DE1130816B - Verfahren zur Herstellung neuer hypertensinwirksamer Heptapeptide - Google Patents

Description

DEUTSCHES

PATENTAMT

C19131IVb/12q

ANMELDETAG: 4. JUNI 1959

BEKANNTMACHUNG
DER ANMELDUNG
UNDAUSGABEDER
AUSLEGESCHRIFT: 7. JUNI 1962

Gegenstand der Erfindung ist die Herstellung neuer Heptapeptide mit Hypertensinwirkung.

Bekannt ist das im Pferdeserum vorkommende Dekapeptid Hypertensin I mit der Aminosäuresequenz L-Asparaginsäure, L-Arginin, L-Valin, L-Tyrosin, L-Isoleucin, L-Histidin, L-Prolin, L-Phenylalanin, L-Histidin, L-Leucin, als Ileu⁵-Hypertensin I bezeichnet, und das im Rinderserum vorkommende VaP-Hypertensin I, ebenfalls ein Dekapeptid, das sich von dem vorher genannten nur durch die fünfte Aminosäure, L-Valin, unterscheidet. Aus Pferdeserum wurde ferner ein Oktapeptid, Ileu⁵-Hypertensin II, isoliert, das sich vom entsprechenden Hypertensin I durch Fehlen der neunten und zehnten Aminosäure unterscheidet und mittels eines im Serum vorhandenen Enzyms aus dem Dekapeptid gebildet wird. Es wurde bereits vorgeschlagen (Patentanmeldung C15418 IVb/12q [deutsche Auslegeschrift 1125942]), das dem VaI⁸-Hypertensin I entsprechende Oktapeptid, Val⁵-Hypertensin II, zu synthetisieren. Hierbei wurde auch gezeigt, daß den genannten Peptiden entsprechende Polypeptide, welche statt des Asparaginsäurerestes den Asparaginrest aufweisen, Hypertensinwirkung haben und weiter, daß die Aminosäuren 2, 3 und 5 durch verwandte Aminosäuren ersetzt werden können, wobei die Hypertensinwirkung erhalten bleibt. In anderen Fällen von Abwandlungen des Moleküls geht die Wirkung größtenteils oder vollständig verloren. So zeigt sich insbesondere, daß das Heptapeptid, das die achte Aminosäure des Oktapeptids nicht enthält, keine Hypertensinwirkung mehr hat (Lentz, Skeggs et al., Journ. exp. Med., 104 [1956], S. 190).

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist nun die Herstellung von Heptapeptiden der allgemeinen Verfahren zur Herstellung neuer hypertensinwirksamer Heptapeptide

Anmelder: CIBA Aktiengesellschaft, Basel (Schweiz)

Vertreter: Dipl.-Ing. E. Splanemann, Patentanwalt, Hamburg 36, Neuer Wall 10

Beanspruchte Priorität: Schweiz vom 13. Juni 1958 (Nr. 60 539)

Dr. Robert Schwyzer, Riehen,

und Dr. Bernhard Riniker, Birsfelden (Schweiz),

sind als Erfinder genannt worden

Formel L - κ - (Amino - niederalkyl) - <x - amino - acetyl-L-a-niederalkyl-Ä-amino-acetyl-L-tyrosyl-L-Ä-niederalkyl - oc - amino - acetyl - l - histidyl -L-prolyl-L- phenylalanin und ihrer Salze.

Der Rest einer L-«-(Amino-niederalkyl)-«-aminoessigsäure ist hierbei ein L-Arginyl-, L-Ornithyl- oder ein L-Lysylrest; Reste einer L-a-Niederalkyl-w-aminoessigsäure sind L-Valyl, L-Leucyl und L-Isoleucyl, ferner L-Norvalyl, L-Norleucyl sowie L-Alanyl.

Überraschenderweise zeigen diese Heptapeptide eine gute Hypertensinwirkung, insbesondere das L - Arginyl - L - valyl - l - tyrosyl - l - valyl - L - histidyl - L-prolyl-L-phenylalanin der Formel

NH

CH-N

C-NH'

H —HN-CH-CO —NH-CH-CO —NH-CH-CO —NH-CH-CO—NH- CH-CO

CH₂
I
co_NH — CH- CO — OH

Pro

209 608/349

Die neuen Heptapeptide bieten insofern bedeutende technische Vorteile gegenüber den bekannten Hypertensinen, als sie sehr viel leichter und billiger herstellbar sind. Es hat sich gezeigt, daß der Ersatz einer oder mehrerer der in den natürlichen Hypertensinen vorkommenden Aminosäuren Arginin, Valin, Isoleucin durch die oben genannten Aminosäuren qualitativ keine Änderung der Wirkung bedingt.

