AT234922B - Verfahren zur Herstellung neuer Polypeptide - Google Patents

Description

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  Verfahren zur Herstellung neuer Polypeptide 
Gegenstand der Erfindung ist die Herstellung neuer Polypeptide mit Hypertensinwirkung. 



   Bekannt sind das im   Pferdeserum vorkommende   Dekapeptid Hypertensin I mit der Aminosäuresequenz L-Asparaginsäure, L-Arginin, L-Valin, L-Tyrosin, L-Isoleucin, L-Histidin, L-Prolin, L-Phenylalanin,   L-Histidin, L-Leucin,   als   Ileu5 - HypertEfnsin I   bezeichnet, und das im Rinderserum vorkommende   Valus-   Hypertensin I, ebenfalls ein Dekapeptid, das sich von dem vorher genannten nur durch die fünfte Aminosäure, L-Valin, unterscheidet. Aus Pferdeserum wurde ferner ein Oktapeptid,   Ileu5 - Hypertensin   II isoliert, das sich vom entsprechenden Hypertensin I durch Fehlen der 9. und 10. Aminosäure unterscheidet   und mittels eines im Serum vorhandenen Enzyms aus dem Dekapeptid gebildet wird. Gemäss dem Verfahren der österr.

   Patentschrift Nr. 226386 wurde auch das dem Val5 -Hypertensin I entsprechende Okta-   peptid, Val5-Hypertensin II, synthetisiert. Es wurde auch gezeigt, dass den genannten Peptiden entsprechende Polypeptide, welche statt der Asparaginsäure das Asparagin aufweisen, Hypertensinwirkung haben und weiter, dass die Aminosäuren 2,3 und 5 durch verwandte Aminosäuren ersetzt werden können, wobei die Hypertensinwirkung erhalten bleibt. In andern Fällen von Abwandlungen des Moleküls geht die Wirkung grösstenteils oder vollständig verloren. So zeigt sich insbesondere, dass das Heptapeptid, das die 8. Aminosäure des Oktapeptids nicht enthält, keine Hypertensinwirkung mehr hat (Lentz, Skeggs et al., Joum. exp. Med. 104   [1956],     S. 190).   



   Gegenstand der Erfindung ist nun ein Verfahren zur Herstellung von Heptapeptiden der Formel   L- a - (Niedermolekular-aminoalkyl) -a - amino-acetyl- L- a -niederalkyl-a -amino- acetyl- L-tyrosyl- L- a-      - niederalkyl-ct-amino-acetyl-L-histidyl-L-prolyl-L-phenylalanin, worin   die Niedermolekular-aminoalkyl- und die Niederalkylgruppe   1 - 5   Kohlenstoffatome aufweisen. 



   Überraschenderweise zeigen sie eine gute Hypertensinwirkung, insbesondere das L-Arginyl-L-valyl- -L-tyrosyl-L-valyl-L-histridyl-L-prolyl-L-phenylalanin der Formel 
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Die genannten Heptapeptide bieten insofern bedeutende technische Vorteile gegenüber den bekannten Hypertensinen, als sie sehr viel leichter und billiger herstellbar sind. 



   Unter dem Rest einer   L-a- (Niedermolekular-aminoalkyl)-a-amino-essigsäure   sind insbesondere L-Arginyl, L-Ornithyl und L-Lysyl zu verstehen, unter den Resten einer   L-a-Niederalkyl-a-aminu-essig-   säure L-Valyl und L-Norvalyl, ferner L-Leucyl, L-Isoleucyl und L-Norleucyl sowie L-Alanyl, also vorzugsweise Reste natürlicher Aminosäuren. 



   Die neuen Peptide werden nach den für die Peptidherstellung bekannten Methoden erhalten, wobei die Aminosäuren in der erwähnten Reihenfolge einzeln oder nach vorheriger Bildung kleinerer Peptidenheiten verknüpft werden. So kann man eines der   Aminosäure- bzw. Peptid moleküle   in Form eines Esters mit einem weiteren   Aminosäure- bzw.   Peptidmolekül, das eine geschützte Aminogruppe enthält, in Gegenwart eines Kondensationsmittels wie eines Carbodiimids oder eines Phosphorigsäureesterhalogenids verknüpfen oder man kann mit dem   Aminosäure- bzw.   Peptidester mit freier Aminogruppe eine Aminosäure bzw. ein Peptid mit aktivierter Carboxylgruppe (und geschützter Aminogruppe),   z.

