DE2214490A1 - Hämopeptide und Verfahren zu ihrer Herstellung - Google Patents
Hämopeptide und Verfahren zu ihrer HerstellungInfo
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- C07K—PEPTIDES
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Description
Die Erfindung betrifft neue synthetische Hämopeptide, die im
folgenden als Pl, P2, H und S bezeichnet v/erden. Das Hämopeptid Pl hat die Peptidkette Val-his~leu-ser~ala~glu-glu-lysglu-ala; das Hämopeptid P2 hat die Peptidkette Val-his-leuser-ala-glu-glu-lys-g.ln.~ala; das Hämopeptid H hat die Peptidkette Val-his-leu-thr-pro-glu-glu-lys-ser-ala und das Hämopeptid S hat die Peptidkette Met-leu-thr-ala-glu-glu-lys-alaala. Das Verfahren gemäß der Erfindung zur Herstellung dieser Hämopeptide ist eine gesteuerte stufenweise Synthese, bei der die einzelnen Aminosäuren der Peptidkette in der angegebenen
Reihenfolge durch Peptidverknüpfungen miteinander verbunden
v/erden. Die Erfindung betrifft auch bei diesen Verfahren hergestellte Zwischeriverbindungen. Insbesondere werden die neuen Kcüi.op-ptiao hergestellt, indem man entweder nacheinander jede der einzelnen Aminosäuren stufenweise in der angegebenen Reihc/ji'o-i ^e einfuhrt oder indem man zwei oder mehr Segmente der
Peptiokc-tte herstellt und diese dann in der angegebenen Reihenf"o.!(-,c: r...;ttii;;jndtjr· verknüpft.
folgenden als Pl, P2, H und S bezeichnet v/erden. Das Hämopeptid Pl hat die Peptidkette Val-his~leu-ser~ala~glu-glu-lysglu-ala; das Hämopeptid P2 hat die Peptidkette Val-his-leuser-ala-glu-glu-lys-g.ln.~ala; das Hämopeptid H hat die Peptidkette Val-his-leu-thr-pro-glu-glu-lys-ser-ala und das Hämopeptid S hat die Peptidkette Met-leu-thr-ala-glu-glu-lys-alaala. Das Verfahren gemäß der Erfindung zur Herstellung dieser Hämopeptide ist eine gesteuerte stufenweise Synthese, bei der die einzelnen Aminosäuren der Peptidkette in der angegebenen
Reihenfolge durch Peptidverknüpfungen miteinander verbunden
v/erden. Die Erfindung betrifft auch bei diesen Verfahren hergestellte Zwischeriverbindungen. Insbesondere werden die neuen Kcüi.op-ptiao hergestellt, indem man entweder nacheinander jede der einzelnen Aminosäuren stufenweise in der angegebenen Reihc/ji'o-i ^e einfuhrt oder indem man zwei oder mehr Segmente der
Peptiokc-tte herstellt und diese dann in der angegebenen Reihenf"o.!(-,c: r...;ttii;;jndtjr· verknüpft.
209eVi/1196
BAD
804 t 22UA90
Die Hämopeptide Pl, P2, H und S sind zum Induzieren der Freigabe
und bzw. oder Synthese von Hormonen durch lebende Organismen
wertvoll und bewirken insbesondere die Freigabe von Wachstumshormonen durch Zellen des Hypophysenvorderlappens. Sie
werden zweckmäßig durch Injektion, vorzugsweise durch intrakarotide
Injektion, verabreicht, wenn eine Abgabe und bzw. oder Synthese von Wachstumshormon erwünscht ist.
Im folgenden werden für die einzelnen Aminosäuren, ihre Derivate
und bevorzugte Abschirmungsgruppen folgende Abkürzungen verwendet:
L-Alanin AIa
L-Glutaminsäure GIu
L-Glutamin GIn
L-Histidin " His
L-Leucin Leu
L-Lysin Lys
L-Methionin " Met
L-Prolin · Pro
L-Serin Ser
L-Threonin Thr
L-VaI in VaI
Derivate; abschirmende
N-Carboxynnhydrid . NCA
N-Thiocarboxyanhydrid TCA
Benzyloxycarbonyl Cbz
(Carbobenzoxy)
tnrt iür-Butylojxycarbony 1 tBOC
N -lly ö.voxy sue c inimid ester NHS
Methylester OMe
- 2 209841/1196
Gemäß der Erfindung werden die Hämopeptide Pl, P2, H und S ·■
durch stufenweise Kupplung (durch Peptidverknüpfungen) der entsprechenden einzelnen Aminosäuren hergestellt, wobei die
Kupplung durch Umsetzen der entsprechenden Aminosäure der Folge (in der Form eines' Derivats, in dem die Carboxylgruppe
aktiviert und anwesende Aminogruppen abgeschirmt sind) zuerst mit Alanin (der Aminosäure" am C-Ende, d.h. dem Carboxyende
der Polypeptidkette) und dann mit dem jeweils als Zwischenverbindung
erhaltenen Polypeptid durchgeführt wird. Dieses Verfahren wird hier als Stufensynthese bezeichnet. Wenn
diese Stufensynthese in Lösung durchgeführt wird, so wird als carboxylgruppenaktivierte Aminosäure im allgemeinen vorzugsweise
das Aminosäure-NCA, das Aminosäure-TCA, das Aminosäureazid
oder ein aktivierter Ester, wie der NHS-Ester einer solchen Aminosäure, verwendet. Diese NCA- und TCA-Stufensynthesen
sind in der FR-PS 1 497 5^6 beschrieben.
Alternativ werden die Hämopeptide Pl, P2, H und S, angefangen vom C-Ende durch eine Festphasenstufensynthese hergestellt. In
diesem Verfahren wird das Carboxylende der endständigen Aminosäure, Alanin (und in den folgenden Stiifen des entsprechenden
Polypeptids) covalent an einen unlöslichen Polymerträger
(insoluble polymeric resin support), wie beispielsweise als Carbonsäureester des in Hydroxymethyl/subst. Polystyrol/Divinylbenzol-Harz
anwesenden, in dem Harz gebundenen Benzylalkohols, gebunden. Bei diesem Festphasenverfahren kann die
Peptidkupplung eine direkte Kondensation zwischen der freien Carboxylgruppe einer Aminosäure und der Aminogruppe des harzgebu.iiüonen
Alanins oder Polypeptids sein. Eine solche Umsetzung wird gewöhnlich in Gegenwart eines Kupplungsmittels, wie Dicycloh«.xy3cprbodiimid,
durchgeführt; jedoch kann die Aminosäure auch in eier For-n einer carboxyl gruppen al·: t !vierten Aminosäure, wie dem
einem Arninosäureazid und dergl. verwendet werden.
209841/1 196
14 804 <. 22U490 ι
Statt durch eine Stufensynthese können die Hämopeptide' Pl, P2, >
H und S auch durch eine Blocksynthese hergestellt werden. Dabei ι
werden verschiedene Peptidsegmente der Hämopeptidketten einzeln !
synthetisiert, und diese Segmente werden dann in der erforderlichen Reihenfolge zu dem gewünschten Polypeptid gekuppelt. Die
Peptidsegmente ihrerseits werden zweckmäßig durch Stufensynthese \
in Lösung nach dem NCA, TCA, Azid- oder NHS-Ester-Verfahren oder !
durch Festphasenstufensynthese unter Verwendung eines carboxyl- I
gruppenaktivierten NHS-Esters oder Aminosäureazlds oder ge- \
wünschtenfalls einer eine freie Carboxylgruppe enthaltenden j
Aminosäure zusammen mit einem Kupplungsmittel hergestellt. Die j
Anzahl Aminosäuren in den für die Blocksynthese der Hämopeptide · ;
Pl, P2, H und S verwendeten Peptidsegmenten kann zwischen zwei ;
und acht variieren. Jedoch werden vorzugsweise Peptidsegmente,
die fünf oder weniger Aminosäuren enthalten, verwendet, um Kondensationsreaktionen größerer Peptidsegmente mit entsprechenden ι Verlusten an diesen wertvolleren höheren Peptidfragmenten zu ■ vermeiden. ;
die fünf oder weniger Aminosäuren enthalten, verwendet, um Kondensationsreaktionen größerer Peptidsegmente mit entsprechenden ι Verlusten an diesen wertvolleren höheren Peptidfragmenten zu ■ vermeiden. ;
Bei der Lurchführung dieser Stufen- oder Blocksynthesen, bei
denen eine Carboxyl- (oder aktivierte Carboxyl-) Gruppe einer
Aminosäure und eine Aminogruppe der anderen miteinander rea- \ gieren, werden gewöhnlich vorzugsweise die Aminogruppen in der ' der Reaktion unterworfenen Aminosäure oder dem Peptid am
Carboxylgruppenende des Moleküls sowie andere funktioneile
Gruppen in beiden Reaktionsteilnehmern, die unter den Bedingungen einer solchen Synthese reaktiv sind, abgeschirmt. Die
abschirmenden Gruppen'müssen ihre abschirmende Wirkung unter
den Bedingungen der Kupplung behalten und müssen selektiv abtrennbar sein, ohne die Peptidverknüpfungen anzugreifen. Abschirmende Gruppen, die in einer folgenden Stufe abgetrennt
werden sollen, müssen außerdem selektiv so abtrennbar sein,
daß andere abschirmende Gruppen, die für nachfolgende Kupplungsstufen erhalten bleiben sollen, nicht angegriffen werden.
denen eine Carboxyl- (oder aktivierte Carboxyl-) Gruppe einer
Aminosäure und eine Aminogruppe der anderen miteinander rea- \ gieren, werden gewöhnlich vorzugsweise die Aminogruppen in der ' der Reaktion unterworfenen Aminosäure oder dem Peptid am
Carboxylgruppenende des Moleküls sowie andere funktioneile
Gruppen in beiden Reaktionsteilnehmern, die unter den Bedingungen einer solchen Synthese reaktiv sind, abgeschirmt. Die
abschirmenden Gruppen'müssen ihre abschirmende Wirkung unter
den Bedingungen der Kupplung behalten und müssen selektiv abtrennbar sein, ohne die Peptidverknüpfungen anzugreifen. Abschirmende Gruppen, die in einer folgenden Stufe abgetrennt
werden sollen, müssen außerdem selektiv so abtrennbar sein,
daß andere abschirmende Gruppen, die für nachfolgende Kupplungsstufen erhalten bleiben sollen, nicht angegriffen werden.
« 4 209841/1196
14 804 % ς 22U490
Zu den gewöhnlich verwendeten Aminogruppen abschirmenden Gruppen gehören Salzbildung, die sich insbesondere zur Abschirmung
stark basischer Aminogruppen eignet* Acylsubstituenten, wie
Formyl, Phthalyl, Trifluoraeetyl, Toluolsulfonyl, Dibenzylphosphoryl,
Nitrophenylsulfenyl, Tritylsulfenyl, o-Nitrophenoxyacetyl
und dergl., Urethan abschirmende Substituenten,
wie Benzyloxy-earbonyl (Carbobenzoxy), p-Methoxycarbobenzoxy, p-Nitroearbobenzoxy, t-Butyloxycarbonyl, 2-(p-Biphenylyl)-2~
propyloxyearbonyl, Isonieotinyloxycarbonyl und dergl., Alkylgruppen
enthaltende Substituenten, wie Triphenylmethyl, Tri-.
alkylsilyl, Trimethylsilyl und dergl. Vorzugsweise wird
die a-Aminogruppe in den Aminosäuren (oder Pep-
t-iden) die der Umsetzung am Carboxylende des Moleküls unterworfen
werden, unter Verwendung von t-Butyloxycarbonyl (tBOC)
abgeschirmt, da diese Gruppe nach jeder solchen Reaktion und vor der nachfolgenden Stufe (in der eine solche ce-Amino gruppe
selbst an einer Umsetzung teilnimmt) leicht durch verhältnismäßig milde Wirkung von Säuren (beispielsweise die Einwirkung
von Trifluoressigsäure für eine Zeit von 5 bis 10 Minuten) abgetrennt
werden kann, wobei eine solche milde Säurebehandlung Gruppen, wie Carbobenzoxy (Cbz) und Isonicotinyloxycarbonyl,
die zur Abschirmung anderer Aminogruppen, wie der β-Aminogruppe
von Lysin verwendet werden und die durch die starke Einwirkung einer starken Säure (beispielsweise Bromwasserstoff in Eisessig
oder wasserfreiem Fluorwasserstoff in Gegenwart von Anisol für etwa 1 Stunde) abspaltbar sind, nicht angreift.
Gewöhnlich verwendete Carboxylgruppen abschirmende Gruppen sind beispielsweise Amide, Salzbildung, Estersubstituenten, wie die
Methyl- und Ä'thylester (die bevorzugt sind, wenn eine anschließende
Umwandlung; über das Hydrazid in das Azid erwünscht ist), der Benzylester und insbesondere der harzgebundene Benzylester, der
in der Festphasensynthese verwendet wird (und direkt mit Hydrazin unter Abspaltung des Peptids von dem Harz und Bildung des Peptidhydrazids
reagiert), p-Nitrobenzylester, t-Butylester und dergl.
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14 804 6 22H490
Hydroxygruppen werden bei der Synthese der Hämopeptide gewöhnlich
nicht abgeschirmt, wenn die Kupplungsreaktionen in Lösung durchgeführt werden. Jedoch kann gewünschtenfalls eine solche
Abschirmung mit Tetrahydropyranyl, Benzyl, Trifluoracetyl, t-Butyl und dergl. erfolgen. Dagegen werden diese 0-abschirmenden
Substituenten und insbesondere die O-Benzyl- und die 0~t-Butyl-Gruppe
gewöhnlich vorzugsweise in einer Festphasensynthese zur Herstellung des Hämopeptids Pl oder der Serin oder Threonin
enthaltenden Segmente der Kette vorwendet. Auch der Imidazolstickstoff
von Histidin kann gewünschtenfalls abgeschirmt werden, wofür 'vorzugsweise ein N-Kohlenwasserstoff (oder substituierter
Kohlenwasserstoff), wie N-Benzyl, N~(2,4~Dinitrophenyl)
und dergl. verwendet wird.
Die Wahl der abschirmenden Gruppen wird teilweise durch die angewandten
Kupplungsbedingungen und teilweise durch die für die Umsetzung verwendeten Aminosäuren oder Peptide vorgeschrieben.
Richtlinien für die Auswahl bestimmter abschirmender Gruppen sind in der oben erwähnten FR-PS 1 496 5^6 niedergelegt.
Das bevorzugte Gesamtverfahren für .die Herstellung des Hämopeptids
Pl kann schematisch dargestellt werden, wie in der folgenden Figur 1 gezeigt:
984^ Π 196
8o4
22U49Q
Ala
GIu-NCA
Glu-ala
Glu-ala
NHS
a-tBpC-6-Cbz-lysglu-ala
F^CCOOH
6-Cbz-lys-glu-ala
6-Cbz-lys-glu-ala
GIu-NCA
Glu-6-Cbz-lys-gluala
GIu-NCA
Glu-glu~£-Cbz«lys · glu-ala
■tBOC-val-his-leu*
ser-ala-N^, Leu-OMe HCl
His-TCA HBr His-leu-OMe 2H0AC
His-TCA HBr His-leu-OMe 2H0AC
a-tBOC-6-Cbz-lys.-. J
tBOC-val-NHS
tBOC-val-his-leu-OMe
H2NNH2
tBOC-val-his-leu-NHNH2
I HONO
tBOC-val-his-leu-N
AIa-OMe
10 tBOC-ser-NHS tBOC-ser-ala-OMe
12 11
Ser-ala-OMe F^CCOOH
tBOC-yal-his-leu-serala-OMe
P5CCOOH
tBOC-val-his-leu-ser l2
HONO
tBOC-val-his-leu-ser-ala-glu-glu-^-Cbz-lys-glu-ala
wasserfreies HF
Val-his-leu-ser-ala-glu-glu-lys-glu-ala
Die Zahlen neben den Pfeilen geben die Nummer des Beispiels an.
Figur 1
- 7 209841/1196
804 221U90
Das bevorzugte Gesamtverfahren für die Herstellung des Hämopeptids P2 kann schematisch dargestellt werden, wie in der
folgenden Figur 2 gezeigt;
Ala
I GIn-NCA Gln-ala
α-tBOC-£~Cbz-Iys-NHS
a-tBOC-6-Cbz-lysgln-ala
Ilf:
CCOOH
£-Cbz-lys~gln~ala
GIu-NCA
Gl
ala
ala
GIu-NCA
Glu-glu-C-Cbz-lysgln-ala
tBOC-val-his-leuser-ala-N^
Leu-OMe HCl
His-TCA His-leu-0Me-2H0AC
tBOC-val-NHS
tBOC-val-his-leu-OMe
H2NNH2
tBOC-val~his«leu-NHNH«
10
HONO
tBOC-val-his-leu-N-
12 11
Ser-ala-OMe*F^CCOOH <-
AIa-OMe
tBOC-ser-NHS
tBOC-ser-ala-OMe
F,CCOOH
. tBOC-val-hiS'-leU'-serala-OMe
H2NNH2
tBOC-val-his-leu-ser-
Vi XXlM JlI j^}
HONO
tBOC-val-his-leu-ser-ala-glu-glu-^-Cbz-lys-gln-ala
wasserfreies HP
Yai-his-leu-ser-ala-glu-glu-lys-gln-ala
Die Zahlen neben den Pfeilen geben die Muinmer des Beispiels an.
Figur 2
- 8 -209841/1196
8o4
Das bevorzugte Gesamtverfahren für die Herstellung des*Hämopeptids
H kann schematisch dargestellt werden, wie in der folgenden Figur J5 gezeigt i
AIa-OMe HCl I tBOC-ser-NHS
tBOC-ser-ala-OMe 2
P3CCOOH
Ser-ala-OMe P3CCOOH
l·
GIu-NCA
Leu-OMe HCl
I His-TCA-HBr His-leu-OMe 2H0AC
1 tBOC-val-NHS tBOC-val-his-leu-OMe
a-tBOC-6-Cbz-lys-NHS
a-tBOC-i-Cbz-lysser-ala-OMe
.a) NaOH
b) P^CCOOH [c) pS 5,05
b) P^CCOOH [c) pS 5,05
£-Cbz-lys-ser-ala GIu-NCA
GIu- 6-Cbz-lys -serai a
H2NNH2
tBOC-val-his-leu-NHNH2
HONO
tBOC-val-his -leu-N I Thr-pro-OMe HCl
tBOG-val-his-leuthr-pro-OMe
H2NNH2
Pro
tBOC-thr-NHS
tBOC-thr-pro
F^CCOOH
Thr-pro F5CCOOH
CH5OH SOCl0
16 tBOC-val-his-leuthr-pro-NHNHg
HONO
Glu-glu-£-Cbz-lys~
ser-ala
tBOC-val-his-leuthr-pro-N-z
tBOC-val-his-leu-thr-pro-glu-glu-E-Cbz-lys-ser-ala
iv/asserfreies HF
VaI-his-lcu-thr-pro-glu-glu-lys-ser-ala
Die Zahlen neben den Pfeilen geben die Nummer des Beispiels an.
