-Benzylgruppe. Die S-Benzy!schutzgruppe vermindert im allgemeinen die Löslichkeit des Peptids in hydroxylgruppenhaltigen Lösungsmitteln. Diese Gruppe kann jedoch nur abgespalten werden, indem man Natrium in flüssigem Ammoniak verwendet. Dieses System führt jedoch zur Zersetzung vieler Peptide. Fluorwasserstoff wurde bereits zur Entfernung der S-Benzy!schutzgruppe verwendet, aber er ist für die Herstellung im grösseren Masstab unpraktisch, verursacht oftmals

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einen Abbau der Peptide und ist auch nicht ausreichend selektiv, weil er auch die Carbobenzoxy-, t-Butoxy- und t-Butoxycarbonylgruppen entfernt. Andere Gruppen, wie die S-p-Nitrobenzyl-, S-p-Diphenylmethyl-, S-Benzylthio-methyl und die Triphenylmethylgruppen sind bei Synthesen von Cysteinpeptiden angewendet worden, aber auch sie befriedigten noch nicht vollständig. Beispielsweise erniedrigt die p-Nitrophenylgruppe die Löslichkeit des Peptids in hydroxylgruppenhaltigen Lösungsmitteln und kann nur durch katalytische Hydrierung in Gegenwart eines Palladium-auf-Kohle-Katalysators und von Chlorwasserstoffsäure entfernt werden. Dieses System arbeitet in Gegenwart von Schwefel nicht gut, weil der Katalysator während der Umsetzung oftmals vergiftet wird und wegen der mangelnden Selektivität, falls eine Carbobenzoxygruppe irgendwo in dem Molekül ist, weil diese Gruppe auch durch dieses System entfernt wird. Beim S-Benzylthiomethylcystein kann die Schutzgruppe durch Quecksilber(II)-chlorid in warmer Chlorwasserstoffsäure oder durch QuecksilberdD-acetat in 80£iger Ameisensäure entfernt werden. Sehr saure Bedingungen sind unerwünscht, weil dadurch Gruppen, welche Tryptophan enthalten, zerstört werden und unerwünschte Nebenprodukte sich bilden. Die Anwesenheit dieser Gruppe vermindert auch die Löslichkeit des Peptids in hydroxylgruppenhaltigen Lösungsmitteln. Die S-p-Diphenylmethylgruppe kann durch Natrium in flüssigem Ammoniak oder durch Trifluoressigsäure entfernt werden. Das letztere Reagens ist aber ungeeignet, weil es nicht selektiv ist und weil.es auch die tert.-Butylester- und die tert.-Butoxycarbonylgruppen entfernt. Die Anwesenheit einer starken Säure ist ein weiteres unerwünschtes Merkmal. Die Triphenylmethylgruppe kann mit einer schwachen Säure oder mit Quecksilbersalzen entfernt werden, aber diese Schutzgruppe wird zu leicht durch schwache Säuren unter üblichen Bedingungen entfernt und ist darum eine ungenügende Schutz-

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gruppe für Peptidsynthesen. Darüberhinaus wird durch die Gegenwart dieser Gruppe die Löslichkeit des Peptids in hydroxylgruppenhaltigen Lösungsmitteln vermindert.

Die S-Schutzgruppen können wie folgt unter Verwendung des Cysteinmoleküls als Beispiel eines Cysteinrestes veranschaulicht werden:

0 H COOH

R-C-N-CH₀-S-CH₀-CH , (I) d d ,

worin bedeuten R Niedrigalkyl, wie Methyl, Äthyl, Propyl oder Butyl, Aryl, wie Phenyl oder Naphthyl oder einen Acetonyl- oder Benzyloxyrest.

Bedeutet R in Formel 1 Niedrigalkyl oder Aryl, so kann die Schutzgruppe in einem Zweistufenverfahren gebildet werden. In der ersten Stufe wird ein N-Hydroxymethylalkyland d oder N-Hydroxymethylarylamid gebildet, beispielsweise N-Hydroxymethylacetamid oder N-Hydroxymethylbenzamid durch Umsetzung einer etwa Squimolekularen Menge eines Amids, wie Acetamid oder Benzamid, und Formaldehyd in Gegenwart einer katalytischen Menge von Kaliumcarbonat. Am einfachsten kann man eine 36- bis 38#ige wässrige Formaldehydlösung verwenden. Die Mischung wird mehrere Minuten auf einem Dampfbad erhitzt und anschliessend lässt man sie im allgemeinen mehrere Stunden bei Raumtemperatur stehen. Man fügt dann Trockeneis zur Einführung von Kohlendioxid in die Lösung, worauf anschliessend die Lösung im Vakuum auf einem Dampfbad

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bei etwa ^tO bis 50⁰C verdampft wird. Der Rückstand wird in einem geeigneten Lösungsmittel gelöst, beispielsweise in Aceton oder Methylenchlorid, die Lösung wird über einem geeigneten Trocknungsmittel getrocknet und das Lösungsmittel wird im Vakuum abgedampft. Der Rückstand wird durch Kristallisation oder durch andere bekannten Methoden gereinigt.