   B. ein Säure-   halogenid, -azid, -anhydrid oder einen aktivierten Ester, wie Cyanmethylester oder Carboxymethylthiolester, umsetzen. Umgekehrt kann auch eine Aminosäure bzw. ein Peptid mit freier Carboxylgruppe (und geschützter Aminogruppe) mit einer Aminosäure bzw. einem Peptid mit aktivierter Aminogruppe (und geschützter Carboxylgruppe),   z. B.   einem Phosphitamid, zur Reaktion gebracht werden. Alle genannten Methoden sind für jede erfindungsgemäss in Betracht kommende Bildung von Peptidbindungen anwendbar, jedoch sind die im Beispiel angewendeten Verfahren besonders vorteilhaft.

   An der Reaktion nicht beteiligte freie funktionelle Gruppen werden zweckmässigerweise geschützt, insbesondere mittels durch Hydrolyse oder Reduktion leicht abspaltbarer Reste, die Aminogruppe beispielsweise durch den 
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 Die Hydroxylgruppe des Tyrosyls muss bei der Reaktion nicht notwendigerweise geschützt werden. 



   Die Umwandlung einer   geschützten- Aminogruppe   in eine freie Aminogruppe sowie die Überführung einer funktionell abgewandelten Carboxylgruppe in eine freie Carboxylgruppe im Verlaufe des Verfahrens zur Herstellung der Heptapeptide und Zwischenprodukte erfolgt nach an sich bekannten Methoden durch Behandlung mit hydrolysierenden bzw. reduzierenden Mitteln. 



   Je nach der Arbeitsweise erhält man die neuen Verbindungen in Form von Basen oder ihren Salzen. 



  Aus den Salzen können in an sich bekannter Weise die Basen gewonnen werden. Von letzteren wiederum lassen sich durch Umsetzung mit Säuren, die zur Bildung therapeutisch verwendbarer Salze geeignet sind, Salze gewinnen, wie   z. B.   solche mit anorganischen Säuren, wie Halogenwasserstoffsäuren, z. B.

   Salzsäure oder Bromwasserstoffsäure,   Salpetersäure,   Thiocyansäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, oder mit organischen Säuren, wie Essigsäure, Propionsäure, Glykolsäure, Milchsäure, Brenztraubensäure, Oxalsäure, Malonsäure, Bemsteinsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Weinsäure, Zitronensäure, Benzoesäure, Zimtsäure, Salicylsäure,   2-Phenoxy- oder 2-Acetoxybenzoesäure,   Mandelsäure, Methansulfonsäure, Äthansulfonsäure,   Hydroxyäthansulfonsäure,     Benzol- oder Toluolsulfonsäure.   



   Die   verfahrensgemäss erhaltenen Heptapeptide   können als blutdrucksteigemde Mittel in Form von pharmazeutischen Präparaten Verwendung finden. Diese enthalten die Peptide in Mischung mit einem für die enterale oder parenterale Applikation geeigneten pharmazeutischen organischen oder anorganischen Trägermaterial. Für dasselbe kommen solche Stoffe in Frage, die mit den Polypeptiden nicht reagieren, wie z. B. Gelatine, Milchzucker, Glukose, Kochsalz, Stärke, Magnesiumstearat, Talk, pflanzliche Öle, Benzylalkohole, Gummi, Polyalkylenglykole, Vaseline, Cholesterin oder andere bekannte Arzneimittelträger. Die pharmazeutischen Präparate können   z. B.   als Tabletten, Dragées, Pulver, Salben, Cremen, Suppositorien, oder in flüssiger Form als Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen vorliegen.

