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Verfahren zur Herstellung neuer adrenocorticotrop wirksamer Peptide
Es wurde bereits vorgeschlagen (vgl. die deutsche Patentanmeldung F 39 959 IVb/12
q, deutsche Auslegeschrift 1220 433), Eikosa- bis Tetrakosapeptide mit ACTH-Aktivität
durch Überführung von Dekapeptiden in ihre p-Nitrophenylester und anschließende
Kondensation der Nitrophenylester mit Dekabis Tetradekapeptiden herzustellen. Die
Kondensation der Dekapeptide mit Deka- bis Tetradekapeptiden kann auch in einem
Schritt, ohne Isolierung des entsprechenden p-NTitrophenylesters, in Gegenwart von
mindestens 1 Äquivalent p-Nitrophenol mittels Dicyclohexyl-carbodiimid vorgenommen
werden (deutsche Patentanmeldung F 48417 IVb/12 y, deutsche Auslegeschrift 1240
088).
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In weiterer Ausgestaltung dieses neuen Kondensationsverfahrens wurde
gefunden, daß man mit dieser Methode besonders vorteilhaft auch solche Peptide herstellen
kann, die eine gegenüber dem natürlichen Corticotropin (ACTH) veränderte Aminosäuresequenz
besitzen.
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Es ist bekannt, daß man die Aminosäuresequenz des natürlichen Corticotropins
(ACTH) auf die ersten zwanzig Aminosäuren - vom Aminoende her gezählt - verkürzen
kann, ohne daß damit eine wesentliche Einbuße an biologischer Aktivität verbunden
ist. So besitzt z. B. das ßl-211_Corticotropin-valin-20-amid der Formel
| H-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Try-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-Val-I%7H2 |
| 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 |
nach H o f m a n n (J. Amer. Chem. Soc., 84, 4481 [1962]) noch eine Aktivität von
mehr als 100 1. E./mg.
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Bei weiterem Verkürzen der Peptidkette vom Carboxylende her sinkt
jedoch die biologische Aktivität rasch ab, so daß ein Corticotropin mit der Aminosäuresequenz
1 bis 20 des natürlichen ACTH nach dem Stand der Technik als das kleinste noch voll
wirksame Peptid angesehen werden muß.
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Es wurde nun gefunden, daß Peptide der allgemeinen Formel I
| H-Ser-Y-Met-Glu-His-Phe-Arg-Try-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-X-R |
| 1 2,3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 |
in der R die Hydroxy- oder die Aminogruppe, Y einen der Reste -Phe-Ser- oder -Tyr-Ala-
und X die Reste
| -Val- (I a) |
| -Val-Lvs- (1b) |
| -Val-Lys-Val- (I c) |
| -Val-Lys-Val-Tyr- (1d) |
| oder |
| -Val-Lys-Val-Tyr-Pro- (I e) |
bedeutet, die somit eine bestimmte, gegenüber dem Corticotropin am Aminoende veränderte
Aminosäuresequenz besitzen, überraschenderweise mit einer corticotropen Wirksamkeit
von 70 bis 90 1. E./mg (2. internationaler Standard) hoch aktiv sind. Ihre hohe
Aktivität ist deshalb überraschend, weil aus vielen Versuchen, z. B. aus dem Abbau
mit Aminopeptidbase (W. F. W h i t e, J. Amer. Chem. Soc., 77, 4691 [1955]), der
enge Zusammenhang zwischen den aminoendständigen Hydroxy-aminsäuren und der adrenocorticotropen
Aktivität gesichert schien. Man erhält diese veränderten Peptide, indem man das
Dekapeptid der allgemeinen Formel II
| OB H2c |
| BOC-Ser-Y-Met-Glu-His-Phe-Arg-Try-Gly-O° |
| il |
in der BOC den tert. Butyloxycarbonyl- und B den tert. Butylrest
bedeutet, mit einem Peptid der allgemeinen Formel III
in der R' den tert.Butyloxyrest oder die Aminogruppe, X' die Reste
und A = das Anion einer starken Säure mit Ausnahme einer Carbonsäure bedeutet, mittels
Dicyclohexylcarbodiimid in Gegenwart von 4-Nitrophenol zu einem Peptid der allgemeinen
Formel IV
kondensiert und die Schutzgruppen anschließend in an sich bekannter Weise abspaltet.
