DK148905B

DK148905B - Analogifremgangsmaade til fremstilling af lh-rh-analoge nonapeptidderivater

Info

Publication number: DK148905B
Application number: DK361875AA
Authority: DK
Inventors: Wolfgang Koenig; Rolf Geiger; Juergen Kurt Sandow
Original assignee: Hoechst Ag
Priority date: 1974-08-09
Filing date: 1975-08-08
Publication date: 1985-11-11
Also published as: US4024248A; GB1523623A; DE2438350A1; IL47880A; FR2281132B1; NL7509260A; DK361875A; SE7508926L; IE41510L; NL182051C; AU8374475A; IL47880A0; ATA618975A; CH613186A5; CA1069888A; NL182051B; DK148905C; SE7805545L; SE424184B; IE41510B1

Description

148905

Releasinghormonet LH-RH/FSH-RH, der udløser det luteotrope hormon (LH) og det follikelstimulerende hormon (FSH), med strukturen ^Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 12 3456789 10 (Biochem. Biophys. Res.Commun. 1334 (1971)) er allerede blevet modificeret i mange positioner. Herved fandt man ud af, at aktiviteten blev hævet ved erstatning af Gly i positionen 6 med D-alanin (Biochemistry 12, 4616 (1973)) eller ved erstatning af Gly-NHj i positionen 10 med ethylamid, propylamid eller isopropylamid (J. Med. Chem. 16, 1144 (1973)). Kombineres disse to modifikationer, får man 2 148905 analoge med endnu stærkere virkning (Biochem. Biophys. Res.

Commun. 57, 335 (1974)). Det gode resultat af udbytningen af Gly med D-aminosyrer er første gang blevet vist ved insulin (Scientia Sinica XVI, 71-78 (1973)).

Erstatningen af glycin i positionen 6 med stærkere li-pophile D-aminosyrer, f.eks. D-valin, D-leucin eller D-prolin, førte til analoge med ringe LH-RH-virkning (Abstracts of The Endocrine Society 55. Annual Meeting, 1973, side A 145).

Det har nu overraskende vist sig, at udbytningen af glycin med stærkt lipophile unaturlige D-aminosyrer, der indeholder en tertiær butylgruppe eller en benzyloxycarbonylgruppe som beskyttelsesgruppe, giver endnu stærkere virksomme analoge end de tilsvarende allerede kendte i 6-stillingen ubeskyttede analoge. .

Opfindelsen angår således en analogifremgangsmåde til fremstilling af hidtil ukendte LH—RH—analoge nonapeptidderivater med den almene formel ^Glu-His-Trp-Ser-Tyr- X -Leu-Arg-Pro-Y (I) 123456 7 89 10 hvor X betyder D-Ser (Bu*") , D-Thr (But), D-Asp(OBu^) , D-GlufOBu*'), D-Orn(Boc) eller D-Lys(Boc), og Y betyder en NH-alkylgruppe, i hvilken alkylgruppen indeholder 1-3 carbonatomer, eller betyder en NH-cyclopropylgruppe, og denne fremgangsmåde er ejendommelig ved, at de fremstilles enten a) ved indenfor peptidkemien sædvanlig fragmentkondensation af peptidbrudstykker eller b) ved trinvis opbygning, hvorved funktionelle grupper,, der ikke skal indgå i kondensationen, eventuelt midlertidigt blokeres med afhydrogenerbare eller i alkalisk eller svagt surt medium fraspaltelige beskyttelsesgrupper.

Særlig længe virkende LH-RH-analoge fås, når Y i den almene formel I betyder en NH-alkylgruppe med 2-3 carbonatomer.

3 148905

Af større betydning er de her omhandlede forbindelser, i hvilke X betyder D-Ser(Bu^) , D-Thr(Bu^), D-Glu-(OBu*") eller D-AspiOBu^). Disse forbindelser er oralt virksomme. Oralt virksomme peptider med denne kædelængde har hidtil ikke været kendt. Dette er særlig overraskende, da de tertiære butylethere og tertiære butylestere er ustabile i surt medium.

Som forbindelser med den her omhandlede udbytning i positionen 6 kommer f.eks. følgende LH-RH-analoge i betragtning: 123456 7 89 10 J-GJ-u-His-Trp-Ser-Tyr- X - Leu -Arg-Pro -NH-C2H5 -NH-CH2-CH2-CH3 -NH-CH^-^" 12 ^ch2

Af de ovenfor nævnte forbindelser er sådanne af særlig betydning, i hvilke X betyder D-Ser(Bu^), D-Glu(OBu^) og D-Asp(OBu^).

Ved syntesen af de her omhandlede forbindelser skal der kun anvendes metoder, ved hvilke de surt letfraspaltelige tertiære buty lgrupper i positionen 6 ikke fraspaltes.

