DE2447805A1 - Verfahren zur herstellung von synthetischem l-pyroglutamyl-l-histidyl-l-prolinamid - Google Patents
Verfahren zur herstellung von synthetischem l-pyroglutamyl-l-histidyl-l-prolinamidInfo
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Description
KRAUS & VVEISERT
DR. WALTER KRAUS DIPLOMCHEMIKER . DR.-ING. ANNEKÄTE WEISERT DIPL.-tNG. FACHRICHTUNG CHEMIE
D-8 MÜNCHEN 19 · FLÜQGENSTRASSE 17 · TELEFON Ο89/17 7ΟΘ1
1049/WK/jo
Istituto Farmacologico Serono S.p.A., Rom, Italien
Das Thyreotropin-Releasinghormon (TRH) oder der Releasing·
faktor ist der Hypothalamusfaktor, der die Freisetzung des schilddrüsenstimulierenden Hormons (Thyreotropin)
aus dem Hypophysen—Vorderlappen stimuliert.
Es wurde in neuerer Zeit gezeigt, daß das TRH, das zuerst
aus Schafhypotalami und sodann aus Schweinehypotalami isoliert worden ist, die Struktur von L-Pyroglutamyl-L-histidyl-L-prolinamid
hat:
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-CO-NH - CH -CO- N
(I) CH2
CONH
(nachstehend als pGlu-His-Pro-NH2 bezeichnet).
Es ist gleichfalls gezeigt worden, daß synthetisches
TRH dieselben hormonalen Aktivitäten wie das Schweine-TRH besitzt und daß sowohl Schweine-TRH als auch synthetisches
TRH Thyreotropin aus der Hypophyse des normalen Menschen freisetzt.
Synthetisches TRH ist daher für Untersuchungen über die Rolle von TRH als Kontrollfaktor bei der normalen
und abnormalen Sekretion von Thyreotropin und über den Einfluß von TRH auf die Sekretion der anderen Hypophysenhormone
sehr wertvoll. Es sind schon mehrere Verfahren entwickelt worden, um synthetisches TRH herzustellen.
Die meisten erfordern jedoch die Verwendung von geschützten Ausgangsaminosäuren und/oder Zwlschen-Dipeptiden
und sie weisen langwierige und aufwendige Stufen der Entfernung der Schutzgruppen auf.
Wenn andererseits nicht-geschützte Aminosäuren miteinander und mit Dipeptiden gekuppelt werden, dann sind
die Ausbeuten sehr niedrig.
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In Anbetracht der Tatsache, daß mindestens zwei theoretische
Kupplungsstufen erforderlich sind, um das gewünschte
Tripeptid herzustellen, wird verständlich, daß, bezogen auf die Ausgangsmaterialien 9 nur eine nichttragbare
niedrige Endausbeute erhalten wird. Bei der Beurteilung der Gesamtwirtschaftlichkeit des Verfahrens
muß auch in Betracht gezogen werden, daß scharfe Fällungs- und Reinigungsstufen erforderlich sind, um das
gewünschte Zwischenprodukt und die Endprodukte aus den Reaktionsgemischen zu isolieren, die unvermeidbar erhebliche
Mengen an Nebenprodukten enthalten.
Es besteht daher ein Bedürfnis nach einem neuen, schnellen
und wirtschaftlichen Verfahren zur Synthese von hochreinem TRH in hohen Ausbeuten.
Durch die Erfindung wird nun hochreines synthetisches TRH mit hoher Ausbeute hergestellt, indem man zunächst
das geschützte Tripeptid Pyroglutamyl-N m-benzylhistidylprolinamid
der Formel:
^.J-CO-NH-CH-CO-N
(nachstehend als PGIu-(BzI)HiS-PrO-NH2 bezeichnet) herstellt,
dieses mittels Natrium in flüssigem Ammoniak
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reduktiv in die ungeschützte Form überführt und daß man
das resultierende rohe ungeschützte Tripeptid durch eine Gelfiltrationseinrichtung leitet.
