DE1793086C3

DE1793086C3 - L-Aspartyl-L-tyrosyl-L-methionylglycyl-L-tryptophyl-L-methionyl-Laspartyl-L-phenylalanin-amid und seine Verwendung als diagnostisches Hilfsmittel bei Rentgenuntersuchungen der Gallenblase

Info

Publication number: DE1793086C3
Application number: DE1793086A
Authority: DE
Inventors: Miguel A. North Brunswick Ondetti; John T. Middlesex Sheehan
Original assignee: ER Squibb and Sons LLC
Current assignee: ER Squibb and Sons LLC
Priority date: 1967-07-31
Filing date: 1968-07-31
Publication date: 1980-06-19
Also published as: GB1239960A; FR8212M; DE1793086A1; GB1239959A; US3488726A; FR1601314A; DE1793086B2; CA974512A

Description

Die Erfindung betrifft den in den Patentansprüchen gekennzeichneten Gegenstand.

Das Octapeptidamid der Erfindung besitzt Cholezystokinin-Aktivität, d.h. es hat die Fähigkeit, die Gallenblase zur Kontraktion anzuregen. Deshalb kann es als diagnostisches Hilfsmittel bei Röntgenuntersuchungen der Gallenblase in gleicher Weise wie Cholezystokinin verwendet werden. Für diese Zwecke kann es Tieren, z. B. Katzen oder Hunden, in Einzeldosen von ungefähr 0,3 bis 1,0 mg pro kg Körpergewicht intravenös oder subkutan verabreicht werden.

Das Octapeptidamid der Erfindung zeigt eine Cholecystokinin-Wirkung in mindestens der gleichen Größenordnung wie das intakte Hormon, das 33 Aminosäuren enthält; vgl. B. Rubin et al, J. Pharm. Sei, 58 (1969), 955, und The Pharmacologist, Il (1969), 277.

Zur Herstellung des Octapeptidamids der Erfindung wird zuerst ein geschütztes L-Methionylglycin hergestellt. Dies wird durch die Reaktion eines aktivierten, geschützten L-Methionins mit Glycin erreicht. Das geschützte Dipeptid wird dann in ein freies Dipeptid verwandelt und zur Reaktion mit einem aktivierten, geschützten L-Thyrosin gebracht, wodurch ein geschütztes Tripeptid entsteht. Durch die gleiche Reaktionsfolge wird ein Asparaginsäurerest angefügt und das entstandene Tetrapeptid wird dann in eine aktivierte Form, z. B. in seinen p-Nitrophenylestor, übergeführt, und dann mit dem Tetrapeptidamid Trp-Met-Asp-Phe-NH2 zur Bildung des geschützten Octapeptidamids zur Reaktion gebracht. Nach Entfernen der Schutzgruppe wird das Octapeptidamid erhalten.

Beispiel

L-Aspartyl-L-tyrosyl-L-methionyl-glycyl-

L-tryptophyl-L-methionyl-L-aspartyl-

L-phenylanilin-amid

a) tert.-Butyloxycarbonyl-L-methionylglycin

1,87 g Glykokoll werden in einer Mischung aus 45 ml Wasser und 45 ml Pyridin gelöst, und der pH-Wert wird mit 2 η Natronlauge auf 8,5 eingestellt. Tert-

Butyloxycarbonyl-L-Methionin-2,4,5-trichlorphenylester (10,7 g) wird in kleinen Portionen unter Rühren zugegeben, und der pH-Wert wird durch Zugabe von 2 η Natronlauge im Bereich von 8,5 bis 8,7 gehalten. Nach Zugabe der ganzen Estermenge und 30minütiger pH-Konstanz wird die Reaktionsmischung mit Wasser (350 ml) verdünnt, in einem Eisbad gekühlt, mit 6 η Salzsäure auf pH 3 angesäuert und viermal mit Äthylacetat extrahiert. Die Äthylacetatextrakte werden vereinigt, mit Wasser gewaschen und mit Magnesiumsulfat getrocknet. Nach Entfernen des Lösungsmittels im Vakuum kristallisiert man den Rückstand aus Äthylacetat/Hexan. Die Ausbeute: 6,1 g; Schmelzpunkt: (122) 125-126°C.

b) terL-Bütyloxycarbonyl-L-tyrosyl-L-methionyl-glycin

3,06 g tert-Butyloxycarbonyl-L-methionyl-glycin werden in 25 ml eiskalter 1,9 η Salzsäure in Essigsäure gelöst. Nach drei Stunden bei Raumtemperatur werden 75 ml Äther bis zur vollständigen Ausfällung des Hydrochlorids zugefügt Die Kristalle werden abfiltriert, mit Äther gewaschen und getrocknet Ausbeute: 2,4 g; Schmelzpunkt (184) 187-188°C.