Ved fragmentkoblingen ifølge a) anvender man fortrinsvis den uden racemisering forløbende azidkobling eller DCC/l-hydroxy-benzotriazol- eller DCC/3-hydroxy-4-oxo-3,4-dihydro-l,2,3-benzo-triazinmetoden. Man kan også anvende aktiverede estere af fragmenter.

For den trinvise kondensation af aminosyrer ifølge b) egner der sig særlig godt aktiverede estere af benzyloxycarbonylaminosyrer, f.eks. N-hydroxysuccinimidester eller 2,4,5-trichlorphenylester og 4-nitrophenylester. Aminolysen af de to sidstnævnte aktive estere kan særlig godt katalyseres af N-hydroxyforbindelser, der besidder omtrent den samme aciditet som eddikesyre, f.eks. 1-hydroxybenzo-triazol.

4 148905

Som intermediære aminobeskyttelsesgrupper anvendes der af-hydrogenerbare grupper, f.eks. benzyloxycarbonylgruppen (= Z-gruppen) eller svagt surt fraspaltelige grupper, f.eks. 2-(p-diphenyl)--isopropyloxycarbonyl- eller 2-(3,5-dimethoxyphenyl)-isopropyloxy-carbonylgruppen.

Guanidofunktionen i arginin kan forblive ubeskyttet eller kan blokeres af en nitrogruppe, der fraspaltes ved den efterfølgende hydrogenering. Den kan imidlertid også blokeres med surt fraspaltelige beskyttelsesgrupper, f.eks. carbobenzoxygruppen eller tosy lgruppen, hvorved beskyttelsesgrupperne imidlertid skal fraspaltes senest på tetrapeptidtrinnet. I tilfælde af nitro- eller tosylgrup-pen lykkedes dette godt med flydende HF/anisol. Det samme gælder for en intermediær beskyttelse af amidgruppen ved hjælp af den surt fra-spaltelige 4,4'-dimethoxybenzhydrylgruppe, der også senest skal fraspaltes på tetrapeptidtrinnet enten med trifluoreddikesyre/anisol eller sammen med en guanidobeskyttelsesgruppe og/eller surt fraspaltelig aminogruppe med HF/anisol.

De her omhandlede forbindelser udviser i forhold til tilsvarende i 6-stillingen ubeskyttede analoge ved en ovula-tionsprøve og ved en ascorbinsyreformindskelsesprøve en stærkere og længere varende virkning. Den overraskende orale virkning (dosis 0,01-0,2 mg/kg) af forbindelserne (X = D-SerCBu1^, D-THriBu*'), D-Glu(OBu^), D-Asp (OBu*"j) åbner for disse lægemidler et bredere anvendelsesområde end det hidtil kun parenteralt eller nasalt indgivelige LH-RH. De udgør nye lægemidler, der ved hypothalamus- og hypophyse-insufficiens bevirker udløsningen af det luteiniserende og det follikelstimulerende hormon fra hypophyseforlappen og anvendes derfor til behandling af kvindelig og mandlig sterilitet, hvis denne er af hypothalamisk--hypophysær oprindelse.

De her omhandlede forbindelser kan opløst i en fysiologisk kogsaltopløsning anvendes intravenøst, intramuskulært eller subcutant, men kan også anvendes intranasalt i form af næsedræber eller næsespray og også oralt.

5 148905

De forskellige anvendelsesmåders fortrinsvis anvendte doseringer er: intravenøst 20 - 1000 ng/kg subcutant 20 - 2000 ng/kg intramuskulær 20- 10000 ng/kg intranasalt 100- 50000 ng/kg peroralt 10 000 - 200 000 ng/kg

Den biologiske aktivitet af de her omhandlede forbindelser i forhold til forbindelser ifølge kendt teknik hhv. peptider, der i position 6 har en D-aminosyre uden But eller Boc, er vist ved de nedenfor beskrevne forsøgsmetoder.

Materialer og metoder

Peptiderne, der er anført i tabellen nedenfor, afprøves ved to forskellige biologiske forsøgsmetoder:

Prøve 1: Fremkaldelse af ovulation med LH-RH eller LH-RH-analoge hos ikke-kønsmodne rotter, der i forvejen er behandlet med serum-gonadotropin fra drægtige hopper (PMSG) (hvilket er en forudsætning for, at der kan fremkaldes ovulation). Prøve 2: Formindskelse af ovarie-ascorbinsyre hos pseudo-drægtige rotter, der i forvejen er behandlet med PMSG og humant chorion-gonadotropin. Baggrunden for denne prøve er, at ascorbinsyre er en co-faktor for steroid-biosyntesen og derved omdannes til dihydroascorbinsyre. Når der syntetiseres meget steroid, forbruges der også meget ascorbinsyre, hvorved koncentrationen deraf falder. LH-RH-Analoge intensiverer steroid-biosyntesen (via frigørelsen af LH og FSH) og sænker derfor ascorbinsyreniveauet.

