DE3623747A1 - Stoffe zur experimentellen untersuchung von membranproteinen und verfahren zu deren herstellung - Google Patents

Stoffe zur experimentellen untersuchung von membranproteinen und verfahren zu deren herstellung

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Description

Die Erfindung betrifft Stoffe und deren Herstellung zur selektiven Anreicherung und experimentellen Untersuchung von Membranproteinen.
Biologische Membrane sind seit langem Gegenstand intensiver Forschung. Die in Membranstrukturen eingelagerten Proteine weisen einen meist hohen Glykosilierungsgrad und eine hohe Lipophilie auf.
Bei der Arbeit mit diesen Proteinen in physiologischen Medien sind daher Detergentien notwendig. Sowohl die z. Z. verwendeten kommerziellen Detergentien, z. B. Polyethylenglykole und deren Derivate, Sulfobetaine, aliphatische Sulfonsäuren und Glykoside als auch die mit Glycin oder Taurin konjugierten Gallensäuren sind für Membranproteine nicht selektiv.
Nur durch eine hohe Selektivität für bestimmte Membranfunktionen ist jedoch z. B. eine Anreicherung, Isolierung und experimentelle Untersuchung bestimmter gewünschter Proteine möglich.
Der vorliegenden Erfindung lag daher die Aufgabe zugrunde, Verbindungen zu synthetisieren, die neben einer guten Detergentienwirkung auch eine hohe Selektivität für bestimmte Membranproteine aufweisen.
Die Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß - bevorzugt in 3- oder 7-Stellung - substituierte, konjugierte Cholsäurederivate verwendet werden. Sie haben neben einer überraschend hohen Selektivität auch andere für die Arbeit mit Membranproteinen sehr günstige Eigenschaften. Bevorzugt mit 4-Amino-7- Benzamido-3α,12α-5β-Taurocholsäure sind selektive Solubilisierungen von Membranproteinen verschiedener Spezies möglich.
Die entstehenden Proteinsolubilisate sind aufgrund der hohen Wasserlöslichkeit der Cholsäurederivate kältestabile klare Lösungen.
Weder Phasentrennungen noch das Ausflocken von Detergens oder Proteinen werden beim Abkühlen oder Einfrieren beobachtet.
Zur Herstellung der 7-Amino-Cholsäure wird Cholsäure nach Fieser und Rajagopolan (IACS 71, 3935) in 7- Stellung oxidiert, nach Redel et al. (Bull. Soc. Chin. Fr. 1949, S. 877) zum Oxim umwandelt und nach Tserng et al. (J. Lipid Res. 18, 404, 1977) mit Taurin konjugiert; sowie anschließend unter Druck am Platinkontakt zum Amin hydriert. Das Amin wird anschließend mit einem Nitroarylalkohol oder einer aromatischen Nitrocarbonsäure, bevorzugt 4-Nitrobenzoesäure unter Zusatz von N-Ethoxycarbonyl-2-ethoxy-1,2-dihydrochinolin (EEDQ) in Dimethylformamid (DMF) gekuppelt und das 4-Nitrobenzamid in essigsaurer methanolischer Lösung mit PtO₂ ×H₂O als Katalysator zur Aminoverbindung, bevorzugt zum 4-Aminobenzoesäurederivat hydriert.
Die Synthese der 3- und/oder 7-Hydroxy-Taurocholsäureester erfolgt analog durch Umsetzen der entsprechenden Hydroxyverbindung mit einem Nitroarylalkohol oder einer aromatischen Nitrocarbonsäure, bevorzugt 4-Nitrobenzoesäure unter Zusatz von EEDQ in DMF. Anschließend wird, wie beschrieben, am PtO₂-Kontakt hydriert.
Anwendungsbeispiele Beispiel 1 Synthese von 4′-NH₂-7-benzamido-3α,12α-5β-taurocholsäure
Handelsübliche Cholsäure (Merck) wird nach Fieser und Rajagopalan (JACS 71, 3935) in 7-Stellung oxidiert und nach Redel et al. (Bull. Soc. Chim. Fr. 1949, S. 877) zum Oxim umgesetzt.
Die Konjugation mit Taurin erfolgt nach Tserng et al. (J. Lipid Res. 18, S. 404, 1977).
