NO120478B - - Google Patents

Description

Fremgangsmåte for fremstilling av et nytt

terapeutisk aktivt pentakosapeptid.

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for fremstilling av det nye, terapeutisk aktive pentakosapeptid med formel D-seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-norleucyl- L- glutamyl- L- hi stidyl- L- f enylalanyl- L- ar ginyl- L- tryptof anyl- glycyl- L-ly syl-L- prolyl- L- valyl- glycyl- L-lysyl- L- ly syl- L- ar ginyl- L- ar ginyl- L-prolyl- L- valyl- L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolyl-L-valinamid, i det følgende betegnet med D-Ser<1->4 25 1-25

Nie -(Val-NH2) -£ -ACTH, og dettes syreaddisjonssalter og tungmetall-komplekser. Det særegne ved fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen er at aminosyrene D-serin, L-tyrosin, L-serin, L-norleucin, L-glutaminsyre, L-histidin, L-fenylalanin, L-arginin, L-tryptofan, glycin, L-lysin, L-prolin, L-valin, glycin, L-lysin, L-lysin, L-arginin, L-arginin, L-prolin, L-valin, L-lysin, L-valin, L-tyrosin, L-prolin og L-valin i den angitte rekkefølge og/eller peptidbruddstykker som inneholder disse aminosyrer i den i formelen angitte rekkefølge, under anvendelse av innen peptidkjemien kjente metoder kondenseres til det angitte pentakosapeptid, idet for den peptidiske tilknytning aktiveres enten en endestående karboksylgruppe eller en aminogruppe, og de øvrige rekative grupper beskyttes intermediært, idet karboksyl-gruppen i den endestående valinrest til å begynne med eller på et vilkårlig tidspunkt i syntesen overføres i amidgruppen, og om ønskes overføres det således erholdte pentakosapeptid i sine terapeutisk virksomme syreaddisjons-salter eller tungmetall-komplekser.

Det var tidligere kjent at det kunne syntetiseres et pentakosapeptid med sekvensen L- ser yl- L- ty ro syl- L- se ryi- L-norleucyl- L- glutamyl- L-histidyl- L- f enyl-alanyl- L- ar ginyl- L- tryptof anyl- glycyl- L- lysyl- L- prolyl- L- valyl- glycyl- L- ly syl- L-ly syl- L- ar ginyl- L- ar ginyl- L- prolyl- Lt- valyl- L- lysyl- L- valyl- L- tyrosyl- L- valinamid med cortikotrop virkning, idet det følgende betegnet med Nie<4->pentakosapeptid.

Nie<4->pentakosapeptid besitter like overfor naturlig ACTH den fordel at det

ikke fremviser noen antigene egenskaper.

En ytterligere fordel ved Nie<4->pentakosapeptid er at det i 4-stilling ikke i likhet med naturlig ACTH har en metioninrest, som er lett oksyderbar og derved om-danner hormonet i en inaktiv form, men derimot en norleucinrest, som fremviser de samme steriske egenskaper som metioninresten, men som i motsetning til denne er bestandig mot oksydasjon. Videre fremviser Nie 4-pentakosapeptidet i 25-stilling en valinamidrest, som ved naturlig ACTH ikke forekommer på dette sted. Valinamid-resten på karboksylenden beskytter peptidkjeden mot nedbyggende enzymer.

I likhet med det naturlige ACTH fremviser imidlertid Nie<4->pentakosapeptidet

i 1-stilling en L-serinrest, som som kjent er,meget ømfintlig overfor den nedbyggende virkning av aminopeptidaser. Det ble av denne grunn forsøkt å erstatte den endestående L-serinrest i Nie<4->pentakosapeptidet med en rest som er stabil like overfor den nedbyggende virkning av aminopeptidasene.

I virkeligheten lyktes det også ved erstatning av den endestående L-serinrest med en D-serinrest i Nie<4>-pentakosapeptidet, å erholde det like overfor aminopeptidaser

1 4 1-2'S

stabile D-Ser -Nie -(Val-NH2) -/3 -ACTH. Da imidlertid som kjent D-amino-syrerester ikke foreligger i de naturlige, biologisk aktive peptidhormoner, var det overraskende og ikke mulig å forutse at det ved erstatning av en naturlig aminosyrerest med sin i naturen ikke forekommende antipode fås en forbindelse som ikke bare kvalitativt fremviser de samme biologiske og terapeutiske egenskaper som naturlig ACTH, men også kvantitativt er overlegent det naturlige ACTH, som det inngående skal forklares i det følgende.

