DE1543872A1

DE1543872A1 - Ein bisher unbekanntes Polypeptid sowie ein Verfahren zu dessen Herstellung

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Publication number: DE1543872A1
Application number: DE19661543872
Authority: DE
Inventors: Pless Dr Janos; Boissonnas Dr Roger; Guttmann Dr Stephan
Original assignee: Sandoz AG
Current assignee: Sandoz AG
Priority date: 1965-08-24
Filing date: 1966-08-20
Publication date: 1970-02-05
Also published as: BE685841A; FI45179C; CH467246A; US3761459A; SE345447B; CS151441B2; ES330471A1; FI45179B; FR5981M; DE1543872C3; BR6682297D0; GB1153445A; DE1543872B2; OA02653A; NO120478B; IL26364A; AT285065B

Description

Ein bisher unbekanntes Polypeptid sowie ein Verfahren zu dessen

Herstellung

Die vorliegende Erfindung betrifft das neue Pentacosapeptid der Formel D-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-norleucyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophanyl-glycyl-L-lysyl-L-prolyl-L- valyl-glycyl-L-lysyl-L-lysyl-L-argir-yl-L-arginyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolyl-L-valinamid, im Nachstehenden

1 4
mit D-Ser -Nie -Pentacosapeptid bezeichnet, seine therapeutisch wirksamen Säureadditions salze und Schwermetallkomplexe sowie ein Verfahren zu dessen Herstellung.

1 4
D-Ser -Nie -Pentacosapeptid, seine Salze und Schwermetallkomplexe

besitzen eine hohe adrenocorticotrope Wirksamkeit.

Es war bereits bekannt, dass man ein Pentacosapeptid der Sequenz L-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-norleucyl-L-glutamyl-

BAD ORIGINAL

L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophanyl-glycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-L-lysyl-L-lysyl-L-arglnyl-L-arginyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyi-L-tyrosyl-L- prolyl-L-valinamid mit corticotroper Wirkung, im Nächste-

Il
henden mit Nie -Pentacosapeptid bezeichnet, synthetisieren kann.

4
Nie -Fentacosapeptid besitzt gegenüber dem natürlichen

ACTH den Vorteil, dass es keine antigenen Eigenschaften auf-

4 weist. Ein weiterer Vorteil des Nie -Pentacosapeptlds ist, dass es in Stellung 4 nicht wie natürliches ACTH einen

Methioninrest besitzt, der leicht oxydierbar ist und dadurch das Hormon in eine inaktivierte Form umwandelt, sondern einen Norleucinrest, der dieselben sterischen Eigenschaften

wie der Methioninrest aufweist, hingegen gegen Oxydation

Il beständig ist. Ueberdles weist das Nie -Pentacosapeptid in Stellung 25 einen Valinamidrest auf, der beim natürlichen ACTH an dieser Stelle nicht vorkommt. Der Valinamidrest an Carboxylende schützt die Peptidkette gegen abbauende Enzyme.

4 Gleich dem natürlichen ACTH weist Jedoch das Nie -Penta-

. cosapeptid in Stellung 1 den endständigen L-Serinrest auf, der bekanntlich gegenüber der abbauenden Wirkung von Aminopeptidasen sehr empfindlich ist«
Es wurde aus diesem Grunde versucht« den L-Serinrest des

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Nie -Pentacosapeptids durch einen Rest zu ersetzen, der gegenüber der abbauenden Wirkung der Aminopeptidase!! stabil ist.

Tatsächlich gelang es, durch den Ersatz des endständigen L-Serin-

4
restes mit einem D-Serinrest beim Nie -Pentacosapeptid das gegen-

1 4 über Aminopeptidasen unempfindliche D-Ser -Nie -Pentacosapeptid zu erhalten. Da aber bekanntlich D-Aminoeäurereste in den natürlichen, biologisch aktiven Peptidhormonen nicht vorhanden sind, war es überraschend und nicht vorauszusehen, dass durch den Ersatz eines natürlichen Aminosäurerestes durch seinen in der Natur nicht vorkommenden Antipoden eine Verbindung erhalten wird, die nicht nur qualitativ dieselben biologischen und therapeutischen Eigenschaften wie das natürliche ACTH aufweist, sondern auch noch quantitativ dem natürlichen ACTH, wie später eingehend dargelegt wird, überlegen ist.

D-Ser -Nie - Pentacosapeptid kann nach für die Synthese von Verbindungen dieser Art allgemein bekannten Methoden hergestellt werden, wobei die Aminosäuren in der, in der obigen Formel festgelegten Reihenfolge einzeln oder nach vorheriger Bildung kleinerer Peptideinheiten miteinander verknüpft werden.