Zur Synthese des neuen Dekapeptids der Formel II, worin Y -Phe-Ser- bedeutet, stellt
man zunächst aus H-Phe-Ser-OCH3 und BOC-Ser-N3 das Tripeptid BOC-Ser-Phe-Ser-OCH3
her, das nach Überführen ins Hydrazid und Azid mit H-Met-OCH3 zum Tetrapeptid BOC-Ser-Phe-Ser-Met-OCH3
umgesetzt wird. Dieses wird, wiederum nach Überführen ins Hydrazid und Azid, mit
dem Hexapeptid H-Glu(OB)-His-Phe-Arg-Try-Gly-OH analog Chem. Ber., 96, 1080 (1963),
zur Reaktion gebracht.
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Zur Synthese des neuen Dekapeptids der Formel II, worin Y -Tyr-Ala-
bedeutet, stellt man zunächst aus H-Tyr-Ala-OCH3 und BOC-Ser-N3 das Tripeptid BOC-Ser-Tyr-Ala-OCH3
her, das nach Überführen ins Hydrazid und Azid mit H-Met-OCH3 zum Tetrapeptid BOC-Ser-Tyr-Ala-Met-OCH3umgesetzt
wird. Dieses wird, wiederum nach Überführen ins Hydrazid und Azid, mit dem Hexapeptid
H-Glu(OB)-His-Phe-Arg-Try-Gly-OH analog Chem. Ber., 96, 1080 (1963), zur Reaktion
gebracht.
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Die Peptide IIIa bis IIIe sind aus Chem. Ber., Bd. 96, S. 609 ff.
(1963), und Bd. 97, S. 1197 und 1204 f (1964), bekannt.
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Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren werden die Peptide der Formeln
1I und IIIa bis IIIe in Anwesenheit von mindestens einem Äquivalent Dicyclohexylcarbodiimid
in Lösungsmitteln bei Temperaturen von 0 bis 40'C, vorzugsweise Raumtemperatur,
miteinander umgesetzt, wobei die Peptide der Formeln III a bis III e als Salze starker
Säuren, wie Salzsäure, Benzolsulfosäure, Toluolsulfosäure, Naphthalinsulfosäure,
vorliegen müssen. A° kann auch das Anion von Disulfonsäureimiden, wie z. B. des
Ditosylimids, bedeuten. Als Lösungsmittel kommen vorzugsweise in Frage: heterocyclische
tertiäre organische Basen, wie z. B. Pyridin, oder niedere aliphatische Carbonsäureamide,
wie z. B. Dimethylformamid, oder Gemische dieser Lösungsmittel. Die Reaktionsdauer
beträgt im allgemeinen mehrere Tage, sie ist abhängig von der Reaktionstemperatur.
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Im Reaktionsmedium wird zuerst der Nitrophenylester des Dekapeptides
1I gebildet, der sich dann mit den Verbindungen der Formel Ma bis IIIe zu den gewünschten
Reaktionsprodukten IVa bis IVe umsetzt. Die Anwendung eines Überschusses an Dicyclohexylcarbodiimid
ist besonders vorteilhaft, wodurch die durch stets vorhandenes, praktisch nicht
völlig zu entfernendes Wasser verseiften Nitrophenylester von Il regeneriert und
erneut der Kondensation mit den Verbindungen der Formeln III a bis IIl e zugeführt
werden. Das rohe Reaktionsprodukt enthält nur noch wenig Ausgangsprodukte, wodurch
die Reinigung der Verfahrensprodukte erleichtert wird.