Es bestehen verschiedene Möglichkeiten bezüglich des Aufbaues der Heptapeptide aus Aminosäuren oder kleineren Peptideinheiten. So kann, man einen L-a-Niederalkyl-oc-amino-acetyl-L-tyrosyl-L-a-niederalkyl- ot, - amino - acetyl - l - histidyl - l - pr olyl - l - phenylalaninester mit einer L-«-(Amino-niederalkyl)-«-aminoessigsäure, in der die «-Aminogruppe und gegebenenfalls auch die a-Amino-niederalkylgruppe geschützt ist, kondensieren, beispielsweise nach dem Schema von Fig. 1 oder 2:

Z —!Arg— OH

Z-Arg

H—VaI Tyr VaI His Pro Phe!— OCH₃
VaI Tyr VaI His Pro Phe |— OCH₃

H -1 Arg

VaI Tyr VaI His Pro Phe [— OH

Fig.

NO₂

Z— j Arg I— OH
NO₂

Z-] Arg

H—I VaI Tyr VaI His Pro Phe'-OCH₃

VaI Tyr VaI His Pro Phe—OCH.

H-

Arg

Tyr VaI His

Pro

Phe I—OCH₃

H-jArg

VaI Tyr VaI His

Pro

Phe r- OH

Fig.

Der als Ausgangsmaterial genannte Hexapeptidester H-Val-Tyr-Val-His-Pro-Phe-OCHg kann nach den Verfahren der Patentanmeldung C15418 IVb/12q (deutsche Auslegeschrift 1 125 942) hergestellt werden. Statt dieses Esters können auch die ebenfalls in der genannten Patentanmeldung beschriebenen Hexapeptidester H-Val-Tyr-Leu-His-Pro-Phe-OCHg oder H-Leu-Tyr-Ileu-His-Pro-Phe-OCHa mit Arginin kondensiertwerden.

An der Reaktion nicht beteiligte freie funktionelle Gruppen werden zweckmäßigerweise geschützt, insbesondere mittels durch Hydrolyse oder Reduktion leicht abspaltbarer Reste, die Aminogruppe beispielsweise durch den Tosyl- oder Tritylrest und insbesondere die Carbobenzoxygruppe oder farbige Schutzgruppen, wie die p-Phenylazo-benzyloxy-carbonylgruppe und die p-(p'-Methoxy-phenylazo)-benzyloxycarbonylgruppe. Die Hydroxylgruppe des Tyrosylrestes muß bei der Reaktion nicht notwendigerweise geschützt werden.

Die Umwandlung einer geschützten Aminogruppe in eine freie Aminogruppe sowie die Überführung einer funktionell abgewandelten Carboxylgruppe in eine freie Carboxylgruppe im Verlaufe des Verfahrens zur Herstellung der Heptapeptide und Zwischenprodukte erfolgt nach an sich bekannten Methoden durch Behandlung mit hydrolysierenden bzw. reduzierenden Mitteln.

Je nach der Arbeitsweise erhält man die neuen Verbidnungen in Form von Basen oder ihren Salzen. Aus den Salzen können in an sich bekannter Weise die Basen gewonnen werden. Von letzteren wiederum lassen sich durch Umsetzung mit Säuren, die zur Bildung therapeutisch verwendbarer Salze geeignet sind, Salze gewinnen, wie z. B. solche mit anorganischen Säuren, wie Halogenwasserstoffsäuren, z. B. Salzsäure oder Bromwasserstoffsäure, Salpetersäure, Thiocyansäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, oder mit organischen Säuren, wie Essigsäure, Propionsäure, Glykolsäure, Milchsäure, Brenztraubensäure, Oxalsäure, Malonsäure, Bernsteinsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Weinsäure, Zitronensäure, Benzoesäure, Zimtsäure, Salicylsäure, 2-Phenoxy- oder 2-Acetoxybenzoesäure, Mandelsäure, Methansulf onsäure, Äthansulfonsäure, Hydroxyäthansulfonsäure, Benzol- oder Toluolsulfonsäure.

Die verfahrensgemäß erhaltenen Heptapeptide können als blutdrucksteigernde Mittel in Form von pharmazeutischen Präparaten Verwendung finden. Diese enthalten die Peptide in Mischung mit einem für die enterale oder parenteral Applikation geeigneten pharmazeutischen organischen oder anorganischen Trägermaterial.

In den nachstehenden Beispielen sind die Temperaturen in Celsiusgraden angegeben.

Es werden folgende Abkürzungen verwendet:

H-Arg-OH
H-VaI-OH
H-Tyr-OH
H-Phe-OH
H-His-OH
H-Pro-OH
Z

L-Arginin.

L-Valin.

L-Tyrosin.

L-Phenylalanin.

L-Histidin.

L-Prolin.

Carbobenzoxy.