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Erfindungsgemäss kann D-Ser -Nie -Pentacosapeptid beispielsweise hergestellt werden, indem man L-Valyl-£" N-R-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolyl-L-valinamid, worin R eine Carbo-tert.-butoxy- oder eine Carbo-tert.-amyloxy-, eine Toluolsulfonyl-, eine Phthalyl-, eine Porayl- oder eine Trifluoracetyl-Gruppe bedeutet, mit dem N-Carbobenzoxy-L-valyl-glycyl- £-N-R-L-lysyl- ^-N-R-L-lysyl-nitro-L-arginyl-nitro-L-arginyl-L-prolin, worin R obige Bedeutung hat, kondensiert, das erhaltene N-Carbobenzoxy-L-

10 valyl-glycyl- £-N-R-L-Iysy1- £-N-R-L-lysyl-nitro-L-arginylnitro-L-arginyl-L-prolyl-L-valyl- ^N-R-L-Iy sy 1-L-valy 1-L-tyrosyl-L-prolyl-L-valinamid, worin R obige Bedeutung hat, nach Abspaltung der Carbobenzoxygruppe und der Nitrogruppen mit dem N-Triphenylmethyl-7-O-tert.-butyl-L-glutamyl·

15 Im-triphenylmethyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophanyl-glycyl-E-N-R-L-lysyl-L-prolin, worin R obige Bedeutung hat, kondensiert, das erhaltene N-Triphenylmethyl-7-0-tert.-buty1-L-glutamyl-Im-triphenylmethyl-L-histidyl-

L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophanyl-glycyl-C-N-R-L-

- £-N-R-L-lysyl lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl- c-N-R-L-lysy^L-arginyl-L-

arginyl-L-prolyl-L-valyl- i-N-R-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolyl-L-valinamid, worin R obige Bedeutung hat,nach Abspaltung der N-Triphenylmethyl-Gruppe mit dem N-R'-D-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-norleucylazid, worin R¹ eine Tripheny!methyl-, eine Carbo-tert.-butoxy- oder eine Carbo-

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- 5 - ioo- 2194

tert.-amyloxy-, eine Carbobenzoxy-, eine Trifluoracetyl-, eine Acetyl-j eine Chloracetyl-oder eine Porraylgruppe bedeutet, kondensiert und die gesamten Schutzgruppen des erhaltenen neuen, geschützten Pentacosapeptids N-R'-D-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-norleucyl-'Y-O-tert.-butyl-L-glutamyl- Im-triphenylmethyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophanyl-glycyl-C-N-R-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl- £-N-R-L-lysyl- £-N-R-L-Iysyl-L-arglnyl-L-arginyl-L-proIyI-L-valyl- £-N-R-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolyl-L-vallnamid, worin R und R' obige Bedeutung haben, in einer oder *in mehreren Stufen im sauren Milieu abspaltet.

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Die Ausgangsprodukte zur Herstellung des D-Ser -Nie -Pentacosapeptids können, sofern sie bisher noch nicht bekannt waren, nach den für die Peptidchemie bekannten Methoden erhalten werden, wobei die Aiainosäuren einzeln oder nach vorheriger Bildung kleinerer Peptideinheiten miteinander verknüpft

werden.

1 k
D-Ser -Nie -Pentacosapeptid lässt sich auch in Form seiner Salze gewinnen bzw. verwenden. Als Salze kommen solche mit organischen Säuren, wie Essigsäure, Propionsäure, Glykolsäure, Milchsäure, Brenztraubensäure, Malonsäure, Bernsteinsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Weinsäure, Zitronensäure, Benzoesäure, Zimtsäure, Salicylsäure, 2-Phenoxy- oder 2-Acetoxy-benzoesäure, Mandelsäure, Methansulfonsäure, Aethansulfonsäure,

rad ^BAÜ

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Hydroxyäthansulfonsäure, Benzol- oder Toluolsulronsäure, Naphthalinsulfonsävire, Sulfanilsäure sowie polymere Säuren wie Gerbsäure, Alginsäure, Polygalacturonsäure, Polyphloretinphosphat oder Carboxymethylcellulose und Salze mit anorganischen Säuren, wie Halogen-5 wasserstoffsäure, z. B. Salzsäure oder Bromwasserstoffsäure,

Salpetersäure, Thiocyansäure, Schwefelsäure und Phosphorsäure in Frage. Als Schwermetallkomplex kommt z. B. derjenige des Zinks in Frage.

1 4
D-Ser -Nie -Pentacosapeptid, seine Salze und Schwermetallkomplexe

IO können beispielsweise für die Behandlung der folgenden Erkrankungen

verwendet werden:

Akuter und chronischer Gelenkrheumatismus, Colitis ulcerosa, Nephrose, Kollagenosen, wie z. B. Lupus erythematodes, Sklerodermie usw. , Allergische Erkrankungen der verschiedenen Organsysteme, wie Asthma bronchiale, Ekzem, Urticaria, Dermatitis exfoliativa, anaphylaktischer Schock usw., Intoxikationen verschiedener Genese, Tumoren, wie z. B. Leukämien, Lymphosarcomen, Reticulosarcomen

usw., zur Verhinderung der Nebennierenrindenatrophie bei der Therapie mit Corticosteroiden,

Insuffizienzerscheinungen der Hypophyse.

ORIGiNAL

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Ein wesentlicher Vorteil gegenüber natürlichem, aus tierischem Material extrahierten Hormon liegt darin, dass dem synthetischen Pentacosapeptid antigene Eigenschaften fehlen. Es kann somit bei den oben erwähnten Erkrankungen auch dann unbedenklich verwendet werden, wenn beim Patienten im Verlauf einer früheren Be handlung mit natürlichem ACTH allergische Erscheinungen auftraten.