Figur 5
- 9 -209841/1196
Oo'l
JO
Dnr, bovorr-Ußte fiofinmtvorfahren fUr die» llorntnllunj», den "HKmopoptidfj
f> kann r.chomntisch darpjentrllt worden, wie in der
fol^ondon Ficv>r H
Ala
J AIa-TCA Aln-nla
a-tBOC-C-Cbz-lyR-NIir.-eBter
a-tDOC-£-Cbz-lys».ala-ala
J P,CCCOH C-Cbz-lys-ala-ala
H GIu-NCA Glu-6-Cbz-lys-nla-ala
GIu-NCA Glu-glu-t-Cbz-lyn-ala-ala
tPr/C-niet-leu-thr-ala-N-AIn-OMo
V tnoc-thr-Nlin-cntor
tnoc-thr-alo-OKo
F.CCOOH
Thr-aln-OMe F^CCOOII ·
tBOC-leu-llHS-PHtor
tnOC-leu-thr-nln-v^Mo
ti
F,CC0011
I tnoC-met-NHS-cfiter
tnOC-met-lou-thr-nla-Ofie
11
tnOC-met-leu-thr-aln-lül!)!!;,
HONO
tBOC-met-leu-thr-ala-ßlu-Klu-H-Cbz-lys-ala-ala
\ia.3serfreies IW
Met-leu-thr-ala-glu-clu-lys-ala-ala
Die Zahlen neben den Pfeilen p:eben die Mummer den
Figur H
COPY ;'
BAD ORIGINAL 2 O 9 8 A 1 /Ί 1 9
Diese bevorzugten flesamtverfahren sind Kombinationen von Stufen-Synthesen und Blocksynthesen, bei denen zunächst einzelne Pep-
der Deoapeptidkette durch Stufensynthese entweder in
odor durch FentphaoenntuferiGyntheße gebildet und diese
Seimente dann in der erforderlichen ReJhenfolce miteinander gekuppoJt werden. Dei diesem Verfahren wird der tBOC-Substituent
zu·' Abrchirmunp; von a-Aminogruppen, der Cbz-Substituent zur Ab-Rcliirrrunp, der E-Aminotfruppe von Lysin und der Methyleßtersubstituent zur Abschirmung der Carboxy gruppen vor. Alanin, Leucin,
Lcucln-thrconyl-alanln, Hietidyl-leuoin, Seryl-alanin, Threonylnlnnln und Threonyl-prolin verwendet. Der Methylester dient auch
dom weiteren Zweck, die Zwischenverbinduncen für die Herstellung
von tHOC-val-hin-lcu-azid, tBOC-val-hiß-lou-ser-ala-azid und
tHOC-vnl-hls-leu-thr-pro-nzid Über das Hydrazid zu liefern. Die
oben definiertsn HHiropcptido können aber otatt nach diesen bevorzugten Verfahren nuoh nach versohledonen Permutationen davon
oder Alternativen und unter Verwendune anderer abschirmender
(•ruppen, die den obi^on Kriterien cenllßen, hernnstollt werden,
wobei auch bei solchen Alternativen i'.tufenoynthcsen in Lösung,
Ptufenrjyntheoon in fester Phaoc und Kombinationen von Stufeniiiid niocksynthoiJcn angewandt werden.
Wio nus Pipur 1 zu erßehen, wird boi dem bevorzupten Gesamtver-
°Miron zur Hrrftlclluni; ucn HMmopeptido Pl in niner fltufenaynthese
in Li>ruii£ (a) dna nbncschlrmto Pentapeptidnetvn^nt Glu-p.lu-C-Cbz«
ly:j-r.l»i-ola und fb) das oarboxylgruppenakb!vierte nbeoeuhirmte
Pt-ntaprptidcoor.cnt tJBOC-vnl-his-lou-anr-aln-nzid hercontellt.
Pn.«; err.trro Pentnppptid wird horßertellt, Indern man Alanin mit
UIu-WCA u.T.set-/t. Dieße UmootzunR «rf öl et durch krUftiRon VorrUhroti dor Itonktlonstcllnehmor in wlißrlucr LUiiun^ bejm pH 10,2,
miter welchen Dodlnßunccn die Umsetzung gcwühnlluh in otwa 1 bin
J? Minuten beendet int. Die »lknliBcho Löminr. vilrd angesäuert,
wobt»1 dnr. nln ZwinchenvcrbJndunR Gebildete Cnrbamat unter DiI-i'. cJiic·!· vi?lf1rii;<n L'inuni: von Gl\i-nlo zoruetzt. wird. Ktwn daß
'oh·. Vo]im.·η ?'t)jniit>] wird KUßnectrt, und die wh'Orin~?^thanoli-
COPY / -U-
Λ 22Η490
sehe Lösung von Glu-ala wird mit dem NHS-ester von a-tBOC-€-Cbz-lysin
zu a-tBOC-S-Cbz-lys-glu-ala umgesetzt, während das
pH bei etwa 8,0 gehalten wird. Das abgeschirmte Tripeptid wird
mit Trifluoressigsäure umgesetzt, wodurch die abschirmende tBOC-Gruppe
abgetrennt und £~Cbz-lys-glu-ala gebildet.wird. Dieses
abgeschirmte Tripeptid wird durch Einstellen des pH auf 4,1
aus der wäßrigen Lösung gefällt.
Dieses £-Cbz-lys-glu-ala wird mit dem N-Carboxyanhydrid von
Glutaminsäure (GIu-NCA) umgesetzt, indem man die Reaktionsteilnehmer
in wäßriger Lösung beim pH 10,2 kräftig miteinander verrührt. Unter diesen Bedingungen ist die Umsetzung gewöhnlich in
etwa 1 bis 2 Minuten beendet. Die alkalische Lösung wird angesäuert, wobei das als Zwischenverbindung gebildete Carbamat zersetzt
und eine Lösung von Glu-£-Cbz-lys-glu-ala, die nach Einstellen
des pH auf 10,2 unter kräftigem Rühren mit weiterem Glu-NCA unigesetzt wird, gebildet wird. Die Reaktionslösung wird
angesäuert, wobei das als Zwischenverbindung gebildete Carbamat zersetzt wird, unddas pH der wäßrigen Lösung wird auf 3,5 eingestellt,
wobei das abgeschirmte Pentapeptid Glu-glu-C-Cbz-lysglu-ala
ausgefällt wird«
Das endständige Dipeptidsegment des anderen Pentapeptids wird
in der Form seines Methylester-trifluoracetats Ser-ala-OMe
F-,CCOOH hergestellt, indem man zunächst den Alaninmethylester
mit dem NHS-ester von N-tBOC-serin in Lösung in Dimethylformamid
unter alkalischen Bedingungen (vorzugsweise pH 8,0) unter Bildung des tBOC-ser-ala-OMe umsetzt. Dieses Dipeptid wird mit
Trifluoressigsäure zu Ser-ala-OMe-trifluoracetat umgesetzt.
Das für die Synthese des Hämopeptids Pl noch erforderliche Tripeptid,
nämlich Val-his-deu, wird hergestellt, indem man deti
Leuciiiinethylester mit dem N-Thiocarboxyanhydrid von Histidin
(das als Hie-TCA HDr zugesetzt wird) in wäßriger Lösung unter
kräftigem Rühren beim pH 9,5 umsetzt. Unter diesen Bedingungen
Xf-
2 098 A1/1196
i'st die Umsetzung gewöhnlich in etwa 20 Minuten beendet. Die
alkalische Lösung wird angesäuert, wobei das als Zwischenverbindung gebildete Thiocarbamat zersetzt wird, und das pH der
angesäuerten Lösung wird auf 5*0 eingestellt, Verunreinigungen
werden abfiltriert, und das Filtrat wird im Vakuum eingedampft, wobei man das Dipeptid His-leu in der Form seines Methylesters
erhält. Das so erhaltene Rohmaterial wird durch Chromatographie an Silieagel unter Verwendung von n-Butanol/Essigsäure/Wasser
als Eluierungsmittel gereinigt, wobei das His-leu-OMe-diaeetat
erhalten wird. Dieses His-leu-OMe-diacetat wird in Lösung in
Dimethylformamid mit dem NHS-ester von N-tBOC-valin unter
schwach alkalischen Bedingungen (vorzugsweise pH 8,0) zu dem Tripeptid tBOC-val-his-leu-OMe umgesetzt, wonach dieses Tripeptid
mit Hydrazin umgesetzt und das gebildete Hydrazid mit salpetriger Säure zu dem tBOC-val-his-leu-azid umgesetzt wird.
Das tBOC-val-his-leu-azid wird mit Ser-ala-OMe-trifluoracetat
in Lösung in Dimethylformamid unter schwach alkalischen Bedingungen (vorzugsweise pH 8,0) zu dem entsprechenden abgeschirmten
Pentäpeptid tBOC-val-his-leu-ser-ala-OMe umgesetzt, und
dieses wird dann mit Hydrazin umgesetzt und das Hydrazid wird mit salpetriger Säure versetzt, wobei das tBOC-val-his-leuser-ala-azid
gebildet wird.
Die beiden abgeschirmten Pentapeptide Glu-glu-S-Cbz-lys-glu-ala
und tBOC-val-his-leu-ser-ala-azid werden in Lösung in Dimethylformamid
unter schwach alkalischen Bedingungen (vorzugsweise pH 8,0) zu dem abgeschirmten Decapeptid tBOC-val-his-leu-serala-glu-glu-£-Cbz-lys-glu~ala
umgesetzt.
Das tBOC-val-his-leu-ser-ala^glu-glu-E-Cbz-lys-glu-ala oder
ein anderes abgeschirmtes Derivat des Hämopeptids Pl wird dann
der starken Einwirkung einer starken Säure als Spaltmittel, beispielsweise wasserfreier Halogenwasserstoffsäure als sol-«
eher oder in Lösung in einem praktisch wasserfreien nicht-
1}
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209841/1196
hydroxylischen, praktisch nicht-basischen, organischen1Lösungsmittel
für diese Halogenwasserstoffsäure, beispielsweise wasserfreiem
Fluorwasserstoff, Bromwasserstoff in Eisessig, Chlorwasserstoff
in Äthylacetat und dergl., unterworfen, wobei unter Abtrennung der abschirmenden Gruppen Val-his-leu-ser-ala-gluglu-lys-glu-ala,
d.h. das unsubstituierte Hamopeptid Pl gebildet
wird. Im allgemeinen ist es vorteilhaft, bei dieser Spaltung mit starker Säure ein Carboniumionendesoxydationsmittel,
wie Anisol, Veratrol, Dimethylsulfid, Methionin und dergl., das den bei der Spaltung in Freiheit gesetzten abschirmenden Substituenten in eine nicht-reaktive Form überführt, zu verwenden.
wie Anisol, Veratrol, Dimethylsulfid, Methionin und dergl., das den bei der Spaltung in Freiheit gesetzten abschirmenden Substituenten in eine nicht-reaktive Form überführt, zu verwenden.
Wie durch Figur 2 veranschaulicht, wird bei dem bevorzugten Gesamtverfahren
zur Herstellung des Hämopeptids P2 durch Stufensynthese
in Lösung (a) das abgeschirmte Pentapeptidsegment GIuglu-E-Cbz-lys-gln-ala
und (b) das carboxylgruppenaktivierte abgeschirmte
Pentapeptidsegment tBOC-val-his-leu-ser-ala-azid hergestellt.
Das erstere Pentapeptid wird hergestellt, indem man
Alanin mit GIn-NCA umsetzt, wobei diese"Umsetzung unter kräftigem Verrühren der Reaktionsteilnehmer in wäßriger Lösung vom
pH 10,2 durchgeführt wird. Unter diesen Bedingungen ist die Umsetzung gewöhnlich in etwa 1 bis 2 Minuten beendet. Die alkalische Lösung wird angesäuert, so daß das als Zwischenverbindung
gebildete Carbamat unter Bildung einer wäßrigen Lösung von
Gln-ala zersetzt wird. Ein etwa gleiches Volumen Äthanol viird
zugesetzt, und die wä.3rig-äthanolische Lösung von Gln-ala wird
mit NHS-ester von cc~tBOC-£-Cbz~lysin zu a-tBOC-^-Cbz-lys-gln-ni umgesetzt, wobei das pH bei etwa 8,0 gehalten wird. Dieses abgeschirmte Tripeptid wird mit Trifluoressigsäure umgesetzt, wobei die abschirmende tBOC-Gruppe unter Bildung des E-Cbz-lys-gln-a] abgetrennt wird. Dieses abgeschirmte Tripeptid wird aus der
wäßrigen Lösung durch Einstellen des pH auf 5*2 gefällt.
Alanin mit GIn-NCA umsetzt, wobei diese"Umsetzung unter kräftigem Verrühren der Reaktionsteilnehmer in wäßriger Lösung vom
pH 10,2 durchgeführt wird. Unter diesen Bedingungen ist die Umsetzung gewöhnlich in etwa 1 bis 2 Minuten beendet. Die alkalische Lösung wird angesäuert, so daß das als Zwischenverbindung
gebildete Carbamat unter Bildung einer wäßrigen Lösung von
Gln-ala zersetzt wird. Ein etwa gleiches Volumen Äthanol viird
zugesetzt, und die wä.3rig-äthanolische Lösung von Gln-ala wird
mit NHS-ester von cc~tBOC-£-Cbz~lysin zu a-tBOC-^-Cbz-lys-gln-ni umgesetzt, wobei das pH bei etwa 8,0 gehalten wird. Dieses abgeschirmte Tripeptid wird mit Trifluoressigsäure umgesetzt, wobei die abschirmende tBOC-Gruppe unter Bildung des E-Cbz-lys-gln-a] abgetrennt wird. Dieses abgeschirmte Tripeptid wird aus der
wäßrigen Lösung durch Einstellen des pH auf 5*2 gefällt.
Dieses £-Cbz-lys-gln-ala wird mit dem N-Carboxyanhydrid von
Glutaminsäure (GIu-NCA) umgesetzt, indem die Reakoionsteil-
Glutaminsäure (GIu-NCA) umgesetzt, indem die Reakoionsteil-
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nehmer in wäßriger Lösung vom pH 10,2 kräftig miteinander verrührt
werden. Unter diesen Bedingungen ist die Umsetzung gewöhnlich in etwa 1 bis 2 Minuten beendet. Die alkalische Lösung
wird angesäuert, wobei das als Zwischenverbindung gebildete Carbamat unter Bildung einer Lösung von Glu-E-Cbz-lysgli'.-ala
zersetzt wird. Dieses wird dann nach Einstellen des pH auf 10,2 unter kräftigem Rühren mit weiterem GIu-NCA umgesetzt.
Die Lösung wird angesäuert, wobei das als Zwischenverbindung gebildete Carbamat zersetzt wird, und das pH der
wäßrigen Lösung wird auf 3,7 eingestellt, wobei das abgeschirmte
Pentapeptid Glu-glu-C-Cbz-lys-gln-ala gefällt wird.
Das andere Pentapeptid in seiner abgeschirmten Form, d.h. das
tBOC-val-his-leu-ser-ala-OMe, wird wie oben im Zusammenhang
mit der Synthese des Hämopeptids Pl beschrieben hergestellt
und dann mit Hydrazin umgesetzt, und das HydrazinumsetzungsprtKiukt
wird mit salpetriger Säure zu'dem tBOC-val-his-leuser-ala-azxd
umgesetzt.
Die beiden abgeschirmten Pentapeptide, Glu-glu-£-Cbz-lys-glnala
und tBOC-val-his-leu-serr-ala-azid, werden in Lösung in
Dimethylformamid unter schwach alkalischen Bedingungen (vor-ϊι-ΐί-,Γ.weise
pH 8,0) zu dem abgeschirmten Decapeptid tBOC-valhis-leu-ßer-ala-glu-glu-i-Cbz-lys-gln-ala
miteinander umge-
Das tBOC-val-lris-leu-ser-ala-glu-glu-S-Cbz-lys-gln-ala oder
c Ir: anderes abgeschirmtes Derivat des Hämopeptids P2 wird
da,.η der starken Einwirkung einer starken Säure als Spaltmittel,
beispielsweise wasserfreier Halogenwasserstoffsäure a]?.:· solcher oder in Lösung in einem praktisch wasserfreien,
nicht-hydroxylisohen, praktisch nicht-basischen, organischen
L">.-;ur-r-;:-:r:3tt':3l für diese Halogenviasserstoff säure, beispielsweise wasserfreiem Fluorwasserstoff, Bromwasserstoff in
}:.J:r>-,::.rA(r, Chlorwr^strstoff in Athylacetat usw. unterwor»
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Λ 221U90
fen, wobei die abschirmenden Gruppen unter Bildung des' VaI-his-leu-ser-ala-glu-glu-lys-gln-ala,
d.h. dem unsubstituierten Hämopeptid P2, abgespalten werden. Im allgemeinen ist es
von Vorteil, bei -dieser Spaltung mit starker Säure ein Carboniumionendesoxydationsmittel,
wie Anisol, Veratrol, Dimethyl- · sulfid, Methionin und dergl., das den bei der Spaltung in Freiheit
gesetzten Substituenten in eine nicht-reaktive Form überführt,
zu verwenden.
Wie durch Figur J> veranschaulicht, wird bei dem bevorzugten Gesamtverfahren
zur Herstellung des Hamopeptids H in Stufensynthese
in Lösung (a) das abgeschirmte Pentapeptidsegment GIuglu-£-Cbz-lys-ser-ala
und (b) das carboxylgruppenaktivierte abgeschirmte Pentapeptidsegment tBOC-val-his-leu-thr-pro-azid
hergestellt. Das erstere Pentapeptid wird hergestellt, indem man Alaninmetbylester mit dem NHS-ester von N-tBOC-serin in
Dimethylformamid unter schwach alkalischen Bedingungen (vorzugsweise
pH 8,0) umsetzt. Das gebildete Dipeptid tBOC-serala-OKf:
wird einer selektiven Säurebehandlung, vorzugsweise
mit TrifluoreSoigsh'ure, unterworfen, um die abschirmende
tBOC-Gruppe abzutrennen und das freie a-Amin Ser-ala-OMe zu
bilden. Das Ser-ala-OMe wird-dann in Dimethylformamid mit dem NHS-ester von α-tBOC-E-Cb2-Iysin zu dem a-tBOC-S-Cbzlys-ser-ala-OMe
umgesetzt. Dieses abgeschirmte Tripeptid
wird zunächst mit wc!!Brig alkalischer Lösung umgesetzt, um
die Kethylectercruppe abzuhydrolyeieren, und dann mit Trifluoressigsäure,
um die abschirmende tBOC-Gruppe unter Bildung dos £~Cb::;-lyG-£er--ala abzutrennen. Das so gebildete abgeschirmte
Tr!peptid wird durch Einstellen des pH auf 5^05 aus
der wäßrigen Lösung gefallt.
Das G-Cbz-ly.s-Ger-rJa wird mit dem N~Carbo>;yanhydrid von Glutaminsäure
(G1i'.-]:CA) umgesetzt, ίηαοιίί die rioaUtionstcilnehmci'
in wäßriger Lösung beim pH 10,1 J:r!iftig nijtojnander verrührt
Vverderi. Unter dic^o;, Bcdlngung-jn 3st d.i (? ll!:!;".i;'t;;:urig gcwöhnl:Lc:h
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in etwa 1 bis 2 Minuten beendet. Die alkalische Lösung wird angesäuert, wobei das als Zwischenverbindung gebildete Carbarnat
unter Bildung einer Lösung von Glu-£-Cbz-lys-ser-ala zersetzt wird. Dieses wird dann nach Einstellen des pH auf 10,1
unter kräftigem Rühren mit weiterem GIu-NCA umgesetzt. Die Lösung
wird angesäuert, wodurch das als Zwischenverbindung gebildete Carbamat zersetzt wird, und das pH der wäßrigen Lösung
wird auf 3,6 eingestellt, wobei das abgeschirmte Pentapeptid
Glu-glu-6-Cbz~lys-ser-ala ausgefällt wird.
Das endständige Dipeptid des anderen Pentapeptids wird in der
Form seines Methylesterhydrochlorids Thr-pro-OMe HCl hergestellt, indem man zunächst Prolin mit dem NHS-ester von .
N-tBOC-threonin in Lösung in Dimethylformamid unter alkalischen
Bedingungen (vorzugsweise pH 10,0) unter Bildung des
tBOC-thr-pro umsetzt. Dieses Dipeptid wird mit Trifluoressigsäure zu dem Thr-pro-trifluoracetat umgesetzt. Dieses Thrpro-trifluoracetat
wird dann mit Methanol in Gegenwart von Thionylchlorid als Katalysator zu dem Methylester von Thrpro
umgesetzt, der in der Form seines Hydrochlorids von dem
Reaktionsgemisch abgetrennt wird.