Das Natriumsalz der erhaltenen 7-Hydroxyiminotaurocholsäure wird nun unter Druck zum Amin hydriert:
8,54 g 7-Hydroxyiminotaurocholsäure Natriumsalz = 15,5 mM werden in 40 ml MeOH gelöst, mit 50 mg PtO₂×H₂O versetzt und 3 Tage unter 60 bar hydriert. Der Katalysator wird abfiltriert und das Lösungsmittel abgezogen. Der Rückstand wird in Wasser gelöst und lyophilisiert. Die erhaltene 7-NH₂-Taurocholsäure wird mit Hilfe von EEDQ an 4-NO₂-Benzoesäure gekuppelt und entstandene Benzamidoderivate unter Normaldruck zur 4′-NH₂-Benzamidotaurocholsäure hydriert.
Beispiel eines typischen Reaktionsansatzes:
8,12 g 7-NH₂-Taurocholsäure= 15,2 mM 3,60 g 4-NO₂-Benzoesäure= 21,5 mM 5,64 g EEDQ= 22,8 mM
Lösungsmittel: abs. DMF + 3,3 ml Triethylamin p.a.
Man legt die 7-NH₂-Taurocholsäure mit dem EEDQ in DMF vor und gibt die Benzoesäure dazu. Nach der Zugabe von Triethylamin wird unter Rühren auf 90°C erwärmt und drei Stunden gerührt. Nach dem Abkühlen wird mit eiskaltem Ether versetzt und über Nacht stehengelassen. Der Niederschlag wird in 0,2 n methanolischer NaOH gelöst und mit eiskaltem Ether gefällt. Das Produkt wird abgesaugt, in Wasser gelöst und lyophilisiert.
Die Hydrierung des 4′-NO₂-Benzamids wird in essigsaurer methanolischer Lösung mit PtO₂×H₂O bei Normaldruck und Raumtemperatur durchgeführt. Der Katalystor wird abfiltriert und das Produkt lyophilisiert. Die erhaltene Substanz ist bis zu 90% rein (Dünnschichtchromatographie) und sauber genug für den Einsatz als Detergens.
Die Gesamtausbeute bezogen auf Cholsäure beträgt: 18%.
Beispiel 2 Solubilisierung von Proteinen aus der Kernmembran der Rinderleberzelle mit Hilfe von 4′-NH₂-7-Benzamidotaurocholsäure
Die Zellkerne werden nach der modifizierten Methode von Dwyer und Blobel (Dwyer, N. Blobel, G. J. Cell. Biology 70, 581-591) aus Rinderleberzellen isoliert und subfraktioniert. Die erhaltene, bis zu diesem Schritt nicht lösliche Subfraktion enthält die gesuchten Proteine quantitativ.
Diese Fraktion wird mit 2%iger 4′-NH₂-BATC (4′-NH₂-7-Benzamidotaurocholsäure) in 100 mM Tris/HCl-Puffer pH 7,4 45 min bei Raumtemperatur inkubiert.
Es wird abzentrifugiert und die Proteine im Überstand mit Aceton gefällt.
Die Analyse auf dem 10% Polyacrylamidgel zeigt, daß die gesuchten Proteine zu ca. 50-75% im Überstand zu finden sind und selektiv angereichert worden sind.
Beispiel 3 Solubilisierung von Proteinen aus der Plasmamembran der Rattenleberzelle mit Hilfe von 4′-NH₂-BATC
Die Plasmamembranfraktion wird in isoton. Phosphatpuffer pH 7,4 aufgenommen und mit festem 4′-NH₂-BATC versetzt, so daß man eine 2%ige Lösung erhält. Man rührt bei Raumtemperatur 30 min und zentrifugiert dann ab. Im Überstand finden sich bis zu 80% angereichert Transportproteine für verschiedene organische Anionen und Fremdstoffe.
Beispiel 4 Solubilisierung von Proteinen aus der Zellmembran von Bacillus subtilis mit Hilfe von 4′-NH₂-BATC
Die Zellmembrane von Bacillus subtilis wurden nach der Lysozym-Methode in Anlehnung an Dedonder et al. (Marquet, M., Wagner, M.-C., De Donder R. 1971, Biochemie 53, 1131 [1971]) präpariert und in 50 mM Tris/HCl-Puffer, pH 8 aufgenommen.
Zur Solubilisieurng der Membrane wurden verschiedene Konzentrationen von 4′-NH₂-BATC (0,1-4%) eingestellt und bei 4°C 30 min inkubiert. Anschließend wurde 30 min bei 4°C mit 40 000×g zentrifugiert, wobei jeweils klare Überstände erhalten wurden.
Als optimale Detergenskonzentration erwies sich dabei ein Gehalt von 2% 4′-NH₂-BATC, womit ca. 50% der Proteine der Bacillus subtilis-Zellmambran solubilisiert werden konnten.