In den für die Standardisierung üblichen und anerkannten Tests besitzt D-Ser -Nie -Pentacosapeptid eine biologische Wirksamkeit von 625 - 13O Corticotropin-IE pro mg freies Peptid- So dienten zur Testung des verfahrensgemäss hergestellten Pentacosapeptids der 3. Internationale Standard für Corticotropin, welcher in Form des "International Standard for Corticotropin" zur Verfügung steht und die Einstellung von ACTH-Präparaten auf Internationale Einheiten ermöglicht. Es hat sich herausgestellt, dass das neue Pentacosapeptid nach intravenöser Verabreichung eine längere Wirkungsdauer besitzt als die bisher bekannten natürlichen und synthetischen ACTH-Präparate, was einen bedeutenden technischen Fortschritt darstellt. Die Dosierung des verfahrensgemäss hergestellten Pentacosapeptids variiert ungefähr zwischen 4O und 6O IE pro Tag, in besonderen Fällen zwischen IO und 1OO IE pro Tag.

Die unerwartete, bei der Standardisierung festgestellte hohe Wirksamkeit des neuen Pentacosapeptids hat sich bei der therapeutischen Anwendung voll bestätigt, so dass das neue Pentacosapeptid auf Gewichtsbasis

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i : ·:■ .· BAD ORIGINAL

stärker wirkt als alle bis jetzt bekannten natürlichen und synthetischen ACTH-Präparate.

1 4 D-Ser -Nie -Pentacosapeptid kann als Heilmittel, z. B. in Form pharmazeutischer Präparate, Verwendung finden. Diese enthalten die genannte Verbindung in Mischung mit einem für die par enter ale Applikation geeigneten organischen oder anorganischen Trägermaterial. Für dasselbe kommen solche Stoffe in Frage, die mit der neuen Verbindung nicht reagieren, wie z. B. Gelatine, Milchzucker, Stärke, Magnesiumstearat, Talk, pflanzliche OeIe, Benzylalkohol«_t

Gummi arabicum, Polyalkylenglykole, Vaseline, Cholesterin oder

andere bekannte Arzneimittelträger. Die pharmazeutischen Präparate können z. B. in flüssiger Form als Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen vorliegen. Gegebenenfalls sind sie sterilisiert und bzw. oder enthalten Hilfe stoffe wie Koneer vie runge-, Stabilisie rungs-,

Netzmittel oder Emulgiermittel. Sie können auch noch andere, therapeutisch wertvolle Stoffe enthalten. Die neue Verbindung kann wie natürliches ACTH auch in Form eines Depotpräparates verabreicht werden.

1 4 D-Ser -Nie -Pentacosapeptid und seine Salze kann auch als Zwischen-

2O produkt zur Herstellung von pharmazeutischen Präparaten Verwendung finden.

Beim Aufbau des neuen Pentacosapeptids haben sich für die Blockierung

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der Aminogruppe dee Serinrestes die Triphenylmethyl-, die Carbotert. -butoxy- und die Carbo-tert. -amyloxy-Gruppe bewährt, doch können auch andere geeignete Schutzgruppen wie die Carbobenzoxy-, die Trifluoracetyl-, die Acetyl-, die Chloracetyl-, die Formylgruppe verwendet werden.

Für die Blockierung der £-Aminogruppe de« Lyeinreetes hat eich die Carbo-tert. -butoxy- und die Carbo-tert. -amyloxy-Gruppe bewährt, doch können auch andere geeignete Schutzgruppen, wie die Carbobenzoxy-, die Toluolsulfonyl-, die Phthalyl-, die Formyl- und die T rifluor-acetyl-

IO Gruppe verwendet werden.

Für die Blockierung der Ϊ""- Carboxyl -Gruppe des Glutaminsäure reste β hat eich die tert. -Butyloxy-Gruppe bewährt, doch können auch andere geeignete Schutzgruppen, wie die Methoxy-, die Aethoxy-, die tert. -Amyloxy-, die Amid- oder die Benzyloxygruppe verwendet werden. Für die Blockierung der Imi da ζ öl gruppe de· Histidinrestes hat sich die Triphenylmethylgruppe bewährt, doch können auch andere geeignete Schutzgruppen, wie die Carbo-tert. -butoxy-, die Carbo-tert. -amyloxy-, die Carbobenzoxy- oder die Benzylgruppe verwendet werden.

Für die Blockierung der Guanidogruppe der Argininreete wurde die Nitro-Gruppe verwendet, doch können auch andere geeignete Schutzgruppen, wie die Togylgruppe, die p-Nitrocarbobenzoxygruppe oder die 2-(Iiopropyloxycarbonyl)-3, 4, 5, 6-tetrachlorobenzoylgruppe verwendet werden. Man kann auch den Schutzeffekt der Protoni exe rung der Guanidogruppe bei der Synthese verwenden.