Beispiel 1 (vgl. Fig. 1)
a) Z-Arg-Val-Tyr-Val-His-Pro-Phe-O CH₃

775 mg (0,001 Mol) H-Val-Tyr-Val-His-Pro-Phe-OCH₃, hergestellt nach dem Verfahren der Patent- S anmeldung C 15418 IVb/12q (deutsche Auslegeschrift 1125 942), und 462 mg (0,0015MoI) Z-Arg-OH werden in 5 ml frisch destilliertem Dimethylformamid gelöst bzw. suspendiert und dazu 0,125 ml (0,0015 Mol) 12,0normale wäßrige Salzsäure gegeben. Nach kurzem *° Erwärmen auf 30° tritt klare Lösung ein. Es wird auf 0° abgekühlt, 340 mg (0,00165 Mol) Dicyclohexylcarbodiimid zugegeben und 4 Stunden bei 0° stehengelassen. Nach weiteren 10 Stunden bei 20° gibt man 0,1 ml Eisessig zu, läßt nochmals 1 Stunde stehen und filtriert dann vom gebildeten Dicyclohexyl-harnstoff ab. Das Filtrat wird im Hochvakuum bei 40° eingedampft, in wenig Wasser gelöst, unter Eiskühlung mit Natriumcarbonat alkalisch gemacht und die käsige Fällung mit n-Butanol extrahiert. Nach dem Neutralwaschen und Eindampfen erhält man 1,28 g eines Rohproduktes, das zur Reinigung im System Methanol—Wasser-1: 1—Chloroform (Phasenvolumen je 10 ml) einer Craig-Verteilung über 45 Stufen unterworfen wird. Aus Röhrchen 17 bis 33 (Maximum bei Nr. 24) erhält man 660 mg eines weißen Pulvers, das direkt zum freien Peptid hydrolysiert wird.

b) H-Arg-Val-Tyr-Val-His-Pro-Phe-O H

30

660 mg Z-Arg-Val-Tyr-Val-His-Pro-Phe-OCHs werden in 5 ml konzentrierter Salzsäure gelöst und während 70 Minuten auf 40° erwärmt. Man erhält nach Eindampfen zur Trockne bei 40° im Hochvakuum 630 mg eines pulverigen Hydrochloride, das zur Freisetzung des Peptides durch eine schwach basische Ionenaustauschersäule filtriert wird (Handelsname Merck Nr. II, Durchmesser =12 mm, 1=13 cm) unter Verwendung von Methanol—Wasser 1:1 als Lösungsmittel. Nach Abdampfen des Methanols im Vakuum und Lyophilisieren erhält man 510 mg eines farblosen Pulvers.

Dieses Rohprodukt wird durch eine Craig-Verteilung im System n-Butanol—0,3m Ammoniumacetatlösung (pn 7,0) über 63 Stufen verteilt. Aus Röhrchen 17 bis 32 (Maximum bei Nr. 24; G = 0,62) erhält man nach Eindampfen zur Trockne und Wegsublimieren des Puffers im Hochvakuum bei 45° insgesamt 280 mg H-Arg-Val-Tyr-Val-His-Pro-Phe-OH als farbloses, amorphes Pulver vom F. etwa 200° (unter Zersetzung). Die Verbindung ist leicht löslich in Wasser und Methanol. Im Papierchromatogramm zeigt sie in den Systemen tert.-Amylalkohol—Triäthylamin—Veronal—Wasser—Isopropanol (100:0,8:1,8:50:40) und sek. - Butanol — Veronalnatrium — Wasser — Isopropanol (100:0,5:70:15) einheitliche Flecken mit Rf-Werten von 0,51 bzw. 0,69 (positiv auf Pauly-Reagens und Ninhydrin).

Beispiel 2 (vgl. Fig. 2)
a) Z-Arg(NO₂)-Val-Tyr-Val-His-Pro-Phe-O CH₃

60

775 mg (0,001 Mol) H-Val-Tyr-Val-His-Pro-Phe-OCH₃ und 565 mg (0,00275 Mol) Dicyclohexyl-carbodiimid werden in 2 ml Dimethylformamid und 10 ml Acetonitril gelöst und dazu 882 mg (0,0025 Mol) Z-Arg(NO₂)-OH, gelöst in wenig Dimethylformamid, zugetropft. Es bildet sich rasch eine kristalline Fällung von Dicyclohexyl-harnstoff, und das Gemisch wird über Nacht bei Zimmertemperatur stehengelassen. Nach Zugabe von 0,2 ml Eisessig wird nochmals 1 Stunde stehengelassen, dann filtriert und mit wenig Methanol gewaschen. Das Filtrat wird im Hochvakuum zur Trockne eingedampft, in Butanol gelöst, mit eiskalter Natriumcarbonatlösung und dann mit Wasser neutral gewaschen und zur Trockne eingedampft. Man erhält 1,6 g eines Rohgemisches, das im System Methanol—Wasser—Chloroform—Benzol 3:1:3:1 über 60 Stufen verteilt wird (Phasenvolumen je 10 ml). Der Inhalt der Röhrchen 10 bis 21 ergibt beim Eindampfen zur Trockne 900 mg Material, das zur Hydrierung verwendet wird.