Det ved fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen fremstillbare nye pentakosapeptid, som også i det følgende betegnes m1 ed - b-Ser<1>-Nie 4 -(Val-NH„z) 25 -/3 1-25-ACT<H>

er i visse henseende overlegent de D-Ser -peptider hvis fremstilling omhandles i eksemplene i norsk ansøkning nr. 159.327, som er ålment tilgjengelig. 1 4 Sammenligner man den adrenokortikotrope virkning av D-Ser -Nie -(Val-25 1-25 1 NH„) -p-ACTH med den i ovennevnte ansøkning oppførte forbindelse D-Ser - Om -Orn<18>- p 1-24 -ACTH, så viser det seg at det i henhold til foreliggende fremgangsmåte fremstillbare polypeptid er 7 ganger så virksom ved administrering til mennesker som ACTH, mens det ovennevnte polypeptid, hvis fremstilling er om-handlet i den nevnte ålment tilgjengelige ansøkning, bare er 5 ganger så virksomt som ACTH. Undersøkelsen ble foretatt på sunne eller endokrint normale pasienter. Virkningen av de nevnte peptider på binyrene ble undersøkt ved måling avøkningen

av plasmasteroid og på utskilling av kortikosteroider.

Norsk ansøkning nr. 159.327 omhandler ikke noen ACTH-peptidsekvenser

som i 4-stillingen inneholder en norleucinrest, d.v.s. en ikke-naturlig aminosyre rest.

Det var tidligere kjent at L-serinrester i endeposisjon var ømfintlig overfor den avbyggende virkning av aminipeptidaser, at aminopeptidaser i de enkelte tilfelle ikke eller bare langsomt angriper endestående D-aminosyrer og at erstatningen av metioninresten i 4-stillingen med en norleucinrest fører til en noe sterkere virkning.

Det som imidlertid ikke tidligere var kjent er at kombinasjonen av tre sam-tidige endringer i en ACTH-peptidsekvens (erstatning av L-serin med D-serin i 1-stillingen, erstatning av L-metionin med L-norleucin i 4-stillingen, og erstatning av L-asparagin med L-valinamid i 25-stillingen) fører til en forbindelse med betydelig bedre effekt.

Det er en kjent erfaring i peptidkjemien at kombinasjonen av også bare små endringer i peptidsekvensen bare i unntageisestilfelle fører til mer aktive forbindelser. Dette må føres tilbake til at peptidkjeder avACTH-typen er fleksible og har tendens

til dannelse av tertiære strukturer. Dette er også grunnen til at innflytelsen av forskjellige substitusjoner på ACTH-molekylet ikke kan virke additivt. På grunn av den kjennskap man idag har til sammenheng mellom konstitusjon og virkning ved ACTH-peptider kan det derved ennå ikke avklares hvilke virkningsforskjeller en substituering av enkelte peptid-enheter innenfor en ACTH-sekvens kan tilbakeføres til.

Det var derfor overraskende og ikke nærliggende, at med det store antall av mulige substitusjoner nettopp kombinasjonen av 3 bestemte variasjoner førte til et høyvirksomt peptid.

142^ D-Ser -Nie -(Val-NH2) - p -ACTH kan fremstilles ved<*>de ovenfor angitte, for syntese av forbindelser av denne art alminnelig kjente metoder, hvorved aminosyrene i den i den ovennevnte formel fastlagte rekkefølge enkeltvis eller etter foregående dannelse av mindre peptidenheter knyttes til hverandre.

14 2S 1-21!