Claims (6)

1. Cholansäurederivate der allgemeinen Formel wobei
R₁= NH-CH₂-CH₂-SO₃H, NH-CH₂-COOH bzw. deren Alkalisalze R3,4,5= H, CH₃, C₂H₅, i-C₃H₇, n-C₃H₇, t-Butyl, i-Butyl, n-Pentyl, i-Amyl, Cyclohexyl, Acetyl, Br-Acetyl Succinyl, Benzoyl, Benzyl, 2,3,4-R₆- Benzoyl und 2,3,4-Benzyl R₆= NO₂, N₃, NCS, NH₂, N(R3,4,5)₂, Cl, Fbedeuten, dadurch gekennzeichnet, daß sie zur selektiven Isolierung und Charakterisierung von Membranproteinen dienen.
2. Cholansäurederivat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um 4′-Amino-7-Benzamido-3α, 12α-5β-Taurocholsäure handelt.
3. Cholsäurederivate der allgemeinen Formel wobei
R₁ = NH-CH₂-CH₂-SO₃H, NH-CH₂-COOH bzw. deren Alkalisalze
R₂ und/oder R₂′ -O-R₅
R₅ = R3,4,5 nach Anspruch 1
bedeuten.
4. Verfahren zur Herstellung der Verbindungen nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß Cholsäure in 7-Stellung oxidiert, zum Oxim umgewandelt und mit Taurin konjugiert wird; sowie anschließend mit einem aromatischen Nitroarylalkohol oder einer aromatischen Nitrocarbonsäure in Gegenwart von N-Ethoxycarbonyl-2-ethoxy- 1,2-dihydrochinolin (EEDQ) in Dimethylformamid (DMF) gekuppelt und anschließend in essigsaurer Lösung mit PtO₂×H₂O als Katalysator zur Aminoverbindung hydriert wird.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß mit 4-Nitrobenzoesäure gekuppelt wird und die Verbindung 4-Amino-7-Benzamido-3α,12α-5β-Taurocholsäure erhalten wird.
6. Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der allgemeinen Formel wobei
R₂ und/oder R₂′ -O-R₅ und
R₅ = R3,4,5 nach Anspruch 1
bedeuten, dadurch gekennzeichnet, daß die mit Taurin konjugierten Hydroxyverbindung mit einem Nitroarylalkohol oder einer aromatischen Nitrocarbonsäure in Gegenwart von EEDQ in DMF gekuppelt und anschließend in essigsaurer Lösung mit PtO₂×H₂O als Katalystor zur Aminoverbindung hydriert wird.
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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US4892868A (en) * 1984-08-17 1990-01-09 Gipharmex, S.P.A. Derivatives of biliary acids, process for the production thereof and corresponding pharmaceutical compositions
EP0559064A2 (de) * 1992-02-29 1993-09-08 Hoechst Aktiengesellschaft Komplexe enthaltend Glykosyl-Phosphatidylinositol-Proteine und Cholansäurederivate, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung
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