Das geschützte Tripeptid wird vorzugsweise erfindungsgemäß dadurch hergestellt, daß man N-t-Butyloxycarbonyl-N benzylhistidin
mit Prolinamid in Gegenwart von N,N1-Dicyclohexylcarbodiimid
kuppelt, wodurch mit hoher Ausbeute das geschützte Dipeptid N-t-Butyloxycarbonyl-N m-benzylhistidyl-prolinamid
erhalten wird.
Die Entfernung der t-Butyloxycarbonylgruppe durch mit
HBr gesättigtem Eisessig liefert das N -Benzylhistidylprolinamiddihydrobromid, das durch Umkristallisation gereinigt
und mit einem aktiven Ester der Pyroglutaminsäure zu dem geschützten Tripeptid PGIu-(BzI)HiS-PrO-NHp umgesetzt
wird. Alternativ kann man auch, was weniger bevorzugt wird, N-Carbobenzoxypyroglutaminsäure und den
Benzylester von N m-Benzylhistidin nach dem Mischanhydridverfahren
kuppeln und den resultierenden Dipeptidester durch selektive Hydrogenolyse in Pyroglutamyl-N m-benzylhistidin
überführen. Das geschützte Dipeptid wird sodann mit Prolinamid in Gegenwart von Ν,Ν'-Dicyclohexylcarbodiimid
zu pGlu-(Bzl)His-Pro-NH2 umgesetzt.
Die reduktive Entfernung der Schutzgruppe des geschützten Tripeptide gemäß der vorliegenden Erfindung wird
durchgeführt, indem das Tripeptid in flüssigem Ammoniak aufgelöst wird, worauf allmählich Natrium zu der Lösung
gegeben wird. Die Reaktionszeit wird ausgehend von dem Moment an gezählt, wenn die Lösung eine dauernde blaue
Farbe annimmt. Nach einer extrem kurzen Zeitperiode von
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etwa 30 bis 60 sec wird die Reaktion abgebrochen, indem
sorgfältig Eisessig zugesetzt wird.
Die Reaktionszeit ist etwas kritisch. Zeitspannen von weniger als 30 see können nicht ausreichend sein, um
eine im wesentlichen vollständige Überführung des Tripeptide in die ungeschützte Form zu erreichen. Andererseits
können Zeiträume von mehr als 60 see zu einer Zersetzung des Produkts führen.
Es ist bekannt, daß die Reduktion mit Natrium im flüssigen Ammoniak eine etwas drastische Methode darstellt.
Diese Umsetzung ist als solche noch niemals als geeigneter Weg beschrieben oder vorgeschlagen worden, um geschütztes
synthetisches TRH in die ungeschützte Form zu überführen, überraschenderweise wurde nun gefunden, daß
das geschützte Tripeptid pGlu-(Bzl)His-Pro-NH2 die reduktive
Entschützungsstufe ohne wesentliche Zersetzung des Tripeptidmoleküls durchläuft.
Ein weiteres überraschendes Merkmal ,der Erfindung liegt
in der großen Leichtigkeit, mit der das in die ungeschützte Form überführte Tripeptid chromatographisch
gereinigt werden kann. Bereits ein einziger Durchlauf des in die ungeschützte Form überführten Reaktionsprodukts
durch eine chromatographische Säule, die mit einer geeigneten Gelfiltrationseinrichtung bepackt ist,
liefert direkt extrem reines synthetisches TRH mit hoher Ausbeute.
Die entsprechenden Eluatfraktionen, die das gewünschte
Produkt enthalten, werden aufgrund der scharfen und symmetrischen Gestalt des Peaks leicht gewonnen.
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Demgegenüber sind die Endreinigungsstufen bei den Verfahren nach dem Stand der Technik langwierig und aufwendig,
wenn man mit der erfindungsgemäß erfoi fanden
einzigen GeIf lltrat ions stufe vergleicht.