Således kan f.eks. D-Ser -Nie -(Val-NH2) - p'. -ACTH fremstilles ved at L-valyl- £-N-R-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolyl-L-valinamid, hvori R betyr en karbotert.butoksy- eller en karbotert.amyloksy- , en toluensulfonyl- , en ftalyl- , en formyl- eller en trifluoracetyl-gruppe, kondenseres med N-karbobenzoksy-L-valyl- glycyl-£ -N-R- L- ly syl- £ -N-R-L-lysyl-nitro-L-arginyl-nitro-L-arginyl-L-prolin, hvori R har den ovennevnte betydning, det erholdte N-karbobenzoksy-L-valyl-glycyl-

£ -N-R-L-lysyl- £ -N-R-L-lysyl-nitro-L-arginyl-nitro-L-arginyl-L-prolyl-L-valyl-£-N-R-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolyl-L-valinamid, hvori R har den ovennevnte betydning, kondenseres etter avspalting av karbobenzoksy-gruppen og nitrogruppen med N-trifenylmetyl-^ -O-tert.butyl-L-glutamyl-Im-trifenylmetyl-L-histidyl-L-fenylalanyl-L-arginyl-L-tryptofanyl-glycyl- £ -N-R-L-lysyl-L-prolin, hvori R har den ovennevnte betydning, det erholdte N-trifenylmetyl- jf -O-tert.butyl-L-glutamyl-Im-trifenylmetyl-L-histidyl-L-fenylalanyl-L-arginyl- L-tryptofanyl-glycyl-

i -N-R-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl- £-N-R-L-lysyl- £ -N-R-L-lysyl-L-ar ginyl-L-arginyl-L-prolyl-L-valyl- £ - N-R-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolyl-L-valinamid, hvori R har den ovennevnte betydning, kondenseres etter avspalting av N-trifenylmetyl-gruppen med N-R'-D-seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-norleucylazid, hvori R' betyr en trifenylmetyl- , en karbotert.butoksy- eller en karbotert.amyloksy- ,

en karbobenzoksy- , en trifluoracetyl- , en acetyl- , en kloracetyl- , eller en formyl-gruppe, og samtlige be skyttel sesgrupper i det erholdte nye, beskyttede pentakosapeptid N-R'-D- seryl-L-tyrosyl-L-seryl- L-.norleucyl- % -O-tert. butyl-L-glutamyl-Im-trifenylmetyl-L-histidyl-L-f enylalanyl-L-arginyl-L-tryptofanyl-glycyl- i -N-R-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl- £ -N-R-L-lysyl- £ - N-R-L-lysyl-L-arginyl-L-arginyl-L-prolyl-L-valyl- £ -N-R-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolyl-L-valinamid, hvor R

ogR' har den ovennevnte betydning, avspaltes i et eller flere trinn i surt miljø.

14 25 1-25 Utgangsproduktene for fremstilling av D-Ser -Nie -(Val-NH2) -/? -ACTH kan, såfremt de tidligere ikke er kjent, fremstilles ved for peptidkjemien kjente metoder, hvorved aminsyrene enkeltvis eller etter foregående dannelser av mindre peptidenhetér knyttes til hverandre. D-Ser 1 -Nie 4 -(Val-NHg) 25 ~ P l-'" ?5-ACTH lar seg også fremstille, henholdsvis anvende i form av sine salter. Som salter kommer i betraktning salter med organiske syrer, som eddiksyre, propionsyre, glykolsyre, melkesyre, pyrodruesyre, malon-syre, ravsyre, maleinsyre, fumarsyre, vinsyre, sitronsyre, benzosyre, kanelsyre, salicylsyre, 2-fenoksy- eller 2-acetoksy-benzosyre, mandelsyre, metansulfonsyre, etansulfonsyre, hydroksyetansulfonsyre, benzen- eller toluensulfonsyre, naftalin-sulfonsyre, sulfanilsyre såvel som polymere syrer som garvesyre, alginsyre, poly-galakturonsyre eller karboksymetylcellulose, og salter med uorganiske syrer som saltsyre eller bromhydrogensyre, salpetersyre, tiocyansyre, svovelsyre, og fosfor-syre. Som tungmetall-kompleks kommer f.eks. sådanne med sink på tale. 14 2S 1-21! D-Ser -Nie -(Val-NH2) -0 -ACTH, dets salter og tungmetall-komplekser kan f.eks. anvendes for behandling av følgende sykdommer:

Akutt og kronisk leddreumatisme,

Golitisk ulcerosa,

Nefrose,

Kollagenoser, som f.eks. Lupus erytematodes, Sklerodermi etc.,

Allergiske sykdommer i de forskjellige organsystemer, som Astma bronchiale, eksem, urtikaria, dermatitisk eksfoliativa, anafylaktisk sjokk etc. ,

Intoksikasjoner av forskjellige typer, f.eks. ved kronisk alkoholisme.