LH-RH anvendes som sammenligningspræparat (rent syntetisk peptid) og har en aktivitet på 400 ng ved prøve 1 (minimal virksom dosis defineret som ED25) og 600 ng ved prøve 2 (ED5Q). Resultaterne i tabellen viser de relative aktiviteter i forhold til LH--RH, idet aktiviteten af LH-RH er sat til 1. Alle peptider prøves ved to eller flere dosisniveauer.

148905 6

Tabel position 6_position 10 Prøve 1 Prøve 2 LHRH 1 1

Her omhandlede f orb.: D-Ser (But) . ethylamin 133 130-150 D-Lys (Boc) " 45 92 D-Glu (OBut) / ; .. . " 40 79 D-Asp (0But) " 47 40 ~ D-Ser (But)· cyclopropylamin 40 65

Kendte eller beslægtede forb.: D-Lys (Ref.A+) ethylamin (20) 150) D-Ala (Ref.R+) " 44 38 D-Ser ' " 20 21 D-Glu J : - 12 · 28 D-Åsp " (ikke af- 8 prøvet)

Ref.A = US-patent nr. 3.896.104 (tilhører ikke kendt teknik)

Ref.R = Biochem. and Biophys. Res. Comm. 57, 1248 - 1256 (1974).

Resultater

Det viser, sig, at peptider, der er beskyttet med tert.-• butyl-holdige beskyttelsesgrupper i sidekæden af en D-aminosyre i position 6, alle er mere aktive end de tilsvarende.ikke-beskyt-tede forbindelser eller beslægtede LH-RH-forbindelser, der har en D-aminosyre i position 6 og ethylamin i position 10.

7 148905

Fragmentkondensationen ifølge fremgangsmådevariant a) kan illustreres på følgende måde: 1 2 3 4 5678 9 10

l-Glu His Trp Ser Tyr X Leu Arg Pro Y

Z-OTcp H---- Z------ Z-OTcpH-----

3zl Z

2 t--OH H------

Bzl Z ------- ---S3 H------- Y = NH-C2Hg (eksempel 1 og 2) Y = NH-Cyclopropyl (eksempel 3)

Forkortelser:

Bzl Benzyl

Boc Tert.butyloxycarbony1

Bufc Tert.buty1 DCC Dicyclohexylcarbodiimid ^-Glu Pyroglutaminsyre HOBt 1—Hydroxybenzotriazol

Mbh 4,4'-Dimethoxybenzhydrol OBut Tert.butylester ONb p-Nitrobenzylester ONSu N-Hydroxysuccinimidester OTcp 2,4,5-Trichlorphenylester OOBt 3-Hydroxy-4-oxo-3,4-dihydro-l,2,3-benzotriazinester Z Benzyloxycarbonyl 8 148905

Eksempel I (Eragmentkondensa tion 1-3 + 4-10) CGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(But)-Leu-Arg-Pro-NH-C2H5 a) Z-Arg (Z2) -Pro-NH-C2Hj.

Til en opløsning af 8,9 g (50 mmol) H-Pro-NH-C2H,-*HCl, 28,9 g (50 mmol) Z-Arg(Z2)-0H og 6,75 g (50 mmol) HOBt i 150 ml methylen-chlorid sætter man ved 0°C 6,5 ml N-ethylmorpholin og 11 g DCC, og der omrøres i 1 time ved 0°C og henstilles natten over ved stuetemperatur. Bundfaldet fraskilles ved sugning, og filtratet koncentreres. Remanensen fordeles mellem eddikeester og vand. Eddikeesterfasen udrystes efter hinanden med en mættet natriumhydrogencarbonat-opløsning, 2N svovlsyre, en mættet natriumhydrogencarbonatopløsning og med vand, tørres over natriumsulfat og koncentreres. Remanensen opløses i isopropanol. Herfra fældes en olie med petroleumsether, hvilken olie krystalliserer i løbet af natten. Udbytte 27,8 g (80%), smp. 82-85°C [aj22 = -30,0° (c=l, methanol).

b) H-Arg-Pro-NH-C2H^-2HC1 39,7 g (56,7 mmol) Z-Arg(Z2)-Pro-NH-C2H5 opløses i 200 ml methanol. Hertil sættes en spatelspids Pd/BaSO^-katalysator, og der hydrogeneres, idet man under omrøring leder hydrogen gennem opløsningen. pH-værdien af opløsningen holdes ved hjælp af en auto-titrator ved tilsætning af IN methanolisk saltsyre på 4,5. Kataly-.