In der zweiten Stufe wird Cysteinhydrochlorid-monohydrat und ein geringer überschuss des N-Hydroxymethyl-alkylamids 'oder N-Hydroxymethyl-arylamids in einem geeigneten Lösungsmittel, wie Wasser, Methanol oder Äthanol, gelöst. Wie das folgende Reaktionsschema veranschaulicht, verläuft die Reaktion wahrscheinlich über ein Zwischenprodukt:

O O iiL-Λ. O H₊

R-C-N-CH₀OH· > R-C-N = CH₀ <ς Ί~ R-C-N=CH₉

^{d ά} -H .

^Cystein

0 H COOH

R-C-N-CH₀-S-CH₀-CH
^{ά ά} ι

worin R Niedrigalkyl, Aryl oder Benzyloxy bedeutet. Die Lösung der Reaktionsteilnehmer wird in einem Eisbad gekühlt und unter Rühren gibt man eine Säure, wie konzentrierte Chlorwässerstoffsäure, Bromwasserstoffsäure oder Schwefelsäure, zu. Die Reaktionsmischung wird dann vorzugsweise unter einer inerten

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Atmosphäre, wie Stickstoff, verschlossen und beim Raumtemperatur mehrere Stunden bis 1 oder 2 Tage stehengelassen. Die Verwendung von Stickstoff ist nicht kritisch, aber seine Verwendung führt im allgemeinen zu besseren Ausbeuten an dem gewünschten Produkt. Die Mischung wird im Vakuum bei etwa ^O bis 50° C verdampft. Ein Lösungsmittel, wie Benzol oder Äthanol, wird zugegeben und anschliessend entfernt, um Spuren von Wasser zu entfernen, und der feste Rückstand wird aus einem geeigneten Lösungsmittel, wie Methanol oder Äthanol, oder Mischungen aus Alkohol und wasserfreiem Äther, umkristallisiert. Das Produkt wird als Säuresalz erhalten, und die Abwesenheit von freiem Cystein in dem 5-Alkylamidomethylcysteinsalz wird durch DünnschichtChromatographie bestimmt. Die freie Aminosäure kann erhalten werden, indem man das Säuresalz mit wässrigem Alkali behandelt, bis die Lösung genau am isoelektrischen Punkt ist, oder indem man Silberoxid zufügt, um das Chlorid als Silberchlorid zu entfernen.

Bedeutet R in der Formel I Benzyloxy, so kann die Schutzgruppe in gleicher Ifeise wie vorher beschrieben wurde, gebildet werden. N-Hydroxymethyl-benzyloxycarboxamid wird hergestellt, indem man Benzyloxycarboxamid mit Formaldehyd umsetzt, und die Schutzgruppe wird angefügt, indem man ungefähr Squimolekulare Mengen von Cysteinhydrochlorid-monohydrat mit N-Hydroxymethylbenzyloxy-carboxamid umsetzt unter Bildung des Säuresalzes von S-ZBenzyloxycarboxamidomethyiy-cystein. Die Abwesenheit von freiem Cystein im Produkt wird durch Dünnschichtchromatographie bestimmt.

Bedeutet R in Formel I Acetonyl, so wird die N-Hydroxymethyl-Verbindung gebildet und durch Umsetzung von ungefähr äquimolekularen Mengen S-Methyl-isoxazol und Formaldehyd in Gegen-

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wart einer äquivalenten Menge Chlorwasserstoffsäure. Das vorstehend beschriebene Verfahren wird im wesentlichen wiederholt, wobei sich 2-Hydroxymethyl-5-methyl-isoxazaliumchlorid bildet. Diese Verbindung wird mit Cysteinhydrochlorid-monohydrat umgesetzt in Gegenwart einer Säure, wie Chlorwasserst off säure oder Bromwasserstoffsäure, wobei sich ein Kondensat i on sprodukt bildet, das isoliert, aber nicht gereinigt wird. Das Kondensationsprodukt wird mit wässrigem Alkali behandelt, wodurch der Oxazolring sich öffnet und man S-/Aceto-φ acetamidomethylj-eystein erhält.

Die S-Alkylamidomethylcystein-Verbindungen können hergestellt werden, indem man Derivate des N-Hydroxymethylalkylamids, wie die Ester oder Halogenmethyl-alkylamide, verwendet. Die Ester können einfach aus den N-Hydroxymethylalkyl- oder Arylamiden durch Umsetzung mit einem Acylierungsmittel, wie Acetylchlorid, Essigsäureanhydrid, Trifluoressigsäureanhydrid, Methansulfonylchlorid oder p-Toluolsulfonylchlorid hergestellt werden.