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- JLU -

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Es werden folgende Abkürzungen verwendet: CBO « Carbo"benzoxy

2rit ' » Trityl » Triphenyljsethyl

CTB μ Carbo-tert.-butyloxy

NO₂ β nitro

OCP m 2,4,5-Trichlorphenoxy

OTB β , tert.-Butylosy OKe « Methoxy OEt · β Aethoxy Arg * L-arginyl GIu . . » I-glutamyl GIy β glycyl Kis »■ L-histidyl

Lye » L-lysyl

KIe » L-norleucyl Phe β L-phenylalanyl Pro ■ I-prolyl

Ser *» L-eeryl

D-Ser * D-seryl Try » L-tryptophanyl Tyr β L-tyrosyl

VaI « L-valyl

Im a Ircidazolyl In den folgenden Beispielen, die die Ausführung des Verfahrens

erläutern, den Umfang der Erfindung aber in keiner Veise ein-

schränken sollen, erfolgen alle Stoperaturangaben in Celsius«

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Fig. A. Herstellung von H-Val-Gly-iRjLys-iRjLys-Arg-Arg-Pro-Val-iRjLys-Val-Tyr-Pro-Val-NH,

CBO -| VaI GIy i,ys Lys |- N- H -^Arg Arg Pro j- OH

CBO -J VaI GIy Lys Lys

Arg Arg Pro (· OH H -] VaI Lys VaI Tyr Pro VaI j-N

VaI Lys Val~~ Tyr Pro VaI j-Ii

GBO -| VaIGly

Lys Lys Arg Arg Pro

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H -I VaI GIy Lys Lys Arg Arg Pro

VaI Lys VaI Tyr Pro VaI I-

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Beispiel 1: L-VaIy l-#lycyl~carbo»«t ert.--butoxy-L-ly syl-carbo-tert.— butoxy-L-ly3yl-L-arginyl-L-arfrinyl-L-T>ro3.yl-L-valvlcarbo-tert. -bu toxy-L-lysvl-L-valyl-L-tyrO8vl·-L-^prolvl-

Val-(CTB)Iya-Val-Tyr-Pro-Val-2!H₂)..

Man löst 88 g C30-(U0₂)Arg-(N0₂)Arg-Pro-QMe in einem 90?i-igea Dioxan-Wasser Gemisch und versetzt mit 220 ecm 2-n Natronlauge· Nach 2 Std. wird mit 1 L Wasser verdünnt und wiederholt mit Essigester ausgewaschen. Anschliessend säuert man die wässerige Lösung mit 4-n Salzsäure an, löst das ausgefallene Produkt in einem Gemisch von Methanol-Azeton 1:1 aui und fällt durch Zugabe von Aethyläther. Man erhält 70 g CBO-(IiO₂)ATg-(NO₂)ATg-PrO-OH vom Smp. 108° (mit Zersetzung), [ocj-q » -19° in Dimethylformamid· Man löst das obenerhaltene Tripeptid in 400 ml einer 33#-igen lösung von Bromwasserstoff in Eisessig,, lässt 1 Std. bei 20° stehen, konzentriert auf 200 ml, fällt mit Aethyläther aus, filtriert, wäscht Bit Aethylacetat und trocknet. Man erhält 72 g H-(NO₂)Arg-(N0₂)Arg-Pro-OH · 3 HBr vom Smp. 84° (mit Zersetzung), [a]^ « -19° in 955^-iger Essigsäure. In einer lösung von 72 g H-(KO₂)ATg-(KO₂)Arg-Pro-0H Hydrobromid in 600 ml Dimethylformamid und 56 ml Triäthylamin wurde bei 0° C 84 g CBO-VaI-Grly-(CTB)Lys-lC27B)Lys-SL (aus 85 g des entsprechenden Hydrazide her gestellt) eingetragen. Man lässt die lösung 16 Stunden stehen und dampft das Lösungsmittel ein. Der Rückstand wird in einem Gemisch von n-Butanol-Essigester 2:8 gelöst und wiederholt mit verdünnter Schwefelsäure nachgewaschen· Man konzentriert die Lösung im Vakuum ein und fällt mit Aether aus. Man erhält 90 g CBO-VaI-GIy-(CTB)LyS-(CTB)LyS-(NO₂)ATg-(NO₂)Arg-Pro-0H vom Smp· 151° (mit Zersetzung).

Ca]₁₃ » -38° la Methanol. 9Q9886/1692 BAD ORiG¹NAL

-is- .

Beispiel 2: O-tert.~Tr.:itvl-L-^lutaniYl-ia-trityl-L-histidyl--L-T)henylalaϊ^yl·~L-ar^τin _ι VJ■-L-·tΓvτ?^tophanyl-^p:l·ycyl-^?T·-carbo-^tert.-'bu^toxy-L-l·vsvl-L-υrolyl-L-val·vl-_lfyl·ycyl·--N-carbo-tert.-butoxy-L-lysyl-N-carbo-tert.-butoxy-L'-lvsyl-L-arginyl-L--arffinyl-T—rjrolvl-L-vg.lyl-ff-carbo-tert.-butory-L-lysyl-L·- yalyl-L-tyrosyl-I-Tirolvl-L-valiriainid. (H-(OTB)GIu-(Trit) Kis-Phe-Arg-Try-Gly-(CT3)Lys-Pro-Val-Gly-(CT3)Lys-(CT3) Lys-Arg-Arg-Pro-Val-(CTB)Lys-Val-Tyr-Pro-Val-NH₂).