satoren fraskilles ved sugning efter endt hydrogenering, og filtratet koncentreres. Remanensen udrives med ether.og fraskilles ved sugning. Udbytte 17,9 g amorft stof (85%), [a]^ = -26,0° (c-1., methanol)

c) Z-Ser-Tyr(Bzl)-OH

Til en suspension af 5,52 g (20 mmol) Η-Tyr(Bzl)-OH i 60 ml dimethylacetamid sættes 7,68 g Z-Ser-OOBt, og der omrøres i 6 timer ved stuetemperatur. Der fraskilles ved sugning fra uopløste bestanddele, og til det til 0°C afkølede filtrat sættes 300 ml vand. Bundfaldet frasfcilles ved sugning, vaskes med dimethylacetat/vand-blan-ding (1:10) og vand og sammenrøres med IN svovlsyre. Nu fraskilles der igen ved sugning og vaskes med vand og tørres. Der omkrystalliseres fra eddikeester/petroleumsether. Udbytte 7,35 g (75%), smp. 166°C, [<x]20 = 20,9° (c=l, methanol).

9 148905 d) Z-D-Ser(But)-Leu-Arg-Pro-NH-C2H5

Til en opløsning af 11,2 g (30 mmol) H-Arg-Pro-NH-CgH^^HCl i 50 ml dimethylformamid sættes ved 0° 7,8 ml N-ethylmorpholin og 8,25 g Z-Leu-ONSu. Blandingen henstilles natten over ved stuetemperatur og koncentreres, og remanensen udrives en gang med eddikesyreester og en gang med ether. Opløsningsmidlet afdekanteres, og olien tørres i højvakuum. Remanensen (20,0 g) opløses i methanol og hydrogeneres katalytisk analogt med eksempel lb. Remanensen udrives med ether og tørres i højvakuum. Der fås 16,1 g amorft H-Leu-Arg-Pro-NHC2H,-*2HC1, der er forurenet af salte (14,5 g = 100% henført til H-Arg-Pro-NH-C2H,j ·2Η01). 2,45 g af dette stof opløses sammen med 675 mg HOBt, 1,3 ml N-ethylmorpholin og 2,4 g Z-D-Ser(But)--OTcp i 20 ml dimethylformamid. Blandingen henstilles natten over ved stuetemperatur og koncentreres den efterfølgende dag. Remanensen udrives to gange med en mættet natriumhydrocarbonatopløsning, opløses i methylenchlorid, tørres over natriumsulfat og koncentreres, og remanensen sammenrives med ether. Udbytte 2,3 g (71% henført til H-Arg-Pro-NH-C2H5*2HCl), smp. 85-116°C.

e) H-Ser-Tyr-D-Ser(But)-Leu-Arg-Pro-NH-C2H5*2 HC1 2,3 g (3,33 mmol) Z-D-Ser(But)-Leu-Arg-Pro-NH-C2H5 opløses i methanol og hydrogeneres katalytisk analogt med eksempel lb. Remanensen udrives med ether og tørres i højvakuum. Udbytte 1,93 g amorft materiale (93%).

Ovennævnte 1,95 g (3,1 mmol) H-D-Ser(But)-Leu-Arg-Pro-NH--C2H5*2HC1 suspenderes sammen med 1,53 g (3,1 mmol) Z-Ser-Tyr(Bzl)--0H, 420 mg HOBt og 0,8 ml N-ethylmorpholin i 7 ml dimethylformamid. Ved 0°C tilsættes 680 mg DCC, og blandingen omrøres i 1 time ved 0°C og henstilles natten over ved stuetemperatur. Bundfaldet fraskilles ved sugning den påfølgende dag, og filtratet koncentreres. Remanensen udrives to gange med en mættet natriumhydrogencar-bonatopløsning og opløses i methylenchlorid, og opløsningen tørres over natriumsulfat og koncentreres. Remanensen udrives med ether og frasuges. Der fås 2,65 g (= 2,57 mmol Z-Ser-Tyr(Bzl)-D-Ser(Bufc)-Leu--Arg-Pro-NH-C2H^ af et amorft stof, der hydrogeneres katalytisk analogt med eksempel lb. Remanensen udrives med ether og tørres i højvakuum.

10 148905

Udbytte 2,2 g amorf H-Ser-Tyr-D-Ser(Bu*")Leu-Arg-Pro-NH--C2H5*2HC1 (= 2,5 mmol = 75% henført til Z-D-Ser(Bufc)-Leu-Arg-Pro- -nh-c2h5).

Til en analytisk prøve renses 1,3 g på den i det følgende beskrevne fordelingschromatografi-søjle. Opbygning af søjlen: 400 ml iseddike, 800 ml n-butanol og 4 liter vand udrystes. 300 ml af den øvre fase sammenrøres med 204 g "Sephadex"LH 20 Herved opsuges det samlede opløsningsmiddel. Den således forbehandlede søjlefyldning suspenderes i en tilsvarende mængde af den underste fase. Der opkvældes i 3 timer, og søjlen fyldes (1 m x 4 cm). Der elueres med den underste fase. Udbyttet af chromatografisk rent stof er 562 mg.