Tumorer, som f. eks. leukemier, lymfosarkomer, retikulosarkomer etc.

for forhindring av binyrebarkatrofi ved terapi med cortikosteroider,

Insuffisienssymtomer i hypofysen.

En vesentlig fordel like overfor naturlig, fra dyrisk material ekstrahert hormon ligger i at det syntetiske pentakosapeptid mangler antigene egenskaper. Det kan dermed ved de ovennevnte sykdommer også anvendes uten betenkeligheter, når det i pasientene i løpet av en tidligere behandling med naturlig ACTH forekom allergiske symtomer.

I de for standardisering vanlige og anerkjente prøver besitter D-Ser 1 -Nie<4->

25 1-25

(Val-NH2) -0 -ACTH en biologisk aktivitet av 625 + 130 korticotropin-IE pro mg fritt peptid. Således tjente for prøving av det i henhold til oppfinnelsen fremstillbare pentakosapeptid den 3. internasjonale standard for cortikotropin, som står til disposisjon i form av den "International Standard for Corticotropin" og muliggjør innstilling av ACTH-preparater til internasjonale enheter. Det har vist seg at det nye pentakosapeptid etter intravenøs tilførsel har en lengre virkningstid enn de tidligere kjente naturlige og syntetiske ACTH-preparater, hvilket representerer et betydelig teknisk fremskritt. Doseringen av det i henhold til oppfinnelsen fremstillbare pentakosapeptid varierer omtrent mellom 40 og 60 IE pr. dag, i spesielle tilfelle mellom 10 og 100 IE pr. dag. Den uventede, ved standardiseringen fastslåtte høye virkning av det nye pentakosapeptid er fullt ut blitt bekreftet ved den terapeutiske anvendelse.

14 2S 1-2^

D-SER -Nie -(Val-NH2) -/? -ACTH kan anvendes som legemiddel, f.eks.

i form av farmasøytiske preparater. Disse inneholder den nevnte forbindelse i blanding med et for parenteral tilførsel egnet inert organisk eller uorganisk bærermaterial. Preparatene kan også inneholde andre, terapeutisk verdifulle stoffer. Den nye forbindelse kan som naturlig ACTH også adminstreres i form av et depotpreparat.

Ved oppbygging av det nye pentakosapeptid har trifenylmetyl- , karbo-tert.butoksy-og karbo-tert. am yl oksy-gruppen vist seg gunstig for blokkering av aminogruppen i serinresten, dog kan også andre egnete beskyttelsesgrupper som karbobenzoksy- , trifluoracetyl- , acetyl- , kloracetyl- og formylgruppen finne anvendelse.

For blokkeringen av £ -aminogruppen i lysinresten har karbo-tert.butoksy- og karbo-tert.amyloksy-gruppen vist seg gunstig, dog kan også andre egnete beskyttelses grupper som karbobenzoksy- , toluensulfonyl- , ftalyl- , formyl- og trifluoracetyl-gruppen anvendes.

For blokkeringen av ^-karboksyl-gruppen i glutaminsyreresten har tert.-butyloksygruppen vist seg gunstig, dog kan også andre egnete beskyttelsesgrupper, som metoksy- , etoksy- , tert.-amyloksy- , amid- eller benzyloksygruppen finne anvendelse.

For blokkeringen av imidazolgruppen i histidinresten har trifenylmetylgruppen vist seg gunstig, dog kan også andre egnete beskyttelsesgrupper, som karbo-tert.butoksy- , karbo-tert.amyloksy- , karbobenzoksy- eller benzylgruppen finne anvendelse.

For blokkeringen av guanidogruppen i argininresten ble nitrogruppen anvendt, dog kan også andre egnete beskyttelsesgrupper, som tosylgruppen, p-nitrokarbo-benzoksygruppen eller 2-(isopropyloksykarbonyl)-3 ,4,5,6-tetraklorbenzoylgruppen anvendes. Det kan også ved syntesen anvendes beskyttelsesvirkningen av protoniser-ing av guanidogruppen.