Man löst 62 g H-VaI-GIy-(CTB)LyS-(CTB)LyS-ATg-ATg-PrO-VaI-(CTB)LyS-Val-Tyr-Pro-Val-KH₂ · 3 Tos-OH in 300 ml Pyridin und 300 ml Acetonitril auf. Anschliessend gibt man 57 g TrIt-(OTB)GIu-(TrIt)His-Pho-Arg-Try-GIy-(CTB)Lys-Pro-OH zu und wenn alles in Lösung ist, kühlt man auf ab, versetzt mit 28,6 g Dicyclohexylcarbodiimid. Nach 24-stUndigem Schütteln,bei 20° wird der Harnstoff abfiltriert und die Lösung ι mit Aether gefällt. Das Produkt wird wiederholt in Methanol gelöst und mit Essigestar gefällt. j

; ι

Man erhält 90 g Trit-(0T3)Glu-(Trit)His-Phe-Arg-Try-Gly-(C?3)Lys-Pro- -(CTB)LyE '

Val-Gly-(CT3)Lys/Arg-Arg-?ro-Val-(CT3)Lys-Val-Tyr-?ro-VaI-KH₃ Tri-

toluolBulfonat. Smp. 184° mit Zers. Ca]Jj « -51° in Methanol·

Man löst 45 g Trit-(öTB)GIu-(TrIt)His-Phe-Arg-Try-Gly-(CTB)Lys-Pro-Val-Gly-iCTBjLys-iCTBjLys-Arg-Arg-Pro-Val-iCTBjLys-Val-Tyr-Pro-Val-KHg 3 Tos-OH in 500ml 60 #-iger Essigsäure und lässt 2 Stunden bei 5O⁰

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- 3Λ - ioo- 2194

Man löst 56 g CBO-Val-Gly-iCTBjLys-tCTB^ys-iNOgUrg-UOgjArg-Pro-OH in 900ml Dimethylformamid und 900 ml Tetrahydrofuran. Nach" Zugabe von 6,2 ml Triethylamin wird die Lösung auf - 10° C abgekühlt und bei dieser Temperatur mit 4,2 ml Chlorameisensäureaethylester versetzt. Nach 10 Min. wurden 36 g K-VaI-(CTB)Ly3-Val-Tyr-Pro-Val-NH₂ in 160 ml Dimethylformamid zugegeben und über 16 Stunden bei 20° weiter gerührt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum verdampft und der Rückstand mit Wasser ausgewaschen. Man löst das Peptid in heissem Aethanol und fällt mit Essigester aus.. Nach Abnutschen und Trocknen erhält man 72 g CBO-Val-Gly-(CTB)Lys-(CTB)Lys-(NOJArg-(NO.)Arg-?ro-Val-(CTB)Lys-Val-Tyr-Pro-Val-NH, vom Smp. 190° (mit Zers.). [aJ₃ =» -36° in Dimethylformamid.

Kan löst 72 g CBO-Val-Gly-(CTB)LyS-(CTB)LyS-(NO₃)Arg-(NO₂)Arg-Pro-VaI-(CTB)Lys-Val-Tyr-Pro-Val-NH in 1,5 L 80#-iger Essigsäure, versetzt mit Palladium Katalysator, hydriert bis zur Beendigung der Wasserstoffaufnähme und filtriert vom Katalysator ab. Nach Einengen löst man den Rückstand in 500 ml Methanol auf, kühlt auf - 5°» versetzt mit 4,1 g p-Toluolsulfonsäure und fällt anschliessend mit Aether. Man erhält 66 g H-Val-Gly-(CTB)Lys-(CTB)Lys-Arg-Arg-Pro-Val-(CTB)Lys-Val-Tyr-?ro-Val-NH₂ als Tritrtoluolsulfonat voa Smp. 185° • (mit Zers·). [a]i β -42° in Dimethylformamid.

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stehen. Man gibt 5O ml Amberlit IRA-41O in Acetatform zu, filtriert, verdampft imVakuum und löst den Rückstand in Methanol auf. Nach Fällen mit Aether erhält man 4O g H-(OTB)Glu-(Trit)His-Phe-Arg-Try-Gly-(CTB)Lys-Pro-Val-Gly-(CTB)Lys-(CTB)Lys-Arg-Arg-5 Pro-Val-(CTB)Lys-Val-Tyr-Pro-Val-NH . Zersetzung bei 17O°

l? = -49° in Methanol.

Beispiel 3; L-Tyrosyl-L-seryl-L-norleucinmethylester (H-Tyr-Ser-

NIe-OMe) Man löst 54 g H-Ser-Nle-OMe · HCl und 63 g CBO-Tyr-OH in 86O ml Acetonitril, kühlt auf O⁰, gibt 28 ml Triäthylamin zu, kühlt auf -lO°und gibt 41 g Oicyclohexylcarbodiimid zu. Das Gemisch wird während 16 Stunden bei O⁰ gerührt, dann abfiltriert. Der Niederschlag wird mit 14OO ml Pyridin gewaschen. Die vereinigten Filtrate werden abgedampft und der Rückstand aus Essigester kristallisiert. Man erhält 1Ol g CBO-Tyr-Ser-Nle-OMe (Smp. 14O-142°£öC3^° = -15* in Dimethylformamid).