Die Halogenderivate können aus einem geeigneten Amid, wie Acetamid oder Benzamid, durch Umsetzung mit Formaldehyd und trocke-Ä nem Chlorwasserstoff- oder Bromwasserstoffgas in einem geeigneten Lösungsmittel, wie Eisessig, hergestellt werden. Die Halogenmethyl-Derivate können hergestellt werden, aus dem entsprechenden N-Hydroxymethylamid durch Umsetzung mit Phosphorpentachlorid oder Phosphortribromid in einem geeigneten Lösungsmittel, wie Dioxan, oder einer Mischung von Kther und Dioxan.

Diese Derivate können mit Cystein in einem weiten pH-Bereich umgesetzt werden unter sauren oder basischen Bedingungen, wobei sich das entsprechende S-Alkyl- oder S-Arylamidomethylcystein

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bildet. Man kann beispielsweise S-Acetamidomethylcystein aus 0-Methansulfonyl-M-hydroxymethylaeetamid durch Umsetzung mit Cystein in einem geeigneten Lösungsmittel, wie Wasser oder Äthanol, oder einer Mischung von Lösungsmitteln, herstellen. Die Umsetzung wird bei pH 5 unter Verwendung etwa äquimolekularer Mengen der Reaktanten durchgeführt. Der pH wird durch Zugabe von Alkali, wie Natriumhydroxid kontrolliert. Nach der Entfernung des Lösungsmittels im Vakuum wird das Produkt durch Umkristallisation aus Methanol/Äther oder durch andere bekannte Methoden gereinigt.

Die S-Alkylamino-Schutzgruppe keoin vollständig von dem einen Cysteinrest enthaltenden Peptid entfernt werden, indem man etwa ein Moläquivalent eines wasserlöslichen Salzes eines Schwermetalles, wie die Acetate oder Mitrate von Quecksilber, Silber, Cadmium, Zinn, Antimon, Platin, Gold, Blei oder Wismuth oder Organometallsalze von Schwermetallen, wie p-Chlorirereuri-benzoesäure, mit einer wässrigen Lösung des S-Alkylamidomethylcystein 1 bis 2 Stunden rührt. Dabei können Lösungsmittel, wie Methanol, Dimethylformamid oder Mischungen dieser Lösungsmittel verwendet werden. Die Umsetzung wird im allgemeinen bei Raumtemperatur durchgeführt, aber andere Temperaturen als Raumtemperatur können auch angewendet werden. Das feste Metallsalz wird im allgemeinen zu der Lösung des Cysteinderivates zugegeben, aber man kann das Salz auch als Lösung zusetzen. Dabei bildet sich im allgemeinen ein Niederschlag und man lässt die Reaktion etwa 30 bis 90 Minuten laufen. Die Umsetzung kann in einem weiten pH-Bereich unter sauren oder basischen Bedingungen durchgeführt werden, je nachdem welches spezielle Mittel zur Entfernung der Schutzgruppe verwendet wird. Die besten Resultate werden jedoch bei pH 4 erhalten, wenn man anorganische Salze als Schutzgruppen-

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Entfernungsmittel verwendet, und bei pH 9, wenn Organometallsalze von Schwermetallen als Schutzgruppen-Entfernungsmittel verwendet v/erden. Werden diese Salze in Lösung zugegeben, so wird der pH der Lösung im allgemeinen dem pH, bei dem die Reaktion durchgeführt wird, angepasst. Nachdem.die Umsetzung vollständig ist, leitet man Schwefelwasserstoffgas in die Mischung ein, um das Metall zu entfernen oder man kann dieses durch Dialyse gegen eine Chelatverbindung, wie Äthylendiamintetraessigsäure entfernen. Die vollständige Abwesenheit der Schutzgruppe wird durch Dünnschicht-Chromatographie bestimmt.

Bedeutet R Acetonyl, so kann die Schutzgruppe durch Hydroxylamin, Hydrazin oder Pheny!hydrazin in Eisessig bei Raumtemperatur entfernt werden. Das Hydrazin reagiert mit den funktionellen Carbonylresten unter Bildung eines cyclischen Hydrazide und des S-Aminomethy!cystein als Rückstand. Dieser Rückstand ist im wässrigen Medium instabil und durch Zugabe von Wasser oder wässrigem Alkohol bricht er auf,unter Bildung von Ammoniak, Formaldehyd und dem freien Peptid. Das Produkt wird im allgemeinen mit Äther als bromwasserstoffsaures Salz ausgefüllt.

Ist in dem als Endprodukt hergestellten Peptid eine Disulfidbindung erwünscht, so lässt man nach Entfernung der Schutzgruppen in die Reaktionsmischung Luft einperlen, wobei sich das Disulfid durch Luftoxidation bildet.

Das Verfahren der Erfindung ist nützlich bei Peptidsynthesen, weil die Schutzgruppen unter den verschiedenen Reaktionsbedingungen, wie sie im allgemeinen bei Peptidsynthesen angewendet werden, stabil sind. So sind die Schutzgruppen z.B. unter sauren und basischen Bedingungen im pH 0 bis 13, in

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konzentriertem Ammoniak und in Trifluoressigsäure stabil. S-Acetamidomethyleystein, ein nützliches Zwischenprodukt bei der Synthese von cysteinenthaltenden Peptiden ist sehr löslieh in Wasser, eine Eigenschaft, die bei einigen Peptidsynthesen sehr nützlich ist.