[a]^ = -43,9° (c=l, i methanol).

f) t-Cslu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(But)-Leu-Arg-Pro-NH-C2H^-diacetat

Til en opløsning af 500 mg I-gIu-Ηϊs-Trp-NH-NH2 i 6 ml dime-thylformamid sættes ved -30°C 0,66 ml af en 6,05 N HCl/dioxanopløs-ning og 1,2 ml af en 10%'s tertiær butylnitritopløsning i absolut dioxan. Der omrøres i 20 minutter ved -10°C og tilsættes ved -40°C

877,8 mg råt H-Ser-Tyr-D-Ser(Bu1)-Leu-Arg-Pro-NH-C2H5*2HCl og 0,78 ml N-ethylmorpholin. Blandingen henstilles natten over i et kølerum ved 4°C og koncentreres, og remanensen udrives med ether. Stoffet opløses i vand og chromatograferes over "Dowex" ® 1x2 (acetatform). Eluatet koncentreres og renses over en carboxymethylcellulosesøjle (90 x 1,5 cm), der er indstillet til ligevægt med 0,002 M NH^-ace-tatopløsning. Stoffet tilsættes opløst i den 0,002 molære ammonium-acethtopløsning. Der elueres med en 0,002 molær ammoniumacetatop-løsning, der pålægges en gradient af 0,01 M NH^-acetatopløsning (blandingsvolumen 250 ml).

De fraktioner, der indeholder det ønskede peptid, fryse-tørres to gange. Udbyttet er 401 mg chromatografisk rent stof. Indholdet af peptidbase er ifølge UV-spektret 76% (udbytte 25%).

[a]j^ = -40,4° (c=l, i dimethylacetamid).

u 148905 I—1 g) LGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser-Leu-Arg-Pro-NH-C2H^-diacetat (som sammenligningsstof) 200 mg ^-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(But)-Leu-Arg-Pro-NH-C2H5-diacetat opløses sammen med 0,1 ml mercaptoethanol i 2 ml trifluoreddikesyre. Blandingen henstilles i 1 time ved stuetemperatur og koncentreres, og remanensen udrives med ether. Stoffet fraskilles ved sugning og vaskes med ether, opløses i vand og chromatograferes over Dowex 1x2 (acetatform). Eluatet koncentreres, og remanensen renses analogt med eksempel le over "Sephadex" LH 20. Udbyttet er 120 mg. Indholdet af peptidbase er ifølge UV-spektret 77,5%. [a]p® = -43,7° (c-l, HjO)

Eksempel 2 (f ragmentkondensat ion 1-3 + 4-10) ^Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Glu(OBu1^ -Leu-Arg-Pro-NH-C2H5 a) Z-D-Glu- (OBu^·)-Leu-Arg-Pro-NH-C2Hj 2,45 g med salte forurenet H-Leu-Arg-Pro-NH-C2H,-·2HC1 omsættes analogt med eksempel ld med 2,6 g Z-D-GluiOBu1^)-OTcp, 675 mg HOBt og 1,3 ml N-ethylmorpholin i 20 ml dimethylformamid. Udbytte 2,75 g (81% henført til H-Arg-Pro-NH-C2H5*2HC1), smp. 83-100°C.

b) H-Ser-Tyr-D-Glu(OBut)-Leu-Arg-Pro-NH-C2H5*2HC1 1,85 g (2,53 mmol) Z-D-Glu(OBu*1)-Leu-Arg-Pro-NH-C2H(j hydrogeneres katalytisk analogt med eksempel lb i methanol. Remanensen udrives med ether og frasuges. Udbyttet er 1,7 g (99,5%) .

Ovennævnte 1,7 g (2,5 mmol) H-D-GlufOBu*^-Leu-Arg-Pro-NH--C2H5*2HC1 omsættes analogt med eksempel le med 1,23 g Z-Ser-Tyr-(Bzl)-OH, 340 mg HOBt, 0,65 ml N-ethylmorpholin og 550 mg DCC i 5 ml dimethylformamid. Udbytte 2,8 g let forurenet Z-Ser-Tyr(Bzl)- 12 148905 -D-Glu(OBu^)-Leu-Arg-Pro-NH-C^H^, der hydrogeneres katalytisk analogt med eksempel lb i methanol. Råstoffet renses analogt med eksempel 2e ved fordelingschromatografi. Udbyttet er 1,108 g ckromatografisk ensartet produkt (47% henført til Z-D-Glu (OBu*") -Leu-Arg--Pro-NH-C2H5). [a]22 = -42,3° (c=l, i methanol).

c) l-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Glu(OBu^)-Leu-Arg-Pro-NH-C^H^-diacetat

Analogt med eksempel lf omsættes 500 mg ^-Glu-His-Trp-NH-NH2 med 920 mg (1 mmol) H-Ser-Tyr-D-GlufOBu^-Leu-Arg-Pro-NH-C^Hj^HCl og renses chromatografisk. Udbytte 491,5 mg chromatografisk rent materiale. Indholdet af peptidbasen er ifølge UV-spektret 74% (udbytte 30%).