Man löst 51 g von dem so erhaltenen Produkt in 2 L einer 1 N Lösung von HCl in Methanol und hydriert in Anwesenheit von IO g Palladium/ Kohle. Nach ca. 2 Stunden beendigt die Aufnahme des Wasserstoffe. Man filtriert, dampft ab und kristallisiert den Rückstand aus einem Gemisch von Methanol-Aether (3:1). Man erhält 42 g H-Tyr-Ser-Nle-OMe · HCl. Smp. 227^e£o£/7*° = -7° in Dimethylformamid.

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Beispiel 4: Carbo-tert.-butoxy-D-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-Ii-norleucin· hvdragjd. (CTB-D-Ser-Tyr-Ser-Nle-NHNHg).

Han löst 60 g D-Serinmethyleeter hydrochlorid in 200 ml Dimethylformamid und 54 ml Triäthylamin, kühlt auf 0° und filtriert das Triäthylaminhydrochlorid ab· Dimethylformamid wird bei Hochvakuum eingedampft und der Rückstand in 150 ml Pyridin aufgelöst. Man tropft 100 g tert-Eutyloxycarbonylazid zu und läset 2 Tage bei 20° stehen· ■

Man dampft das Lösungsmittel ab und nimmt das Produkt in Essigester auf. Nach Vaschen mit Wasser» verdünnter Salzsäure und Kaliumhydrogenearbonat-Iösung trocknet man Über Natriumsulfat· Nach Abdampfen des Essigesters bleibt das CTB-D-Ser-OKe als ein OeI zurück. Man löst den Ester in 500 ml Methanol auf und lässt mit 50 ml Hydrazinhydrat 2 Tage bei 20° stehen. Nach Verdampfen des Methanols kristallisiert das Hydrazid. Aus heissem Essigester umkristallisiert isoliert man 53 g CTB-D-Ser-NHN^ vom Smp U4°.[«]2 - 3° in DiiMthylformamid.

Man löst bei - 10° C 10 g CTB-D-Serinhydrazid in 136 ml 1 N Salzsäure die 15 g Natriumchlorid enthält· Bei dieser Temperatur werden 160 al Sssigester und anschlieseend 38 g Natriumnitrit in 3 Portionen zugegeben. Unter ständigem Rühren wird bei - 10° noch 5 Hinuten reagieren gelassen· Die Sseigeeterphaee wird abgetrennt, mit kaltem lQ£-iger Kaliunhydrogencarbonatlösung gewaschen und mit Natriumsulfat getrocknet. Die getrocknete Lösung wird mit einer lösung bestehend aus 13 g H-Tyr-Ser-Nle-OMe Hydrochlorid in 60 ml Dimethylformamid und 6 ml Triäthylamin vtreetxt. Anschliessend dampft man den Sssigester im Vakuum ab und läset 16 Stunden bei 20° stehen.

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Das zurückgebliebene Lösungsmittel wird im Vakuum eingedampft und der Rückstand in Essigester gelöst· Kan wäscht mit verdünnter Phosphorsäure und Kaliumhydrosencarbonatlösung aus und trocknet über Natriumsulfat. Nach Einengen des Lösungsmittels und Fällung mit Aether erhält man 15 g CTB-D-Ser-Tyr-Ser-Nle-OMe. Smp. 135°. [o]p° β - 6* in Methanol.

Man löst 11 g CTB-D-Ser-Tyr-Ser-Nle-OMe in ICO ml Kethanol und versetzt mit 45 Bl Hydrasinhydrat. Ueber Nacht lässt man bei 20°

stehen, worauf das Produkt auskristallisiert. Man filtriert und wäscht mit Methanol und Petroläther. Man erhält 7.7 g CTB-D-Ser-Tyr-Ser-Nle-hydrazid vom Smp. 210°. [a]_D ■ + 6,4° in Dimethylformamidι

Beispiel 5t P-Servl-L-tvrosvl-L-earyl-L-norleucvl-I-flrlutanvl-l·-

-I—valvl-L-tvroövl—L—

prcar|l^fit-yalinaraid. (D-Ser-Tyr-Ser-Nle-ßlu-Hie-Phe-Arg-•-Xiys-Pro-Val-Gly-Lys-Iye-Arg-Arg-Pro-Val-Lye-Val Tyr-Pro-Val-NHg).

Kan löst 2,0 g CTB-D-Ser-Tyr-Ser-Nle-NHSHg (Bsp· 4) in 12 öl Dimethylformamid, gibt 4 ml Wasser zu, kühlt auf - 10°, gibt 2 ml

6 N Salzsäure zu, versetzt mit 260 mg Natriumnitrit, rührt 5 bei -5°, gibt 300 ml 0,2 N Kaliumbicarbonatlösung hinzu und zentri« fugiert. Kan löet das erhaltene CTB-D-Ser-Tyr-Sei^N- in 50 ml Dimethylformamid, versetzt mit 10,5 δ H-Glu(OTB)-(TrlÖHis-Phe-Arg-Try-Gly-(CT3)Lys-Pro-Val-aiy-(CTB)-Iys-Val-&ly-(CTB)Lys«iCI3)Iys-Arg-Arg-?rb-Val-(CTB)Lys-Val-Tyr-Pro-Val-NH₂ · Azetat, lässt 12 Std,