Das bei der Stufensynthese des Hämopeptids H noch zu synthetisierende
Tripeptide nämlich Val-his-leu, wird hergestellt,
indem man Leueinmethylester mit dem N«Thiocarboxyanhydrid von
Histidin (das in der Form des His-TCA HBr zugesetzt wird) in
wäßriger lösung beim pH 9,5 unter kräftigem Rühren umsetzt. Unter diesen Bedingungen ist die Umsetzung gewöhnlich in etwa
20 Minuten beendet. Die alkalische Lösung wird angesäuert, wobei das als Zwlschenverbindung gebildete Thiocarbamat zersetzt
wird, und das pH der angesäuerten Lösung wird auf 5>0 eingestellt,
Verunreinigungen v/erden abfiltriert, und das Filtrat wird iff« Vakuum eingedampft, wobei das Dipeptid Hiß-leu in der
Form seines Mothylestors erhalten wird. Das so erhaltene Rohn.ate/'ial
wird durch Chromatographie an Silicagel unter Verwen-
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dung von n-Butanol/Essigsäure/tfasser als Eluierungsmittel gereinigt,
wobei das His-leu-OMe-diacetat erhalten wird. Dieses
His-leu-OMe-diacetat wird mit dem NHS-ester von N-tBOC-valin
in Lösung in Dimethylformamid unter schwach alkalischen Bedin~ gungen (pH mit Triäthylamin auf 8,0 eingestellt) zu dem Tripeptid
tBOC-val-his-leu-OMe umgesetzt, das dann mit Hydrazin umgesetzt
wird. Das so erhaltene Hydrazid wird mit salpetriger Säure
zu dem tBOC-val-his-leu-azid umgesetzt.
Das tBOC-val-his-leu-azid wird mit Thr-pro-OMe in Lösung in
Dimethylformamid unter schwach alkalischen Bedingungen (vorzugsweise
pH 8,0) zu dem entsprechenden abgeschirmten Pentapeptid
tBOC-val-his-leu-thr-pro-OMe umgesetzt. Dieses wird
dann mit Hydrazin umgesetzt, und das so gebildete Hydrazid wird mit salpetriger Säure zu tBOC-val-his-leu-thr-pro-azid
umgesetzt.
Die beiden abgeschirmten Pentapeptide, Glu-glu-£-Cbz-lys~ser-ala
und tBOC-val-his-leu-thr-pro-azid, werden in Lösung in Dimethyl formamid unter schwach alkalischen Bedingungen (vorzugsweise pH
8,0) zu dem abgeschirmten Decapeptid tBOC-val-his-leu-thr-proglu-glu-E-Cbz-lys-ser-ala
umgesetzt.
Das tBOC-val-his-leu-thr-pro-glu-glu-E-Cbz-lys-ser-ala oder
ein anderes Abschirmungsderivat des Hämopeptids H wird dann
der starken Einwirkung einer starken Säure, beispielsweise wasserfreier Halogenwasserstoffsäure für sich oder in Lösung
in einem wasserfreien, nicht-hydroxylischen, nicht-basischen, organischen Lösungsmittel dafür, beispielsweise wasserfreiem
Fluorvrasserstoff, Bromwasserstoff in Eisessig, Chlorwasserstoff
in Ä'thyläcetat und dergl., unterworfen, um die abschirmenden
Gruppen abzutrennen und das unsubstltuierte Ha'mopeptid H
V^l-his-leu-thr-pro-glu-glu-lys-ser-ala zu bilden.
WIo in Figur H- gezeigt, wird bei dem bevorzugten Gesamtvcrfah-
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22U490
ren zur Herstellung des Hämopeptids S in Stufensynthese in Lösung
(a) das abgeschirmte Pentapeptidsegment Glu-glu-€<-Cbz-lys-.
ala-ala und (b) das earboxylgruppenaktivierte abgeschirmte Tetrapeptidsegme'nt
tBOC-siet-leu-thr-ala-azid hergestellt. Das Pentapeptid
wird hergestellt, indem man Alanin mit AIa-TCA durch kräftiges Verrühren der Reaktionsteilnehmer in wäßriger Lösung
vom pH 9,5 umsetzt, unter welchen Bedingungen die Umsetzung gewöhnlich in etwa 10 Minuten beendet ist. Die alkalische Lösung
wird angesäuert, wobei das als Zwischenverbindung gebildete Carbamat unter Bildung einer wäßrigen Lösung von Ala-ala zersetzt
wird. Ein etwa gleiches Volumen Äthanol wird zugesetzt, und die wäSrig-äthanolische Lösung von Ala-ala wird mit dem
NHS-ester von a«tBOC-£-Cbz~lysin zu a~tBOC-£-Cbz-lys-ala-ala
umgesetzt, während das pH bei etwa 8,0 gehalten wird. Dieses abgeschirmte Tripeptid wird mit Trifluoressigsäure umgesetzt,
wobei die abschirmende tBOC-Gruppe entfernt und das £~Cbz~lysala-ala
gebildet wird. Dieses abgeschirmte Tripeptid wird durch Einstellen des pH der wäßrigen Lösung auf 4,1 ausgefällt.
Dieses £.-Cbz~lys-ala~ala wird mit dem N-Carboxyanhydrid von
Glutaminsäure (GIu-NCA) umgesetzt, indem die Reaktionsteilneh-
:ner in wäßriger Lösung vorn pH 10;0 kräftig miteinander verrührt
werden. Unter diesen Bedingungen ist die Umsetzimg gewöhnlich in ο tv; a 1 bis 2 Minuten beendet. Die alkalische Lösung wird angeoäuert,
wobei das als Zwischenverbindung; gebildete Carbamat unter Bildung einer Lösung von GIu-E-Cbz-lys-ala-ala zersetzt
wird. Dieses wird dann nach Einstellen des pH auf 10,0 unter
kräftigen. Rühren mit weiteren GIu-UCA umgesetzt. Die Reaktion*;--1
OGUMj' wird angesäuert, wobei das als Zwischenverbindung ge-1)3.3ö:ot-e
CarOamat z-zrsetzt wird, und dac pH der wäßrigen Lösung
\;ivu auf ';, 1 c insect eilt. Das Wasser v?ird in Vakuum abgedampft,
und ccr HUcI^ItLG wird durch Chromatographie gereinigt, wobei
αίίό rb.'.ctehirnite Pcul-opeptid Glu-glu-j^-Cbz-lys-ala-ala er hai-
!·.;■ xrxrC.
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BAD OBIGIHAL
22HA90
Das endständige Dipeptidsegment des Tetrapeptidanteils'wird
in der Form seines Methylester-trifluoraeetats Thr-ala-OMe
P7CCOOH " hergestellt, indem man zunächst Alaninmethylester
mit dem NHS-ester von tBOC-threonin in Lösung in Dimethylformamid unter alkalischen Bedingungen (vorzugsweise pH 8,0)
unter Bildung von tBOC-thr-ala-OMe umsetzt. Dieses Dipeptid
wird mit Trifluoressigsäure zu dem Thr-ala-OMe-trifluoracetat
umgesetzt. Dieses Dipeptid wird dann in Lösung in Dimethylformamid mit dem NHS-ester von tBOC-leu zu dem tBOC-leu-thrala-OMe
umgesetzt. Dieses abgeschirmte Tripeptid wird mit
Trifluoressigsäure umgesetzt, wobei die abschirmende tBOC-Gruppe
abgetrennt und Leu-thr-ala-OMe gebildet wird. Dieses
wird dann mit dem NHS-ester von tBOC-met in Lösung in Dimethylformamid
zu dem abgeschirmten Tetrapeptid tBOC-metleu-thr-ala-OMe
umgesetzt, das dann seinerseits mit Hydrazin umgesetzt wird. Das Hydrazid wird mit salpetriger Säure unter
Bildung des tBOC-met-leu-thr-ala-azids umgesetzt.
Das abgeschirmte Pentapeptid Glu-glu-£-Cbz-lys-ala-ala wird
mit diesem tBOC-met-leu-thr-ala^azid in Lösung in Dimethylformamid
unter schwach alkalischen Bedingungen (vorzugsweise pH 8,0) zu dem abgeschirmten Nonapeptid tBQC-met-leu-thr-alaglu-glu-£.-Cbz-l3r's-ala~ala
umgesetzt.
Das tBOC-met-leu-thr-ala-glu-glu-E-Cbz-lys-ala-ala oder ein
anderes abgeschirmtes Derivat des Hämopeptids S wird dann
der starken Einwirkung einer starken Säure, beispielsweise wasserfreier Halogenwasserstoffsäure für sich oder in Lösung
in einem praktisch wasserfreien, nicht-hydroxylischen, praktisch
nicht-basischen, organischen Lösungsmittel dafür, beispielsweise Viasserfreiem Fluorwasserstoff, Bromwasserstoff in
Eisessig, Chlorwasserstoff in frthylacetat und dergl., unterworfen,
um die abschirmenden Gruppen abzutrennen und das Met~leu-thr-a.la~glu»glu-lys~ala~ala, d.h. das unsubstituicrte
Ilnmopeptid S zu bilden. Im allgemeinen ist es von Vorteil,
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14 80* · w 22HA90
hei dieser Spaltung mit starker Säure ein Carboniumione'ndes«
Oxydationsmittel, wie Anisol, Veratrol, Dimethylsulfid, Methionin
und dergl., zu verwenden, um den bei der Spaltung in Freiheit
gesetzten abschirmenden Substituenten in eine nicht-reaktive
Form zu überführen.
Wie oben erwähnt, werden vorzugsweise die oben genannten abgeschirmten
Tetrapeptide, Pentapeptide, Nonapeptide und Decapeptide verwendet. Jedoch können auch andere Abschirmungsgruppen
als die oben genannten verwendet werden. Außerdem können auch die Carboxygruppe des Alanins, der Imidazolstickstoff des
Histidine und die Hydroxygruppen des Threonins und Serins wie oben beschrieben abgeschirmt werden. Die Erfindung betrifft
also sowohl die Hämopeptide Pl, P2, H und S für sich als auch ihre Abschirmungsderivate und Abschirmungsderivate des als Zwischenverbindung
hergestellten Tetrapeptide Met-leu-thr~ala und
der Pentapeptide Val«his-leu«ser~ala, Glu-glu-lys-glu-ala,
Glu-glu-lys-gln-ala, Val-his-leu-thr-pro, Glu-glu-lys-ser-ala
und Glu-glu-lys-ala-ala, in denen die a~Aminogruppen des Valins
und Methionins und die £-Aminogruppe des Lysins mit Substituenten
abgeschirmt sind, die ohne Spaltung der Peptidbindungen wieder abgetrennt werden können, und wobei auch die Hydroxylgruppe
des Threonins und bzw. oder die Hydroxylgruppe des Serins mit Gruppen abgeschirmt sein können, die ebenfalls ohne
beträchtliche Spaltung der Peptidbindungen entfernt werden
können.
Die Hämopeptide Pl, P2, H und S, ihre Amide, wie VaL-his-leu«
ser-äla-glu~glu-lys-glu-ala-NHp, Val-his-leu-ser-ala-glu-glulys-gln-ala-NHo,
Val-his-leu-thr~pro-glu-glu-lys~ser-ala-NHp
und Met~leu-thr-äla-glu~glu~lys~ala-ala-NHp, ihre Ester, wie
Val~his«leu-ser-ala-glu~glu~lys-glu~ala-acetat, Val~his«leuser-ala-glu-glu-lys-glu~ala-phosphat,
Val-his-leu~ser~ala-gluglu-lys-gln-ala-acetat,
Val-his^leu-öer-ala-glu-glu-lys-glnala-phocphat,
Val-his-leu-thr-pro-glu-glu-lys-ser-ala-acetat,
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- 21 -
Val-his-leu-thr-pro-glu-glu-lys-ser-ala-phosphat, Met-leu-thrala-glu-glu-lys-ala-ala-acetat,
Met-leu-thr-ala-glu~glu~lysala-ala-phosphat,
ihre N~Acylderivate, wie N-Formyl-val-hisleu-ser-ala~glu-glu-lys-glu~ala,
N-Aoetyl-val-his-leu-ser-ala~ glu-glu-lys-glu-ala, N-Formyl-val-his-leu-ser-ala-glu-glu-lysgln-ala,
N-Acetyl-val-his-leu-ser-ala-glu-glu-lys-gln-ala,
N-Formyl-val-.his-leu-thr-pro-glu-glu-lys-ser-ala, N-Acetylval-his-leu-thr-pro-glu-glu-lys-ser-ala,
N-Formyl-met-leuthr-ala-glu-glu-lys-ala-ala
und. dergl. sowie abgeschirmte Derivate der Hämopeptide, wie tBOC-val-his-leu-ser-ala-glu-glu-
£-Cbz-lys~glu-ala, tBOC-val-his-leu-ser-ala-glu-glu-^-Cbz-lysgln-ala,
tBOC-val-his-leu-thr-pro-glu-glu-S-Cbz-lys-ser-ala
und tBOC-met~leu-thr~ala-glu-glu-£~Cbz~lys-ala~ala können verwendet
werden, um bei lebenden Wirbeltieren die Infreiheitsetzung
von Hormonen herbeizuführen, und sind insbesondere verwendbar, um die InfreiheitSetzung oder Synthese von Wachstumshormonen
durch Zellen des Hypophyeenvorderlappens von Säugetieren zu bewirken. Die Hämopeptide Pl, P2, H und S und
Substitutionsderivate davon vermögen ein rasches und bzw. oder maximales Wachstum von Säuget^en zu fördern und stellen wertvolle
Heilmittel bei gewissen Arten von Zwergwuchs dar. Die Hämopeptide und ihre Substitutionsderivate werden zweckmäßig
durch Injektion oder durch Absorption durch Schleirnhautmembranen (beispielsweise sublingual, intranasal usw.) verabreicht.
Bei Derivaten, die gegen die Verdauung im Magen resistent sind, kann auch eine orale Verabreichung erfolgen. Um eine direkte
Wirkung auf den Hypophysenvorderlappen zu erzielen, werden die Hämopeptide und ihre Substitutionsderivate gewöhnlich intrakarotid
in einer Dosierung von etwa 0,05 bis 0,5 μβ/kg Körpergewicht
je Tag injiziert, um die Infreiheitsetzung von Wachstumshormonen
zu erzielen, und wenn eine Synthese von Wachstumshormon erwünscht ist, kann gewünschtenfalls bis zu etwa 0,1 mg/
kg Körpergewicht verabreicht werden.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung. ■
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Etwa 1,78 S Ala werden in 200 ml Im wäßriger Kaliumboratpufferlösung
(pH 10,2) * gelöst. Die Lösung wird auf etwa O0C gekühlt,
und etwa J>,6^ g GIu-KCA werden der Lösung innerhalb 1 Minute
zugesetzt, während das Gemisch kräftig bewegt (vorzugsweise unter Verwendung eines Waring-Mischers) und die Temperatur bei
O0C und das pH durch tropfenweise Zugabe von 50^-igem Kalium»'
hydroxyd bei 10,2 gehalten wird. Die Umsetzung wird fortschreiten gelassen, während sie stetig weiter bewegt und die Tempera«
tür bei O0C und das pH bei 10,2 gehalten wird, bis der Verbrauch
an Base aufhört (etwa 1 Minute). Dann wird so viel Schwefelsäure
zugesetzt, daß das pH auf J>,0 sinkt, und etwa 15 Minuten lang
wird Stickstoff durch das angesäuerte Reaktionsgemisch geleitet, um Kohlendioxyd aus der gebildeten Lösung von Glu-ala abzutrennen.
Die Pufferlösung wird zweckmäßig wie folgt hergestellt: 1 Mol Borsäure wird in 500 ml Wasser auf ge schlämmt 3 und es wird gerade
soviel Kaliumhydroxyd zugesetzt, daß die Borsäure in Lösung
geht. Dann wird weiteres Kaliumhydroxyd zugesetzt, um das pH auf 10,2 einzustellen, die Lösung wird auf 990 ml verdünnt, das
pH wird erneut auf 10,2 eingestellt, \ind die Lösung wird auf das
Endvolumen von 1000 ml aufgefüllt.
Der wie in Beispiel 1 erhaltenen wäßrigen Lösung von Glu-ala
werden 200 ml Äthanol zugesetzt, und das pH wird durch Zugabe von 5O;6-iger wäßriger Kaliumhydroxydlösung auf 8,0 eingestellt.
Etwa 9*5^ g NHS-ester von a~tBOC~£.-Cbz-lys werden der Glu-ala-Lösung
unter Rühren zugesetzt, währenddie Temperatur bei etwa 250C und das pH .durch tropfenweise Zugabe von 50/a-iger wäßriger
Natr iumhy dr oxy el lösung bei 8,0 gehalten wird. Wenn der Verbrauch
von Base aufhört, wird die Lösung filtriert, das Äthanol wird
im Vakuum abgedampft, und die wäßrige Lösung wird mit 300 ml
Ä'thylacetat «xtralriert, wobei nicht -um gss et ζ tor NHS-ester in
den Extrakt übergeht. Das pH der wäfirigon Reaktionslösurig wird
2 0 9 8 41 /1196
14 8o4
221U90
dann durch Zugabe von konzentrierter Schwefelsäure auf3*7 eingestellt,
und die angesäuerte Lösung wird dreimal mit je 300 ml
Äthylacetat extrahiert. Die Äthylacetatextrakte werden vereinigt, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, und das Äthylacetat
wird im Vakuum abgedampft, wobei ein schweres öliges Material
erhalten wird. Die Dünnschichtchromatographie an Silicagel
unter Verwendung von n-Butanol/Pyridin/Essigsäure/Wasser
(30:20:6:24) als Eluierungsmittel ergibt, daß das Produkt hauptsächlich aus a-tBCC-E-Cbz-lys-glu-ala mit einer Spur (weniger
als 1%) einsr rascher fortschreitenden Verunreinigung besteht.
Bei,spiel 3
Dieses a«tBOC-£-Cbz~lys~glu-ala wird in etwa 50 ml Methylenchlorid
gelöst. Die Lösung wird auf 150C gekühlt. Etwa 60 ml
Trifluoressigsäure werden zugesetzt, und die Temperatur des
Gemisches wird innerhalb 5 Minuten auf etwa 220C ansteigen gelassen.
Die Lösung wird auf O0C gekühlt, und Äther wird zugesetzt,
während die Temperatur bei O0C gehalten wird, wobei E-Ccr.-lys-glu-ala-trifluoracetat ausfällt. Das ausgefällte
Material wird abfiitriert und in Wasser gelöst. Das pH der
Lösung wird durch Zugabe von 2,5n wäßriger■Natriumhydroxydlösung
auf 4,1 eingestellt, und das sich abscheidende kristalline
Material wird abfiitriert und getrocknet. Man erhält etwa 2^5 g praktisch reines 6-Cbz^lys-glu-ala.
Etwa 4,22 g des £"-Cbz-lys-glu-ala werden in 90 ml Im wäßriger
Kaliumboratpufferlösung (pH 10,2) gelöst. Die Lösung wird auf etwa O0C gekühlt, und etwa 1,60 g GIu-NCA werden innerhalb etwa
1/2 Minute zugesetzt, während welcher Zeit das Gemisch kräftig
bewegt und die Temperatur bei O0C und das pH durch tropfenweise
Zugabe von 50;i-iger wäßriger Kaliumhydroxydiösung bei 10,2 gehalten
wird. Die Umsetzung wird unter stetigem Bewegen fortschreiten gelassen, während die Temperatur bei O0C und das p}]
bei 10,2 gehalten wird, bis dor Basenverluaueh aufhört. Da'in
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14804 · fe- . 221U90
wird so viel konzentrierte Schwefelsäure zugesetzt, daß das pH
auf 2,5 sinkt, und Stickstoff wird etwa JO Minuten lang durch
das angesäuerte Reaktionsgemisch geleitet, um Kohlendioxyd von
der gebildeten Lösung von Glu-S-Cbz-lys-glu-ala abzutrennen.