ίο 2,4 g L-Methionylglycinhydrochlorid werden in einer eiskalten Mischung von 50 ml N,N'-Dime:hylformamid und 2,8 ml Triethylamin gelöst Zu der entstandenen Lösung von tert-Butyloxycarbonyl-L-tyrosin werden 5,1 g 2,4,5-Trichlorphenylester hinzugefügt Die Reak-

li tionsmischung wird 4>/2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, mit 400 ml Äthylacetat verdünnt und einmal mit 20prozentiger Citronensäure und dreimal mit Wasser gewaschen. Die Äthylacetatlösung wird über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel unter vermindertem Druck abdestilliert Der Rückstand wird in 45 ml Äthylacetat gelöst und mit 2 ml Dicyclohexylamin versetzt Nach dreistündigem Stehen bei Raumtemperatur werden die Kristalle des geschützten Tripeptiddicyclohexylammoniumsalzes abfiltriert, mit

2^r> Äthylacetat gewaschen und getrocknet Ausbeute: 5,13 g; Schmelzpunkt: (132) 139-141"C.

c) N^Ä-tert-Butyloxycarbonyl-/i-tert-butyl-L-aspartyl-L-tyrosyl-L-methionyl-glycin

«ι 3,6 g tert-Butyloxycarbonyl-L-tyitjsyl-L-methionylglycin-dicyclohexylammoniumsalz werden in 2,8 ml eiskalter TrifluoressigsSure gelöst, und die Lösung wird 15 Minuten bei Raumtemperatur gehalten. Das Tripeptidtrifluoracetat wird durch Zugabe von 500 ml

» Äther ausgefällt, abfiltriert, gewaschen und im Vakuum getrocknet.

2,61 g des erhaltenen Materials werden in 28 ml kaltem Dimethylformamid und 1,55 ml Triäthylamin gelöst und mit tert.-Butyloxycarbonyl-«-p-nitrophenyl-/?-tertbutyl-L-aspartat versetzt. Nach 2'/2Stündigem Stehen bei Raumtemperatur wird das Reaktionsgemisch mit Äthylacetat verdünnt, einmal mit 20prozentiger Citronensäure und dreimal mit Wasser gewaschen. Die organische Phase wird mit Magnesiumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird in Äther aufgeschlämmt, abfiltriert und getrocknet.

Ausbeute: 2,3 g. C₂₉H₄₄N₄Oi₀S:

Berechnet: C 54,4, H 6,9, N 8,7;
" gefunden: C 54,8, H 7,3, N 8,3.

d) N*-tert-Butyloxycarbonyl-j9-terl.-butyl-L-aspartyl-L-tyrosyl-L-methionyl-glycin-p-nitrophenylester

ν, 192 mg der geschützten Tetrapeptidsäure aus Stufe c) und 46 mg p-Nitrophenol werden in einer Mischung von 1,5 mg Acetonitril und 0,3 ml Dimethylformamid gelöst. Die Lösung wird in einem Eis-Wasserbad gekühlt und mit 62 mg Dicyclohexylcarbodiimid versetzt.

Wi Nach 30minütigem Rühren in einem Eisbad und dreistündigem Stehen bei Raumtemperatur wird der ausgefallene Dicyclohexylharnstoff abfiltriert, das Filtrat unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft, und der Rückstand mit Äther aufgeschlämmt, abfiltriert,

b^r> gewaschen und getrocknet.

Ausbeute: 186 mg. K: 0,6 (Chloroform, Toluol, Methanol, Wasser = 5:5:8:2). IR-Spektrum (Nujol): 1770cm-¹ (C = O).

e) N^Ä-tert-Butyloxycarbonyl-/?-butyl-L-aspartyI-L-tyrosyl-L-methionyl-glycyl-L-tryptophyl-L-methionyl-L-aspartyl-L-phenylalanin-amid

136 mg des geschützten Tetrapeptidnitrophenylesters aus Stufe d) werden zu einer Lösung von 103 mg L-Tryptophyl-L-methionyl-L-aspartyl-L-phenylalaninamid-trifluoracetat in einem Gemisch aus 0,9 ml Dimethylformamid und 0,04 ml Triethylamin gegeben. Nach zweieinhalb Stunden werden 0,02 ml Essigsäure und 40 ml Äthylacetat zugefügt Der Niederschlag wird abfiltriert, mit Äthylacetat gewaschen und getrocknet Ausbeute: 168 mg. Das Produkt sintert bei 195° C und schmilzt bei 215° C.

170 mg des geschützten Octapeptidamids aus Stufe e) werden in 5 ml kalter Trifluoressigsäure gelöst und die Lösung wird bei Raumtemperatur eine Stunde unter Stickstoffatmosphäre gehalten. Nach Zugabe von Äther fällt das Octapeptid-trifluoracetat aus. Ausbeute: 150 mg.

150 mg des Octapeptid-trifluoracetats werden in Puffer bei pH 8,5 gelöst Die entstehende Lösung wird mit Salzsäure auf pH 4—6 gebracht Der Niederschlag wird abfiltriert mit Wasser gewaschen und getrocknet. Ausbeute 100 mg der Titelverbindung. K. = 3,2 (Butanol, Pyridin, Essigsäure, Wasser = 4:2:1:7).
[ap-24,6 (c=0,6; 1 η NH₃).
Cholecystokinin-Wirkung 200 IDU/mg.

Claims

Patentansprüche:

1. L-Aspartyl-L-tyrosyl-L-methionyl-giycyl-L-tryptophyl-L-methionyl-L-aspartyl-L-phenylalaninamid.

2. Verwendung der Verbindung gemäß Anspruch 1 als diagnostisches Hilfsmittel bei Röntgenuntersuchungen der Gallenblase.