Die Erfindung liefert daher ein einfaches Verfahren, das die Hauptnachteile des Stands der Technik überwindet,
d.h. das Problem der Herstellung von nicht-zersetztem, im wesentlichen vollständig in die ungeschützte Form
überführten TRH sowie die bislang erforderliche aufwendige
Endreinigung des Produkts.
Beispiele für geeignete Gelfiltrationsmedien sind Polyacrylamid, Dextran und Agarosegel. Es hat sich gezeigt,
daß solche Dextrangele, wie die Produkte mit dem Warenzeichen Sephadex (eine Reihe von perlenförmigen Dextrangelen,
die von Pharmacia, Uppsala, Schweden, hergestellt wirdX sehr gut dazu geeignet sind, die Endreinigungsstufe
des Peptide bei dem Verfahren der Erfindung durchzuführen.
Synthetisches TRH wird gewöhnlich aus den L-Formen der
Ausgangsaminosäuren hergestellt, um eine Anpassung an die Struktur von natürlichem TRH vorzunehmen. In den
Beispielen und in den Ansprüchen beziehen sich daher die Bezeichnungen "Pyroglutaminsäure", "Histidin" und
"Prolin" sowie diejenigen ihrer Derivate oder Abkürzungen auf die L-Formen der entsprechenden Aminosäuren oder
ihrer Derivate.
Es liegt aber im Rahmen der Erfindung, entweder die L- oder die D- oder beide Formen zu verwenden.
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Die Erfindung wird in den Beispielen erläutert. Beispiel 1
Prolinamidhydrochlorid (6g) und N-t-Butyloxycarbonyl-N m-"benzylhistidin
(13,8 g) wurden in 200 ml Acetonitril in Gegenwart von 4,04 g Triäthylamin und 10,3 g N,N1-Dicyclohexylcarbodiimid
umgesetzt, wodurch N-t-Butyloxycarbonyl-Nim-benzylhistidyl-prolinamid
als öliger Rückstand erhalten wurde. Das öl wurde in 150 ml 2n Bromwasserstoffsäurelösung
in Eisessig aufgelöst. Die Lösung wurde bei Raumtemperatur 1 std lang in einem zugestopften
Kolben belassen und sodann in 1500 ml wasserfreien Äther gegossen. Der feste Niederschlag wurde in Methanol
wieder aufgelöst und erneut mit Äther ausgefällt, wodurch 13,2 g (65,696) kristallines Nim-Benzylhistidyl- ·
prolinamiddihydrobromid erhalten wurde. Der Schmelzpunkt nach der Umkristallisation aus Methanoläther betrug
196 bis 198°C.
Eine Suspension von 13,2 g des obigen geschützten Dipeptiddihydrobromids
in 150 ml N,N-Dimethylformamid, das 5,29 g Triäthylamin enthielt, wurde mit einer Lösung
von 9,9 g Pentachlorphenylpyroglutamat in 130 ml N,N-Dimethylformamid vermischt. Nach einstündigem heftigen
"uhren bei 0 bis 50C und anschließendem 24-stündigem
Rühren bei Raumtemperatur wurde das Reaktionsgemisch im Vakuum zur Trockene eingedampft.
Der Rückstand wurde in 100 ml destilliertem Wasser aufgelöst. Die Lösung wurde abfiltriert und das wäßrige
Filtrat wurde erneut im Hochvakuum zur Trockene einge-
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dampft, wodurch ein öliger Rückstand erhalten wurde, der
in einem Gemisch aus 45 ml Äthylacetat und 10 ml Methanol wieder aufgelöst wurde.
Nach Abfiltrieren des Triäthylaminhydrobromid-Niederschlags, Eindampfen des Filtrats zur Trockene im Vakuum,
Waschen des öligen Rückstands mit 100 ml wasserfreiem Äther, Filtrieren und Trocknen wurden 8,24 g (69,596)
kristallines pGlu-(BzI)His-Prο-NHp gewonnen.