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Nach beendeter Kondensation werden die Schutzgruppen in an sich bekannter
Weise abgespalten. Vorteilhaft erfolgt die Abspaltung durch einstündiges Stehen
in Trifluoressigsäure. Die so gebildeten Verfahrensprodukte der allgemeinen Formeln
Ia bis Ie können anschließend in an sich bekannter Weise, z. B. durch Chromatographie
an Carboxymethylcellulose (J. Am. Chem. Soc., 84 [l962], S.4475) gereinigt werden.
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Das erfindungsgemäße Verfahren als einstufiges Kondensationsverfahren
zur Herstellung der Peptide der Formel IV ist besonders vorteilhaft, da es in einfachster
Weise durchführbar ist. Die Kondensation der Peptidbausteine über den intermediär
gebildeten Nitrophenylester verläuft mit vorzüglichen Ausbeuten. Im Gegensatz zur
bisher bekannten Verwendung von Dicyclohexylcarbodiimid als Kondensationsmittel
allein werden praktisch keine Nebenprodukte erhalten.
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Darüber hinaus bietet die Herstellung der Verfahrensprodukte nach
dem erfindungsgemäßen Verfahren gegenüber der Herstellung der in 2- und
3-Stellung
nicht veränderten Peptidkette präparativ große Vorteile. Das zur Synthese des Dekapeptids
1I, in dem Y den Baustein -Tyr-Ala- bedeutet, benötigte Tetrapeptid der Sequenz
-Ser-Tyr-Ala-Met- enthält im Gegensatz zu der natürlichen Sequenz -Ser-Tyr-Ser-Met-
1 Serin weniger. Dieses Tetrapeptid wird nach der Azidmethode nach dem Schema 3
-- 1 dargestellt; durch das Fehlen des Serin in Position 3, das außerdem eine der
wertvollsten Aminosäuren darstellt, wird die Bildung von Nebenprodukten durch Oxazolidon-Ringschluß
vermieden. Für den Fall, daß Y den Baustein -Phe-Ser- bedeutet, ist die Herstellung
der Peptide nach dem erfindungsgemäßen Verfahren ebenfalls mit Vorteilen verbunden;
durch die geringere Zahl der OH-Gruppen in den Teilstücken (Tetrapeptid, Dekapeptid
Il) ist auch hier die Bildung von Nebenprodukten - diesmal infolge O-Acylierung
- vermindert.
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Die Verfahrensprodukte besitzen eine hohe corticotrope Wirksamkeit,
sie liegt etwa bei 70 bis 90 1. E./mg bei intravenöser Applikation nach dem 2. internationalen
Standard. Sie können daher als wertvolle Therapeutika, z. B. bei Hypophysenstörungen,
allgemein allergischen Reaktionen oder Erkrankungen des hämatopoetischen Systems,
verwendet werden. Beispiel 1 a) bis d) Herstellung des Ausgangspeptids 1I (Y = Phe-Ser)
a) H-Phe-Ser-OCH3 (Z = Carbobenzoxy) 40 g Z-Phe-Ser-OCH3 (Helv. Chim. Acta, 43,
1349 [1960]) werden in 800 ccm 0,6 normaler methanolischer HCl in Anwesenheit von
Palladiumschwarz unter Durchleiten von Wasserstoff hydriert. Man filtriert vom Katalysator
ab, engt im Vakuum auf ein kleines Volumen ein und fällt H-Phe-Ser-OCH3 - HCl durch
Zugabe von Äther aus. Ausbeute 27,9 g (92 °/o der Theorie). Schmp. 189 bis 190°C.
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Zur Herstellung des freien Esters wird das Hydrochlorid in 120 ccm
Chloroform suspendiert. Man tropft unter Rühren bei O' C 20 ccm 5n-NH3 in
Methanol zu, rührt noch 10 Minuten bei 0°C, gibt nochmals 60 ccm Chloroform zu und
filtriert über eine Klärschicht. Das Filtrat wird im Vakuum bei 20°C eingedampft.