Die neuen Schutzgruppen können bei der Synthese von bekannten Peptiden, die allgemein bekannte biologische Eigenschaften haben, wie Oxytocin, welches die Milchbildung reguliert, und Basopressin, welches blutdrucksenkende Eigenschaften hat, verwendet werden.

So wurde z.B. bei der Synthese von Oxytocin festgestellt, dass die f'e rc apt ο gruppe geschützt werden kann, indem man zunächst S-Acetamidomethylcystein-N-carboxyanhydrid mit Prolyl-leucylglycinairdd in Gegenwart von Kaliumborat bei einem pH von etwa 10 bis 11 umsetzt, wobei im allgemeinen ein etwa l$iger molarer überschuss de.s Carboxyanhydrids verwendet wird. !lach der Zugabe des K-Carboxyanhydrids wird der pH auf etwa 3 mit einer Mineralsäure, wie konzentrierte Schwefelsäure, eingestellt, und das Reaktionsgei7^;iis wird vaxy Entfernung von Kohlendioxid etwa 15 Minuten mit Stickstoff genpült. Der p'I wird dann wiederum auf IO bis 11 reit Kaliurnhydroxid einreguliert und anr-ob.3 nennend wird Aöparagin-N-carboxyonhydrid zu der Mischung gegeben. Die vorstehend genannte Reihenfolge, nach v/elcher der pH auf 3 gesenkt und dann wiedei* auf 10 erhöht wird nach der darauffolgenden Zugabe des Carboxyanhydrids, v/ird während der Zugabe von GHutnrain-n-carboxynnhydrid, Isolucin-K-carboxyanhydrid und Tyrosin-H-carboxyanhydrid wiederholt, bis die leiste Verfahrennstufe erreicht wird, wo der pH auf etwn P- erhöht wird und ein etwa lOyfciger überschuss an N-t-Butoxycarbonyl-S-acetamidomethylcystein-N-h.vdroxycussinimidester zugefügt wird. Der pH wird

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dann erniedrigt und etwa 15 bis 20 Stunden bei 1 gehalten, um die t-Butoxycarbonylgruppe zu entfernen und die S-Acetamidomethyl-Schutzgruppe wird durch Zugabe von Quecksilber(II)-acetat bei einem pH von etwa k bis 5 entfernt. In die Mischung lässt man zur Entfernung des Quecksilbers Schwefelwasserstoffgas perlen und anschliessend Luft, um den Rückstand zu Oxytocin zu oxidieren. Es wurde auch festgestellt, dass man anstelle von N-t-Butoxycarb anyl-S-acetamid'omethylcystein-N-hydroxysuccinimidester N-o-Nitrophenylsulfenyl-S-acetamidomethy lcystein-p-nitrophenylester verwenden kann, um das Endprodukt zu erhalten.

S-Acetamidomethylcystein-N-carboxyanhydrid wird hergestellt, indem man S-Acetamidomethylcystein mit Phosgen in einem geeigneten trockenen Lösungsmittel, wie peroxidfreiem Tetrahydrofuran, umsetzt. Phosgen wird unter Rühren in die Reaktionsmischung eingeleitet und nan erhält nach Beendigung der Reaktion eine klare Lösung. Das Produkt wird durch Verdampfen des Lösungsmittels gewonnen und dann in bekannter Weise gereinigt.

N-t-Butoxycarbonyl-S-acetamidomethylcystein-N-hydroxysuccinimidester kann hergestellt werden, indem man t-Butoxy-S-acetamidomethylcystein mit N-Hydroxysuccinimid in einem geeigneten Lösungsmittel, wie trockenem Dioxan, umsetzt. t-Butoxycarbonyl-S-acetamidomethylcystein erhält man, indem man S-Acetamidomethylcystein mit t-Butoxycarbonylazid in einem geeigneten Lösungsmittel, wie Dioxan, in Gegenwart einer Base, wie Magnesiumoxid, umsetzt. N-o-Nitrophenylsulfenyl-S-acetamidomethylcystein-p-nitrophenylester. kann hergestellt werden, indem man N-o-Nitrophenylsulfenyl-S-acetamidomethylcystein mit Nitrophenol in einem geeigneten Lösungsmittel, wie Tetrahydrofuran, in Gegenwart eines Überschusses desDicyclohexylcarbodiimids

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umsetzt. N-o-Nitrophenylsulfenyl-S-aeetamidomethyIcystein erhält man durch Umsetzung von S-Acetamidoir.ethylcystein mit o-Nitrophenylsulfenylchlorid in einem geeigneten Lösungsmittel, wie Dioxan, in Gegenwart einer Base, wie Magnesiumoxid.

