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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung biologisch wirksamer Tri- und Tetrapeptidalkylamide der allgemeinen Formel
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in der R1 einen Alkylrest mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen, A einen peptidisch gebundenen Alanin- oder Prolinrest, B einen peptidisch gebundenen Glycin-, Alanin- oder Prolinrest, n 1 oder 2 und R eine Alkylcarbonylaminogruppe mit 2 bis 12 Kohlenstoffatomen, einen Alkenylrest mit 6 bis 12 Kohlenstoffatomen oder eine Benzyloxycarbonylaminogruppe bedeutet.
Dieses Verfahren besteht darin, dass man eine Verbindung der allgemeinen Formel H-B-Ala-A-NH-R (II),
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stoffatomen oder einen Aralkylrest mit 7 Kohlenstoffatomen bedeutet, umsetzt, wonach man vom gebildeten Zwischenprodukt der allgemeinen Formel
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Die DE-OS 3229632 beschreibt gewisse Carboxyalkanoylpeptid-alkylamide, die bemerkenswerte elastaseinhibierende Eigenschaften zeigen und physiologisch einwandfrei verträglich sind. Bei eingehenden Untersuchungen wurde eine bedeutsame Rolle der elektrostatischen Wechselwirkung dieser Stoffe mit einem Elastasemolekül festgestellt. Sowohl in den Elastaseinhibitoren wie auch bei den entsprechenden Substraten findet die erwähnte elektrostatische Wechselwirkung im N-terminalen Teil des Moleküls statt (Eur. J. Biochem. 69, 1 [1976], FEBS Lett. 40,353 [1974]. Die wechselwirkenden Strukturelemente sind dabei jeweils die Dicarbonsäurereste, z. B. die Rest von Bernsteinoder Glutarsäure.
Es wurde nun völlig unerwartet festgestellt, dass durch den Einbau eines Asparaginsäure- oder Glutaminsäureesters in dem N-terminalen Teil der Peptidkette des Inhibitors ähnliche Voraussetzungen für die erwähnte elektrostatische Wechselwirkung zustande kommen wie
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gruppe infolge teilweiser intramolekularer Neutralisation konnte dabei durch geeignete N-Acylsubstitution beinahe völlig beseitigt werden. Dabei wurde überraschenderweise festgestellt, dass der der Carboxylgruppe benachbarte hydrophobe Acylrest im N-terminalen Teil des Inhibitormoleküls die elastaseinhibierende Wirksamkeit von solchen anionischen Inhibitoren stark steigert.
Ferner ist diese Steigerung der Inhibitionskante (Ki) durch die N-Acylierung keineswegs auf die entsprechenden Acylasparaginsäure- und -glutaminsäurederivate beschränkt, eine ähnliche Aus-
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wirkung konnte nämlich überraschenderweise ebenso bei Alkenylderivaten von Bernstein- und Glutarsäure ermittelt werden.
Die erfindungsgemäss hergestellten neuen anionischen Elastaseinhibitoren mit eingebauten N-acylierten Asparaginsäure- oder Glutaminsäureresten oder mit alkenylsubstituierten Bernsteinoder Glutarsäureresten im N-terminalen Teil des Inhibitormoleküls modellieren bestimmte Strukturelemente des Elastins, also des natürlichen Elastasesubstrats, das bekanntlich einen erhöhten Gehalt an sauren und hydrophoben Aminosäuren aufweist. Die erfindungsgemäss hergestellten Verbindungen zeigten in vitro starke Inhibitionswirksamkeit gegenüber pankreatischer und leukocytärer Elastase ; die entsprechenden Testergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle I zusammenstellt.