Det anvendes følgende forkortelser:

CBO - karbobenzoksy

Trit - trityl - trifenylmetyl

CTB - karbo-tert.butyloksy

N02- nitro

OCP - 2,4,5-triklorfenoksy

OTB - tert. butyl oksy

OMe - metoksy

OEt - etoksy

Arg - L-ar ginyl

Glu - L-glutamyl

Gly - glycyl

His - L-histidyl

Lys - L-lysyl

Nie - L-norleucyl

Fe - L-fenylalanyl

Pro - L-prolyl

Ser - L-seryl

D-Ser - D-seryl

Try - L-tryptofanyl

Tyr - L-tyrosyl

Val - L-valyl

Im - Imidazolyl

I de følgende eksempler, som skal illustrere utførelsen av fremgangsmåten, er alle temperaturangivelser i °C.

Eksempel:

a) L- valyl- glycyl- karbo- tert. -butoksy- L- lysyl- karbo- tert. butoksy- L- lysyl- L-ar ginyl- L- ar ginyl- L- prolyl- L- valyl- karbo- tert. -butoksy- L- lysyl- L- valyl-L-tyrosyl-L-prolyl-L-valinamid. (H-Val-Gly- (CTB) Lys- (CTB) Lys-Arg-Arg-Pro-Val- (CTB) Lys-Val-Tyr-Pro-Val-NH2).

88 g CBO-(N02)Arg-(N02)Arg-Pro-OMe løses i 90% dioksan-vannblanding og tilsettes 220 ccm 2-n natronlut. Etter 2 timer fortynnes med en liter vann og det utvaskes gjentatte ganger med etylacetat. Deretter surgjøres den vandige oppløs-

ning med 4-n saltsyre, det utfeldte produkt oppløses i en blanding av metanol-aceton 1:1 og felles med tilsetning av etyleter. Det fås 70 g CB0-(N09)Arg-(N00)Arg-Pro-OH med smeltepunkt 108 C (med spalting). [ oå 2rj 1<=>-19 o i dimetylformamid. Det ovenfor erholdte tripeptid oppløses i 400 ml av en 33% oppløsning av bromhydrogen i iseddik, blandingen får stå i en time ved 20°, det konsentreres til 200 ml, felles med etyleter, filtreres, vaskes med etylacetat og tørres. Det fås 72 g H-(NO„)Arg-

o 21 (N02)Arg-Pro-OH. 3 HBr med smeltepunkt 84 (med spalting). [d D<=>-19° i 95% eddiksyre. I en oppløsning av 72 g H-(NC<2) Arg-(NO2) Arg-Pro-OH hydrobromid i 600 ml dimetylformamid og 56 ml trietylamin innføres ved 0 C 84 g CBO-Val-Gly-(CTB)Lys-(CTB)Lys-N3(fremstilt fra 85 g av det tilsvarende hydrazid). Oppløs-ningen får stå i 16 timer og deretter inndampes oppløsningsmidlet. Resten løses i en blanding av n-butanoletylacetat (2:8) og det ettervaskes gjentatte ganger med fortynnet svovelsyre. Oppløsningen konsentreres i vakuum og felles med eter. Det er-holdes 90 g CBO-Val-Gly-(CTB)Lys-(CTB)Lys-(N02)Arg-(N02)Arg-Pro-OH med smeltepunkt 151°C (med spalting). [oJi) = -38° i metanol.

56 g CBO-Val-Gly-(CTB) Lys-(CTB) Lys-(N02) Arg-(N02) Arg-Pro-OH løses

i 900 ml dimetylformamid og 900 ml tetrahydrofuran. Etter tilsetning av 6,2 ml trietylamin avkjøles oppløsningen til -10°C og ved denne temperatur tilsettes 4,2

ml klormaur-syreetylester. Etter 10 min. tilsettes,36 g H-Val-(CTB) Lys-Val-Tyr-Pro-Val-NH2i 16 ml dimetylformamid og omrøres videre i 16 timer ved 20°C. Oppløsningsmidlet inndampes i vakuum og resten utvaskes med vann. Peptidet løses

i varm etanol og felles med etylacetat. Etter avsuging på nutsj og tørring fås 72 g CBO-Val-Gly(CTB) Lys- (CTB) Lys- (NOg) Arg- (N02) Arg-Pro-Val- (CTB) Lys-Val-Tyr-Pro-Val-NH2med smeltepunkt 190°C (med spalting). [ojD - -36° i dimetylformamid.