[a]22 = -31,3° (c=l, dimethylacetamid) d) f-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Glu-Leu-Arg-Pro-NH-C2H5-diacetat (som sammenligningsstof) 190 mg ^-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Glu(OBu^)-Leu-Arg-Pro-NH-C2H^-diacetat omsættes og renses analogt med eksempel lg. Udbytte 148,9 mg. Ind-holdet af peptidbasen er ifølge UV-spektret 85%. [a]^ = -47,8° (c=l, i H20).

Eksempel 3 (fraqm_entkondensation 1-3 + 4-10) l-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(But)-Leu-Arg-Pro-cyclopropylamid a) Z-Pro-cyclopropylamid

Til en opløsning af 25 g (0,1 mol) Z-prolin, 13,5 g (0,1 mol) HOBt og 5,71 g (0,1 mol) cyclopropylamin i 200 mJL absolut tetrahydro-furan sættes ved 0°C 22 g DCC, opløst i 50 ml kold absolut tetrahydro-furan. Blandingen omrøres i 1 time ved 0°C og i 3 timer ved stuetemperatur. Bundfaldet fraskilles ved sugning, og filtratet koncentreres. Den olieagtige remanens opløses i eddikeester og udrystes efter hinanden med en mættet natriumhydrogencarbonatopløsning, 2N saltsyre, en mættet natriumhydrogencarbonatopløsning og vand, tørres over natriumsulfat og koncentreres. Remanensen udrives med pe-troleumsether og frasuges. Til rensning omkrystalliseres der fra eddikeester/petroleurasether. Udbyttet er 23 g (= 80%). Smp. 120-123°, 24 o [a)D = -45,5 (c=l, i methanol) 148905 13 b) H-Pro-cyclopropylamid»HCl

Analogt med eksempel lb hydrogeneres katalytisk 19 g Z-Pro--cyclopropylamid i methanol. Remanensen udrives med ether. Udbyttet er 11 g (88%) og smeltepunktet er 169-173°C.

c) Z-Arg(Z2)-Pro-cyclopropylamid

Til en opløsning af 28,85 g (50 mmol) Z-Arg(Z2)-OH, 9,5 g (50 mmol) H-Pro-cyclopropylamid, HC1 og 6,75 g (50 mmol) HOBt i 100 ml methylenchlorid og 25 ml dimethylformamid sættes 6,5 ml N-ethylmorpholin og ved 0°C en opløsning af 11 g DCC i lidt methylenchlorid. Blandingen henstilles i 1 time ved 0°C og natten over ved stuetemperatur. Bundfaldet fraskilles ved sugning, og filtratet koncentreres. Remanensen optages i eddikeester og vaskes med vand, en natriumhydrogencarbonatopløsning, IN saltsyre og en na-triumhydrogencarbonatopløsning, tørres med natriumsulfat og koncentreres. Remanensen krystallisere fra eddikeester/petroleums-ether. Råstoffet (26,3 g) renses chromatografisk med en 250 g kisel-gelsøjle i methylenchlorid/acetone 9:1 og 8:2. Udbyttet er 22 g (62%) , og smeltepunktet er 171°C. [a]j^ = -33,0° (c=l, i methanol) .

d) H-Arq-Pro-cyclopropylamid·2HC1 22 g (30,9 mmol) Z-Arg(Z2)-Pro-cyclopropylamid hydrogeneres katalytisk i methanol analogt med eksempel lb. Remanensen tørres i højvakuum. Der fås 11 g (89%) af et amorft stof.

e) Z-D-Ser (Bu*~) -Leu-Arg-Pro-cyclopropylamid

Til en opløsning af 3,83 g (10 mmol) H-Arg-Pro-cyclopropyl-amid· 2HC1 i 20 ml dimethylf ormamid sætttes ved 0°C 2,6 ml N-ethylmorpholin og 2,75 g Z-Leu-ONSu. Blandingen henstilles natten over ved stuetemperatur og koncentreres, og remanensen sammenrives en gang med eddikeester og en gang med ether. Opløsningsmidlet afdekanteres, og olien tørres i højvakuum. Remanensen opløses i methanol og hydrogeneres katalytisk analogt med eksempel lb. Remanensen sammenrives med ether og tørres i højvakuum. Der dannes 5,45 g amorf H-Leu-Arg-Pro-cyclopropylamid·2HC1, der er forurenet af salte (4,96 = 100% henført til H-Arg-Pro-cyclopropylamid.2HCl). Det samlede stof opløses sammen med 1,35 g HOBt, 2,6 ml N-ethylmorpholin og 4,8 g Z-D-Ser (Bu*") -OTcp i 20 ml dimethylf ormamid. Blandingen henstilles i 2 timer og koncentreres, og remanensen sammen- 1489Q5 14 rives to gange med en mættet natriumhydrogencarbonatopløsning, opløses i methylenchlorid, tørres over natriumsulfat og koncentreres, og remanensen sammenrives to gange med en mættet natriumhydrogen-carbonatopløsning, opløses i methylenchlorid, tørres over natriumsulfat, koncentreres og remanensen sammenrives med ether. Udbyttet er 4,55 g (65% henført til H-Arg-Pro-cyclopropylamid*2HCl). Stoffet er amorft og videreforarbejdes uden yderligere rensning.