Wie aus der vorstehenden Beschreibung hervorgeht, können die neuen Schutzgruppen bei der Synthese einer Anzahl von verschiedenen Peptiden, die einen oder mehrere Cysteinreste enthalten, verwendet werden. Die nachgewiesene chemische Stabilität der neuen Schutzgruppen und die Leichtigkeit, mit der sie mit spezifischen Reagentien wieder entfernt werden können, sind ganz besondere Vorteile gegenüber den zurzeit verwendeten Schutzgruppen bei Peptidsynthesen.

Die folgenden Beispiele beschreiben die Erfindung, ohne sie zu beschränken.

S-Acetamidomethylcysteinhydrochlorid

127 g (1,¹»3 Mol) N-Hydroxymethylacetamid und 228 g (1,3 Mol) Cysteinhydroehlorid-monohydr&t v/erden in einem Rundkolben in 350 ml Wasser gelöst. Die Lösung wird auf einem Eisbad gekühlt und dazu werden langsam unter Rühren 50 ml konzentrierte Chlorwasserstoff säure zugegeben. Man leitet Stickstoffgas in den Kolben und lässt diesen, nachdem er verschlossen wurde, 2 Tage bei Raumtemperatur stehen. Die Reaktionsmischung wird im Vakuum bei H0° C abgedampft. Man gibt absolutes Äthanol hinzu und verdampft im Vakuum. Dieser Schritt wird mehrere Male wiederholt, um alle Spuren Wasser zu entfernen. Der erhaltene weisse Niederschlag wird in Methanol bei Raumtemperatur gelöst und dazu wird wasserfreier Äther gegeben, bis die Lösung wolkig ist. Man lässt die Lösung 3 Tage bei 0 bis 5°C stehen, in dieser Zeit

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kristallisiert das Produkt. Nach dem Filtrieren und Waschen mit Äther wird das Produkt bei Raumtemperatur im Vakuum getrocknet, wobei man 150 g S-AcetamidomethyXeystelfihydroehlorid, das bei 187 C unter Zersetzung schmilzt, erhält.

Die freie Base erhält man, indem man das Hydrochlorid in einer geringen Menge Wasser löst und dazu verdünntes Natriumhydroxid gibt, bis der isoelektrische Punkt erreicht ist. Das Lösungsmittel wird im Vakuum entfernt und der Rücketand aus Äthanol kristallisiert. Man kann auch ein Äquivalent Silberoxid zu der wässrigen Lösung des Hydrochloridsalees zugeben. Das ausgefallene Silberchlorid wird abfiltriert und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt und der Rückstand aus Äthanol umkristallisiert.

Wird in dem vorstehend beschriebenen Verfahren N-Hydroxymethylpropionamid oder N-Hydroxymethylbenzamid anstelle von N-Hydroxymethylacetamid verwendet, so erhält man S-Propionamldomethylcysteinhydrochlorid und S-Benzamidomethylcystein-Hydrochlorid.

N-tert.-Butoxycarbonyl-S-acetamidomethylcystein

22,8 g (0,1 Mol) S-Acetamidomethylcystein-Hydrochlorid werden in einem Dreihals-Kolben, der mit einem mechanischen Rührer und einem Kühler ausgerüstet ist, in 250 ml 50$igem Dioxan (säuerstoffrei) gelöst. Man gibt 12 g Magnesiumoxid (0,3 Mol)

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hinzu und rührt die Mischung bei Raumtemperatur 30 Minuten. Man gibt 15,7 E (0,11 Mol) mehrfach destilliertes t-Butoxycarbonylazid hinzu und rührt die Mischung 20 Stunden auf einen ölbad bei ^5 C. ftan lässt das Reaktionsgemisch auf Raumtemperatur abkühlen und gibt 1 1 Wasser zu. Die wässrige Mischung wird zweimal mit je 250 ml Äthylacetat gewaschen, auf einem Eisbad gekühlt und mit 5O/5iger Zitronensäure auf pH 3 angesäuert. Die saure Lösung wird dann mit Natriumchlorid gesättigt und mit Kthylacetat extrahiert. Die Extrakte werden zweimal mit 200 ml einer gesättigten Natriumchloridlösung gewaschen, über wasserfreiein Natriumsulfat getrocknet, filtriert und im Vakuum verdampft unter Bildung eines amorphen Rückstandes Der Rückstand wird in warmem Kthylacetat gelöst und dazu gibt man 2 Volumenteile Benzol. Beim Stehen bei Raumtemperatur kristallisiert das Produkt und wird nach dem Filtrieren mit Benzol gewaschen und im Vakuum getrocknet. Einen zweiten und einen dritten Anteil erhält man, indem man Benzol zu den PiI-traten hinzufügt und Impfkristalle zusetzt. Mach dem Trocknen im Vakuum erhält man 11 g N-t-Butoxycarbonyl-S-acetamidomethylcystein, F.p. 110° bis 112°C.

Wird bei dem vorstehend beschriebenen Verfahren Benzyloxycarbonylazid oder Äthoxycarbonylazid anstelle von t-Butoxycarbonylazid verwendet, so erhält man Benzoxycarbonyl-S-acetamidomethy!cystein bzw. Sthoxycarbonyl-S-acetamidomethy!cystein.

