DE3126606A1

DE3126606A1 - Bestatin-verwandte verbindungen als immunverstaerker

Info

Publication number: DE3126606A1
Application number: DE19813126606
Authority: DE
Inventors: Takaaki Fujisawa Kanagawa Aoyagi; Shunzo Tokyo Fukatsu; Kenji Zama Kanagawa Kawamura; Tomio Tokyo Takeuchi; Hamao Toyko Umezawa
Original assignee: Microbial Chemistry Research Foundation
Current assignee: Microbial Chemistry Research Foundation
Priority date: 1980-07-07
Filing date: 1981-07-06
Publication date: 1982-05-19
Also published as: GB2083046A; DE3153030C2; GB2083046B; IT8109465A0; DE3126606C2; IT1167937B; FR2485924B1; FR2485924A1; IT8109465A1; US4370318A; CA1178610A

Description

3125606

PATENTANWÄ üfE* : : :'

DR. A. VAN DER WERTH DR. FRANZ LEDERER R. F. MEYER-ROXLAU

DlPL-ING. (1934-1974) DIPL-CHEM. DIPL-ING.

8000 MÖNCHEN 80 LUCILE-GHAHN-STRASSE

TELEFON: (089) 472947 TELEX: 624624 LEDER D TELEGR.: LEDERERPATENT

ZAIDAN HOJIN BISEIBüTSü KAGAKÜ KENKYU KAI _{g Ju} 14-23, Kami Osaki 3-chome, Shinagawa-ku 79153 Tokyo, Japan

Bestatin-verwandte Verbindungen als Immunverstärker

Die Erfindung bezieht sich auf neue chemische Verbindungen, die mit Bestatin verwandt und als Immunverstärker zur Verstärkung der immunologischen Reaktion in Tier und Mensch brauchbar' sind. Die Erfindung umfaßt auch die Herstellung dieser neuen Verbindungen sowie die Verwendung dieser neuen Verbindungen und ihrer verwandten bekannten Verbindungen als Immunverstärker.

Bestatin hat bekanntlich immunverstärkende Eigenschaften (vgl.die US-PS 4 029 547 und 4 189 604). Bestatin ist (2S, 3R)-3-Amino-2~hydroxy-4-phenylbutanoyl-(S)-leucin und hat folgende Struktur:

OH

(R) I (S)

CHp-CH-CH -CO-NH-CH-COOH (I)

I - ■
NH.

¹ (S)

CH₂
CH(CH3)2

Im eigenen Hause wurden einige.Verbindungen chemisch synthetisiert, die in ihrer chemischen Struktur mit Bestatin verwandt sind und durch folgende allgemeine Formel wiedergegeben werdens

I ZQOUO

j j··

X j

OH

Rl-CH-CH-CO-NH-CH-

COOH

worin R

(CH₂)_n- ist,

worin R Wasserstoff, Chlor, Methyl, Nitro, Hydroxy oder

Amino und η 0 oder 1 und R (nieder)-Alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, Hydroxy-(nieder)-alkyl, Alkylthioalkyl, Carboxamido-(nieder)-alkyl oder Carboxy-(nieder)-alkyl

1 2

ist, vorausgesetzt, daß, wenn R Benzyl und R Isobutyl ist, die Konfiguration der Verbindung. (2S,3R,2'R), (2S,3S,2'S) oder (2S,3S,2'R) ist (vgl. die US-PS 4 189 604) Die Verbindungen der Formel (II) sind die Dipeptide, die physiologisch aktiv sind,und Aminopeptidase B, Leucinaminopeptidase und Bleomycin-hydrolase inhibieren und

die Antitumorwirkung von Bleomycin erhöhen.

Nun wurden Bestatin und seine verwandten (bekannten) Verbindungen weiter erforscht, und es wurden jetzt erfolgreich weitere neue Verbindungen geschaffen, die in ihrer chemischen Struktur mit Bestatin verwandt sind und die Aminopeptidase-inhibierende Aktivität und immunverstärkende Aktivität besitzen.

Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung neuer Verbindungen, die die immunverstärkenden Aktivitäten zeigen, sowie die Schaffung von Verfahren zur Herstellung dieser

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neuen Verbindungen. Ferner soll ein Immunverstärker mit diesen neuen Verbindungen oder ihren verwandten, bekannten Verbindungen geschaffen werden. Weitere Aufgaben und Verwendungsmöglichkeiten der Erfindung werden aus der folgenden Beschreibung klar.