Das pH der wie in Beispiel 4 hergestellten Lösung von Glu-£-Cbz~
lys-glu-ala wird bei O0C durch Zugabe von 50^-iger wäßriger Kaliumhydroxydlösung
auf 10,2 eingestellt, und etwa 1,678 g GIu-NCA
werden der Lösung innerhalb etwa 1/2 Minute unter kräftigem Bewegen des Gemisches und Einhalten der Temperatur bei O0C und des
pH bei 10,2 durch Zugabe von 50/£-iger wäßriger Kaliumhydroxydlösung
zugesetzt. Die Umsetzung wird unter stetigem Bewegen und Einhalten der Temperatur bei O0C und des pK bei 10,2 fortschreiten
gelassen, bis der Basenverbrauch aufhört. Die Reaktionslösung wird filtriert. Dann wird so viel konzentrierte Schwefelsäure
zugesetzt, daß das pH des Piltrats auf 3*5 sinkt, und
das dabei.ausgefällte Material wird abfiltriert, mit Wasser gewaschen
und im Vakuum getrocknet. Man erhält etwa 4,9 g GIuglu-£-Cbz-lys-glu~ala,
das bis zu etwa 15$ Tetrapeptid und Z>%
Hexapeptid als Verunreinigung enthalten kann. Dieses Material wird einer freifließenden Elektrophorese beim pH 7*0 in 0,143m
2,6-Lutidin/Essigsäure-Puffer unterworfen, wobei etwa 2,32 g
praktisch reines Glu-glu-£-Cbz-lys-glu~ala erhalten werden.
Etwa 4>J4 g Leu-OMe-hydrochlorid werden in etwa 240 ml In wäßriger
Kaliumboratpufferlösung (pH 9,5) gelöst. Die Lösung wird auf etwa O0C. gekühlt, und etwa 10,01 g His-TCA-hydrobromid werden der
Lösung innerhalb 10 Minuten zugesetzt, während welcher Zeit das Gemisch kräftig bewegt und die Temperatur bei O0C und das pH
durch tropfenweise Zugabe von 50^-iger wäßriger Kaliumhydroxydlösung
bei 9,5' gehalten wird. Die Umsetzung wird unter stetigem Bewegen fortschreiten gelassen, während die Temperatur bei O0C
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und das pH bei 9 ..5 gehalten wird, bis der Basenverbrauch aufhört
(etwa 10 Minuten). Dann wird so viel konzentrierte Schwefelsäure zugesetzt, daß das pH auf 5^0 sinkt. Die angesäuerte
Reaktionslösung wird filtriert, und das Filtrat wird im Vakuum
zur Trockne eingedampft« Der Rückstand, der sowohl His als auch Leu-OMe enthält, wird einer Chromatographie an Silicagel unter
Verwendung von n-Butanol/Essigsäure/Wasser (D:2,3:6) als EIuierungsmittel
unterworfen. Man erhält etwa 7,0 g praktisch reines His-leu-OMe-diacetat.
Beispiel 7 ■
Etwa 2,4 g His-leu-OMe-diacetat werden in l4o ml Dimethylformamid
gelöst. Der Lösung werden etwa 2,23 g NHS-ester von
tBOC-val unter Rühren bei 250C zugesetzt, und das pH der Lösung
wird durch Zugabe von Triäthylarnin auf 8,0 eingestellt.
Die erhaltene Lösung wird etwa 20 Stunden stehengelassen, während gelegentlich das pH durch Zugabe von Triäthylamin wieder
auf 8,0 eingestellt wird. Dann wird die Lösung im Vakuum zur Trockne eingedampft, und der Rückstand wird in 400 ml Wasser
gelöst. Die wäßrige Lösung wird dreimal mit je 400 ml Chloroform extrahiert. Die vereinigten Extrakte werden über wasserfreiem
Natriumsulfat getrocknet, im Vakuum zur Trockne eingedampft, und das restliche Öl wird mit Äther verrieben. Das
dabei gebildete kristalline Material wird abfiltriert und getrocknet, wobei 1,96 g tBOC-val-his-leu-OMe erhalten werden.
Zu etwa 2,8 g tBOC-val-his-leu-OMe werden 20 ml eines Gemisches
von wasserfreiem Hydrazin und Methanol (1:1) zugesetzt. Das erhaltene
Gemisch wird etwa 3 Minuten bei Zimmertemperatur gerührt. (Die Auflösung ist gewöhnlich in etwa 1 Minute beendet,
und nach etwa 2 Minuten bildet sich ein Niederschlag.) Das Reaktionsgemisch wird dann im Vakuum bei einer Temperatur von
etwa 350C eingedampft. Dem Rückstand werden etwa 10ml Äthanol
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zugesetzt, und das gebildete Geraisch wird im Vakuum eihgedamxjft.
Dann werden etwa 10 ml Dimethylformamid zugesetzt, und das gebildete Gemisch wird im Vakuum eingedampft. Der feste
Rückstand wird im Vakuum bei Zimmertemperatur für etwa 15 Stunden
getrocknet und aus Methanol umkristallisiert. Man erhält etVia 2,2 g tBOC-val-his-leu-hydrazid.
Etwa 1,0 g wie in Beispiel 8 beschrieben hergestelltes tBOC-val-his-leu-hydrazid
v/erden in JO ml frisch entgastem Di-·
methylformamld suspendiert, und die Suspension wird auf eine Temperatur von -4O0C gekühlt und unter einer trockenen Stickstoff
atmosphäre gegen Feuchtigkeit geschützt. Der kalten Suspension wird unter Rühren eine Losung von 6,24 ml 2n Chlor«
wasserstoff in Tetrahydrofuran und dann Ojj5 ml Isoamylnitrit
zugesetzt. Das gebildete Gemisch wird etwa 1 Stunde bei einer Temperatur von -150C bis -200C unter trockenem Stickstoff gehalten,
wonach das Hydrazid vollständig unter Bildung von tBOC-val-hiß-leu-azid umgesetzt ist, wie durch Dünnschichtchromatographie
an Silicagel G unter Verwendung von Chloroform/fithanol/Wasser
(5«5*1) sls Lösungsmittel gezeigt werden
kann.
Etwa 5,56 g AIa-OMe-hydrochlorid und etwa 12,08 g des NHS-esters
von tBOC-ser werden in 400 ml frisch entgastem Dimethylformamid
gelöst. Das pH der erhaltenen Lösung wird durch Zugabe von Diisopropyläthylamin auf 8,0 eingestellt,
und die Lösung wird etwa 4 Stunden gerührt, während die Temperatur bei etwa 25<€ und das pH durch Zugabe von Diisopropyl-Mt
hy lan: In bei 8,0 gehalten wird. Das IJeaktionsgemisch wird im
Vskuurn eingedampft. Das zurückbleibende Öl wird in Methylencblorlä
gelöst, und die Lösung wird zweimal mit 0,2n wäßriger
.cJc» ν:·:.].'«;-] :-i;.:-^;· <":- -\v;'jr_} mit Hatr j.urr;r;v'l f ;";t gesättigt, einmtil mit
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ORfGfNAL
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gesättigter wäßriger Natriumchloridlösung, zweimal mit'gesättigter
wäßriger Natriumbicarbonatlösung und schließlich zweimal mit
gesättigter wäJ3riger Natriumehlorldlösung gewaschen. Dann wird die gewaschene Lösung über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet
und im Vakuum eingedampft. Das zurückbleibende öl wird aus Äthylacetat/Hexan
umkristallisiert, wobei etwa 9*08 g kristallines
tBOC-ser-ala-OMe erhalten werden.
Etwa 6,0 g dieses tBOC-ser-ala-OMe werden bei einer Temperatur
von etwa O0C in der Mindestmenge Trifluoressigsäure gelöst, und
die Lösung wird bei einer Temperatur von etwa 250C etwa ^5 Minuten
lang gerührt und dann tropfenweise unter kräftigem Rühren einem großen Volumen (etwa 100 ml) Äther zugesetzt. Das
ausfallende Material wird abfiltriert, mit Äther gewaschen und im Vakuum getrocknet. Man erhält etwa 4,97 g Ser-ala-OMe-trifluoracetat.
Beisniel 12
Die das tEGC-val-his-leu-azid enthaltende Lösung, hergestellt
wie in Beispiel 9 beschrieben, wird auf eine Temperatur von -4o°C gekühlt und dann mit einer Lösung von 6^0 mg Ser-ala-OMetrifluoracetat
in 10 ml entgastem Dimethylformamid versetzt. Das pH der erhaltenen Lösung wird durch Zugabe von Diisopropyläthylamin
auf 8,0 eingestellt, und das Gemisch wird etwa 20 Stunden bei einer Temperatur zwischen etwa -200C und -150C gehalten,
während von Zeit zu Zeit das pH mit Diisopropyläthylamin
wieder auf 8,0 eingestellt wird. Nach dieser Zeit ist die Umsetzung unter Bildung des Pentapeptids praktisch beendet,
wie sich aus der Dünnschichtchromatographie an SiIjcagel
G unter Verwendung von Äthylacetat/PyrJdin/EsGigsäure/
Wasser (10:5:10) als Lösungsmittel ergibt. Die Lösung wird
im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wird mit Äthylacetat
verrieben, und das erhaltene feste Material vnrd droirral m:it
Xthy lc.eetat gewaschen und dann aus Ath'-'nol/Atbylaectrt urn-
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kristallisiert. Man erhält etwa 0,8 g praktisch reines tBOC-val-his-leu-ser-ala-OMe.
Zu etwa 790 mg tBOC-val-his-leu-ser-ala-OMe werden 9 ml eines
wasserfreien Gemisches von Hydrazin und Methanol (1:1) zügesetzt. Das gebildete Gemisch wird etwa 3 Minuten bei Zimmertemperatur
gerührt, wonach die Auflösung praktisch beendet ist. Die erhaltene Lösung wird im Vakuum bei etwa 350C eingedampft. Dem Rückstand werden etwa 10 ml Äthanol zugesetzt, und
die gebildete Lösung wird, im Vakuum eingedampft.. Der Rückstand wird in der Mindestmenge Chloroform/Methanol/Wasser (6θ:4θ:1θ)
gelöst, und die Lösung wird durch eine trockene Säule von 50 g Silicagel H geführt, wobei Spuren von nicht-umgesetztem
Hydrazin entfernt werden (wie durch Dünnschichtchromatographie an Silicagel G gezeigt werden kann), und das Lösungsmittel wird
im Vakuum abgedampft. Man erhält etwa 550 mg tBOC-val-his-leuser-ala-hydrazid.
Etwa 528 mg tBOC-val-his-leu-ser-ala-hydrazid, hergestellt wie
in Beispiel 13 beschrieben, werden in 100 ml frisch entgastem
Dimethylformamid gelöst. Die Lösung wird unter einer trockenen Stickst off atmosphäre auf etwa -400C gekühlt, und etwa 9,6 ml
2n wasserfreier Chlorwasserstoff in Tetrahydrofuran werden unter Rühren zugesetzt. Etwa 0,12 ml Isoamylnitrit werden dann
zugesetzt, und das erhaltene Gemisch wird für etwa 1 Stunde bei einer Temperatur zwischen etwa-500C und -150C gehalten, wonach
das Hydrazid vollständig unter Bildung von tBOC-val-hisleu-ser-ala-azid
umgesetzt ist, wie sich aus der Dünnschichtchromatographie unter Verwendung von Chloroform/Methanol/Wasser
(6O:4OtlO) als Lösungsmittel ergibt.
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Die wie in Beispiel 14 beschrieben erhaltene Lösung von tBOC~val-his~leu-ser-ala~azid in Dimethylformamid wird mit
etwa 612 mg Glu-glu-t-Cbz-lys-glu-ala versetzt, und das
Gemisch wird bei etwa -200C gerührt, bis das Azid in Lösung
geht. Dann wird die Temperatur der Lösung auf ~40°C und das pH durch Zugabe von Diisopropyläthylamin auf 8 eingestellt.
Die Lösung wird etwa 20 Stunden zwischen etwa -200C und -150C
gehalten, während von Zeit zu Zeit das pH durch Zugabe von Diisopropyläthylamin auf 8,0 eingestellt wird. Nach dieser
Zeit ist die Umsetzung unter Bildung des Decapeptids praktisch
beendet, wie sich aus der Dünnschichtchromatographie an Silicagel G unter Verwendung von Butanol/Pyridin/Essigsäure/Wasser
(30:20:6:24) als Lösungsmittel ergibt. Das Reaktionsgemisch,
das einen gelatinösen Niederschlag enthält, wird im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wird mit V/asser
verrieben und gewaschen, und das mit Wasser gewaschene Material wird in 50$-iger wäßriger Essigsäure gelöst. Die Lösung
wird durch eine Säule von superfeinem Filtrationsgel geführt, wobei eine geringe Menge an Verunreinigung abgetrennt
wird, und ergibt dann etwa 474 mg tBOG-val-his-leuser-ala-glu-glu-E-Cbz-lys-glu-ala.
Etwa 4o mg tBOC-val-his-leu-ser-ala-glu-glu-iUcbz-lys-glu-ala
werden im Vakuum etwa 15 Stunden über Phosphorpentoxyd getrocknet, um Spuren von Wasser abzutrennen, und das trockene
Material wird In ein etwa 0,3 ml Anisol enthaltendes Polyäthylenrohr
eingebracht. Das Gemisch wird auf eine Temperatur von etwa -350C gekühlt. 1 ml wasserfreier Fluorwasserstoff
wird in das Rohr einkondensiert, und das gebildete Gemisch wird etwa 45 Minuten bei einer Temperatur von etwa O0C gerührt.
Danach wird trockener Stickstoff durch das Gemisch, das noch bei O0C gehalten wird, geführt, um überschüssigen
Fluorwasserstoff abzutrennen. Das restliche Material wird
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etwa 20 Minuten bei einer Temperatur von etwa 250C im Vakuum
gehalten und dann in wäßriger'Essigsäure gelöst. Die essigsaure
Lösung wird gefriergetrocknet, wobei etwa 41 ml eines amorphen Produktes erhalten werden. Dieses Produkt wird aus
Wasser/Äthanol umkristallisiert, und man erhält praktisch reines Val-his-leu-ser-ala-glu-glu-lys-glu-ala.
Etwa 1,78 g AIa werden in 200 ml Im wäßriger Kaliumboratpufferlösung
(pH 10,2) * gelöst, die Losung wird auf etwa O0C
gekühlt, und etwa 3,63 g GIn-NCA werden ihr innerhalb 1 Minute
zugesetzt, während welcher Zeit das Gemisch kräftig bewegt wird, vorzugsweise unter Verwendung eines Viaring-Mischers,
und die Temperatur bei O0C und das pH durch tropfenweise Zugabe
von 50^-igem wäßrigem Kaliumhydroxyd bei 10,2 gehalten
wird. Die Umsetzung wird unter stetigem Bewegen fortschreiten gelassen, während die Temperatur bei O0C und das pH bei 10,2
gehalten wird, bis der Basenverbrauch aufhört (etwa 1 Minute). Dann wird so viel konzentri^te Schwefelsäure zugesetzt, daß
das pH auf 3,0 gesenkt wird, und Stickstoff wird 15 Minuten lang durch das angesäuerte Reaktionsgemisch geleitet, um das
Kohlendioxyd von der gebildeten Lösung von Gln-ala abzutrennen.
* Dieser Puffer wird zweckmäßig wie, folgt hergestellt: 1 Mol
Borsäure wird in 500 ml Wasser aufgeschlämmt, und es. wird gerade
so viel festes Kaliurr.hydroxyd zugesetzt, um die Borsäure
in Lösung zu bringen. Dann wird weiteres Kaliumhydroxyd zugesetzt,
um das pH auf 10,2 einzustellen, die Lösung wird auf 990 ml verdünnt, das pH wird erneut auf lo,2 eingestellt, und
die Lösung wird auf das Endvolumen von 1000 ml aufgefüllt.
Bej spiel 18
Der wie in Beispiel 17 beschrieben hergestellten wäßrigen Lö-ευν,Γ-.
von oin-ala v/erden 200 ml Äthanol zugesetzt, und d as pH
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wird durch Zugabe von 50^-iger wäßriger Kaliumhydroxydlösung
auf 8,0 eingestellt. Dieser Gln-ala-Lösung werden etwa 9,54 g NHS-ester von a~tBOC~£~Cbz-lys unter Rühren zugese'tzt, während
die Temperatur bei etwa 250C und das pH durch tropfenweise Zugabe
von 50,1>-iger wäßriger Natriumhydroxydlösung bei 8,0 gehalten
wird. Nach Beendigung des Basenverbrauchs wird die Lösung filtriert, das Äthanol wird im Vakuum abgedampft, und die
wäßrige Lösung wird mit 300 ml Äthylacetat extrahiert, um nicht-umgesetzten NHS-ester abzutrennen. Dann wird das pH der
wäßrigen Lösung durch Zugabe von konzentrierter Schwefelsäureauf 3*7 eingestellt, und die angesäuerte Lösung wird dreimal
mit je 300 ml Äthylacetat extrahiert. Die Extrakte werden vereinigt,
über Viasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, und das Äthylacetat wird im Vakuum abgetrennt, wobei ein schweres öl
erhalten wird. Die Dünnschichtchromatographie an Silicagel unter Verwendung von n-Butanol/Pyridin/Essigsäure/Vasser
(30:20:6:24) als Eluierungsmittel zeigt, daß das Produkt hauptsächlich aus a-tBOC-6-Cbz-lys-gln-ala mit einer Spur
(weniger als 1%) einer rascher fortschreitenden Verunreinigung
besteht.
Dieses a-tBOC-C-Cbz-lys-gln-ala wird in etwa 50 ml Methylenchlorid
gelöst. Die Lösung wird auf 150C gekühlt. Etwa 60 ml Trifluoressigsäure werden zugesetzt, und die Temperatur des
Gemisches wird innerhalb 5 Minuten auf etwa 220C ansteigen gelassen.
Die Lösung wird auf O0C gekühlt, und Äther wird zugesetzt,
während die Temperatur bei O0C gehalten wird, wobei E-Cbz-lys-gln-ala-trifluoracetat ausfällt. Die Ausfällung wird
abfiltriert, in Wasser gelöst, und das pH der Lösung wird durch Zugabe von 2,5n wäßriger Natriumhydroxydlösung auf 5*2
eingestellt. Das sich abscheidende kristalline Material wird abfiltriert und getrocknet. Man erhält etwa 4,5 g praktisch
reines £-Cbz-lys-gln-ala.
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Etwa 4,22 g des £-Cbz-lys~gln-ala werden in 90 ml Im wäßriger
Kaliumboratpufferlösung (pH 10,2) gelöst. Die Lösung wird auf etwa O0G gekühlt, und etwa 1,60 g GIu-NCA werden innerhalb etwa
0,5 Minuten zugesetzt, während das Gemisch kräftig bewegt und die Temperatur bei O0C und das pH durch tropfenweise Zugabe von
50#-iger wäßriger Kaliumhydroxydlösung bei 10,2 gehalten wird.
Die Umsetzung wird unter stetigem Bewegen fortschreiten gelassen, während die Temperatur bei O0C und das pH bei 10,2 gehalten
wird, bis der Basenverbrauch aufhört. Dann wird so viel konzentrierte Schwefelsäure zugesetzt, daß das pH auf 2,5 sinkt,
etwa.
und Stickstoff wird/50 Minuten lang durch das angesäuerte Reaktionsgemisch
geleitet, um Kohlendioxyd von der gebildeten Lösung von Glu-6-Cbz-rlys-gln-ala abzutrennen.