4* £) H-Ser-Tyr-D-Ser(Bu )-Leu-Arg-Pro-cyclopropylamid·2HC1 3,5 g (5 mmol) Z-D-Ser(But)-Leu-Arg-Pro-cyclopropylamid hydrogeneres katalytisk i methanol analogt med eksempel lb. Remanensen sammenrives med ether og tørres i højvakuum. Udbyttet er 3 g (94%) af et amorft materiale.

De ovennævnte 3 g (4,7 mmol) H-D-Ser(But)-Leu-Arg-Pro-cyclo--propylamid*2HCl opløses sammen med 2,32 g (4,7 mmol) Z-Ser-Tyr(Bzl)--OH, 635 mg HOBt og 1,22 ml N-ethylmorpholin i 10 ml dimethylform-amid. Ved 0°C tilsættes 1,04 g DCC, og blandingen henstilles i 1 time ved 0°C og natten over véd stuetemperatur. Bundfaldet fraskilles den følgende dag ved sugning, og filtratet koncentreres. Remanensen udrives to gange med en mættet natriumhydrogencarbonatopløs-ning, opløses i methylenchlorid, og opløsningen tørres over natriumsulfat og koncentreres. Remanensen udrives med ether og frasuges.

Der fås 3,5 g (71%) Z-Ser-Tyr(Bzl)-D-Ser(Bu^)-Leu-Arg-Pro-cyclopropylamid, der hydrogeneres katalytisk analogt med eksempel lb. Remanensen udrives med ether og tørres i højvakuum. Udbyttet er 2,92 g (= 70% henført til Z-Ser-Tyr(Bzl)-OH). Det rå stof renses som beskrevet i eksempel lb chromatografisk med Sephadex LH 20. Udbyttet af et chromatografisk rent stof er 1,4 g.

[et]22 = -44,2° (c=l, i methanol).

g) l-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(But)-Leu-Arg-Pro-cyclopropylamid-diacetat Γ~ι

Analogt med eksempel If omsættes 500 mg LGlu-His-Trp-NH-NH9 med 890 mg H-Ser-Tyr-D-Ser(Bu )-Leu-Arg-Pro-cyclopropylamid*2HC1, oparbejdes og renses. Udbyttet er 420 mg chromatografisk rent stof. Indholdet af peptidbase er ifølge UV-spektret 77% (udbytte 32%).

[ct]2<^ = -40,8° (c=l, i dimethylacetamid).

15 148905

Eksempel 4 (fragmentkondensation 1-2 + 3-10) C^lu-His-Trp-Ser—Tyr-D-Ser (Bu*1) -Leu-Arg-Pro-NH-c2H5 332 mg Qlu -His-OH (10%'s molært overskud) opløses i 1 ml vand. Der tilsættes en opløsning af 1,06 g H-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(Bu*^)--Leu-Arg-Pro-NH-C2H|-·2 HC1, 320 mg HOBt og 0,13 ml N-ethylmorpholin 1 6 ml dimethylacetamid. Derpå tilsættes der ved 0°C 440 mg DCC og omrøres 1 time ved 0°C og natten over ved stuetemperatur.

Den næste dag tilsættes der yderligere DCC (110-220 mg), hvis heptapeptidet ikke skulle have reageret færdigt.

Når der ikke mere kan påvises heptapeptid, tilsættes der 0,33 ml 801's hydrazinhydrat, omrøres 2 timer ved stuetemperatur, bundfaldet fraskilles ved sugning, og filtratet fordeles mellem 30 ml n-butanol og 30 ml vandig NaHCO^-opløsning. Den organiske fase udrystes endnu en gang med 30 ml vand og inddampes, og remanensen udrives med ether. Udbytte af rå titelforbindelse: 1,33 g, [a]* = -27,0° (c = 1 i MeOH). Den videre rensning sker som beskrevet i eksempel 5b) nedenfor.