Der Rückstand kristallisiert und wird im Vakuum über P205 getrocknet. Ausbeute 20,8
g (85°/o der Theorie, bezogen auf Hydrochlorid). b) BOC-Ser-Phe-Ser-N,H3 26,6 g
H-Phe-Ser-OCH3 werden in 400 ccm Tetrahydrofuran gelöst. Man fügt die Lösung von
BOC-Ser-N3, hergestellt aus 22 g BOC-Ser-N,H3 (Helv. Chim. Acta, 44, 169 [1961]),
in 300 ccm Essigester zu und läßt 2 Tage bei -#-4'C stehen. Zur Aufarbeitung dampft
man im Vakuum auf ein kleines Volumen ein, löst den Rückstand in Essigester und
wäscht nacheinander mit eiskalter ln-Zitronensäure, 1n-Bicarbonat und Wasser. Alle
diese Lösungen enthalten 15 °/, NaCl. Ein Teil des Reaktionsprodukts fällt schon
beim Ausschütteln aus, wird abgesaugt und mit der Substanz, die nach Abdestillieren
des Essigesters und Verreiben des Rückstandes mit Äther erhalten wird, vereinigt.
Ausbeute 29,0 g (64 °/o der Theorie) Methylester. Zur Überführung in das Hydrazid
wird der Ester in 240 ccm Methanol gelöst. Man gibt 13 ccm 80 °/oiges Hydrazinhydrat
zu, saugt nach 20 Stunden Stehen den Niederschlag ab, wäscht mit Methanol und trocknet
über HzS04 im Vakuum. Umkristallisieren aus Wasser. Ausbeute 24,6 g (85 °/o der
Theorie, bezogen auf Ester). Schmp. 207°C (Zersetzung); [x]D = -30° (c = 2 in 50
°/oiger Essigsäure).
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c) BOC-Ser-Phe-Ser-Met-N2H.-H20 4,53 g BOC-Ser-Phe-Ser-NZH3 werden
in 20 ccm ln-HCI, die 100/, NaCI enthält, bei -10'C gelöst und mit 40 ccm
Essigester überschichtet. Man tropft unter Rühren bei -10°C die Lösung von
0,72g
NaN02 in 3 ccm Wasser zu und rührt noch 5 Minuten bei -10°C. Dann trennt
man die Essigesterphase ab, extrahiert die wäßrige Schicht nochmals mit 40 ccm Essigester
und wäscht die vereinigten Essigesterlösungen rasch mit eiskaltem ln-Bicarbonat
und gesättigter Kochsalzlösung, trocknet über Natriumsulfat, gibt 3,2 g Met-OCH3
zu und bewahrt 2 Tage bei @-4'C auf. Nach Eindampfen der Lösung im Vakuum und Aufnehmen
des Rückstandes in Essigester wäscht man bei 0°C nacheinander mit 2n-Zitronensäure,
1n-Bicarbonat und Wasser. Alle diese Lösungsmittel enthalten 15 °/o NaCl. Dann wird
die Essigesterlösung über Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum eingedampft. Der
Rückstand wird mit den Niederschlägen vereinigt, die schon während des Ausschüttelns
ausgefallen waren. Ausbeute 3,4 g (58 °/o der Theorie) Methylester.
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Zur Überführung in das Hydrazid löst man den Ester in 25 ccm Methanol,
gibt 1,2 ccm 80 °/oiges Hydrazinhydrat zu, filtriert nach Stehen über Nacht den
Niederschlag ab und wäscht mit Methanol. Trocknen über H2S04 im Vakuum und Umkristallisieren
aus 50 °/oigem Äthanol. Ausbeute 2,76 g (79 °/o der Theorie, bezogen auf Ester).
Schmp. 214 bis 216°C (Zersetzung); [x]D = -25,9° (c = 1 in 90°/oiger Essigsäure).
Aus 3,81 g BOC-Ser-Phe-Ser-Met-N211,H20 wird analog Chem. Ber., 96, 1080
(1963), das Azid bereitet und wie dort mit der Lösung von 4,5 g H-Glu(OB)-His-Phe-Arg-Try-Gly-OH,
CH,COOH, 2H20 und 0,75 ccm Triäthylamin in 90 ccm Dimethylformamid vereinigt. Nach
20 Stunden Stehen bei +4'C wird das Reaktionsprodukt mit Essigester ausgefällt.
Zur Reinigung wird mit 55 ccm 80 °/oigem Methanol ausgekocht, nach Abkühlen auf
Raumtemperatur abgesaugt und mit 80°/oigem Methanol und Äther gewaschen. Ausbeute
4,85 g (710/, der Theorie); [x]D = -20,4° (c = 1 in 90°/oiger Essigsäure).