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bei 0° stehen, gibt noch eine weitere, aus 2,0 g CT3-D-Ser-Tyr-Ser-KIe-IIHIiH₂ hergestellte Kenge von Tetrapeptidazid su, lässt 6 Std, bei 0° stehen, dampft ab, verarbeitet mit Essigester, wäscht mit heissem Azeton und Sssigester und trocknet im Vakuum. Man löst das erhaltene Produkt in 100 al 90?«-iger Trifluoressigsäure, lässt 1 Std. bei 20° unter Stickstoff stehen,, dampft ab, verarbeitet mit Sssigester, filtriert und trocknet. Man löst das erhaltene Produkt in 500 ml 0,2 N Essigsäure, behandelt die Lösung mit Asberlit-IRA-410 in Asetatfora, filtriert und lyophilisiert. Nach !Trocknen Über Natriumhydroxyd erhält nan 7,5g H-D-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu-His-Phe-Arg-Tryaiy-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-Val-Lys-Val-Tyr-Pro-Val-i^Hg· Heptaacetat · Dekahydrat, das sich bei der Chromatographie und der Elektrophorese homogen verhält. (Totalhydrolyse gibt die folgenden Amino säure zusamme ns et zungen: Ser«, _QTyr, _QNle. -,GIu_{n n}Hie_{n n}Phe« _n

J.,7 X|7 «^t* •»•»^w •^L»^w *»^·

Mikroanalyse: 3er.: 0 51,9 H 7,5 »16,2 0 24,4*

Gef.i " 52,1 ^M 7,5 " 15,6 « 24,8 %

Smp.: 209° mit Zers. [α3^° ■ - 80° in 1 N Essigsäure.

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Claims

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Patentansorüche:

1. Verfahren zur Herstellung des Fentacosapeptids der Formel D-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-norleucyl-Ii-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arglnyl-L-tryptophanyl-glycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-L-lysyl-L-lysyl-L-arginyl- I^axginyl-I^prolyl-I^valyl-Ii-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-· prolyl-L-valinamid, seiner Säureadditionssalze und Schwermetallkomplexe, dadurch gekennzeichnet, dass man das Peptid der obigen Formel nach aus der Peptidchemie an sich bekannten Mathoden darstellt und anschliessend gegebenenfalls auf an sich bekannte Welse in seine therapeutisch wlrkeamen Säureadditionssalze mit organischen oder anorganischen Säuren oder Schwermetallkomplexe Überführt.

2. Verfahren zur Herstellung des bisher unbekannten Pents*—^ cosape,ptids der Formel D-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-norleucyl-I^glutajnyl-I^hlstidyl-I^phenylalanyl-L-.arginyl-L-tryptophanylglycyl-^lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-Ii-'lysyl-'L-lyiyl-L-argi·-

909888/1692 ^{BAD orig}'nal

Λ543872

nyl-L-arginyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolyl-L-valinaraid, seiner Salze und Schwermetallkoraplexe, dadurch gekennzeichnet, dass man zweokmiissigerweiee unter Schutz der an der Reaktion nicht beteiligten Amino- und Carboxylgruppen, das Tetrapeptid D-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl- · L-norleucin oder ein Derivat dieses Tetrapeptide mit aktivierter endständiger Carboxylgruppe und das Henecosapeptid L-Olutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophanyl-glycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-L-lysyl-L-lysyl-Xr-arginyl-L-arginyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyro- . ' syl-L-prolyl-L-valinamid oder ein Derivat dieses Henecosa peptids mit aktivierter cc-Aminogruppe kondensiert, nach Beendigung der Kondensation die geschützten Aminogruppen und Carboxylgruppen in Freiheit setzt und wenn erwünscht, das erhaltene Pentacosapeptld in seine therapeutisch wirksamen Salze oder Schwermetal!komplexe überführt..

3· Verfahren zur Herstellung des bisher unbekannten Pentacosapeptids der Formel D-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-norleucyl-

L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arglnyl-L-tryptophanyl-

-L-lysyl

glycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-L-lysyiAL-arginyl-L-arginyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-proiyl-L-valinamld, seiner therapeutisch wirksamen Säureadditlons-•alze oder Schwermetallkomplexe, dadurch gekennzeichnet, dass »an L-Valyl- S'-N-R-L-lyeyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolyl-L-valin-

i ■ ■' '

BAD ORlQ¹HAt

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amid, worin R eine Carbo-tert.-butoxy-, eine Carbo-tert.-amyloxy-, eine Toluolsulfonyl-, eine Phthalyl-, eine Formyl- oder eine Trilfuoracetyl-Grappe bedeutet, mit den N-Carbobenzoxy-L-valyl-glycyl- £-N-R-L-iyeyl- £-H-R-L-lysyl-nitro-L-5 arginyl-nitro-L-arginyl-L-prolin, worin R obige Bedeutung