Tabelle I
Inhibitionskonstante (Ki) von elastolytischen Inhibitoren
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<tb>
<tb> PE <SEP> LE <SEP>
<tb> Inhibitor <SEP> Ki <SEP> (mMol)
<tb> Glt- <SEP> (Ala) <SEP> -NAn <SEP> Glt- <SEP> (Ala) <SEP> -Val-NAn
<tb> Suc- <SEP> (Ala) <SEP> -NAn
<tb> Ac-Asp-Ala-Ala-Pro-NH-iBu <SEP> 0, <SEP> 12 <SEP> 0, <SEP> 191 <SEP>
<tb> 0, <SEP> 19 <SEP>
<tb> Ac-Asp-Pro-Ala-Ala-NH-Et <SEP> 0, <SEP> 034 <SEP> 1, <SEP> 0 <SEP>
<tb> 0,025
<tb> Btr-Glu-Ala-Ala-Pro-NH-Pr <SEP> 0, <SEP> 193 <SEP> 0, <SEP> 18 <SEP>
<tb> 0,178
<tb> Btr-Asp-Ala-Ala-Pro-NH-iBu <SEP> 0, <SEP> 12 <SEP> 0, <SEP> 136
<tb> 0,12
<tb> Dde-Ala-Ala-Ala-NH-Et <SEP> 0, <SEP> 0018 <SEP> keine <SEP> Inhibition
<tb> 0, <SEP> 0025 <SEP>
<tb> Dde-Ala-Ala-Ala-NH-iBu <SEP> 0, <SEP> 093 <SEP> 0, <SEP> 515 <SEP>
<tb> 0,099
<tb> Dde-Ala-Ala-Pro-NH-Pr <SEP> 0,0006 <SEP> 0, <SEP> 10
<tb> 0,
<SEP> 0005 <SEP>
<tb> UDA-Asp-Ala-Ala-Pro-NH-Et <SEP> 0,0054 <SEP> 0,012
<tb> Z-GI <SEP> u-Ala-Ala-Ala-NH-Et <SEP> 0, <SEP> 173 <SEP> 0,72
<tb> 0,028
<tb>
Ac-Acetyl, Btr-Butyryl, Et-Äthyl, Pr-Propyl, iBu-Isobutyl, UDA-Undecanoyl, Suc-Succinyl, d. h. 3-Carboxypropionyl, Glt-Glutaryl, d. h. 4-Carboxybutyryl, Dde-2-Dodecenylsuccinyl, NAn-4- - Nitroanilid, Z-Benzoyloxycarbonyl, PE-pankreatische Elastase, LE-leukocytäre Elastase.
Die erfindungsgemäss hergestellten Elastaseinhibitoren enthalten ferner keine unphysiologischen Struktureinheiten. Sie eignen sich daher zur therapeutischen Anwendung, insbesondere zur Therapie der akuten Pankreatitis, chronischer obstruktiver Lungenerkrankungen, z. B. Lungenemphysem und gewisser Arthritisformen, ohne dass unerwünschte Nebenwirkungen auftreten.
Weitere Einzelheiten des Herstellungsverfahrens können den nachstehenden illustrativen Beispielen entnommen werden. - Die Identität und Reinheit der im folgenden angeführten Produkte
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wurde unter anderem mit Elementaranalyse bestätigt ; die gefundenen Werte stimmen mit den berechneten in engen Toleranzgrenzen überein.
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und 12 h bei Zimmertemperatur stehengelassen. Der ausgeschiedene Dicyclohexylharnstoff wird abgesaugt, mit Dimethylformamid gewaschen und das Filtrat wird unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wird mit 8 ml Äthylacetat bei 30 C verrührt, der ungelöste Anteil wird abfiltriert und mit 2 ml Äthylacetat gewaschen. Nach 12 h bei 3 C kristallisiert das Produkt aus ;
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Eine Lösung des vorigen Produktes (440 mg, 0, 7 mMol) in 20 ml Methanol wird nach Zugabe von 0, 5 ml Eisessig und 50 mg Palladiumschwarz 2 h mit Wasserstoff gesättigt. Danach wird der Katalysator abfiltriert, mit Methanol gewaschen und das Filtrat eingeengt. Der nichtkristalline Rückstand wird in 15 ml Äthylacetat gelöst und die Lösung 12 h bei 3 C kristallisieren gelassen.
Dann wird das Produkt abgesaugt, mit Äthylacetat und Petroläther gewaschen und zur Gewichtskonstanz getrocknet. Die Ausbeute beträgt 245 mg, Smp. 127 bis 130 C (aus 2-Propanol-Äthylacetat).