Eksempel 5 (trinvis opbygning) CGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(Bufc)-Leu-Arg-Pro-NH-C2H5 · 2 HOAc a) H-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(But)-Leu-Arg-Pro-NH-C2H5* 2HC1

Til en opløsning af 1,82 g (6 mmol) Z-His-hydrazid i 24 ml IN saltsyre sættes ved 0°C 414 mg (6 mmol) NaN02 opløst i lidt vand. Efter 5 minutter ved 0°C tilsættes der 40 ml koldt ethylacetat og indstilles med kold mættet natriumcarbonatopløs-ning til en pH-værdi på 9. Ethylacetatfasen fraskilles, den vandige fase ekstraheres endnu en gang med ethylacetat, og de forenede ethylacetatfaser inddampes efter tørring over natriumsulfat til ca. 2 ml. Dertil sættes en opløsning af 2,128 g (2 mmol) H-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(But)-Leu-Arg-Pro-NH-C2Hg*2HCl i ca. 6 ml dimethylformamid og 0,78 ml (6 mmol) N-ethylmorpholin.

Den næste dag tilsættes der 40 ml vand og 40 ml n-butanol. n-Butanolfasen udrystes med mættet natriumhydrogencarbonatopløsning og vand og inddampes. For at få over-acyleringer (f.eks. ved hy-droxygruppen i tyrosin) til at gå tilbage opløses remanensen i 20 ml methanol, og der tilsættes 1 ml 80%'s hydrazinhydrat. Efter 2 timers henstand ved stuetemperatur inddampes der, og remanensen 16 148905 fordeles mellem n-butanol og vand. n-Butanolfasen udrystes én gang med vand og inddampes. Remanensen udrives med ether.

Der fås et udbytte på 2,2 g af et amorft stof. Til rensning chromatograferes der på " Sephadej^ LH 20" i et system af iseddike, n-butånol og vand. Der fås herved et udbytte på 600 mg stof.

Dette stof opløses i methanol og hydrogeneres under tilsætning af 2N methanolisk saltopløsning katalytisk (Pd/BaSO^-katalysator) ved en pH-værdi på 4,5. Efter endt hydrogenering fraskilles katalysatoren ved sugning, filtratet inddampes, og remanensen renses igen ved chroma: tograf i på "SephadeiP^ LH 20" i iseddike/n-butanol/-vand-systemet.

Udbytte 560 mg, [a]^ = -44,3 (c = 1, methanol). Amino- syreanalyse efter hydrolyse i 6N HC1 (24 timer ved 120°C):

Ser (1,9), Leu (0,97), Tyr (1,03), His (1,04), Arg (1,00).

b) CGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(But)-Leu-Arg-Pro-NH-C2H5*2HOAc

Til en opløsning af 2,4 g H-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(Bu^)--Leu-Arg-Pro-NH-C2Hg*2HCl og 270 mg 1-hydroxybenzotriazol i 5 ml dimethylformamid sættes 0,5 ml N-ethylmorpholin og 620 mg ί-Glu-OTcp. Der henstilles 1 dag ved stuetemperatur, tilsættes 0,4 ml hydrazinhydrat, omrøres 2 timer ved stuetemperatur og fordeles mellem 40 ml n-butanol og 40 ml vandig natriumhydrogen-carbonatopløsning. n-Butanolfasen inddampes og udrives med ether.

Der fås et udbytte af rå forbindelse på 2,5 g.

Substansen opløses i fortyndet eddikesyre og chromatograferes på en stærkt basisk ionbytter, der foreligger på acetatform. Eluatet inddampes og chromatograferes til yderligere rensning på "SephadejP^ LH 20" i et iseddike/n-butanol/vand-system.

Udbytte 640 mg. [a]p^ = -49° (c = 1 i vand for den tørre substans).

17 148905

Eksempel 6 (fragmentkondensation 1-4 + 6-10) l-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser (Bu1") -Leu-Arg-Pro-NHH^H,. * 2HOAc 703 mg (1 mmol) Rilu-His-Trp-Ser-Tyr-OH og 628 mg (1 mmol) H-D-Ser(But)-Leu-Arg-Pro-NH-C2H5*2HCl opløses sammen med 163 mg 3-hydroxy-4-oxo-3,4-dihydro-l,2,3-benzotriazin i 5 ml dimethyl-acetamid. Dertil sættes under omrøring 0,13 ml N-ethylmorpholin og ved 0°C 220 mg dicyclohexylcarbodiimid. Der omrøres ca. to timer ved 0°C og en dag ved stuetemperatur, bundfaldet fraskilles ved sugning, og filtratet inddampes. Remanensen fordeles mellem n-butanol og halvmættet natriumhydrogencarbonatopløsning. n-Butanolfasen udrystes yderligere 2 gange med halvkoncentreret vandig natriumhydrogencarbona topløsning og inddampes. Remanensen opløses i 20 ml 2N eddikesyre. Det uopløselige materiale frafiltreres, og filtratet udrøres med en svagt basisk ionbytter (på acetatform). Ionbytteren frafiltreres og eftervaskes godt med vand. Filtratet frysetørres og renses derefter chromatografisk på sædvanlig måde. Udbytte 540 mg.

[a]D = -45,5° (c = 0,5, methanol).