Die wie in Beispiel 20 beschrieben hergestellte Lösung von Glu-£- Cbz-lys-gln-ala wird durch Zugabe von 5Q#-iger wäßriger Kaliumhydroxydlösung
bei 0<C auf ein pH von 10,2 eingestellt, und etwa
1,678 g GIu-NCA werden innerhalb etwa 1/2 Minute zugesetzt, während
das Gemisch kräftig bewegt und bei einer Temperatur von OT
und durch Zugabe von 50#~iger wäßriger Kaliumhydroxydlösung beim pH 10,2 gehalten wird. Die Umsetzung wird unter fortgesetztem Bewegen fortschreiten gelassen, während die Temperatur
bei 0«C und das pH bei 10,2 gehalten wird, bis der Basenverbrauch
aufhört. Die Reaktionslösung wird filtriert. Dem Filtrat wird so viel konzentrierte Schwefelsäure zugesetzt, daß das pH der
Lösung auf 3,7 sinkt, und das dabei ausfallende Material wird
abfiltriert, mit Wasser gewaschen und im Vakuum getrocknet. Man erhält etwa 4,9 g Glu~glu-£~Cbz-lys-glu-ala, das bis zu etwa
15$ Tetrapeptid und 2$ Hexapeptid als Verunreinigungen enthalten
kann. Dieses Material wird freifließender Elektrophorese beim pH 7*0 in 0,143m 2,6-Lutidiny^ssigsäure-Puffer unterworfen,
wobei etwa 2,32" g praktisch reines Glu-glu-C-Cbz-lys-glnala
erhalten werden.
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Etwa 4,34 g Leu-OMe-hydroehlorid werden in etwa 240 ml Im wäßriger
Kaliumboratpufferlösung (pH 9*5) gelöst. Die Lösung wird
auf etwa 0"C gekühlt, und etwa 10,01 g His-TCA-hydrobromid werden
innerhalb 10 Minuten zugesetzt, während das Gemisch kräftig bewegt wird und die Temperatur bei 0"ΐ und das pH durch
tropfenweise Zugabe von 50#-iger wäßriger Kaliumhydroxydlösung
bei 9*5 gehalten wird. Die Umsetzung wird unter stetigem Bewegen fortschreiten gelassen,·während die Temperatur bei OT
und das pH bei 9,5 gehalten wird, bis der Basenverbrauch aufhört (etwa Ϊ0 Minuten). Dann wird so viel konzentrierte Schwefelsäure
zugesetzt, daß das pH auf 5,0 sinkt. Die angesäuerte Lösung wird filtriert, und das Filtrat wird im Vakuum zur
Trockne eingedampft. Der Rückstand, der sowohl His als auch Leu-OMe enthält, wird der Chromatographie an Silicagel unter
Verwendung von n-Butanol/Essigsäure/faasser (10:2,3:6) als
Eluierungsmittel unterworfen. Man.erhält/7,0 g praktisch
reines His-leu-OMe-diacetat.
Etwa 2,4 g His-leu-OMe-diaeetat werden in l4o ml Dimethylformamid
gelöst. Etwa 2,23g NHS~ester von tBOC-val werden unter
Rühren bei 250C zugesetzt, und das pH der Lösung wird durch
Zugabe von Triäthylamin auf 8,0 eingestellt. Die gebildete Lösung
wird etwa 20 Stunden stehengelassen, während von Zeit zu Zeit das pH mit Triäthylamin auf 8,0 eingestellt wird. Dann
wird die Lösung im Vakuum zur Trockne eingedampft, und der Rückstand wird in 400 ml Wasser gelöst. Die wäßrige Lösung
wird dreimal mit je 400 ml Chloroform extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte werden über wasserfreiem Natriumsulfat
getrocknet und im Vakuum zur Trockne eingedampft. Das als Rückstand erhaltene öl wird mit Äther verrieben, wobei
ein kristallines Material erhalten wird. Dieses Material wird abfiltriert und getrocknet, wobei etwa 1,96 g tBOC-val-hisleu-OMe
erhalten werden.
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Zu etwa 2,8 g tBOC-val-his-leu-OMe werden 20 ml eines Gemisches
von Viasserfreiem Hydrazin und Methanol (1:1) zugesetzt. Das erhaltene Gemisch wird etwa 3 Minuten bei Zimmertemperatur gerührt
(die Auflösung ist gewöhnlieh in etwa 1 Minute beendet, und nach etwa 2 Minuten bildet sich ein Niederschlag). Das
Reaktionsgemisch wird dann im Vakuum bei einer Temperatur von etwa 550C eingedampft. Dem Rückstand werden etwa 10 ml Äthanol
zugesetzt, und das gebildete Gemisch wird im Vakuum eingedampft.
Dann werden etwa 10 ml Dimethylformamid zugesetzt, und das gebildete Gemisch wird im Vakuum eingedampft. Der
feste Rückstand wird etwa 15 Stunden im Vakuum bei Zimmertemperatur
getrocknet und aus Methanol umkristallisiert. Man erhält etwa 2,2 g tBOC-val-his-leu-hydrazid.
Etwa 1,0 g wie in Beispiel24 hergestelltes tBGC-val-his-leuhydrazid
werden in 30 ml frisch entgastem Dimethylformamid
gelöst, und die Suspension wird auf eine Temperatur von--400C
gekühlt und durch eine trockene Stickstoffatmosphäre gegen
Feuchtigkeit geschützt. Der kalten Suspension wird unter Rühren eine Lösung von 6,24 ml 2n Chlorwasserstoff in Tetrahydrofuran
und anschließend 0,3 ml Isoairiylnitrit zugesetzt. Das gebildete
Gemisch wird unter einer trockenen Stickstoffatmosphäre etwa 1 Stunde bei einer Temperatur von -150C bis -200C gehalten,
wonach das Hydrazid vollständig unter Bildung von tBOC-val-his-leu-azid
umgesetzt ist, wie durch Dünnschichtchromatographie an Silicagel G unter Verwendung von Chloroform/
Kthanol/Vjasser (5:5:1) gezeigt werden kann.
Etwa 5,56 g AIa-OMe-hydrochlorid und etwa 12,08 g des NHS-esters
von tBOC-ser worden in 400 ml frisch entgastem Dimethylformamid
gelöst. Das pH der erhaltenen Lösung wird
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durch Zugabe von Diisopropylathylamin auf 8,0 eingestellt und
etwa 4 Stunden gerührt, während die Temperatur bei etwa 250C
und das pH durch Zugabe von Diisopropylathylamin bei 8,0 gehalten wird. Das Reaktionsgemisch wird im Vakuum eingedampft. Das
zurückbleibende öl wird in Methylenchlorid gelöst, und die Lösung wird zweimal mit 0,2n wäßriger Schwefelsäurelösung, mit
Natriumsulfat gesättigt, einmal mit gesättigter wäßriger Natriumchloridlösung,
zweimal mit gesättigter wäßriger Natriumbicarbonatlösung und schließlich zweimal mit gesättigter wäßriger
Natriumchloridlösung gewaschen. Die' gewaschene Lösung wird dann über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum
eingedampft. Das zurückbleibende Öl wird aus Äthylacetat/Hexan umkristallisiert. Man erhält 9>O8 g kristallines tBOC-ser-ala-OMe.
Etwa 6,0 g dieses tBOC-ser-ala-OMe werden bei einer Temperatur
von etwa O0C in der Mindestmenge Trifluoressigsäure gelöst. Die
Lösung wird etwa 45 Minuten bei 250C gerührt und dann tropfenweise
unter kräftigem Rühren einem großen Volumen (etwa 100 ml) Äther zugesetzt. Das ausfallende Material wird abfiltriert, mit
Äther gewaschen und im Vakuum getrocknet. Man erhält etwa 4,97 Ser-ala-OMe-trifluoracetat.
Die wie in Beispiel 25 beschrieben hergestellte, tBOC-val-hisleu-azid
enthaltende Lösung wird auf -400C gekühlt, und dieser Lösung wird eine Lösung von 6j5O mg Ser-äla-OMe-trifluoracetat
in 10 ml entgastem Dimethylformamid zugesetzt. Das pH der erhaltenen Lösung wird durch Zugabe von Diisopropylathylamin auf
8,0 eingestellt, und das Gemisch wird etwa 20 Stunden bei einer Temperatur zwischen etwa -200C und -150C gehalten, während von
Zeit zu Zeit das pH durch Zugabe von Diisopropylathylamin auf 8,0 eingestellt wird. Nach dieser Zeit ist die Umsetzung unter
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Bildung des Pentapeptids praktisch beendet, wie durch Dünnschichtchromatographie
an Silicagel G unter Verwendung von Äthylacetat/Pyridin/fossigsäure/Wasser (10:5:1:3) gezeigt werden
kann. Die Reaktionslösung wird im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wird mit Äthylacetat verrieben. Das so erhaltene,
feste Material wird dreimal mit Äthylacetat gewaschen und aus Äthanol/Äthylacetat umkristallisiert. Man erhält etwa 0,8 g
praktisch reines tBOC-Val-his-leu-ser-ala-OMe.
Zu etwa 790 mg tBOC-val-his-leu-ser-ala-OMe werden 9 ml eines
wasserfreien Gemisches von Hydrazin und Methanol (1:1) zugesetzt. Das erhaltene Gemisch wird etwa 3 Minuten bei Zimmertemperatur
gerührt, wonach die Auflösung praktisch beendet ist. Die Lösung wird bei einer Temperatur von etwa 350C im
Vakuum eingedampft. Dem Rückstand werden etwa 10 ml Äthanol
zugesetzt, und die dabei gebildete Lösung wird im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wird in der Mindestmenge Chloroform/
Methanol/Wasser (6O:4O:lO) gelöst, und die Lösung wird durch
eine trockene Säule von 50 g Silicagel H geführt, um Spuren
von nieht-umgesetztem Hydrazin (wie durch DünnschichtChromatographie
an Bilieagel G gezeigt) abzutrennen, und das Lösungsmittel
wird im Vakuum abgedampft. Man erhält etwa 550 mg tBOC-val-his-leu-ser-ala-hydrazid.
Etwa 528 mg tftOC-val-his-leu-ser-ala-hydrazid, hergestellt wie
in Beispiel 2$ beschrieben, werden in 100 ml frisch entgastem Dimethylformamid gelöst. Die Lösung, die unter einer trockenen
Stickst of fatmpsphäre gehalten wird, wird auf etwa -400C gekühlt,
und etwa 9,6 mg 2n wasserfreier Chlorwasserstoff in Tetrahydrofuran
werden unter Rühren zugesetzt. Dann werden etwa 0,12 ml Isoamylnitrit zugesetzt, und das erhaltene Gemisch wird für
etwa 1 Stunde bei einer Temperatur zwischen etwa -20 und -
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gehalten. Danach ist das Hydrazid vollständig unter Bildung von tBOC-val-his-leu-ser-ala-azid umgesetzt, wie durch Dünnschichtchromatographie
unter Verwendung von Chloroform/faethanol/Viasser
(6O:4O:1O) als Lösungsmittel gezeigt werden kann.
Der wie in Beispiel 30 erhaltenen Lösung von tBOC-val-his-leuser-ala-azid
in Dimethylformamid werden etwa 612 mg Glu-glu-E-Cbz-lys-gln-ala
zugesetzt, und das Gemisch wird bei etwa -201C
gerührt, bis das letztere in Lösung gegangen ist. Dann wird die Temperatur der Lösung auf «4θΐ und das pH durch Zugabe von
Diisopropyläthylamin auf 8 eingestellt. Die Lösung wird für etwa 20 Stunden auf einer Temperatur zwischen etwa -200C und
-15Έ gehalten, während von Zeit zu Zeit 'das pH durch Zugabe
von Diisopropyläthylamin auf 8,0 eingestellt wird. Danach ist die Umsetzung unter Bildung des Decapeptids praktisch beendet,
wie durch Dünnschiehtchromatographie an Silicagel G unter Verwendung von Butanol/Pyridin/Essigsäure-Wasser (30:20:6:24) als
Lösungsmittel gezeigt werden kann. Das Reaktionsgemisch, das
einen gelatinösen Niederschlag enthält, wird im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wird mit Wasser verrieben und gewaschen,
und das mit Wasser gewaschene Material wird in 50^-iger wäßriger Essigsäure gelöst. Die Lösung wird durch eine Filtrationssäule aus superfeinem Gel geführt, wobei eine geringe Menge an
Verunreinigung abgetrennt wird. Man erhält etwa 474 mg tBOC-val-his-leu-ser-ala-glu-glu-€^Cbz~lys-glnr-ala.
Beispiel 32 1
Etwa 40 mg tBOC-val-his-leu-ser-ala-glu-glu-S-Cbz-lys-gln-ala
werdefy^ Stunden im Vakuum über Phosphorpentoxyd getrocknet,
um Spuren Wasser abzutrennen. Das erhaltene trockene Material wird in ein etwa 0,3 ml Anisol enthaltendes Polyäthylenrohr
eingebracht. Das Gemisch wird auf eine Temperatur von etwa -350C gekühlt. 1 ml wasserfreier Fluorwasserstoff wird in das
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Rohr einkondensiert, und das gebildete Gemisch wird etwa 45
Minuten bei einer Temperatur von etwa O0C gerührt. Danach wird
trockener Stickstoff durch das Gemisch, das noch eine Temperatur von O0C hat, geleitet, um überschüssigen Fluorwasserstoff
abzutrennen. Das restliche Material wird etwa 20 Minuten im Vakuum bei einer Temperatur von etwa 250C gehalten und dann in
wäßriger Essigsäure gelöst. Diese Lösung wird dann gefriergetrocknet, wobei etwa 40 mg eines amorphen Produktes erhalten
werden. Dieses Produkt wird aus V/asser/Äthanol umkristallisiert, wobei praktisch reines Val-his-leu-ser-ala-glu-glu-lys-gln-ala
erhalten wird.
Etwa 5,56 g Ala-OMe-hydrochlorid und etwa 12,08 g des NHS-esters
von tBOC-ser werden in 400 ml frisch entgastem Dimethylformamid gelöst. Die Lösung wird durch Zugabe von Diisopropyläthylamin
auf pH 8,0 eingestellt und etwa 4 Stunden gerührt, während die Temperatur bei etwa 250C und das pH durch Zugabe von Diisopropyläthylamin
bei 8,0 gehalten wird. Das Reaktionsgemisch wird im Vakuum eingedampft. Das zurückbleibende öl wird in Methylenchlorid
gelöst, und die Lösung wird zweimal mit 0,2n wäßriger Schwefelsäurelösung, mit Natriumsulfat gesättigt, einmal mit
gesättigter wäßriger Natriumchloridlösung, zweimal mit gesättigter wäßriger Natriumbicarbonatlösung und schließlich
zweimal mit gesättigter wäßriger Natriumchloridlösung gewaschen. Die gewaschene Lösung wird über wasserfreiem Natriumsulfat
getrocknet und im Vakuum eingedampft. Das zurückbleibende öl wird aus Äthylacetat/Hexan umkristallisiert. Man erhält
etwa 9*08 g kristallines tBOC-ser-ala-OMe.
Etwa 6,0 g dieses tBOC-ser-ala'-OMe werden bei einer Temperatur
von etwa O'C in der Mindestmenge Trifluoressigsäure gelöst. Die
Lö.sung wird etwa 45 Minuten bei einer Temperatur von etwa 250C
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gerührt und dann tropfenweise unter kräftigem Rühren einem großen Volumen (etwa 100 ml) Äther zugesetzt. Das sich abscheidende
Material wird abfiltriert, mit Äther gewaschen und im Vakuum getrocknet. Man erhält etwa 4,97 S Ser-ala-OMe-trifluoracetat.
Etwa 2,43 g Ser-ala-OMe-trifluoracetat und etwa 3,82 g des
NHS-esters von tBOC-£-Cbz-lys werden in 85 ral frisch entgastem
Dimethylformamid gelöst. Das pH der Lösung wird mit Triäthylamin auf 8,0 eingestellt. Die Lösung wird etwa 4 Stunden
gerührt, während die Temperatur bei etwa 250C und das pH
mit Triäthylamin auf 8,0 gehalten wird. Das Gemisch wird filtriert
und im Vakuum eingedampft. Der zurückbleibende Sirup wird in 200 ml Chloroform gelöst, und die Lösung wird mit 0,ln
wäßriger Schwefelsäurelösung, dann mit gesättigter wäßriger Natriumbicarbonatlösung
und schließlich mit Wasser gewaschen. Die gewaschene Lösung wird über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet
und im Vakuum eingedampft. Das zurückbleibende öl wird aus
Äthylacetat/Äther umkristallisiert. Man erhält etwa 3*15 6
kristallines tBOC-£-Cbz-lys~ser~ala-OMe.
Eine Lösung von etwa 3,15 g tBOC-£-Cbz~lys-ser-ala~OMe in 20 ml
Dioxan werden zu 200 ml V/asser zugesetzt, während das pH durch
Zugabe von In wäßriger Natriumhydroxydlösung bei 11,5 gehalten wird. Die Lösung wird etwa 3 Stunden bei einer Temperatur von
etwa 250C gerührt, während das pH bei 11,5 gehalten wird. Das
Dioxan wird im Vakuum abgedampft, und die zurückbleibende Lösung wird mit V/asser auf etwa 200 ml aufgefüllt. Die wäßrige
Lösung wird dreimal mit je 200 ml Äthylacc-tat gewaschen. Dann wird das pH der wäßrigen Lösung mit Schwefelsäure auf 2,5 eingestellt,
und die angesäuerte wäßrige Lösung wird dreimal mit je 200 ml Äthylacetat extrahiert. Die vereinigten Extrakte
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werden im Vakuum eingedampft, wobei als öliger Rückstand tBOC-6-Cbz-lys-ser-ala
erhalten wird.
Dieses ölige Material wird in 15 ml Methylenchlorid gelöst.
Die Lösung wird auf etwa 50C gekühlt. Der kalten Lösung werden
etwa 15 ml Trifluoressigsäure zugesetzt, und die so gebildete
Lösung wird innerhalb 5 Minuten auf etwa 250C erwärmen gelassen.
Dann wird die Lösung auf O0C gekühlt, und etwa 200 ml Kther werden
unter Rühren zugesetzt. Das ausfallende Material wird ab-« filtriert, mit Äther gewaschen und getrocknet, wobei £~Cbs-lysser-ala-trifluoracetat
erhalten wird.
Dieses E-Cbz-lys-ser-ala-trifluoracetat wird in etwa 25 ml
Wasser gelöst. Das pH wird mit verdünnter wäßriger Natriumhydroxydlösung auf 5j05 eingestellt, und das sich abscheidende
kristalline Material wird abfiltriert und getrocknet. Man erhält etwa 1,4 g £-Cbz-lys-ser~ala.
Etwa 0,88 g des £-Cbz-lys-ser-ala werden in 20 ml Im wäßriger
Kaliumboratpufferlösung (pH 10,1) gelöst. Die Lösung wird auf etwa O0C gekühlt, und etwa 0,J>6 'g GIu-NCA werden innerhalb etwa
I/2 Minute zugesetzt, während welcher Zeit das Gemisch kräftig bewegt wird, vorzugsweise unter Verwendung eines
Waring-Mischers, während die Temperatur- bei O0C und das pH
durch tropfenweise Zugabe von 50$-iger wäßriger Kaliumhydroxydlösung
bei 10,1 gehalten wird. Die Umsetzung wird unter stetigem Bewegen fortschreiten gelassen, während die Temperatur bei
O0C und das pH bei 10,1 gehalten wird, bis der Basenverbrauch
aufhört (etwa 1 Minute). Dann wird so viel konzentrierte Schwefelsäure zugesetzt, daß das pH auf 2,5 sinkt, und Stickstoff
wird etwa 15 Minuten durch das angesäuerte Reaktionsgemisch
geleitet, um Kohlendioxyd von der gebildeten Lösung von £ Cbz-lys-ser-ala abzutrennen.