   Gegebenenfalls sind sie sterilisiert und bzw. oder enthalten Hilfsstoffe, wie Konservierungs-, Stabilisierungs-, Netzoder Emulgiermittel. 



   Die Erfindung wird in den nachfolgenden Beispielen beschrieben. Die Temperaturen sind in Celsiusgraden angegeben. 



    Beispiel l :. N-Carbobenzyloxy-L-arginyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-välyl-L-histidyl-L-prolyl-L-phe-    nylalanin-methylester. 



     775 mg (0, 001 Mol) L-Valyl-L-tyrosyl-L-valyl-L-histidyl- L-prolyl-L-phenylalanin-methylester,   hergestellt nach dem Verfahren der österr. Patentschrift Nr. 226386 und 462 mg (0,0015 Mol) N-Carboben-   zyloxy-L-arginin werden   in 5 ml frisch destilliertem Dimethylformamid   gelöst bzw.   suspendiert und dazu 0, 125 ml (0, 0015 Mol) 12, On-wässerige Salzsäure gegeben. Nach kurzem Erwärmen auf   30    tritt klare Lösung ein. Es wird auf 00 abgekühlt, 340 mg (0, 00165 Mol) Dicyclohexyl-carbodiimid zugegeben und 

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 4 h bei 00 stehen gelassen. Nach weiteren 10 h bei 200 gibt man 0, 1 ml Eisessig zu, lässt nochmals 1 h stehen und filtriert dann vom gebildeten   Dicyclohexyl-hamstoff   ab.

   Das Filtrat wird im Hochvakuum bei 400 eingedampft, in wenig Wasser gelöst, unter Eiskühlung mit Soda alkalisch gemacht und die käsige Fällung mit n-Butanol extrahiert. Nach dem Neutralwaschen und Eindampfen erhält man 1, 28 g eines Rohproduktes, das zur Reinigung im System Methanol-Wasser 1 : 1/Chloroform (Phasenvolumen je 10 ml) einer Craig-Verteilung über 45 Stufen unterworfen wird. Aus Röhrchen   17 - 33   (Max. bei Nr. 24) erhält man 660 mg eines weissen Pulvers, das direkt zum freien Peptid hydrolysiert wird. 
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 nin-methylester werden in 5 ml konz. Salzsäure gelöst und während 70 min auf 400 erwärmt. Man erhält nach Eindampfen zur Trockne bei 400 im Hochvakuum 630 mg eines pulverigen Hydrochlorids, das zur Freisetzung des Peptides durch eine   schwach basische Ionenaustauschersäule filtriert wird (z.

   B.   das   Handelsprodukt"Merck II",   ein Polystyrolderivat mit aliphatischen Aminogruppen ; Länge der Säule = 13 cm, Durchmesser = 12 cm) unter Verwendung von Methanol-Wasser 1 : 1 als Lösungsmittel. Nach Abdampfen des Methanols im Vakuum und Lyophilisieren erhält man 510 mg eines farblosen Pulvers. 



   Dieses Rohprodukt wird durch eine Craig-Verteilung im System   n-Butanol/0,   3 m Ammoniumacetat-   lösung (PH 7,   0) über 63 Stufen verteilt. Aus Röhrchen 17 - 32 (Max. bei Nr. 24 ; G = 0, 62) erhält man nach Eindampfen zur Trockne und Wegsublimieren des Puffers im Hochvakuum bei 450 insgesamt 280 mg   L-Arginyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-valyl-L-histidyl-L-prolyl-L-phenylalanin   als farbloses, amorphes Pulver vom F. zirka 2000 (unter Zersetzung). Die Verbindung ist leicht löslich in Wasser und Methanol. Im Pa- 
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 liche Flecken mit Rf-Werten von 0,51 bzw. 0,69. (Positiv auf Pauly-Reagens und   Ninhydrin.)     Beispiel 2 : N-Carbobenzyloxy-nitro-L-arginyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-valyl-L-histidyl-L-prolyl-L-    - phenylalanin-methylester. 