Das Produkt gab bei der DUnnschichtanalyse auf Silikagel
G unter Verwendung eines 60s45:20-Gemisches aus
Chloroform, Methanol und 30#ige Essigsäure als Eluierungsmittel
einen einzigen Flecken (R- = 0,76).
3,1 g N-Carbobenzoxy-pyroglutaminsäure wurden in 80 ml
Tetrahydrofuran aufgelöst und die Lösung wurde unter Rühren mit 2 ml Triäthylamin und 1,27 ml Äthylchloroformiat
versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde während der Zugabe bei 00C gehalten. Sodann wurde es 1 std bei
Raumtemperatur stehen gelassen. Zu dem obigen Gemisch wurde eine Lösung von 8 g N -Benzylhistidinbenzylesterdibenzolsulfonat
und 4 ml Triäthylamin in 40 ml Tetrahydrofuran langsam gegeben und das Ganze wurde etwa 4
std lang umgesetzt.
Nach dem Eindampfen im Vakuum zur Trockene, Waschen des Rückstandes mit 100 ml Wasser, zweimaligem Extrahieren
mit 100 ml Methylenchlorid, Trocknen auf wasserfreiem Na2SO^, Filtrieren und Eindampfen zur Trockene
im Vakuum wurde der Rückstand in Methanol aufgelöst und
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mit wasserfreiem Äther ausgefällt. Dadurch wurde der kristalline N-Carbobenzoxy-pyroglutamyl-N m-benzylhistidinbenzylester
mit einem Schmelzpunkt von 163 bis 165°C erhalten. Die Ausbeute betrig 4,2 g (61,4%).
4,2 g des obigen geschützten Dipeptide wurden in 300 ml Äthanol aufgelöst. Das Gemisch wurde mit 0,5 g 10% Palladium
auf Kohlenstoff versetzt und es wurde 3 std bei Raumtemperatur bei einem Wasserstoff druck von 2 at hydriert.
Kristallines Pyroglutamyl-N -benzylhistidin
wurde mit einer Ausbeute von 2,19 g (85%) erhalten, als das Reaktionsgemisch der Hydrierung üblichen Verfahrensmaßnahmen, wie einer Filtrierung, Eindampfung und Ausfällung
mit wasserfreiem Äther aus einer äthanolischen Lösung des Rückstandes, unterworfen wurde (zur Wiederauflösung
des Rückstandes wurden 30 ml Äthanol verwendet).
2,19 g Pyroglutamyl-Nim-benzylhistidin, 0,93 g Prolinamidhydrochlorid
und 2 ml Triäthylamin wurden in 50 ml Ν,Ν-Dimethylformamid aufgelöst, worauf auf 00C abgekühlt
und mit einer Lösung von 1,52 g Ν,Ν'-Dicyclohexylcarbodümid
in 20 ml N,N-Dimethylformamid umgesetzt
wurde.
Nach 48-stündigem Rühren bei Raumtemperatur, Abfiltrieren
und Eindampfen zur Trockene wurden 1,25 g (45%) pGlu-(BzI)HiS-PrO-NH2 gewonnen und durch Umkristallisation
aus Methanol gereinigt.
Die Dünnschichtchromatographie ergab, daß das Produkt mit dem Produkt des Beispiels 1 identisch zu sein schien.
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Ein stickstoff geschützter Reaktor, der mit © „a@ü Magnetrührer
versehen wa2% wurde mit etwa 500 ml flüssigem Ammoniak
und 1 g reinem PGIn-(BzI)HiS-PrO-NH2 beschickt.
Es wurde allmählich Natrium zugesetzt, bis die Läsung eine dauernde blau© Färbung angenommen hatte. Nach 30
see wurde die Reaktion durch sorgfältige Zugab© von etwa 1 ml Eisessig abgebrochen. Das Gemisch wurde zur Trokkene
eingedampft und der Rückstand wurde in 0,2n Essigsäure wieder aufgelöst.