b) H-Arg-Val-Tyr-Val-His-Pro-Phe-O CH₃

900 mg Z-Arg(NO₂)-Val-Tyr-Val-His-Pro-Phe-OCH₃ werden in 10 ml Methanol und 5 ml In-SaIzsäure (in Methanol) gelöst und nach Zugabe von 300 mg Palladiumkohle (10%) bis zum Stillstand hydriert, unter Absorption des sich bildenden Kohlendioxyds. Die Aufnahme von etwas mehr als 5 Mol Wasserstoff ist nach 6 Stunden beendigt. Der Katalysator wird abfiltriert, das farblose Filtrat eingedampft und im Hochvakuum bei 40° bis zur Gewichtskonstanz getrocknet. Man erhält 890 mg eines weißen Pulvers (Gemisch von Heptapeptid-methylester-trihydrochlorid und Ammoniumchlorid), das direkt hydrolysiert werden kann.

c) H-Arg-Val-Tyr-Val-His-Pro-Phe-O H

890 mg roher Methylester werden in 6 ml konzentrierter, wäßriger Salzsäure gelöst und während 1 Stunde auf 40° erwärmt. Es wird dann im Hochvakuum bei 40° zur Trockne eingedampft (Dauer etwa 20 Minuten), in wenig Wasser gelöst und langsam durch eine Säule von schwach basischem Ionenaustauscher filtriert (Handelsname Merck II, in der Acetatform vorliegend; Durchmesser = 12,5 mm, 1 = 13 cm). Das wäßrige Eluat wird lyophilisiert und die dabei erhaltenen 770 mg Rohprodukt im System n-Butanol—Wasser über 100 Stufen verteilt (Phasenvolumen je 10 ml). Aus Röhrchen 6 bis 17 (Maximum bei Nr. 11; G = 0,13) gewinnt man insgesamt 484 mg reines H-Arg-Val-Tyr-Val-Pro-Phe-O H-CH₃COOH.

Claims (3)

PATENTANSPRÜCHE:

1. Verfahren zur Herstellung neuer hypertensinwirksamer Heptapeptide der allgemeinen Formel L-a-(Amino-niederalkyl)-»-amino-acetyl-L-a-niederalkyl-a-amino-acetyl-L-tyrosyl-L-oc-niederalkylöc-amino-acetyl-L-histidyl-L-prolyl-L-phenylalanin, worin der L-«-(Amino-niederalkyl)-«-amino-acetylrest für L-Arginyl, L-Ornithyl oder L-Lysyl und der L-a-Niederalkyl-oc-amino-acetylrest für L-Valyl, L-Isoleucyl, L-Leucyl, L-Norvalyl, L-Norleucyl oder L-Alanyl steht, und ihrer Salze, dadurch gekenn zeichnet, daß man einen L-«-Niederalkyl-«-aminoacetyl -L- tyrosyl - l- α -niederalkyl - α - amino - acetyl-L-histidyl-L-prolyl-L-phenylalaninester mit einer L-a (Amino-niederalkyl)-«-aminoessigsäure, in der die «-Aminogruppe und gegebenenfalls auch die a-(Amino-niederalkyl)-Gruppe des Argininrestes geschützt ist, in Gegenwart eines Carbodiimids kondensiert, die Schutzgruppen abspaltet und die Estergruppe verseift und, wenn erwünscht, er-

haltene basische Verbindungen in ihre Salze oder
erhaltene Salze in Basen überführt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ein L-Arginin mit geschützter
Aminogruppe mit einem L-Vaiyl-L-tyrosyl-L-valyl-L-histidyl-L-prolyl-L-phenylalaninester in Gegenwart eines Carbodiimide zum Heptapeptid kondensiert und die Amino-Schutzgruppe und Estergruppe mittels einer starken Mineralsäure abspaltet.

IO

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Nitro-L-arginin mit geschützter Aminogruppe mit einem L-Valyl-L-tyrosyl-L-valyl-L-histidyl-L-prolyl-L-phenyl-alaninester in Gegenwart eines Carbodiimids zum Heptapeptid kondensiert, die Amino-Schutzgruppe und Nitrogruppe reduktiv entfernt und die Estergruppe verseift und, wenn erwünscht, erhaltene basische Verbindungen in Salze oder erhaltene Salze in Basen überführt.

© 209 608/349 5.62