   775 mg (0, 001 Mol)   L-Valyl-L-tyrosyl-L-valyl-L-histidyl-L-prolyl-L-phenylalanin-methylester   und 565 mg (0, 00275 Mol) Dicyclohexyl-carbodiimid werden in 2 ml Dimethylformamid und 10 ml Acetonitril gelöst und dazu 882   mg (0, 0025 Mol) N-Carbobenzyloxy-nitro-L-arginin, gelöst in wenig Dime-   thylformamid, zugetropft. Es bildet sich rasch eine kristalline Fällung von Dicyclohexyl-harnstoff und das Gemisch wird über Nacht bei Zimmertemperatur stehen gelassen. Nach Zugabe von 0,2 ml Eisessig wird nochmals 1 h stehen gelassen, dann filtriert und mit wenig Methanol gewaschen. Das Filtrat wird im Hochvakuum zur Trockne eingedampft, in Butanol gelöst, mit eiskalter Sodalösung und dann mit Wasser bis neutral gewaschen und zur Trockne eingedampft.

   Man erhält 1, 6 g eines Rohgemisches, das im System   Methanol-Wasser-Chloroform-Benzol 3 : 1 : 3 : 1   über 60 Stufen verteilt wird. (Phasenvolumen je 10   ml.)   Der Inhalt der Röhrchen   10 - 21   ergibt beim Eindampfen zur Trockne 900 mg Material, das zur Hydrierung verwendet wird. 
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 alanin-methylester werden in 10 ml Methanol und 5 ml In-Salzsäure (in Methanol) gelöst und nach Zugabe von 300 mg Palladiumkohle   ze   bis zum Stillstand hydriert, unter Absorption des sich bildenden Kohlendioxyds. Die Aufnahme von etwas mehr als 5 Mol Wasserstoff ist nach 6 h beendigt. Der Katalysator wird abfiltriert, das farblose Filtrat eingedampft und im Hochvakuum bei 400 bis zur Gewichtskonstanz getrocknet.

   Man'erhält 890 mg eines weissen Pulvers (Gemisch von Heptapeptid-methylester-trihydrochlorid und Ammoniumchlorid), das direkt hydrolysiert werden kann. 



   L-Arginyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-valyl-L-histidyl-L-prolyl-L-phenylalanin. 



   890 mg roher Methylester werden in 6 ml konzentrierter, wässeriger Salzsäure gelöst und während 1 h auf 400 erwärmt. Es wird dann im Hochvakuum bei 40  zur Trockne eingedampft (Dauer zirka 20   min),   in wenig Wasser gelöst und langsam durch eine Säule von schwach basischem Ionenaustauscher filtriert (Merck II, in der Acetatform vorliegend ; Durchmesser = 12, 5 mm,   l   = 13 cm). Das wässerige Eluat wird lyophilisiert und die dabei erhaltenen 770 mg Rohprodukt im System n-Butanol-Wasser über 100 Stufen verteilt. (Phasenvolumen je 10   ml.)   Aus Röhrchen   6 - 17   (Maximum bei Nr.   11 ;   G = 0, 13) gewinnt man total 484 mg reines   L-Arginyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-valyl-L-histidyl-L-prolyl-L-phenylalanin-monoacetat.  

Claims (1)

1. PATENTANSPRÜCHE : 1. Verfahren zur Herstellung neuer Polypeptide mit Hypertensinwirkung unter Anwendung an sich bekannter Verknüpfungsmethoden, dadurch gekennzeichnet, dass man die Reste einer L-ct- (Niedermoleku- EMI4.1 nannten Reihenfolge, ausgehend von einem L-Arginin mit geschützter Aminogruppe, miteinander verbindet. EMI4.2 Kondensationsmittels zum Heptapeptid kondensiert.

   3. Verfahren nach Anspruch l, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Nitro-L-arginin mit geschützter Aminogruppe mit einem L-Valyl-L-tyrosyl-L-valyl-L-histidyl-L-prolyl-L-phenylalaninester in Gegenwart eines Kondensationsmittels zum Heptapeptid kondensiert, die Schutzgruppen reduktiv entfernt und die Estergruppe verseift.

   4. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass man mit einem Carbodiimid kondensiert.