Die resultierende Lösung wurde abfiltriert und durch eine Chromatographiesäule mit den Abmessungen 2,2 χ 110 cm
geleitet, welche mit Sephadex G-15 bepackt war, das mit
0,2n Essigsäure ins Gleichgewicht gebracht worden war. Die Durchführung der Gelfiltration mit 25 ml/std bei
Verwendung der gleichen 0,2n Essigsäure als Eluierungsmittel lieferte einen symmetrischen Peak des Eluats. Die
Eluatfraktionen, die der Peakfläche entsprachen, wurden
gesammelt und lyöphilisiert, wodurch 0,58 g (72,5%)
hochreines pGlu-HiS-PrO-NH2 (TRH) erhalten wurden. Eine
Dünnschichtanalyse, die auf Platten mit Silikagel G, welche eine std bei 120°C aktiviert worden waren (250 μ),
unter Verwendung entweder des Systems Chloroform : Methanol : konzentriertes Ammoniak (60 : 45 : 20) oder
des Systems Chloroform : Methanol : 3O96ige Essigsäure
(60 : 45 : 20) durchgeführt wurde, zeigte in beiden Fällen einen einzigen Flecken mit Rf-¥erten von 0,6
bzw. 0,36.
Das Produkt schien von Ammonium- (Nessler's Reagenstest) und Halogenidionen vollständig frei zu sein.
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Die Aminosäureanalyse bestätigte die erwartete Struktur,
d° « - 41° (c « ΐ in Methanol).
Beispiel 4
Das Beispiel 3 wurde wiederholt, mit der Ausnahme, daß
8,24 g reines pGlu-(BzI)HiS-Prο-NH2 mit Natrium in
2500 ml flüssigem Ammoniak in die ungeschützte Form umgewandelt wurden und daß etwa 6 ml Eisessig dazu
verwendet wurden, um die Reaktion abzubrechen.
Das rohe Reaktionsprodukt wurde durch eine Säule mit Abmessungen von 5,5 x 135 cm von Sephadex G-15 mit
ml/std geleitet, wobei das gleiche Eluierungsmittel wie im Beispiel 3 verwendet wurde. Es wurden 4,65 g
(70,5%) hochreines pGlu-His-Pro-NH2 erhalten.
Die Analysenergebnisse zeigten, daß dieses Produkt extrem rein war und daß es mit beiden Produkten des Beispiels
3 identisch war.
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Claims (5)
1. Verfahren zur Herstellung von hochreinem Pyroglutamylhistidylprolinamid (TRH) durch Synthese aus
geschützten Aminosäuren, Entfernung der Schutzgruppen und Endreinigung des rohen? in die ungeschützte Form
überführten Tripeptide, dadurch gekennzeichnet, daß man Pyroglutamyl-N -benzylhistidyl-prolinamid reduktiv mittels Natrium in flüssigem Ammoniak
in die ungeschützte Form überführt und daß man das rohe
ungeschützte Tripeptid durch eine Gelfiltrationseinrichtung leitet.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die reduktive überführung in
die ungeschützte Form in der Weise durchführt, daß man das geschützte Tripeptid in flüssigem Ammoniak auflöst,
allmählich Natrium zusetzt, bis die Lösung eine dauernde blaue Färbung annimmt, und die Reaktion mit Eisessig
30 bis 60 see nach Auftreten der dauerenden blauen Färbung abbricht. :
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man das rohe, in die
ungeschützte Form überführte Tripeptid aus dem Reaktionsgemisch gewinnt und ohne Zwischenreinigungsstufe
direkt durch die Gelfiltrationseinrichtung leitet.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als
Gelfiltrationseinrichtung Dextrangel verwendet.
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5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man das
rohe, in die ungeschützte Form überführte Tripeptid mittels einer einzigen Gelfiltrationsstufe reinigt.
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