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Hi
Die wie in Beispiel 37 beschrieben erhaltene Lösung von GIu-E-Cbz-lys-glu-ala
wird auf O0C gekühlt. Das pH wird mit 50^-iger
lösung
wäßriger Kaliumhydroxyd/auf 10,1 eingestellt, und etwa 0,38 g GIu-NCA werden der Lösung innerhalb etwa 1/2 Minute zugesetzt, während das Gemisch kräftig bewegt und die Temperatur bei O0C und das pH durch Zugabe von 50^-igem wäßrigem Kaliumhydroxyd bei 10,1 gehalten wird. Die Umsetzung wird fortschreiten gelassen, während das Gemisch stetig bewegt und die Temperatur bei O0C und das pH bei 10,1 gehalten wird, bis der Basenverbrauch aufhört (etwa 1 Minute). Dann wird das pH der Lösung auf 8,5 eingestellt, und eine geringe Menge an ausgefälltem Material wird abfiltriert. Danach wird so viel konzentrierte Schwefelsäure zugesetzt, daß das pH der Lösung auf 3*6 sinkt, und das dabei ausgefallene Material wird abfiltriert, mit Wasser gewaschen und im Vakuum getrocknet. Man erhält 1,3 g Glu-glu-6-Cbz-lys-ser-ala, das etwas Tetrapeptid und Hexapeptid als Verunreinigungen enthalten kann. Dieses Material wird einer freifließenden Elektrophorese beim pH 7,0 in 0,143m 2,6-Lutidin/Essigsäure-Puffer unterworfen, wobei etwa 0,2 g reines Glu-glu-6-Cbz-lys-ser-ala erhalten werden.
wäßriger Kaliumhydroxyd/auf 10,1 eingestellt, und etwa 0,38 g GIu-NCA werden der Lösung innerhalb etwa 1/2 Minute zugesetzt, während das Gemisch kräftig bewegt und die Temperatur bei O0C und das pH durch Zugabe von 50^-igem wäßrigem Kaliumhydroxyd bei 10,1 gehalten wird. Die Umsetzung wird fortschreiten gelassen, während das Gemisch stetig bewegt und die Temperatur bei O0C und das pH bei 10,1 gehalten wird, bis der Basenverbrauch aufhört (etwa 1 Minute). Dann wird das pH der Lösung auf 8,5 eingestellt, und eine geringe Menge an ausgefälltem Material wird abfiltriert. Danach wird so viel konzentrierte Schwefelsäure zugesetzt, daß das pH der Lösung auf 3*6 sinkt, und das dabei ausgefallene Material wird abfiltriert, mit Wasser gewaschen und im Vakuum getrocknet. Man erhält 1,3 g Glu-glu-6-Cbz-lys-ser-ala, das etwas Tetrapeptid und Hexapeptid als Verunreinigungen enthalten kann. Dieses Material wird einer freifließenden Elektrophorese beim pH 7,0 in 0,143m 2,6-Lutidin/Essigsäure-Puffer unterworfen, wobei etwa 0,2 g reines Glu-glu-6-Cbz-lys-ser-ala erhalten werden.
Etwa 10,3 g Pro v/erden einer Lösung von etwa 28,5 g des NHS-esters
von tBOC-thr in 900 ml frisch entgastem Dimethylformamid
zugesetzt. Das pH der Suspension wird mit Triäthylaniin auf 10,0 eingestellt. Die Suspension wird etwa 16 Stunden gerührt, während
die Temperatur bei etwa 250C und das pH bei 10,0 gehalten
wird. Das Reaktionsgemisch wird im Vakuum eingedampft. Der Rück stand wird in 900 ml Wasser gelöst. Geringe Mengen von Verunreinigungen
werden abfiltriert, und das pH der Lösung 'wird rr.it 6n wäßriger Salzsäure auf 2,5 eingestellt. Die wäßrige Lösung
wird dreimal mit je 1200 ml Äthylacetat extrahiert, und die ver einigten Extrakte werden über wasserfreiem Natriumsulfat ge-
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trocknet und im Vakuum eingedampft. Man erhalt etwa 26 g
amorphes tBOC-thr-pro.
Etwa 25 g dieses tBOC-thr-pro werden bei einer Temperatur von
etwa O0C in etwa der Mindestmenge Trifluoressigsäure gelöst.
Die Lösung wird bei etwa 250C etwa 7 Minuten gerührt, dann werden
ihr langsam unter Rühren etwa 400 ml Äther zugesetzt. Das ausfallende Material wird abfiltriert, mit Äther gewaschen und
im Vakuum getrocknet. Man erhält etwa 14 g Thr-pro-trifluoracetat.
Zu 200 ml kaltem Methanol (etwa -100C) werden tropfenweise unter
Rühren etwa 10 ml Thionylchlorid zugesetzt. Die Lösung wird etwa
15 Minuten bei -1OCC gerührt. Dann werden ih^lO g Thr-protrifluoracetat
zugesetzt, und die so erhaltene Lösung wird etwa J5 Stunden bei 250C gerührt. Das Reaktionsgemisch wird filtriert.
Das Filtrat wird zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird mit Äther verrieben, und das feste amorphe Material
wird abfiltriert und getrocknet. Man erhält etwa 7 g Thr-pro-OHe-hydrochlorid.
4,j4 g Leu-OMe-hydroehlorid werden in etwa 240 ml Im wäßriger
Kaliumboratpufferlösung (pH 9j5) gelöst. Die Lösung wird auf
etwa O0C gekühlt, und etwa 10,01 g His-TCA-hydrobromid werden
innerhalb 10 Minuten zugesetzt, während welcher Zeit das Gemisch kräftig bewegt wird und die Temperatur bei O0C und das pH durch
tropfenweise Zugabe von 50^-igem wäßrigem Kaliumhydroxyd bei 9*5
gehalten wird. Die Umsetzung wird unter stetigem Bewegen fortschreiten
gelassen, während die Temperatur bei 0cC und das pH bei
9,3 gehalten v.'ird, bis der Basenverbrauch aufhört (etwa 10 Minuten).
Dann wird so viel konzentrierte Schwefelsäure zugesetzt,
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daß das pH auf 5*0 sinkt. Die angesäuerte Lösung wird filtriert,
und das Filtrat wird im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der Rückstand, der sowohl His als auch Leu-OMe enthält, wird einer Chromatographie
an Silicagel unter Verwendung von n-Butanol/Essigsäure/Vasser
(10:2,j5:6) als Eluierungsmittel unterworfen, wobei
etwa 7,0 g praktisch reines His-leu-OMe-diacetat erhalten werden.
Etwa 2,4 g His-leu-OMe-diacetat werden in l40 ml Dimethylformamid gelöst. Etwa 2,23 g NHS-ester von tBOC-val werden der Lösung unter
Rühren bei 250C zugesetzt, und das pH der Lösung wird mit Tri-
etwa
äthylamin auf 8,0 eingestellt. Die so erhaltene Lösung wird/20
Stunden stehengelassen, während von Zeit zu Zeit das pH mit Triäthylamin
wieder auf 8,0 eingestellt wird. Dann wird die Lösung im Vakuum zur Trockne eingedampft, und der Rückstand wird in
400 ml V/asser gelöst. Die wäßrige Lösung w ird dreimal mit je
organischen 400 ml Chloroform extrahiert. Die vereinigten/Extrakte werden
zur.Trockne
über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum/eingedampft.
Das zurückbleibende öl wird mit Äther verrieben, wobei ein kristallines Material erhalten wird. Dieses Material wird,
abfiltriert und getrocknet. Man erhält etwa 1,96 g tBOC-val-hisleu-OMe.
Zu etwa 2,8 g tBOC-val-his-leu-OMe werden 20 ml eines Gemisches
von wasserfreiem Hydrazin und Methanol (1:1) zugesetzt. Das erhaltene
Gemisch wird etwa 3 Minuten bei Zimmertemperatur gerührt (die Auflösung ist gewöhnlich in etwa 1 Minute beendet, und nach
etwa 2 Minuten bildet sich ein Niederschlag). Das Reaktionsgemisch wird dann im Vakuum bei etwa 35% eingedampft. Dem Rückstand
werden etwa 10 ml Äthanol zugesetzt, und das erhaltene Gemisch wird im Vakuum eingedampft. Dann werden dem Rückstand
etwa 10 ml Dimethylformamid zugesetzt, und das erhaltene Gemisch
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■wird im Vakuum eingedampft. Der feste Rückstand wird etwa 15
Stunden im Vakuum bei Zimmertemperatur getrocknet und aus Methanol umkristallisiert. Man erhält etwa 2,2 g tBOC-val-hisleu-hydrazid.
.
Etwa 1,0 g tBOC-val-his-leu-hydrazid, hergestellt wie in Beispiel
^4, wird in 30 ml frisch entgastem Dimethylformamid
suspendiert, und die Suspension wird auf eine Temperatur von -400C gekühlt und durch trockenen Stickstoff gegen Feuchtigkeit
geschützt. Der kalten Lösung wird unter Kühren eine Lösung von 6,24 ml 2m Chlorwasserstoff in Tetrahydrofuran und
anschließend 0,3 ml Isoamylnitrit zugesetzt«, Das erha3.tene Gemisch
wird bei -150C bis -200C etwa 1 Stunde unter einer trockenen
Stickstoffatmosphäre gehalten. Danach ist das Hydrazid
vollständig unter Bildung von tBOC-val-his-leu-azid umgesetzt,
wie durch Dünnschichtchroniatographie an Silieagel G unter Verwendung
von Chloroform/Kthanol/Wasser (50:1) als Lösungsmittel
gezeigt werden kann.
Die wie in Beispiel ^5 beschrieben erhaltene Lösung von tBOC-val-his-leu-azid
wird auf -.400C gekühlt«, Dann wird ihr eine
Lösung von 555 mg Thr-pro-OMe-hydrochlorid in 10 ml entgastem
Dimethylformamid zugesetzt. Das pH der erhaltenen Lösung wird mit Diisopropyläthylamin auf 8,0 eingestellt, und das Gemisch
wird etwa 20 Stunden bsi etwa -200C bis -150C gehalten, während
von Zeit zu Zeit das pH mit Diisopropyläthylarriin wieder auf
8,0 eingestellt wird. Nach dieser Zeit ist die Umsetzung unter Bildung des Pentapeptids praktisch beendet, viie durch
Dünnschichtchromatographie an Silicagel G unter Verwendung
von Kthylaeetat/Pyridln/EssigsäureAasser (10:5:10)" als Lösungsmittel gezeigt v/erden kann. Die Lösung wird im Vakuum
eir.fc^dampft. Der Rückstand wird in Viasser gelöst. Die Lösung
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wird gereinigt, indem man sie durch Sephadex-Gel G-IO führt,
wobei etwa 0,8 g praktisch reines tBOC-val-his-leu-thr-pro-OMe
erhalten werden.
Zu etwa 790 mg tBOC-val-his-leu-thr-pro-OMe werden 9 ml eines
wasserfreien Gemisches von Hydrazin und Methanol (1:1) zugesetzt. Das erhaltene Gemisch wird etwa J>
Minuten bei Zimmertemperatur gerührt. Danach ist die Auflösung praktisch beendet.
Die abhältene Lösung wird bei etwa 350C im Vakuum eingedampft.
Dem Rückstand werden etwa 10 ml Äthanol zugesetzt, und die dabei erhaltene Lösung wird im Vakuum eingedampft.
Der Rückstand wird in der Mindestmenge Chloroform/Methanol/ Wasser (60:40:10) aufgelöst, und die Lösung wird durch eine
trockene Säule von 50 g Silicagel H geführt, um Spuren von nicht-umgesetztem Hydrazin abzutrennen (wie durch Dünnschichtchromatographie
an Silicagel G gezeigt). Das Lösungsmittel wird im Vakuum abgedampft. Man erhält etwa 480 mg tBOC-valhis-leu-thr-pro-hydrazid.
Etwa 528 mg wie in Beispiel I17 beschrieben hergestelltes
tBOC-val-his-leu-thr-pro-hydrazid werden in 100 ml frisch
entgastem Dimethylformamid gelöst. Die unter einer Atmosphäre von trockenem Stickstoff gehaltene Lösung wird auf etwa
-40°C gekühlt, und etwa 9*6 ml 2n wasserfreier Chlorwasserstoff
in Tetrahydrofuran werden unter Rühren zugesetzt. Dann werden etwa 0,11 ml Isoamylnitrit zugesetzt, und das erhaltene
Gemisch wird etwa 1 Stunde bei etwa -200C bis -1:;€ gehalten.
Danach ist die Umsetzung des Hydrazids unter Bildung von tBOO-val-his-leu-thr-pro-azid
vollständig beendet, wie -^v-Y. Dünnschichtchromatographie
unter Verwendung von Chloro;:rrr:/Methanol/Vasser
(60:40:10) als Lösungsmittel gezeigt werde:, kann.
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Der wie in Beispiel i\S beschrieben erhaltenen Lösung von tBOC-val-his-leu-thr-pro-azid
in Dimethylformamid werden etwa 515 Glu-glu-E-Cbz-lys-ser-ala zugesetzt, und das Gemisch wird bei
etwa -200C gerührt, bis das letztere in Lösung geht. Dann wird
die Temperatur der Lösung auf ~4o°C und das pH mit Diisopropyläthylamin
auf 8 eingestellt. Die Lösung wird etwa 20 Stunden bei etwa -200C bis -150C gehalten, während von Zeit zu Zeit das
pH mit Diisopropyläthylarain auf 8,0 eingestellt wird. Danach ist die Umsetzung unter Bildung des Decapeptids praktisch beendet,
wie durch Dünnschichtchromatographie an Silicagel G unter Verwendung von Äthylacetat/Pyridin/Essigsäure/Wasser
(10:5:10) als Lösungsmittel gezeigt werden kann. Das Reaktionsgemisch,
das einen gelatinösen Niederschlag enthält, wird im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wird in 50/^iSeF
wäßriger Essigsäure gelöst, und die Lösung wird durch eine Filtrationssäule von feinem Gel G-25 geführt, um eine gerin- ·
ge Menge an Verunreinigungen abzutrennen, wobei etwa 400 mg tBOC-val-his-leu-thr~pro-glu-glu-£-Cbz-lys-ser-ala erhalten
werden.
Etwa 40 mg tBOC-val-his-leu-thr-pro-glu-glu-E-Cbz-lys-ser-ala
werden im Vakuum etwa 15 Stunden über -Phosphorpentoxyd getrocknet,
um Spuren von Wasser zu entfernen. Das trockene Material wird in ein Polyäthylenrohr, das etwa 0,5 ml Anisol
enthält, eingebracht. Das Gemisch wird auf etwa ~J55CC gekühlt.
1 ml Viasserfreier Fluorwasserstoff wird in das Rohr einkondensiert, und das erhaltene Gemisch wird etwa 45 Minuten bei
etwa O0C gerührt. Danach wird trockener Stickstoff durch das
Gemisch von O0C geleitet, um überschüssigen Fluorwasserstoff
abzutrennen. Das restliche Material wird etwa 20 Minuten im Vakuum bei etwa 250C gehalten und dann in wäßriger Essigsäure
gelöst. Die Lösung wird gefriergetrocknet, wobei etwa 4l mg
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amorphes Produkt erhalten werden. Dieses Produkt wird von Wasser/Ä'thanol umkristallisiert, wobei praktisch reines VaI-his-leu-thr-pro~glu-glu-lys-ser-ala
erhalten wird."
Etwa 1,33 g AIa werden in 200 ml 0,1m wäßriger Kaliumboratpufferlösung
(pH 9*5) ' gelöst. Die Lösung wird auf etwa O0C
gekühlt, und etwa 2,0 g AIa-TCA werden innerhalb 5 Minuten
zugesetzt, während das Gemisch gerührt und bei einer Temperawäßrigem
tür von O0C und durch tropfenweise Zugabe von 25^-igen/Natriumhydroxyd
bei einem pH von 9*5 gehalten wird. Die Umsetzung wird fortschreiten gelassen, während weiter gerührt und die
Temperatur bei O0C und das pH bei 9.»5 gehalten wird, bis der
Verbrauch von Base aufhört (etwa 5 Minuten). Dann wird so viel konzentrierte Schwefelsäure zugesetzt, daß das pH auf 3*0 sinkt,
und durch das angesäuerte Gemisch wird etwa 45 Minuten lang
Stickstoff hindurchgeleitet, um das Kohlendioxyd aus der gebildeten Lösung von Ala-ala auszutreiben.
Diese Pufferlösung wird zweckmäßig wie folgt hergestellt:
1 Mol Borsäure wird in 500 ml Wasser aufgeschlämmt, und der
Aufschlämmung wird gerade so viel festes Kaliumhydroxyd zugesetzt,
um die Borsäure zu lösen. Dann wird weiteres Kaliumhydroxyd zugesetzt, um das pH auf 9*5 zu bringen. Die Lösung
wird auf 990 ml verdünnt, das pH wird erneut auf 9*5 eingestellt, und die Lösung wird auf ein Endvolumen von 1000 ml
aufgefüllt. Durch Verdünnen auf das Zehnfaahe wird eine 0,1m
Lösung erhalten.
wäßrigen Der wie in Beispiel51 beschrieben erhaltenen/Lösung von Ala-ala
v/erden 200 ml A'thanol zugesetzt, und das pH wird durch Zugabe
, wäßrigem n
von 25^-igem/Natriumhydroxyd auf 8,0 eingestellt. Etwa 7*15 β
NHS-ester von cx-tBOC-E-Cbz-lys werden unter Rühren zugesetzt,
während die Temperatur bei etwa 250C und dnc pH durch tropfen-
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weise Zugabe von 25/£-igem wäßrigem Natriumhydroxyd bei1 8,0 gehalten
wird. Wenn der Verbrauch von Base aufhört, wird die Lösung filtriert. Das Äthanol wird im Vakuum abgedampft, und die
wäßrige Lösung wird mit 100 ml Äthylacetat extrahiert, um den in der Lösung anwesenden nicht-umgesetzt en NHS-ester abzutrennen.
Dann wird das pH der wäßrigen Lösung durch Zugabe von konzentrierter Schwefelsäure auf 3*7 eingestellt, und die
angesäuerte Lösung wird dreimal mit je 100 ml Äthylacetat 'extrahiert.
Die Extrakte werden vereinigt und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Das Äthylacetat wird im Vakuum abgedampft,
wobei ein schweres Öl erhalten wird. Durch Dünnschichtchromatographie an Sillcagel unter Verwendung von
n-Butanol/Pyridin/Essigsäure/Wasser (30:20:6:24) als Eluierungsmittel-zeigt
sich, daß das Produkt hauptsächlich aus a-tB0C~ (B-Cbz-lys-ala-ala mit einer Spur (weniger als 1$) einer
rascher fortschreitenden Verunreinigung besteht.
BeiEipiel 53
Dieses a-tBOC-E-Cbz-lys-ala-ala-öl wird in etwa 30 ml Methylenchlorid
gelöst. Die Lösung wird auf 100C gekühlt. Etwa 3.6 ml Trifluoresslgsäure
werden, zugesetzt, und die Temperatur des Gemisches wird innerhalb -5 Minuten auf etwa 240C ansteigen gelassen.
Die Lösung wird auf O0C gekühlt, und Äther wird zugesetzt, während
die Temperatur bei O0C gehalten wird, wobei f-Cbz-lys-alaala-trifluoracetat
ausfällt. Das ausgefällte Material wird abfiltriert und in Wasser gelöst. Das pH der Lösung wird mit 2,5n
wäßrigem Natriumhydroxyd auf 4,1 eingestellt, und das sich abscheidende kristalline Material wird abfiltriert und getrocknet.
Man erhält etwa 2,0 g praktisch reines £-Cbz-lys-ala-ala, Durch
Eindampfen der Mutterlaugen worden noch etwa 0,7 β Material erhalten.