72 g CBO-Val-Gly- (CTB) Lys- (CTB) Lys- (N02)Arg- (N02) Arg-Pro-Val- (CTB) Lys-Val-Tyr-Pro-Val-NH2løses i 1,5 1 80% eddiksyre, tilsettes palladium-katalysator, det hydreres til avslutning av hydrogenopptagelse og katalysatoren frafiltreres. Etter inndamping oppløses resten i 500 ml metanol, det avkjøles til -5°C, tilsettes 4,1 g p-toluensulfonsyre og felles deretter med eter. Det fås 66 g H-Val-Gly-(CTB)Lys-(CTB) Lys-Arg-Arg-Pro-Val-(CTB) Lys-Val-Tyr-Pro-Val-NH2 som tritoluensulfonat med smeltepunkt 185°C (med spalting) . [qO = -42° i dimetylformamid. b) O- tert. -butyl- L- glutamyl-im- trityl- L-histidyl- L- f enyl- alanyl- L- ar ginyl- L-tryptofanyl- glycyl- N-karbo-tert. butoksy- L-lysyl- L-prolyl- L- valyl-glycyl-N-karbo-tert. butoksy-L-lysyl-N-karbo-tert. butoksy-L-lysyl-L-arginyl-L-arginyl-L-prolyl-L-valyl-N-karbo-tert. butoksy-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolyl-L-valinamid. (H- (OTB) Glu- (T rit) His-Fe-Arg-Try-Gly- (CTB) Lys-Pro-Val-Gly- (CTB) Lys- (CTB) Lys-Arg-Arg-Pro-Val- (CTB) Lys-Val-Tyr-Pro-Val-NH2). 62 g H-Val-Gly- (CTB) Lys- (CTB) Lys-Arg-Arg-Pro-Val- (CTB) Lys-Val-Tyr-Pro-Val-NH2. 3 Tos-OH løses i 300 ml pyridin og 300 ml acetonitril. Deretter tilsettes 57 g Trit-(OTB)Glu-(Trit)His-Fe-Arg-Try-Gly-(CTB)Lys-Pro-OH og når alt er oppløst avkjøles til 0°C , tilsettes 28,6 g dicykloheksylkarbodiimid. Etter 24 timers rysting ved 20°C frafiltreres urinstoffet og oppløsningen felles med eter. Produktet oppløses flere ganger i metanol og felles med eddikester.

Det fås 90 g Trit-(OTB)Glu-(Trit)His-Fe-Arg-Try-Gly-(CTB)Lys-Pro-Val-Gly- (CTB) Lys- (CTB) Lys-Arg-Arg- Pro-Val- (CTB) Lys-Val-Tyr-Pro-Val-NH2 tritoluensulfonat. Smeltepunkt 184°C med spalting, [ a] d* = -51° i metanol.

45 gTrit-(OTB)Glu-(Trit)His-Fe-Arg-Try-Gly-(CTB)Lys-Pro-Val-Gly-(CTB) Lys-(CTB)Lys-Arg-Arg-Pro-Val-(CTB)Lys-Val-Tyr-Pro-Val-NH2 3 Tos-OH løses

i 500 ml 80% eddiksyre og hensettes i to timer ved 30°C. Det tilsettes 50 ml "Amberlite" IRA-410 i acetatform, filtreres, inndampes i vakuum og resten oppløses i metanol. Etter felling med eter fås 40 g H-(OTB)Glu-(Trit)His-Fe-Arg-Try-Gly-(CTB) Lys-Pro-Val-Gly-(CTB) Lys-(CTB) Lys-Arg-Arg-Pro-Val-(CTB) Lys-Val-Tyr-Pro-Val-NH2. Spalting ved 170°C. [ a] 2^ = -49° i metanol.

c) L-tyrosyl-L-seryl-L-norleucinmetylester. (H-Tyr-Ser-Nle-OMe).