S-AcetamidomethyIcystein-N-carboxyanhydrid

1,0 g S-Acetamidonethylcystein wird in einem trockenen Dreihalskolben, der mit einem Gaseinleitungsrohr und einem Kühler mit

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Trockenrohr versehen ist, vorgelegt. Dazu gibt man 50 ml trockenes peroxidfreies Tetrahydrofuran und rührt die Suspension, während ein Phosgenstrom bei Raumtemperatur eingeleitet wird. Nach 3 Stunden hat sich praktisch alles gelöst und die Lösung wird filtriert und im Vakuum abgedampft unter Bildung von S-AcetamidoiTiethylcystein-M-carboxyanhydrid in Form eines gelben Öls. Das öl wird durch das Infrarotspektrum als das gewünschte Produkt identifiziert.

Wird bei dem vorstehend beschriebenen Verfahren S-Propionamidomethylcystein und S-p-Chlorbenzamidomethy!cystein anstelle von S-Acetamidomethylcystein verwendet, so erhält man S~Propionamidomethylcystein-N-carboxyanhydrid bzw. S-p-Chlorbenzamidomethy Icystein-N-carboxyanhydrid.

N-tert.-Butoxycarbonyl-S-acetamidomethylcystein-N-hydroxysuceinimidester

7>3 g (0,025 Mol) N-tert.-Butoxy-S-acetamidomethylcystein werden in einem trockenen Kolben in 100 ml peroxidfreiem Tetrahydrofuran gelöst. Der Kolben wird auf einem Eisbad gekühlt und dazu gibt man 2,9 g (0,025 Mol) N-Hydroxysuccinimid. Sobald alles gelöst ist, werden 5,66 g (10?iger überschuss) Dicyclohexylcarbodiimid zugegeben. Die Mischung wird 1 Stunde in einem Eis/Salz-Bad gerührt und dann Übernacht bei 0 bis 5°C stehengelassen. Der als Nebenprodukt geformte Harnstoff wird abfiltriert und das Piltrat im Vakuum abgedampft. Der erhaltene weisse Niederschlag wird in Äthylacetat gelöst, einmal mit

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In Natriumbicarbonat und dreimal mit gesättigtem Natriumchlorid gewaschen und dann über Natriumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wird im Vakuum abgedampft, wobei man 9 g eines amorphen Peststoffes erhält. Das Produkt wird in Chloroform gelöst und dazu wird Äther gegeben, bis die Lösung wolkig wird. Beim Stehen Übernacht bei Raumtemperatur kristallisiert N-tert.-Butoxycarbonyl-S-acetamidomethyl-N-hydroxysuecinimidester aus. Die Analyse zeigt ein Produkt der Zusammensetzung C₁₅H₂₃N₃O₇S.

Wird in dem vorstehend beschriebenen Verfahren M-tert.-Butoxy-S-propionamidomethylcystein und M-tert.-Butoxy-S-benzamidomethylcystein anstelle von N-tert .-Butoxy-S-acetamidoruethylcystein verwendet, so erhält man N-tert.-Butoxyearbony1-S-propionamidomethylcystein-lJ-Hydroxysuccinimidester bzw. N-tert.-Butoxycarbonyl-S-benzamidomethylcystein-N-hydroxysuccinimidester.

N-o-Nitrophenylsulfenyl-S-acetamidomethyleystein-p-nitropheny!ester

N-o-Nitrophenylsulfenyl-S-acetamidomethyIcystein

22,8 g (0,1 Mol) S-Acetamidomethylcystein-hydrochlorid werden in 250 ml 5O52igem peroxidfreiem Dioxan in einem 500 ml Dreihalskolben, der mit einem mechanischen Rührer und einer. Kühler ausgerüstet ist, gelöst. Man gibt 12 g (0,3 Mol) Magnesiumoxid zu und rührt die Mischung 30 Minuten bei Raumtemperatur. Dazu werden 0,11 Mol o-Nitrophenylsulfenylchlorid gegeben und die

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Mischung wird 3 Stunden auf einem ölbad bei k5°C gerührt. Das Reaktionsgemisch wird auf Raumtemperatur abgekühlt und 1 1 Wasser wird zugefügt. Die wässrige Mischung wird zweimal mit 200 ml Äthylacetat gewaschen, auf einem Eisbad gekühlt und mit Zitronensäure auf den pH 3 angesäuert. Die Lösung wird dann mit Natriumchlorid gesättigt und mit Äthylacetat extrahiert. Die Extrakte werden zweimal mit einer gesättigten Natriumchloridlösung gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, filtriert und im Vakuum verdampft. Der Rückstand kristallisiert aus Äthylacetatbenzol.

Verwendet man indem vorstehend beschriebenen Verfahren S-Benzamidomethylcystein-hydrochlorid und S-Benzyloxycarboxamidomethylcystein-hydrochlorid anstelle von S-Acetamidomethylcystein-hydrochlorid, so erhält man N-o-Nitrophenylsulfenyl-S-benzamidomethylcystein bzw. N-o-Nitrophenylsulfenyl-S-benzyloxycarboxamidomethylcystein.