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b) Kondensation von 11(Y = Phe-Ser-) mit III d-NH2 (Verfahren der
Erfindung) BOC-Tricosapeptid-amid IVd (R' = NHz, Y = Phe-Ser) 1,48 g (1 mMol) BOC-Dekapeptid-dihydrat
V (Y = Phe-Ser) werden zusammen mit 2,2 g (1 mMol) VM-NHz (als Trihydrochlorid-hexahydrat)
Stunden bei 60°C im Hochvakuum getrocknet. Dann gibt man 25 ccm absolutes Pyridin
zu. Nach
1stündigem Rühren ist nur noch wenig ungelöstes Material
vorhanden. Nun werden 280 mg (2 mMol) p-Nitrophenol und 830 mg (4 mMol) Dicyclohexylcarbodiimid
eingetragen. Nach 4 Tagen Rühren bei Raumtemperatur werden durch Versetzen mit 300
ccm Essigester-Äther (1 : 1) 3,5 g rohes VIId-NH2 ausgefällt. Man digeriert zur
Entfernung leichtlöslicher Begleitstoffe gründlich mit 60 ccm 0,5m-Ammonacetatpuffer,
pH 3,8, saugt ab und trocknet bei 40°C im Hochvakuum. Ausbeute 2,79 g.
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Beispiel 2 a bis e) Herstellung des Ausgangspeptids Il (Y = Tyr-Ala)
a) Z-Tyr-Ala-OCH3 (Z = Carbobenzoxy) 31,5 g Z-Tyr-OH, 14,2 g H-Ala-OCH3 - HCl und
14,0 ccm Triäthylamin werden in 450 ccm Acetonitril und 50 ccm Dimethylformamid
bei 0°C mit der Lösung von 22 g Dicyclohexyl-carbodiimid in 50 ccm Acetonitril versetzt.
Nach 15 Stunden Stehen bei Raumtemperatur saugt man vom Dicyclohexyl-harnstoff ab
(20 g) und destilliert die Lösungsmittel im Vakuum ab. Der Rückstand erstarrt beim
Verreiben mit Äther. Man nimmt ihn in 700 ccm Essigester auf, wäscht mit ln-HCI,
In-Bicarbonat und Wasser, trocknet über Natriumsulfat und dampft das Filtrat ein.
Der Rückstand wird aus Essigester-Petroläther umkristallisiert. Ausbeute 28,8 g
(72°/o der Theorie); Schmp. 135 bis 136°C; [x]D = -18,5' (c = 1 in Methanol).
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b) H-Tyr-Ala-OCH3 40 g Z Tyr-Ala-OCH3 werden in 800 ccm 0,6normaler
methanolischer HCl in Anwesenheit von Palladiumschwarz unter Durchleiten von Wasserstoff
hydriert. Man filtriert vom Katalysator ab, engt im Vakuum auf ein kleines Volumen
ein und fällt H-Tyr-Ala-OCH3 - HCl durch Zugabe von Äther aus. Ausbeute 28,6 g (94,5
°/a der Theorie).
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Zur Herstellung des freien Esters wird das Hydrochlorid in 120 ccm
Chloroform suspendiert. Man tropft unter Rühren bei O' C 20 ccm 5normales
methanolisches Ammoniak zu, rührt noch 10 Minuten bei 0° C, gibt nochmals 60 ccm
Chloroform zu und filtriert über eine Klärschicht. Das Filtrat wird im Vakuum bei
20°C eingedampft. Der Rückstand wird im Vakuum über P205 getrocknet. Ausbeute 22,3
g (89 °/o der Theorie, bezogen auf Hydrochlorid).