Beispiel 2 : Na -Butyrylasparagyl-alanyl-alanyl-prolin-isobutylamid
Eine Lösung von 1, 6 g (5 mMol) BOC-Asp (OBzl) und 1, 56 g (5 mMol) Ala-Ala-Pro-NH-iBu in 66 ml Dimethylformamid wird auf-20 C abgekühlt und mit 1, 1 g DCCI versetzt. Nach 3 h Rühren bei 0 C und 12 h Stehen bei Zimmertemperatur wird der ausgeschiedene Dicyclohexylharnstoff abfiltriert, mit Dimethylformamid gewaschen und das Filtrat eingedampft. Der Rückstand
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Das erhaltene nichtkristalline BOC-Asp (OBzl)-Ala-Ala-Pro-NH-iBu wird in 5 ml Eisessig aufgenommen und mit 5 ml 2, 9 M Chlorwasserstofflösung in Eisessig behandelt.
Nach 3 h bei Zimmertemperatur wird das gebildete Hydrochlorid durch Zugabe von 150 ml Äther ausgefällt, mit Äther dekantiert und im Exsikkator über Natriumhydroxyd und Phosphorpentoxyd getrocknet. So wird nichtkristallines, chromatographisch einheitliches Asp (OBzl)-Ala-Ala-Pro-NH-iBu. HCI in Schaum-
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Das Produkt wird in 20 ml Wasser aufgelöst und 5 ml gesättigte wässerige Natriumhydrogencarbonatlösung wird zugesetzt. Nach dem Abkühlen auf 5 C wird eine Lösung von 1 ml Buttersäureanhydrid in 5 ml Tetrahydrofuran innerhalb von 30 min zugetropft. Nach weiteren 30 min Rühren unter Kühlung wird das Gemisch eingeengt, der Rückstand mit 10 ml heissem Äthylacetat gewaschen und das Filtrat 12 h bei 3 C zur Kristallisation stehengelassen. Das auskristallisierte Produkt wird abgesaugt, nacheinander mit Äthylacetat und Petroläther gewaschen und zur Gewichtskonstanz getrocknet. Die Ausbeute beträgt 350 mg Btr-Asp (OBzl)-Ala-Ala-Pro-NH-iBu, Smp. 149 bis 151 C (aus Äthylacetat).
Dessen Hydrierung auf ähnliche Weise, wie bei der entsprechenden Ac-Asp-Verbindung im Beispiel 1 beschrieben ist, ergibt zuletzt das angestrebte Produkt (76% d. Th.)
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gerührt und 12 h bei Zimmertemperatur stehengelassen. Der Harnstoff wird abfiltriert, mit Dimethylformamid gewaschen und das Filtrat eingeengt. Der feste Rückstand wird in Äthylacetat aufgenommen und die Lösung nacheinander mit l% piger Zitronensäure, 5%igem Natriumhydrogencarbonat und Wasser gewaschen und eingeengt. Der Rückstand wird aus 15 ml siedendem 2-Propanol
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(OBzl)-Ala-Ala-Ala-Rf = 0, 20/SI, 0, 75/S2'
Eine Lösung der Substanz (360 mg, 0, 7 mMol) in 10 ml Tetrahydrofuran und 40 ml 2, 5%iger wässeriger Natriumhydrogencarbonatlösung wird bei 10 C mit einer Lösung von Caprylsäurechlorid (145 mg) in 2 ml Tetrahydrofuran, in zwei Teilen innerhalb von 15 min zugegeben, versetzt.
Nach 1 h Rühren wird das Reaktionsgemisch mit 1 M Chorwasserstoffsäure auf PH 4 angesäuert, das Lösungsmittel abgedampft und die verbleibende wässerige Lösung auf PH 2 eingestellt. Nach
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(2-Propanol-Äthylacetat). Dessen Hydrierung nach Beispiel 1 ergibt das Titelprodukt (62% d. Th.), Smp. 224 bis 227 C.