N-o-Nitrophenylsulfenyl-S-acetamidomethylcysteinp-nitrophenylester

0,025 Mol N-o-Nitrophenylsulfenyl-S-acetaraidomethylcystein werden in einem trockenen Kolben in 100 ml peroxidfreiem Tetrahydrofuran gelöst. Die Lösung wird auf einem Eisbad gekühlt und 0,025 Mol o-Ndtrophenyl werden zugefügt. Nachdem alles gelöst ist, wird ein !Obiger molarer überschuss von Dicyclohexylcarbodiimid zugefügt, die Mischung wird 1 Stunde auf einem Eis/Salz-Bad gerührt und dann Übernacht bei 0 bis 5°C stehengelassen. Der als Nebenprodukt gebildete Harnstoff wird abfiltriert und das FiItrat im Vakuum abgedampft. Der Rückstand wird in Äthylacetat gelöst, einmal mit In. Natriumbicarbonat und dann dreimal mit gesättigtem Natriumchlorid gewaschen, über

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wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum abgedampft. Beim Kristallisieren aus Chloroform/Äther erhält man praktisch reinen N-o-Nitrophenylsulfenyl-S-acetamidomethyleystein-pnitrophenylester.

Verwendet man in dem vorstehenden Verfahren N-o-Mitrophenylsulfenyl-S-benzamidomethylcystein und N-o-Nitrophenylsulfenyl-S-benzyloxyearboxamidomethylcystein anstelle von N-o-Mitrophenylsulfenyl-S-aeetamidomethylcystein so erhält man M-o-Nitrophenylsulfenyl-S~benzamidomethylcystein-p~nitrophenylester bzw. N-o-Nitrophenylsulfenyl-S-benzyloxycarboxamidomethyIcysteinp-nitrophenylester.

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O-Methansulfonyl-N-hydroxymethy!acetamid

^»^ g (0,05 Mol) N-Hydroxymethylacetamid werden in einem 100 ml Dreihals-Kolben, ausgerüstet mit einem Trockenrohr, Tropftrichter, mechanischem Rührer und Thermometer, in 50 ml Pyridin gelöst. Die Lösung wird auf einem Eisbad gekühlt und dazu werden in einem Zeitraum von etwa 20 Minuten unter Aufrechterhaltung der Temperatur zwischen 5 - 10⁰C tropfenweise 0,055 Mol Methansulfonylchlorid zugegeben. Nach mehreren Minuten bildet sich ein Niederschlag und die Mischung wird 1 Stunde bei 5 bis 10⁰C und dann weitere k Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das ausgefallene Pyridinhydrochlorid wird abfiltriert und das Piltrat wird im Vakuum bei ¹IO⁰C abgedampft, wobei man einen öligen Rückstand erhält. O-Methansulfonyl-N-

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hydroxymethy!.acetamid wurde durch das Infrarotspektrum identifiziert.

Verwendet man bei dem vorstehenden Verfahren p-Toluolsulfonyl· chlorid anstelle von Methansulfonylchlorid, so erhält man 0-p-Toluolsulfonyl-N-hydroxymethy!acetamid.

Herstellung von S-Acetamidomethylcystein aus Q-Me thans ulf onyl-N-hydroxyme thy !acetamid

1,21 g (0,01 Mol) Cystein werden in 20 ml Wasser gelöst. Die erhaltene Lösung hat einen pH von 5,0. Man gibt unter Rühren zu dieser Lösung eine Lösung von 0,011 Mol O-Methansulfonyl-N-hydroxymethy!acetamid, gelöst in 10 ml Äthanol. Durch Zugabe von 0,5n Natriumhydroxid wird der pH bei 5 gehalten. Nach mehrstündigem Rühren wird die Gegenwart von S-Acetamidomethylcystein durch Dünnschicht-Chromatographie festgestellt. Das Lösungsmittel wird im Vakuum verdampft und der Rückstand aus Methanol/ Äther umkristallisiert, wobei man reines S-Acetamidomethylcystein erhält.

Verwendet man in dem vorstehenden Verfahren O-p-Toluolsulfonyl-N-hydroxymethylacetamid anstelle von O-Methansulfonyl-N-hydroxymethylacetamid, so erhält man als gewünschtes Produkt S-Acetamidomethylcystein.

Das folgende Beispiel zeigt die Entfernung der S-Acetamidomethy1·

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Schutzgruppe:

96 mg (0,5 Millimol).S-Acetamidomethylcystein werden in 5 ml Wasser gelöst und die Lösung wird mit O,25n Chlorwasserstoffsäure auf pH 4 eingestellt. Dazu gibt man eine Lösung von 159 mg (0,5 Millimol) Quecksilber(II)-acetat in 5 ml Wasser, welches zuvor auf pH k eingestellt worden war. Beim Mischen bildet sich sofort ein Niederschlag. Der pH fällt und wird 1 Stunde lang auf pH ¹J eingeregelt. Während der Umsetzung entnimmt man in 15minütigen Abständen 2 ml Proben. Zu jeder Probe gibt man Schwefelwasserstoff, um die Reaktion abzubrechen. Die klare, überstehende Flüssigkeit wird abdekantiert und ein Dünnschicht-Chromatogramm wird von jeder Probe in einem Butanol-Essigsäure-Wassersystem durchgeführt. Die nach 30 und 45 Minuten gezogenen Proben enthalten kein S-Acetamidomethylcystein. Sie enthielten nur Cystein und Cystin.