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c) BOC-Ser-Tyr-Ala-N2H3 26,6 g H Tyr-Ala-OCH3 werden in 400 ccm Tetrahydrofuran
gelöst. Man fügt die Lösung von BOC-Ser-N3, hergestellt aus 22g BOC-Ser-N,H3 (Helv.
Chim. Acta, 44,169[1961]), in 300 ccm Essigester zu und läft 2 Tage im Kühlschrank
stehen. Zur Aufarbeitung dampft man im Vakuum auf ein kleines Volumen ein, löst
den Rückstand in Essigester und wäscht nacheinander mit eiskalter ln-Zitronensäure,
ln-Bicarbonat und Wasser. Alle diese Lösungen enthalten 15 % NaCl. Ein Teil
des Reaktionsprodukts fällt schon beim Ausschütteln aus, wird abgesaugt und mit
der Substanz, die nach Abdestillieren des Essigesters und Verreiben des Rückstandes
mit Äther erhalten wird, vereinigt. Ausbeute 29,5 g (65,5 °/o der Theorie) Methylester.
Zur Überführung in das Hydrazid wird der Ester in 240 ccm Methanol gelöst. Man gibt
13,2 ccm 80 °/oiges Hydrazinhydrat zu, saugt nach 20 Stunden den Niederschlag ab,
wäscht mit Methanol und trocknet über H2S04 im Vakuum. Umkristallisieren aus Wasser
ergibt 26,0 g Hydrazid (86 °/o der Theorie, bezogen auf Ester) vom Schmp.
186 bis 187°C; [x]D = -38,5° (c = 2 in 50°/oiger Essigsäure).
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d) BOC-Ser-Tyr-Ala-Met-N,H3 - H20 4,53 g BOC-Ser-Tyr-Ala-N,H3 werden
in 20 ccm ln-HCI, die 100/, NaC1 enthält, bei -10°C gelöst und mit 40 ccm
Essigester überschichtet. Man tropft unter Rühren bei -10°C die Lösung von 0,72
g NaN02 in 3 ccm Wasser zu und rührt noch 5 Minuten bei -10°C. Dann trennt man die
Essigesterphase ab, extrahiert die wäßrige Schicht nochmals mit 40 ccm Essigester,
wäscht die vereinigten Essigesterlösungen rasch mit eiskaltem In-Bicarbonat und
gesättigter Kochsalzlösung, trocknet über Natriumsulfat, gibt 3,2 g Met-OCH3 zu
und bewahrt 2 Tage bei +4°C auf. Nach Eindampfen der Lösung im Vakuum und Aufnehmen
des Rückstandes in Essigester wäscht man bei 0°C nacheinander mit 2n-Zitronensäure,
ln-Bicarbonat und Wasser. Alle diese Lösungen enthalten 15 °/o NaCl. Dann wird die
Essigesterlösung über Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum eingedampft. Der Rückstand
wird mit Niederschlägen vereinigt, die schon während des Ausschüttelns ausgefallen
sind. Ausbeute 3,74 g (64 °/a der Theorie) Methylester.
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Zur Überführung in das Hydrazid löst man den Ester in 25 ccm Methanol,
gibt 1,2 ccm 80 °/jges Hydrazinhydrat zu, filtriert nach 20 Stunden den Niederschlag
ab und wäscht ihn mit Methanol. Trocknen über H.S04 im Vakuum und Umkristallisieren
aus 50 °/jgem Äthanol ergibt 3,12 g Hydrazid (810/, der Theorie, bezogen auf Ester);
[oc]D = -32,0° (c = 1 in 80 °/oiger Essigsäure).
Aus 3,81 g BOC-Ser-Tyr-Ala-Met-N,H3 - H20 wird analog Chem. Ber., 96, 1080 (1963),
und Beispiel 1 das Azid bereitet und wie dort mit der Lösung von 4,5 g H-Glu(OB)-His-Phe-Arg-Try-Gly-OH,
CH,COOH, H20 und 0,75 ccm Triäthylamin in 90 ccm Dimethylformamid vereinigt. Nach
20 Stunden Stehen bei +4°C wird das Reaktionsprodukt mit Essigester ausgefällt.
Zur Reinigung wird mit 55 ccm 80 °/jgem Methanol ausgekocht und nach Abkühlen auf
Raumtemperatur abgesaugt und mit 80 °/jgem Methanol und Äther gewaschen. Ausbeute
4,9 g (72°/o der Theorie); [a]D = -16,4° (c = 1 in 90°/jger Essigsäure).