54 g H-Ser-Nle-OMe. HC1 og 63 g CBO-Tyr-OH oppløses i 860 ml acetonitril, det avkjøles til 0°C, tilsettes 28 ml trietylamin, avkjøles til -10°C og tilsettes 41 g dicykloheksylkarbodiimid. Blandingen omrøres i 16 timer ved 0°C , deretter frafiltreres. Resten vaskes med 1400 ml pyridin. De forente filtrater inndampes og resten krystalliseres fra eddikester. Det fås 101 g CBO-Tyr-Ser-Nle-OMe (Smeltepunkt 140 - 142°C). [do* " -15°C i dimetylformamid. 51 g av det således erholdte produkt løses i 2 1 av 1N oppløsning av HC1 i metanol og det hydreres i nærvær av 10 g palladium/kull. Etter ca. 2 timer opphør-er opptagelsen av hydrogen. Det filtreres, avdampes og resten krystalliseres fra en blanding av metanol-eter (3:1) . Det fås 42 g H-Tyr-Ser-Nle-OMe. HC1. Smeltepunkt 227°C. [ a] j) = -7° i dimetylformamid. d) Karbo- tert. -butoksy- D- seryl- L- ty rosyl- L- seryl- L-norleucinhydrazid. (CTB)-D-Ser-Tyr-Ser-Nle-NHNH2). 60 g D-serinmetylester hydroklorid løses i 200 ml dimetylformamid og 54 ml trietylamin, det avkjøles til 0°C og trietylaminhydrokloridet frafiltreres. Dimetylformamid inndampes ved høyvakuum og resten oppløses i 150 ml pyridin. Det til— dryppes 100 g tert.-butyloksykarbonylazid og blandingen hensettes i 2 døgn ved 20°C.

Oppløsningsmidlet avdampes og produktet opptas i eddikester. Etter vasking med vann, fortynnet saltsyre og kaliumhydrogenkarbonat-oppløsning tørres over natriumsulfat. Etter avdamping av eddikesteren blir CTB-D-Ser-OMe tilbake som en olje. Esteren oppløses i 500 ml metanol og får stå i 2 døgn ved 20°C med 50 ml hydrazinhydrat. Etter avdamping av metanolen krystalliserer hydrazidet. Når om-krystallisert fra varm eddikester isoleres 53 g CTB-D-Ser-NHNH2med smeltepunkt 114°C. [ oi i) = -3° i dimetylformamid.

Ved -10°C oppløses 10 g CTB-D-serinhydrazid i 136 ml 1 N saltsyre som inneholder 15 g natriumklorid. Ved denne temperatur tilsettes 160 ml eddikester og deretter 38 g natriumnitrit i 3 porsjoner. Under stadig omrøring får blandingen ennå reagere i 5 min. ved -10°C. Eddikesterfasen fraskilles, vaskes med kold 10% kaliumhydrogenkarbonatoppløsning og tørres med natriumsulfat. Den tørrete opp-løsning tilsettes en oppløsning bestående av 13 g H-Tyr-Ser-Nle-OMe hydroklorid i 60 ml dimetylformamid og 6 ml trietylamin. Deretter avdampes eddikesteren i vakuum og blandingen får stå i 16 timer ved 20°C. Det resterende oppløsningsmiddel inndampes i vakuum og resten løses i eddikester. Det utvaskes med fortynnet fosfor-syre og kaliumhydrogenkarbonatoppløsning og tørres over natriumsulfat. Etter inndamping av oppløsningsmidlet og felling med eter fås 15 g CTB-D-Ser-Tyr-Ser-Nle-OMe. Smeltepunkt 135°C. [oili) = -6° i metanol. 11 g CTB-D-Ser-Tyr-Nle-OMe løses i 100 ml metanol og tilsettes 45 ml hydrazinhydrat. Blandingen får stå over natten ved 20°C hvorved produktet utkrystal-liseres. Det fås 7 ,7 g CTB-D-Ser-Tyr-Ser-Nle-hydrazid med smeltepunkt 210°C. [ a\ i)<=>+6,4° i dimetylformamid. e) D- seryl- L-tyosyl- L- seryl- L-norleucyl- L- glutamyl- L-histidyl- L- f enylalanyl-L- ar ginyl- L-tryptofanyl- glycyl- L-lysyl- L- prolyl- L-valyl- glycyl- L-lysyl- L-ly syl- L- ar ginyl- L- ar ginyl- L- prolyl- L-valyl- L-lysyl- L-valyl- L-tyrosyl- L-prolyl- L-valinamid. (D-Ser-Tyr--Ser-Nle-Glu-His-Fe-Arg-Try-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro~Val-Lys-Val-Tyr-Pro-Val-NH2).