Beispiel 4 : N- (2-Dodecenylsuccinyl) alanyl-alanyl-alanyl-äthylamid
Eine Lösung von 520 mg (2 mMol) Ala-Ala-Ala-NH-Et in 10 ml Dimethylformamid wird mit 1, 05 g 2-Dodecenylbernsteinsäureanhydrid versetzt. Das Gemisch wird 1 h bei 70 C erwärmt, dann wird das Lösungsmittel abgedampft und Petroläther zugefügt. Das ausgeschiedene Rohprodukt wird aus 2-Propanol-Petroläther umkristallisiert und ergibt so Dde-Ala-Ala-Ala-NH-Et (72% d. Th.) Smp. 225 bis 229 C. Die nochmals ähnlich umkristallisierte Analyseprobe schmilzt bei 231 bis 234 C.
Rf = 0, 73/S , 0, 78/S2 (Systeme vgl. Beispiel 2).
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Beispiel 5 : N- (2-Dodecenylsuccinyl)alanyl-alanyl-prolin-propylamid Diese Verbindung wird analog der vorstehenden erhalten. Die Ausbeute ist 66%, Smp. 97
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Eine Lösung von 600 mg (2 mMol) Ala-Ala-Pro-NH-Et in 10 ml Dimethylformamid wird mit 600 mg (2, 4 mMol) Z-Glutaminsäureanhydrid versetzt. Nach 1 h bei 60 C wird das Reaktionsgemisch eingeengt, der nichtkristalline Rückstand mit 30 ml Äthylacetat vermischt und 12 h bei 3 C stehengelassen. Danach wird das auskristallisierte Produkt abgesaugt und nacheinander mit Äthylacetat und Petroläther gewaschen. Die Ausbeute ist 1, 1 g des rohen Produktes vom Smp. 75 bis 80 C.
Nach Umkristalisieren aus Äthylacetat - Petroläther schmilzt die reine Substanz bei 101 bis 103 C.
Beispiel 7: Nα-Acetylasparagyl-glycyl-alanyl-prolin-isobutylamid
Einer Lösung von 7, 84 g (28 mMol) Z-Gly-Ala und 3, 92 g N-Hydroxybenztriazol in 50 ml Chloroform und 30 ml Dimethylformamid wird eine Lösung äquimolarer Menge Pro NH-iBu (aus Z-Pro-NH-iBu freigesetzt) in 56 ml Chloroform zugegeben und das Gemisch wird bei-5 C mit 6, 61 g DCCI versetzt. Nach 2 h Rühren bei 0 C und 3 h Stehen bei Zimmertemperatur wird der gebildete Dicyclohexylharnstoff abfiltriert, das Filtrat eingeengt, der Rückstand in Butanol aufgenommen, die Lösung mit l% iger Zitronensäure, 5%igem Natriumhydrogencarbonat und Wasser ausgeschüttelt, über Natriumsulfat getrocknet und eingeengt. Die anschliessende Kristallisation aus Äthylacetat liefert 4, 5 g (37% d. Th).
Z-Gly-Ala-Pro-NH-iBu. Nach ähnlich wiederholter Kristallisation schmilzt das Zwischen-
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Beispiel 1 und anschliessende katalytische Debenzylierung nach demselben Beispiel ergibt BOC- - Asp-Ala-Ala-Pro-NH-Et (68% d. Th.), Rf = 0, 75 (SI -System vgl. Beispiel 2). Dessen Weiterverarbeitung nach Beispiel 3 unter Verwendung von Undekanoylchlorid zur Acylierung liefert das angestrebte Produkt, Smp. 184 bis 189 C (aus Wasser). Aminosäurenzusammensetzung : Asp 1, 02, Pro 1, 04, Ala 1, 97.
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Beispiel 9 : Nα-Acetylasparagyl-prolyl-alanyl-alanin-äthylamid
Durch die Umsetzung von Z-Pro-Ala mit Ala-NH-Et analog nach Beispiel 7 gewinnt man Z-Pro-Ala-Ala-NH-Et, Smp. 219 bis 220 C (aus 2-Propanol-Äthylacetat), optische Drehung
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Die Hydrierung des letzteren nach Beispiel 1 ergibt dann das angestrebte Produkt, Smp. 153 bis 155 C (schmilzt bei 143 C an).