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f) Kondensation von II (Y = Tyr-Ala) mit IIId-NH$ (Verfahren der Erfindung)
BOC-Tricosapeptid-amid IVd (R' = NH2, Y = Tyr-Ala) Aus 1,48 g BOC-Dekapeptid-dihydrat
V (Y = Tyr-Ala) und 2,2 g VW-NHz werden analog Beispiel 1 2,82 g BOC-Tricosapeptid-amid
erhalten.
Beispiel 3 (Verfahren der Erfindung) Man setzt 1,48 g
II (Y = Phe-Ser- oder Tyr-Ala) analog Beispiel 1 mit
| 1,7g IIIa-OB - 3HCl - 3H20 |
| oder |
| 1,75 g III a-NH2 - 3 HCl - 6 H20 |
| oder |
| 1,9 g IIIb-NH2 - 2HC1- 4H20 |
| oder |
| 2,04 g III c-OB - 3 HCl - 3H20 |
| oder |
| 2,3g IIIe-OB - 3HCl - 4H20 |
| oder |
| 2,26 g III e-NH2 - 3 HCl - 4 H20 |
nach den dort genannten Bedingungen um und erhält entsprechende Mengen der Rohprodukte
der Formeln IVa bis IVe.
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Beispiel 4 Abspaltung der Schutzgruppen (Verfahren der Erfindung)
Von den nach den Beispielen 1 bis 3 hergestellten Peptiden der allgemeinen Formeln
IVa bis IVe wird 1 g in 5 ccm Trifluoressigsäure gelöst. Nach 1stündigem Stehen
bei Raumtemperatur versetzt man mit 100 ccm peroxydfreiem Äther, saugt vom flockig
ausgefallenen freien Peptid-trifluoracetat ab und wäscht es mit Äther. Nach dem
Trocknen erhält man 940 bis 980 mg der Verbindungen I a bis I e als Trifluoracetate.
Zur Überführung in die Acetate filtriert man durch eine kleine Säule des schwach
basischen Ionenaustauschers Amberlite IR-45 in der Acetatform und lyophilisiert
das Filtrat. Ausbeute 750 bis 790 mg. Beispiel s Reinigung der rohen Peptide der
Formeln I a bis I e durch Chromatographie an Carboxymethylcellulose 20 g Carboxymethylcellulose
werden mit 200 ccm 0,1n-HCl in eine Säule 3,2 - 11 cm eingeschlämmt. Man wäscht
mit Wasser chlorfrei, belädt mit der Lösung von 760 mg I a bis I e in 20 ccm Wasser
und eluiert bei einer Durchfiußgeschwindigkeit von 4 ccm/Min. nacheinander mit 0,41
0,10m-Ammonacetatpuffer, pH 6,0, 0,41 0,20m-Ammonacetatpuffer, pH 6,5, 0,41 0,25m-Ammonacetatpuffer,
pH 7,0, 0,41 0,28m-Ammonacetatpuffer, pH 8,0, 0,410,30m-Ammonacetatpuffer, pH 9,0,
0,810,30m-Ammonacetatpuffer, pH 9,2.
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Die Elution kann auch mit kontinuierlicher Erhöhung der Pufferkonzentration
und des pH-Wertes vorgenommen werden. Man nimmt Fraktionen zu 40 ccm ab und stellt
diese mit Eisessig sofort auf pH 5 ein. Die reinen Verbindungen der Formeln Ia bis
Ie erscheinen bei pH 8 bis 9. Man erhält z. B. aus 760 mg rohem Id-I\TH2 (Y = Phe-Ser)
340 mg der reinen Verbindung.