Im folgenden wird die Verwendung der S-Acetamido-Schutsgruppe bei der Synthese eines Cystein enthaltenden Peptids beschrieben.

Synthese von Oxytocin

2 Millimol Prolyl-leucyl-glycinamid und 20 ecm Kaliumborat-Puffer (pH 10,2) werden in einem Waring-Mischer bei O⁰C gefüllt. Dazu gibt man unter Rühren einen 15Sigen molaren überschuss an S-Acetamidomethylcystein-N-carboxyanhydrid. Der pH wird mit konzentrierter Schwefelsäure auf 3,0 eingestellt und das System wird 15 Minuten zur Entfernung von Kohlendioxid

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mit Stickstoff gespült. Der pH wird dann mit 50£igem Kaliumhydroxid auf 10,2 erhöht und ein 2£iger molarer überschuss Asparagin-N-carboxyanhydrid zugefügt. Der pH wird auf 3»0 mit konzentrierter Schwefelsäure eingestellt und das System wird wiederum mit Stickstoff gespült. Man erhöht den pH dann auf 10,2 mit 5O5£igem Kaliumhydroxid und gibt einen 3?igen überschuss Glutamin-N-carbonsäureanhydrid zu. Der pH wird mit konzentrierter Schwefelsäure auf 3 erniedrigt und das System mit Stickstoff gespült. Dann wird der pH wieder auf 10,2 mit 50$igem Kaliumhydroxid erhöht und ein 5/Siger überschuss Tyrosin N-carboxyanhydrid zugegeben. Der pH wird mit konzentrierter Schwefelsäure auf 3 eingestellt und das System wird wiederum zur Entfernung von Kohlendioxid mit Stickstoff gespült. Der pH wird dann auf 8,0 mit 5Oj5igem Kaliumhydroxid erhöht und ein 10/Siger molarer überschuss von N-t-Butoxyearbonyl-S-acetamidomethylcystein-N-hydroxysuccinimidester wird zugegeben. Der pH wird zur Entfernung der tert.-Butoxycarbonylgruppe mit konzentrierter Schwefelsäure auf 1 erniedrigt und 15 Stunden dabei gehalten. Dann wird der pH auf ¹J eingestellt und ein lOjSiger molarer überschuss einer wässrigen Lösung von Quecksilber(II)-acetat wird zu der Reaktionsmischung zugegeben. Der pH wird durch Zugabe von Schwefelsäure auf Ί gehalten. Zur Entfernung der Quecksilber-Ionen wird Schwefelwasserstoffgas in die Reaktionsmischung eingeleitet und zur Oxidation des Produktes zum Oxytocin wird Luft durch die Reaktionsmischung geleitet. Das Produkt wird chromatographisch über Kieselgel gereinigt.

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Claims

602-Div. Patentansprüche

1. Verfahren zur Herstellung von einen Cysteinrest enthaltenden Peptiden, dadurch gekennzeichnet, dass die Mercaptogruppe des Cysteinrestes mit einer Schutzgruppe der allgemeinen Formel

R-C-NH-CH₂-

geschützt wird» in welcher R Niedrigalkyl, Acetonyl, Benzyloxy oder Aryl bedeutet, indem man den Cysteinrest mit einem K-Hydroxymethylalky1- oder -arylamid umsetzt und anschliessend die freie Sulfhydrylverbindung bildet, indem man die Schutzgruppe unter kontrollierten pH-Bedingungen in der letzten Stufe der Synthese entfernt mit einer Verbindung aus der Gruppe Schwermetallsalze, Organometallsalze von Schwermetallen, Hydrazin, Phenylhydrazin und Bromwasserst off säure.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Schutzgruppe S-Acetamidomethy1 und das Reagens zur Entfernung der Schutzgruppe Quecksilber(II)-acetat ist.

3· Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Lösungsmittel Wasser ist und die Schutzgruppe unter sauren Bedingungen entfernt wird.

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4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Reagens zur Entfernung der Schutzgruppe p-Chlorquecksilber(II)-benzoesäure ist und die Umsetzung unter basischen Bedingungen vorgenommen wird.

5. Verfahren zur Herstellung von Disulfidbrücken enthaltenden Peptiden, dadurch gekennzeichnet, dass man die Mercaptogruppen mit einer S-Alkylainidomethylgruppe schützt, in welcher die Carboxygruppe frei oder verestert ist und die Aminogruppe durch eine Schutzgruppe aus der Gruppe o-Nitroary!sulfenyl und Alkyloxycarbonyl geschützt ist.

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