2,0 g CTB-D-Ser-Tyr-Ser-Nle-NHNH2løses i 12 ml dimetylformamid,

det tilsettes 4 ml vann, avkjøles til -10°C, tilsettes 2 ml 6 N saltsyre, tilsettes 280 mg natriumnitrit, omrøres i 5 min. ved -5°C , tilsettes 300 ml 0 ,2 N kalium-bikarbonatoppløsning og sentrifugerer. Det erholdte CTB-D-Ser-Tyr-Ser-Nle-N3

løses i 50 ml dimetylformamid, tilsettes 10,5 g H-Glu(OTB)-(Trit)His-Fe-Arg-Try-Gly- (CTB) Lys-Pro-Val-Gly- (CTB) Lys-Val-Gly- (CTB) Lys- (CTB) Lys- Arg- Arg- Pro-Val-(CTB)Lys-Val-Tyr-Pro-Val-NH2. Acetat, blandingen får stå i 12 timer ved 0°C, det tilsettes en ytterligere, av 2,0 g CTB-D-Ser-Tyr-Ser-Nle-NHNH„ fremstilt mengde av tetrapeptidazid, blandingen får stå i 6 timer ved 0 C , det inndampes, bearbeides med eddikester, vaskes med varm aceton og eddikester og tørres i vakuum. Det erholdte produkt løses i 100 ml 90% trifluoreddiksyre, blandingen får stå i 1 time ved 20°C under nitrogen, det inndampes, bearbeides med eddikester, filtreres og tørres. Det erholdte produkt løses i 500 ml 0 ,2 N eddiksyre, oppløs-ningen behandles med "Amberlite"-IRA-410 i acetatform, filtreres og lyofiliseres. Etter tørring over natriumhydroksyd fås 7 ,5 g H-D-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu-His-Fe-Arg-Try-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-Val-Lys-Val-Tyr-Pro-Val-NH2. Heptaacetat . Dekahydrat, som ved kromatografi og elektroforese forholder seg homogent. (Totalhydrolyse gir de følgende aminosyresammensetninger:

Smeltepunkt: 209°C med spalting. [oJ j) = -80° i 1 N eddiksyre.

Claims (1)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av det nye, terapeutisk aktive pentakosapeptid med formel:

   D- seryl- L- ty rosyl- L- seryl- L- norleucyl- L- glutamyl- L-histidyl- L-f enylalanyl- L- ar ginyl- L- tryptof anyl- glycyl- L-lysyl- L- prolyl-L- valyl-glycyl- L- lysyl- L- lysyl- L- ar ginyl- L- ar ginyl- L- prolyl- L- valyl- L-lysyl- L- valyl- L- tyrosyl- L- prolyl- L- valinamid og dets syreaddisjonssalter eller tungmetallkomplekser,karakterisert vedat aminosyrene D-serin, L-tyrosin, L-serin, L-norléucin, L-glutaminsyre, L-histidin, L-fenylalanin, L-arginin, L-tryptofan, glycin, L-lysin, L-prolin, L-valin, glycin, L-lysin, L-lysin, L-arginin, L-arginin, L-prolin, L-valin, L-lysin, L-valin, L-tyrosin, L-prolin og l-valin i den angitte rekkefølge og/eller peptidbruddstykker som inneholder disse aminosyrer i den i formelen angitte rekkefølge, under anvendelse av innen peptidkjemien kjente metoder kondenseres til det angitte pentacosapeptid, idet for den peptidiske tilknytning aktiveres enten en endestående karboksylgruppe eller en aminogruppe, og de øvrige reaktive grupper beskyttes intermediært, idet karboksyl-gruppen i den endestående valinrest til å begynne med eller på et vilkårlig tidspunkt -i syntesen overføres i amidgruppen, og om ønskes overføres det således erholdte pentacosapeptid i sine terapeutisk virksomme syreaddisjonssalter eller tungmetall-komplekser.