hat, kondensiert, das erhaltene N-Carbobenzoxy-L-valyl-glycyl- £-N-R-L-Iysyl- fc-N-R-L-lysyl-nitro-L-arginyl-nitro-L-arginyl-L-prolyl-L-valyl- S -N-R-L- Iy syl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolyl-L-valinamid, worin R obige Bedeutung hat, nach Abspaltung der Nitro- und Carbobenzoxy-Oruppe mit dem N-Triphenylmethyl-7-O-tert.-butyl-L-glutamyl-Im-triphenylmethyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophanyl-glycyl £-N-R-L-lyeyl-L -prolin kondensiert und das erhaltene N-Triphenylmethyl-7-O-tert.-butyl· L-glutamyl-Im-triphenylmethyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophanyl-glycyl- E-N-R-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl- glycyl-E-N-R-L-lysyl- ζ -N-R-L-lysyl-L-arginyl-L-arginyl-L-prolyl-L-valyl- S -N-R-L-lysy 1-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolyl-L-Tftlinamid, worin R obige Bedeutung hat, nach Abspaltung der o-N-Triphenylmethyl-Oruppe mit dem N-R'-D-Seryl-L-tyrosyl-L- »eryl-L-norleucylazid," worin R' eine Triphenylraethyl-, eine Carbo-tert.-butoxy- oder eine Carbo-tert.-amyloxy-, eine Carbobenzoxy-, eine Trifluoracetyl-, eine Acetyl-, eine Chloracetyl-, eine Formylgruppe bedeutet, kondensiert, die gesamten Schutzgruppen des erhaltenen, neuen, geschützten Pentacosapeptid· N-R * -D-Seryl-L-tyrosyl-L-eeryl-L-norleucyl-7-O-tert. -

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butyl-L-ßlutamyl-lJa-triphenylmethyl-Ii-hletidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophanyl-glycyl- C-Nf-R-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glyeyl- £-K-R-jHy«yl- £-M-R-L-lyeyl-L-arginyl-L-arsinyl-L-prolyl-L-valyl-f-N-R-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolyl-L-valinaiaicl, worin R und R¹ obige.Bedeutung haben« In einer oder in mehreren Stufen abspaltet und das so erhaltene Pentacosapeptid gegebenenfalls anschliessend in seine therapeutisch wirksamen Säureadditionssalze oder Schwermetallkoaplexe überführt.

**' Verfahren zur Herstellung des bisher unbekannten Polypeptide der Formel D-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-norleucyl-L-glutaiayl-L-histidyl-I^phenylalanyl-I^-areinyl-'Ii-tryptophanylglycyl-L-lysyl-Ir-prolyl-I^-valyl-glycyl-Ii-lysyl-L-lysyl-L-arglxiyl-L-arginyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl- L-prolyl-L-valinamid, dadurch gekennzeichnet, dass man aus N-R * -D-Seryl-L-tyrosyl-Ir-seryl-L-norleucyl-^-O-tert ♦ -butyl-L-glutamyl-Im-triphenylaethyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophanyl-glycyl- C-N-R-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl- 5-M-R-L-lysyl- ^-N-R-L-lyeyl-Ii-arginyl-L- arginy 1-L-prolyl-L-valyl- £ -N-R-L-Iy sy 1-L-valy 1-L- tyrosyl-L-prolyl-Ii-valinamid, worin R und R¹ In der Feptidcheole zum Schutz von Aminogruppen verwendete Schutzgruppen bedeuten, die Schutsgruppen In einer oder in mehreren Stufen abspaltet.

5, Verfahren nach Patentanspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass R eine Carbo-tert.-butoxy-, tine Carbo-tert.-amyloxy-, eine Carbobenzoxy-, eine Toluolsulfonyl-, eine Phthalyl-,

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eine Formyl- und eine TrifLuoracetyl-Gruppe und R' eine Triphenylmethyl-, eine Carbo-tert. -butoxy-, eine Carbo-tert. -amyloxy-, eine Carbobenzoxy-, eine Trifluoracetyl-, eine Acetyl-, eine Chloracetyl-, eine Formylgruppe bedeuten.

6. Verfahren zur Herstellung des bisher unbekannten Polypeptide der Formel D-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-norleucyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophanyl-glycyl-L-lyeyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-L-lyeyl-L-lysyl-L-arginyl-L-arginyl" L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-T -valyl-L-tyrosyl-L-prolyl-L-valinamid, dadurch gekennzeichnet, dass man aus N-R'-D-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-norleucyl-3^-O-R"-L-glutamyl-Im-R^MI-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophanyl-glycyl- 5-N-R-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl- 6 -N-R-L-lysyl- i-N-R-L-lysyl-L-arginyl-L-arginyl-L-prolyl-L-valyl- S -N-R-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolyl-L-valinamid, worin R und R¹ eine in der Peptidchemie zum Schutz der Aminogruppe verwendete Schutzgruppe und R" und R"¹ entweder Carboxyl- bzw. Imidazol-Schutzgruppen oder Wasserstoff bedeuten, diese Schutzgruppen in einer oder mehreren Stufen abspaltet.

7. Pentacosapeptid der Formel D-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-norleucyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophanyl-glycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-L-lysyl-L-lysyl-

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BAD ORIGINAL

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Ii-arginyl-L-arginyl-L-prolyl-L-vaiyl-L»lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolyi-L-valinamid.

8. Arzneimittel, dadurch gekennzeichnet, dass es das Pentacosa- peptid nach Anspruch 7 bzw. dessen Säure addition β salze und Schwer metallkomplexe enthält.

37OO/BA/PR - Jir< S A₁N DOZ AG