Beinpiol PA
Etwa 1,26 g des E.-Cb^-lys-ala-ala v/erden in 30 ml Im wäßriger
Ki;llU://borM, pufferlösung (pil 10,0) gelost. Die Lösung wird auf
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etwa O0C gekühlt, und etwa 0,544 g GIu-NCA werden innerhalb etwa
1/2 Minute zugesetzt, während das Gemisch kräftig gerührt und bei O0C und durch tropfenweise Zugabe von 50^-igem wäßrigem
Kaliumhydroxyd beim pH 10,0 gehalten wird. Die Umsetzung wird
fortschreiten gp lassen, während das Gemisch weiter bewegt und bei O0C und pH 10,0 gehalten wird, bis der Verbrauch von Base
aufhört. Dann wird so viel konzentrierte Schwefelsäure zugesetzt, daß das pH auf 2,5 sinkt. Durch das angesäuerte Reaktionsgemisch
wird etwa 30 Minuten Stickstoff hindurchgeleitet, um das Kohlendioxyd von der gebildeten Lösung von Glu-6-Cbz-ly&-ala~ala
abzutrennen.
Die wie in Beispiel 54 beschrieben hergestellte Lösung von Glu-E-Cbz-lys-ala-ala wird bei O0C durch Zugabe von 50^-igem
wäßrigem Kaliumhydroxyd auf ein pH von 10,0 eingestellt. Et-
et,wa wa 0,570 g GIu-NCA werden innerhalb/1/2 Minute zugesetzt,
während das Gemisch kräftig bewegt und bei O0C und durch Zugabe
vom 50^-igem wäßrigem Kaliumhydroxyd beim pH 10,0 gehalten wird. Die Umsetzung wird fortschreiten gelassen, während
das Gemisch weiter bewegt und bei O0C und pH 10,0 gehalten
wird, bis der Verbrauch von Base aufhört. Die Reaktionslösung wird filtriert. Dann wird so viel konzentrierte Schwefelsäure
zugesetzt, daß das pH der Lösung auf 4,1 gesenkt wird. Das Wasser wird im Vakuum abgedampft, und der feste
Rückstand wird in 25 ml 50^-iger wäßriger Essigsäure gelöst. Die wäßrige-Essigsäurelösung wird dann einer Gelpermeationcchromatographie
unterworfen, wodurch Salz und Verunreinigungen entfernt werden. Man erhält etwa 0,4 g praktisch reines
Glu-glu-S-Cbz-lys-ala-ala.
Etwa 2,8 g AIa-OMe-hydr oc hl or id und etwa 6,2J5 g des J:ii3-cstcrs
von tBOC-thr werden in 200 ml frisch entgastem Dimethylformamid
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gelöst. Die Lösung wird mit Diisopropyläthylamin auf pH- 8,0 eingestellt
und etwa 4 Stunden gerührt , während sie bei etwa 250C und durch Zugabe von Diisopropyläthylamin beim pH 8,0 gehalten
wird. Das Reaktionsgemisch wird im Vakuum eingedampft. Das zu«
rückbleibende öl wird in'Methylenchlorid gelöst, und die Lösung
wird zweimal mit 0,2n wäßriger Schwefelsäure, mit Natriumsulfat gesättigt, einmal mit gesättigter wäßriger Natriumchloridlösung,
zweimal mit gesättigter wäßriger Natriumbicarbonatlösung und
schließlich zweimal mit gesättigter wäßriger Natriumchloridlösung gewaschen. Die so gewaschene Lösung wird dann über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum eingedampft. Das
zurückbleibende Öl wird aus Äthylacetat/Hexan umkristallisiert, wobei etwa 4,2 g kristallines tB0C-thr-ala~0Me erhalten werden.
Etwa 3^86 g dieses tBOC-thr-ala-OMe vierden bei etwa O0C in der
Mindestmenge Trifluoressigsäure gelöst. Die Lösung wird etwa
45 Minuten bei etwa 250C getührt und dann zur Trockne eingedampft,
wobei etwa 4,1 g Thr-ala-OMe-trifluoracetat in der
Form eines schweren Öls erhalten werden.
Etwa 4,1 g Thr-ala-OMe-trifluoracetat und etwa 4,1 g des NHS-esters
von tBOG-leu werden in 225 ml frisch entgastem Dimethylformamid
gelöst. Das pH der Lösung wird mit Diisopropyläthylamin auf 8,0 eingestellt, und die Lösung wird etwa
4 Stunden gerührt, während die Temperatur bei etwa 250C und
das pH durch Zugabe von Diisopropyläthylamin bei 8,0 gehalten wird. Das Reaktionsgemisch wird im Vakuum eingedampft.
Der Rückstand wird in Methylenchlorid gelöst, und die Lösung
wird zweimal mit 0,2n wäßriger Schwefelsäure, mit Natriumsulfat gesättigt, zweimal mit gesättigter wäßriger Natriurnchloridlösung,
zweimal mit gesättigter wäßriger Nat-riumbicarbonatlöftung
und schließlich zweimal mit gesättigter
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wäßriger Natriumchloridlösung gewaschen. Dann wird die- Lösung
über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum eingedampft. Der feste Rückstand wird aus ÄthyIacetat /Hexan umkristallisiert,
wobei etwa 3>4 g kristallines tBOC-leu-thrala-OMe
erhalten werden.
Etwa 3)1 g dieses tBOC-leu-thr-ala-OMe wird in der Mindestmenge
Trifluoressigsäure bei einer Temperatur von etwa O0C gelöst. Die Lösung wird bei einer Temperatur von etwa 250C
etwa 45 Minuten gerührt und dann tropfenweise unter "kräftigem
Rühren einem großen Volumen (etwa 100 ml) Äther zugesetzt. Das ausfallende Material wird abfiltriert, zweimal
mit Äther gewaschen und im Vakuum getrocknet. Man erhält etwa 2,8 g Leu-thr-ala-OMe-trifluoracetat.
Etwa 2,8 g Leu-thr-alar-OMe-trifluoracetat und etwa 2,24 g
des NHS-esters von tBOC-met werden in etwa 60 ml frisch entgastem
Dimethylformamid gelöst. Das pH der Lösung wird mit Triethylamin auf 8,0 eingestellt, und die Lösung wird etwa
4 Stunden bei etwa 250C, während das pH durch Zugabe von Triäthylamin
bei 8,0 gehalten wird, gerührt. Dann wird das Reaktionsgemisch im Vakuum eingedampft, und der Rückstand
wird in Äthylacetat gelöst. Die Lösung wird dreimal mit 0,ln
lösung
wäßriger Schwefelsäure^ mit Natriumsulfat gesättigt, dreimal mit gesättigter wäßriger Natriumbicarbonatlösung und schließlich mit gesättigter wäßriger Natriumchloridlösung gewaschen und dann über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Ein Teil des Äthylacetats wird im Vakuum abgedampft. Der sich bildende voluminöse Niederschlag wird abfiltriert, mit einer geringen Menge Äthylacetat gewaschen und im Vakuum getrocknet. Man erhält etwa 1,9 g kristallines tBOC-met-leu-thr-ala-OMe.
wäßriger Schwefelsäure^ mit Natriumsulfat gesättigt, dreimal mit gesättigter wäßriger Natriumbicarbonatlösung und schließlich mit gesättigter wäßriger Natriumchloridlösung gewaschen und dann über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Ein Teil des Äthylacetats wird im Vakuum abgedampft. Der sich bildende voluminöse Niederschlag wird abfiltriert, mit einer geringen Menge Äthylacetat gewaschen und im Vakuum getrocknet. Man erhält etwa 1,9 g kristallines tBOC-met-leu-thr-ala-OMe.
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- 52 -
Zu etwa 1,5 mg tBOC-met-leu-thr-ala-OMe werden 24 ml eines Gemisches
von Hydrazin und Dimethylformamid (1:1) zugesetzt. Das Gemisch wird etwa 5 Minuten bei Zimmertemperatur gerührt. Die·
gebildete Lösung wird im Vakuum bei etwa 350C eingedampft. Dem
Rückstand werden etwa βθ ml Dimethylformamid zugesetzt, und die
gebildete Lösung wird im Vakuum eingedampft. Etwa 100 ml Methanol werden zugesetzt, und das gebildete Gemisch wird im Vakuum
eingedampft. Der Rückstand wird aus Methanol umkristallisiert.,
wobei etwa 1,2 g tBOC-met-leu-thr-ala-hydrazid erhalten werden.
Etwa 252 mg tBOC-met-leu-thr-ala-hydrazid, hergestellt wie in
Beispiel 6l beschrieben, werden in 15 ml frisch entgastem Dimethylformamid gelöst. Die Lösung wird unter einer trockenen
Stickst off atmosphäre auf etwa -1J-O0C gekühlt, und etwa 1,3 ml
2n wasserfreier Chlorwasserstoff in Tetrahydrofuran werden unter Rühren zugesetzt. Dann werden etwa 0,068 ml Isoamylnitrit
zugesetzt, und das gebildete Gemisch wird etwa 1 Stunde bei einer Temperatur zwischen etwa -200C und -150C gehalten, wonach
das Hydrazid vollständig unter Bildung von tBOC-met-leuthr-ala-azid
umgesetzt ist, wie durch DünnschichtChromatographie unter Verwendung von Chlorof orm/lVIethanol/Wasser als Lö
sungsmittel (βθ:4θ:1θ) gezeigt werden- kann.
Der wie in Beispiel 62 beschrieben hergestellten Lösung von tBOC-met-leu-thr-ala-azid in Dimethylformamid werden etwa
215 mg Glu-glu-E-Cbz-lys-ala-ala, in 30 ml Dimethylformamid
gelöst, zugesetzt. Die Temperatur der Lösung wird auf -400C
und das pH durch Zugabe von Diisopropyläthylamin auf 8 eingestellt,
und die Lösung wird für etwa 20 Stunden bei zwischen etwa -20üC und -150C bei gelegentlicher Einstellung des
pH auf 8,0 durch Zugabe von Diisopropyläthylamin gehalten.
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14804 w 22U490
Danach ist die Umsetzung unter Bildung des Nonapeptids praktisch
beendet, wie durch Dünnschichtchromatographie an Silicagel
G unter Verwendung von Äthylacetat/Pyridin/Essigsäure/
Wasser (10:5:10) als Lösungsmittel gezeigt werden kann. Das
Gemisch wird im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wird mit Wasser verrieben und gewaschen, und das mit Wasser gewaschene
Material wird getrocknet, wobei etwa 875 mg tBOC-met-leu-thrala-glu-glu-E-Cbz-lys-ala-ala
erhalten werden.
Etwa 196 mg tBOC-met-leu-thr-ala-glu-glu-E-Cbz-lys-ala-ala
werden etwa 15 Stunden im Vakuum über Phosphorpentoxyd getrocknet,
um Spuren von Wasser zu entfernen, und das so getrocknete Material wird in ein Polyäthylenrohr, das 2,4 ml Anisol und
2,4 g Methionin enthält, eingebracht. Das Gemisch wird auf etwa -350C gekühlt. 1 ml wasserfreier Fluorwasserstoff wird in
das Rohr kondensiert, und das erhaltene Gemisch wird bei etwa O0C etwa 45 Minuten gerührt. Danach wird ein Strom von trockenem
Stickstoff durch das Gemisch, das noch bei O0C ist, geleitet,
um überschüssigen Fluorwasserstoff abzutrennen. Das restliehe Material wird im .Vakuum etwa· 20 Minuten bei etwa 250C gehalten
und dann in wäßriger Essigsäure gelöst. Die Lösung wird gefriergetrocknet. Das so erhaltene Produkt wird in 45 ml Wasser
gelöst, 5 tnl Merc apt o-äthanol werden zugesetzt, und das Gemisch
'wird etwa 24 Stunden auf 45° erhitzt. Die Lösung wird im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird in 50^-iger wäßriger
Essigsäure gelöst. Die Lösung wird durch eine Gelfiltrationssäule geführt und dann gefriergetrocknet. Man erhält etwa
75 mg Met-leu-thr-ala-glu-glu-lys-ala-ala.
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Claims (1)
- PatentansprücheVerfahren zur Herstellung der Hämopeptide Pl, P2, H und S, dadurch gekennzeichnet, daß man in einer Stufensynthese oder Blocksynthese die Aminosäurekomponenten durch Peptidverknüpfungen in entsprechender Reihenfolge wie folgt miteinander verknüpft: Val-his-leu-ser-alaglu-glu-lys-glu-ala für das Hämopeptid Pl, Val-his-leu-serala-glu-glu-lys-gln-ala für das Hämopeptid P2, Val-his-leuthr-pro-glu-glu-lys-ser-ala für das Hämopeptid H und Metleu~thr-ala~glu-glu-lys~ala-ala für das Hämopeptid S, wobei funktionelle Gruppen, die in einer solchen Aminosäure- oder 'Peptidkomponente anwesend und unter den Bedingungen der Kupplung reaktiv sind, von während der Kupplung nicht-reaktiven und ohne Angreifen der Peptidverknüpfungen oder anderer abschirmender Substituenten, die in einer nachfolgenden Kupplung erhalten bleiben, abspaltbaren Substituenten abgeschirmt werden, und das so gebildete, abschirmende Substituenten enthaltende Hämopeptid der Wirkung eines Spaltmittels, das diese Substituenten unter Bildung des Hämopeptiäs abzutrennen vermag, unterworfen wird.Verfahren zur Herstellung des Hämopeptids Pl, dadurch gekennzeichnet , daß man in einer Stufensynthese oder einer Blocksynthese die Aminosäurekomponenten in der Folge Val-his-leu~ser-ala-glu~glu-lys-glu-ala miteinander verknüpft, wobei funktionelle Gruppen, die in einer solchen Aminosäure- oder Peptidkomponente anwesend und unter den Bedingungen der Kupplung reaktiv sind, von während der Kupplung nicht-reaktiven und ohne Angreifen der Peptid-Verknüpfungen oder anderer abschirmender Substituenten, die in einer nachfolgenden Kupplung erhalten bleiben, abspaltbaren S\;bstituenten abgeschirmt werden und das gebildete,209841/119614804 st 221U90Plabschirmende Substituenten enthaltende Hämopeptid/der Wirkung eines Spaltmitteis, das diese Substituenten unter Bildung des Hämopeptids/abzutrennen vermag, unterworfen wird.3. Verfahren zur Herstellung des Hämopeptids P2, dadurch gekennzeichnet , daß man in einer Stufensynthese oder Blocksynthese die Aminosaurekomponenten in der Folge Val-his-leu-ser-ala-glu-glu-lys-gln-ala miteinander verknüpft, wobei funktionelle Gruppen, die in einer solchen Aminosäure- oder Peptidkomporasnte anwesend und unter den Bedingungen der Kupplung reaktiv sind, von während der Kupplung nicht-reaktiven und ohne Angreifen der Peptidverknüpfungen oder anderer abschirmender Substituenten, die in einer nachfolgenden Kupplung erhalten bleiben, abtrennbaren Substituenten abgeschirmt v/erden und das gebildete, abschirmende Substituenten enthaltende Hämopeptid P2 der Wirkung eines Spaltmittels, das diese Subst it ue"h1ien unter Bildung des Hämopeptids P2 abzutrennen vermag, unterworfen wird.4. Verfahren zur Herstellung des Hämopeptids H, dadurch gekennzeichnet , daß man in einer Stufensynthese oder Blocksynthese die Aminosäurekomponenten in der Folge Val~his~leu~thr-pro-glu-glu-lys-ser-ala miteinander verknüpft, wobei funktioneile Gruppen, die in einer solchen Aminosäure- oder Peptidkomponente 'anwesend und unter den Bedingungen der Kupplung reaktiv sind, von während der Kupplung nicht-reaktiven und ohne Angreifen der Peptidverknüpfungen oder anderer abschirmender Substjtuenten, die in der nachfolgenden Kupplung erhalten bleiben, abtrennbaren Subctituenten abgeschirmt werden und das gebildete, abschirmende Substituenten enthaltende Hämopeptid H der Wirkung eines Spaltmittels, das diese Substituenten unter Bildung des Hämopeptids H abzutrennen vermag, unterworfen wird.209841/1 196- 56 -5". Verfahren zur Herstellung des Hämopeptids S, dadurch gekennzeichnet , daß man In einer Stufensynthese oder Blocksynthese die Aminosäurekomponenten in der Folge Met-leu-thr-ala-glu-glu-lys-ala-ala miteinander verknüpft, wobei funktioneile Gruppen, die in einer solchen Aminosäure- oder Peptidkomponente anwesend und unter den Bedingungen der Kupplung reaktiv sind, von während der Kupplung nicht-reaktiven und ohne Angreifen der Peptidverknupfungen oder anderer abschirmender Substituenten, die in einer nachfolgenden Kupplung erhalten bleiben, abtrennbaren Substituenten abgeschirmt werden, und das gebildete, abschirmende Substituenten enthaltende Hämopeptid S der Wirkung eines Spaltmittels, das diese Substituenten unter Bildung des Hämopeptids S abzutrennen vermag, unterworfen wird.6. Verfahren zum Synthetisieren des Hämopeptids Pl der Struktur Val-his-leu-ser-ala-glu-glu-lys-glu-ala aus einem abgeschirmten Derivat davon, in dem funktioneile Gruppen durch Substituenten abgeschirmt sind, die durch die energische Einwirkung einer starken Säure als Spaltmittel abtrennbar sind, ohne Peptidverknupfungen wesentlich anzugreifen, d a durch gekennzeichnet, daß man das abgeschirmte Hämopeptid Pl der energischen Einwirkung einer starken Säure als Spaltmittel unterwirft.7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man tBOC-val-his-leu-ser-ala-gluglu-E"~Cbz-lys-glu~ala unter Bildung des Hämopeptids Pl mit. praktisch wasserfreiem Fluorwasserstoff umsetzt.8. Verfahren zum Synthetisieren des Hämopeptids P2 der Struktur Val-his-leu-ser-ala-glu-glu-lys-gln-ala aus einem abgeschirmten Derivat davon, in dem funktioneile Gruppen durch Substituenten, die durch die energische Einwirkung einer starken Säure als Spaltmittel'abtrennbar sind, ohne daß die Peptid-209841/1Ϊ96- 57 -Verknüpfungen wesentlich angegriffen werden, abgeschirmt sind, dadurch gekennzeichnet, daß man das abgeschirmte Hämopeptid P2 der energischen Wirkung einer starken Säure als Spaltmittel unterwirft.9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet , daß man tBOC~val~his-leu-ser-ala-glu« glu-£~Cbzt-lys-gln-ala unter Bildung des Härnopeptids P2 mit praktisch wasserfreiem Fluorwasserstoff umsetzt.10. Verfahren zum Synthetisieren des Hämopeptids H der Struktur Val-his-leu-thr-pro-glu-glu-lys-ser-ala aus einem abgeschirmten Derivat davon, in dem funktionelle Gruppen durch Substituenten, die durch die energische Einwirkung einer starken Säure als Spaltmittel abtrennbar sind, ohneτ, *. , , , .. , , . , abgeschirmt sind,Peptidverknupfungen wesentlich anzugreifen,/ d a α u r h gekennzeichnet , daß man das abgeschirmte Hämopeptid H der energischen V/irkung einer starken Säure als Spaltmittel unterwirft.11. Verfahren nach Anspruch 10, d'adurch gekennzeichnet , daß man tBOC-val-his-leu-thr-pro-gluglu-6-Cbz-lys-ser-ala unter Bildung des Hämopeptids H mit praktisch wasserfreiem Fluorwasserstoff umsetzt.12. Verfahren zum Synthetisieren des Hämopeptids S der Struktur Met-leu-thr-ala-glu-glu-lys-ala-ala aus einem abgeschirmten Derivat davon, in dem funktionelle Gruppen durch Substituenten, die durch die Einwirkung eines Spaltmittels abtrennbar sind, ohne daß Peptidverknupfungen wesentlich angegriffen werden, abgeschirmt sind, dadurch gekennzeichnet , daß man das abgeschirmt r Hämopeptid S der Einwirkung des Spaltmittels unterwirft.209841/1196- 58 -22U49013. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß man tBOC-met-leu-thr-ala-glu-glu-^- Cbz-lys-ala-ala unter Bildung des Hämopeptids S mit praktisch wasserfreiem Fluorwasserstoff umsetzt.14. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekenn~ zeichnet, daß man AIa mit GIu-NCA zu dem Dipeptid Glu-ala umsetzt, das Glu-ala mit a-tBOC-S-Cbz-lys-NHS zu dem abgeschirmten Tripeptid a-tBOC-C-Cbz-lys-glu-ala umsetzt, dieses Tripeptid mit Trifluoressigsäure unter Abspaltung des Substituenten tBOC.zu E-Cbz-lys-glu-ala umsetzt, die letztere Verbindung mit GIu-NCA zu dem abgeschirmten Tetrapeptid Glu-£-Cbz-lys-glu-ala umsetzt und das Glu-E-Cbz-lys-glu-ala mit GIu-NCA zu dem Glu-glu- £-Cbz-lys-glu-ala umsetzt; Leu-OMe mit His-TCA zu dem Dipeptidester His-leu-OMe umsetzt, diesen Dipeptidester mit tBOC-val-NIIS zu dem abgeschirmten Tripeptidester tBOC-valhis-leu-OMe umsetzt, diesen abgeschirmten Tripeptidester mit Hydrazin umsetzt und das gebildete Hydrazid dann mit salpetriger Säure zu dem tBOC-val-his-leu-azid umsetzt; AIa-OMe mit tBOC-ser-NHS zu dem tBOC-ser-ala-OMe umsetzt, dieses mit Trifluoressigsäure unter Abspaltung des Substituenten tBOC und Bildung von Ser-ala-OMe umsetzt, das Ser-ala-OMe mit dem tBOC-val-his-leu-azid zu dem abgeschirmten Pentapeptidester tBOC-val-his-leu-ser-ala-OMe umsetzt, diesen abgeschirmten Pentapeptidester mit Hydrazin umsetzt und das gebildete Hydrazid dann mit salpetriger Säure unter Bildung des tBOC-val-his-leu-ser-ala-azids umsetzt; uiu dieses tBOC-val-his-leu-ser-ala-azld mit dem Glu-glu-£>Cbz~lys-glu-ala zu dem abgeschirmten Decapeptid tBOC-val-hiö-leu-ser-ala-glu-glu-E-Cbz-lys-glu-ala umsetzt; urd das abgeschirmte Decapeptid dann unter Bildung des Hämopeptids Pl mit wasserfreiem Fluorwasserstoff umsetzt.209841/1196- 59 -15. Verfahren nach Anspruch J>, dadurch gekennzeichnet, daß man Ala mit GIn-NCA zu dem Dipeptid Gln-ala umsetzt, das Gln-ala mit cc-tBOC-6i-Cbz-lys-NHS zu dem abgeschirmten Tripeptid a-tBOC-6-Cbz-lys-gln-ala umsetzt, dieses Tripeptid mit Trifluoressigsaure unter Abtrennen des Substituenten tBOC und Bildung des E-Cbz-lys-gln-ala umsetzt, die letztere Verbindung mit GIu-NCA zu dem abgeschirmten Tetrapeptid GIu-E-Cbz-lys-gln-ala umsetzt und das Glu-E-Cbz-rlys-gln-ala mit GIu-NCA zu dem Glu-glu-£- Cbz-lys-gln-ala umsetzt; Leu-OMe mit His-TCA zu dem Dipeptidester His-leu-OMe umsetzt, diesen Dipeptidester mit tBOC-val-NHS zu dem abgeschirmten Tripeptidester tBOC-valhis-leu-OMe umsetzt, diesen abgeschirmten Tripeptidester mit Hydrazin umsetzt und das erhaltene Hydrazid dann mit salpetriger Säure zu dem tBOC-val-his-leu-azid umsetzt; AIa-OMe mit tBOC-ser-NHS zu dem tBOC-ser-ala-OMe umsetzt, das letztere mit Trifluoressigsaure unter Abspaltung des Substituenten tBOC und Bildung von Ser-ala-OMe umsetzt, das Ser-ala-OMe mit dem tBOC-val-his-leu-azid unter Bildung des abgeschirmten Pentapeptidesters tBOC-val-hisleu-ser-ala-OMe umsetzt, diesen abgeschirmten Pentapeptidester mit Hydrazin umsetzt und das gebildete Hydrazid dann mit salpetriger Säure zu dem tBOC-val-his-leu-serala-azid umsetzt; und dieses tBOC-val-his-leu-ser-alaazid mit dem Glu-glu-6-Cbz-lys-gln-ala unter Bildung des abgeschirmten Decapeptids tBOC-val-his-leu-ser-ala-gluglu-^-Cbz-lys-gln-ala umsetzt; urädas abgeschirmte Decapeptid unter Bildung des Hämopeptids P2 mit wasserfreiem Fluorv/asserstoff umsetzt.16. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man AIa-OMe mit tBOC-ser-NHS unter Bildung des abgeschirmten Dipeptids tBOC-ser-ala-OMe umsetzt, dieses Dipeptid mit Trifluoressigsaure unter Abspaltung des Substituenten tBOC und Bildung von Ser-ala-OMe209841/1196- 6o -14804 M 22U490umsetzt, das Ser-ala-OMe mit a-tBOC-£~Cbz-lys-NHS'4unter Bildung des abgeschirmten Tripeptide a-tBOC-i:-Cbz-lysser-ala-OMe umsetzt, von diesem Tripeptid die Methylestergruppe mit wäßrigem Alkali abhydrolysiert und das Hydrolyseprodukt mit Trifluoressigsäure unter Abtrennen des Substituenten tBOC und Bildung von £-Cbz-lys-ser-ala umsetzt, die letztere Verbindung mit GIu-NCA zu dem abgeschirmten Tetrapeptid Glu-£-Cbz-lys-ser-ala umsetzt und das Glu-f-Cbz-lys-ser-ala mit GIu-NGA zu dem GIuglu-8-Cbz-lys-ser-ala umsetzt; Leu-OMe mit His-TCA zu dem Dipeptidester His-leu-OMe umsetzt, diesen Dipeptidester mit tBOC-val-NHS zu dem abgeschirmten Tripeptide ester tBOC-val-his-leu-OMe umsetzt, diesen abgeschirmten Tripeptldester mit Hydrazin umsetzt und das gebildete Hydrazid mit salpetriger Saure unter Bildung des tBOC-val-his-leu-azid umsetzt; Pro mit tBOC-thr~NHS unter Bildung des tBOC-thr-pro umsetzt, das letztere mit Trifluoressigsäure unter Abspaltung des Substituenten tBOC und Bildung von Thr-pro umsetzt, das Thr-pro mit einem Methylierungsmittel unter Bildung von Thr-pro-OMe umsetzt, dieses Thr-pro-OMe mit dem tBOC-val-his-leu-azid unter Bildung des abgeschirmten Pentapeptidesters tBOC-val-his-leu'-thr-pro-OMe umsetzt, diesen abgeschirmten Pentapeptidester mit Hydrazin umsetzt und das gebildete Hydrazid dann mit salpetriger Saure unter Bildung des tBOC-val-his-leu-thr-pro-azid umsetzt; urüdieses tBOC-val-his-leu-thr-pro-azid mit dem Glu-glu~£-Cbz-ly s-serala unter Bildung des abgeschirmten Decapeptids tBOC-valhis'-leu-thr-pro-glu-glu-E-Cbz-lys-ser-ala umsetzt; und das abgeschirmte Decapeptid unter Bildung des Hämopeptids H mit wasßerfreiem Pluorviasserstoff umsetzt.17. Verfahren nach Anspruch 5» dadurch gekennzeichnet, daß man AIa mit AIa-TCA zu dem Dipeptid Ala-ala umsetzt, das Ala-ala mit a-tBOC-6-Cbz-lys-NHS209841/1196- 61 -804 φ 22UA90ester unter Bildung des abgeschirmten Tripeptids ά-tBOC- £-Cbz-lys-ala-ala umsetzt, dieses Tr!peptid mit Trifluoressigsäure unter Abtrennung des Substituenten tBOC und Bildung von £-Cbz~lys-ala-ala umsetzt, die letztere Verbindung mit GIu-NCA zu dem abgeschirmten Tetrapeptid GIu- £-Cbz-lys-ala-ala umsetzt und das Glu-5-Cbz-lys-ala-ala mit GIu-NCA unter Bildung des Glu-glu-6-Cbz-lys-ala-ala umsetzt; AIa-OMe mit tBOC-thr-NHS-ester unter Bildung des abgeschirmten Dipeptidesters tBOC-thr-ala-OMe umsetzt, diesen abgeschirmten Dipeptidester mit Trifluoressigsäure unter Abspalten des Substituenten tBOC und Bildung von Thr-ala-OMe umsetzt, das Thr-ala-OMe mit tBOC-leu-NHS-ester unter Bildung des abgeschirmten Tripeptidesters tBOC-leu-thr-ala-OMe umsetzt, den letzteren mit TrIfluoressigsäure unter Abspaltung des Substituenten tBOC und Bildung von Leu-thr-ala-OMe umsetzt, dieses Leu-thr-ala OMe mit tBOC-met-NHS-ester unter Bildung des tBOC-metleu-thr-ala-OMe umsetzt, diesen abgeschirmten Tetrapeptidester mit Hydrazin umsetzt und das gebildete Hydrazid dann mit Salpetersäure unter Bildung des tBOC-met-leu« thr-ala-azids umsetzt; und dieses tBOC-met-leu-thr-alaazid mit dem Glu-glu-6-Cbz-lys-ala-ala unter Bildung des abgeschirmten Nonapeptids tBOC-met-leu-thr-ala-glu-glu-E-Cbz-lys-ala-ala umsetzt; und das abgeschirmte Nonapeptid unter Bildung des Hämopeptids S mit wasserfreiem Fluorwasserstoff umsetzt.18. Amide, Ester und N-Acylanaloge von Hämopeptid Pl, dem Decapeptid der Struktur Val-hls-leu-ser-ala-glu-glu-lysglu-ala, und abgeschirmte Derivate des Hämopeptids Pl, seine Amide, Ester und N-Acylanaloge.19. Decapeptid gemäß Anspruch l8 der Struktur Val-his-leuser-ala-glu-glu-lys-glu-ala-NHo.209841/1196- 62 -804 fö 22U490-20. Decapeptid gemäß Anspruch 18 der Struktur N-Acetyl~val« his-leu~ser~ala-glu-glu-lys-glu«ala.21. Synthetisches Val-his-leu-ser-ala-glu-glu-lys-glu-ala, das durch Einwirkung einer starken Säure als Spaltmittel auf ein abgeschirmtes Derivat des Decapeptlds Val-hisleu-ser-ala~glu~glu-lys-glu~ala erhalten ist, wobei das abgeschirmte Derivat dadurch gekennzeichnet ist, daß funktioneile Gruppen des Decapeptids durch Substituenten, die durch die energische Einwirkung einer starken Säure als Spaltmittel abtrennbar sind, ohne daß die in dem Molekül anwesenden Peptidverknüpfungen wesentlich angegriffen werden, und weiter dadurch gekennzeichnet, daß s^e die Freigabe von Wachstumshormon durch Zellen des Hypophysenvorderlappens bewirken.22. Synthetisches Val-his-leu~ser-ala-glu«glu-lys-glu-ala gemäß Anspruch 21, dadurch gekennzeich-* net, daß die als Spaltmittel verwendete starke Säure wasserfreier Fluorwasserstoff ist.2J. Amide, Ester und N-Acylanaloge des Hämopeptids P2 (des Decapeptids der Str\Jktur Val-his-leu-ser-ala-glu-glulys-gln-ala) sowie abgeschirmter Derivate des Hämopeptids P2, seine Amide, Ester und N-Aoylanaloge.24, Decapeptid gemäß Anspruch 25 der Struktur Val-his-leuser-ala-glu-glu-lys-gln-ala~NHo.C.25. Decapeptid gemäß Anspruch 25 der Struktur N-Acetyl-valhis-leu-ser-ala-glu-glu-lys-ngln-ala.26. Synthetisches Val-his-leu-ser-ala-glu-glu-lys-gln-ala, das durch die energische Ei'nwirkung einer starken Säure als Spaltmittel auf ein geschütztes Derivat des Deca-209841/1196- 63 -peptids Val-his~leu~ser--ala-glu~glu-*lys-gln-ala erhalten ist, wobei das abgeschirmte Derivat dadurch gekennzeichnet ist, daß funktioneile Gruppen des Decapeptids durch Substituenten, die durch die energische Einwirkung einer starken Säure als Spaltmittel abspaltbar sind, ohne daß in dem Molekül anwesende Peptidverknüpfungen wesentlich angegriffen werden, und weiter dadurch gekennzeichnet ist, daß es die Freigabe von Wachstumshormon durch Zellen des Hypophysenvorderlappens bewirkt.27. Synthetisches Val-his-leu-ser-ala-glu-glu-lys-gln-ala gemäß Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß die als Spaltmittel verwendete starke Säure wasserfreier Fluorwasserstoff ist.28. Hämopeptid H (das Decapeptid der Struktur Val-his-leuthr-pro-glu-.glu-lj'-s-ser-ala), seine Amide, Ester und N-Acylderivate sowie abgeschirmte Derivate davon.29. Hämopeptid H der Struktur Val~his-leu-thr~pro-glu-glulys-ser-ala.30. Decapeptid gemäß Anspruch 28 der Struktur Val-his-leuthr-pro-glu-glu-lys-ser-ala-NHp.21. Decapeptid gemäß Anspruch 28 der Struktur Val-his-leu~thrpro-glu-glu-lys-ser-ala-acetat.22. Synthetisches Val~his-leu-thr~pro~glu-glu~lys-ser-ala, das erhalten ist, indem ein abgeschirmtes Derivat des Decapeptids Val-his-leu-thr-pro-glu-glu-OLys-ser-ala der energischen Einwirkung einer starken Säure als Spaltmittel unterworfen wurde, wobei das abgeschirmte Derivat dadurch gekennzeichnet ist, daß funktioneile Gruppen des Decapeptids durch Substituenten, die durch die energi-209841/1196- 64 -sehe Einwirkung,einer starken Säure als Spaltmittel abspaltbar sind, ohne daß dabei im Molekül anwesende Peptid-Verknüpfungen wesentlich angegriffen werden, abgeschirmt sind, und weiterhin dadurch gekennzeichnet sind, daß sie die Freigabe von Wachstumshormon durch Zellen des Hypophysenvorder lappens bewirken.33. Hämopeptid S (das Nonapeptid der Struktur Met-leu-thrala-glu-glu-lys-ala-ala), seine Amide, Ester und N-Acylderivate sowie abgeschirmte Derivate davon.34. Hämopeptid S der-Struktur Met-leu-thr-ala-glu-glu-lysala-ala.35· Nonapeptid gemäß Anspruch 33 der Struktur Met-leu-thrala-glu-glu-lys-ala~ala-NHp.Z>6. Nonapeptid gemäß Anspruch 33 der Struktur N-Acetyl-metleu-thr-ala~glu-glu-lys-ala-ala.37· Synthetisches Met-leu-thr-ala-glu-glu-lys-ala-ala, das erhalten ist, indem ein abgeschirmtes Derivat des Nonapeptids Met'-leu-thr-ala-glu-glu-lys-ala-ala der Einwirkung eines Spaltmittels unterworfen wurde, wobei das abgeschirmte Derivat dadurch gekennzeichnet ist, daß funktionelle Gruppen des Nonapeptids durch Substituenten, die durch die Wirkung des Spaltmittels abtrennbar sind, ohne daß dabei im Molekül anwesende Peptidverknüpfungen wesentlich angegriffen werden, abgeschirmt sind, und weiterhin dadurch gekennzeichnet ist, daß es die Freigabe von Wachstumshormon durch Zellen des Hypophysenvorderlappens bewirkt.38. Synthetisches Met-leu-thr-ala-glu-glu-lys-ala~ala gemäß Anspruch 37* dadurch gekennzeich-209841/1196- 65 *& 22TAA90net, daß das Spaltmittel wasserfreier Fluorwasserstoff ist.39. Abgeschirmte Derivate des Decapeptids Val-his-leu-ser-alaglu-glu-lys~glu-ala, dadurch gekennzeichnet, daß funkt ioneile Gruppen des Decapeptids durch Substituenten, die durch die energische Einwirkung einer starken Säure als Spaltmittel abspaltbar sind, abgeschirmt sind.40. Abgeschirmte Decapeptidderivate gemäß Anspruch 39 der Struktur tBOC-val-his-leu^ser-ala-glu-glu-E-Cbz-lys-gluala.41. Das Pentapeptid Glu-glu-lys-glu-ala und abgeschirmte Derivate davon, dadurch gekennzeichnet, daß sie die Freigabe von Wachstumshormon durch Zellen des Hypophysenvorderlappens bewirken.42. Das Pentapeptid Val-his-leu-ser-ala und Derivate davon, dadurch gekennzeichnet, daß sie die Freigabe von Wachstumshormon durch Zellen des Hypophysenvorderlappens bewirken.43. Abgeschirmte Derivate des Decapeptids Val~his-leu-serala-glu-glu-lys-gln-ala, dadurch gekennzeichnet, daß funktioneile Gruppen davon durch Substituenten, die davon abspaltbar sind, ohne daß dadurch Peptidverknüpfungen wesentlich angegriffen werden, abgeschirmt sind.1Ih, Abgeschirmtes .Decapeptid gemäß Anspruch 43 der -'truktur tBOC-val-his-leu-ser-ala-glu-glu-E-Cbz-lys-gln- ala.45. Das Pentapeptid Glu-glu-lys-gln-ala und abgeschirmte Deri-209841/1196vate davon, dadurch gekennzeichnet, daß sie die Freigabe von Wachstumshormon durch Zellen des Hypophysenvorderlappens bewirken.46. Decapeptid gemäß Anspruch 23 der Struktur N-Formyl-valhis-leu-ser-ala-glu-glu-lys-gln-ala.47. Abgeschirmtes Derivat des. Decapeptids Val-his-leu-thrpro-glu~glu~lys~ser-ala, dadurch gekennzeichnet, daß funktioneile Gruppen dieses Decapeptids durch Substituenten, die durch die energische Einwirkung einer starken Säure als Spaltmittel davon abspaltbar sind, 'abgeschirmt sind.48. Abgeschirmtes Decapeptid gemäß Anspruch 4-7 der Struktur tBOC-val'-his-.leu-thr-pro-glu-glu-E-Cbz-lys-ser-ala.49. Das Pentapeptid Glu-glu~lys--ser-ala und abgeschirmte Derivate davon, dadurch gekennzeichnet, daß sie die Freigabe von Wachstumshormon durch Zellen des Hyponhysenvorderlappens bewirken.50. Das Pentapeptid Val-his-leu-thr-pro und Derivate davon, dadurch gekennzeichnet, daß sie die Freigabe von Wachstumshormon durch Zellen des Hypo-' phyBenvorderlappens bewirken.51. Abgeschirmte Derivate des Nonapeptids Met-leu-thr-alaglu-glu~lys~ala~ala, dadurch gekennzeichnet , daß funktioneile Gruppen dieses Nonapeptids durch Substituenten, die durch die energische Einwirkung einer starken Säure als Spaltmittel davon abspaltbar sind, abgeschirmt sind.52« Abgeschirmtes Nonapeptid gemäß Anspruch 51 der Struktur209841/1196- 67 -■tBOC-met-leu-thr-ala-glu-glu-E-Cbz-lys-ala-ala.53. Das Pentapeptid Glu-glu~lys-ala~ala und abgeschirmte Derivate davon, dadurch gekennzeichnet, daß sie die Freigabe von Wachstumshormon durch Zellen des Hypophysenvorderlappens bewirken.54. Das Tetrapeptid Met-leu-thr-ala und Derivate davon, dadurch gekennzeichnet, daß sie die Freigabe von Wachstumshormon durch Zellen des Hypophysenvorderlappens bewirken.0 984 1/1196- 68 -
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