Gemäß einer ersten Ausfuhrungsform der Erfindung wird eine neue Verbindung der Formel

(Ill)

NHR₂

geschaffen, worin R₁ ein Wasserstoffatom oder eine Hydroxylgruppe, R„ ein Wasserstoffatom oder eine Alkanoylgruppe mit 2-7 Kohlenstoffatomen oder eine Alkoxycarbonylgruppe mit 2-7 Kohlenstoffatomen ist, und R₃ unter den Gruppen

-CONH-CH-CH₂OH, I ■

-CONH-CH-CONH-Ch-CH₀OH und

CONH-CH-CONH-CH-/CHVCOOH

ausgewählt ist, worin R^ und R₅ gleich oder verschieden voneinander sein können und jeweils eine Alkylgruppe mit 1-7 Kohlenstoffatomen, eine Hydro xyalkylgruppe mit 1 -

7 Kohlenstoffatomen, eine Mercaptoalkylgruppe mit 1-7 Kohlenstoffatomen, eine Carboxamidoalkylgruppe mit 2-8 Kohlenstoffatomen, eine Aminoalkylgruppe mit 1-7 Kohlenstoffatomen, eine Guanidyl-N-alkyl-Gruppe mit 1-7 Kohlenstoffatomen, eine Alkylmercaptoalkylgruppe mit 2-7 Kohlenstoffatomen, eine Carboxyalkylgruppe mit 2-8 Kohlenstoffatomen, eine Arylgruppe, insbesondere Phenyl, eine Aralkylgruppe mit 2-8 Kohlenstoffatomen oder eine substituierte Aralkylgruppe mit 2-8 Kohlenstoffatomen, η 0 oder 1 ist und das Sternchen die R- oder S-Konfiguration bedeutet.

Die neue Verbindung der Formel (III) kann in Form eines pharmazeutisch annehmbaren Säureadditionssalzes oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes (Carboxylat) vorliegen.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird eine neue Verbindung der Formel

χ J/ \—CH₂-CH CH-R₍

NHR₂ OH

geschaffen, wo^in R₁ ein Wasserstoffatom oder eine Hydroxylgruppe, R„ ein Wasserstoffatom oder eine Alkanoylgruppe mit 2-7 Kohlenstoffatomen oder eine Alkoxycarbonylgruppe mit 2-7 Kohlenstoffatomen und R, die Gruppe

a a t» 6

-CH₂OH,

-CONH-CH-CH₂OH, oder

V
-CONH-CH-CONH-Ch-CH₅OH

! I ²

ist, worin R„ und R₁- wie oben bezüglich Formel (III)
definiert sind und das Sternchen jeweils die R- oder
S-Konfiguration bedeutet.

Spezielle Beispiele für die neue Verbindung (IiIa) gemäß der Erfindung umfassen folgende;

(1) (2S,3R)-3-Amino-2-hydroxy-4-phenyl-1-butanol,

(2) ((2S)-2-N-/~(2'S,3^IR)-3'-Amino-2^I-hydroxy-4^l-phenylbutanoyl_/-amino-4-methyl-pentanol,

(3) (2S)-2-N-/"(2S,3^IR)-3'-N-Acetylamino-2'-hydroxy-4'-. phenylbutanoyl_/-amino-4-methyl-pentanol und

(4) (2S)-2-N-/"(2·S,3'R)-3'-Amino-2'-hydroxy-4'-phenylbutanoyl- (S)-leucyl_y-amino-4-methyl-pentanol.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird eine neue Verbindung der Formel

CH₀-CH-CH-CONH-CH-CONH-CH-ZCHVcOOH (IHb)

NHR₂ OH R

I (I )

7 ^R8^Vo<

ί Δ O Ό U

geschaffen, worin R₁ ein Wasserstoffatom oder eine Hydroxylgruppe, R₂ ein Wasserstoffatom oder eine Alkanoylgruppe mit 2-7 Kohlenstoffatomen oder eine Alkoxycarbonylgruppe mit 2-7 Kohlenstoffatomen ist und R- und Rg gleich oder verschieden voneinander sein können und jeweils eine Alkylgruppe mit 1-7 Kohlenstoffatomen, eine Hydroxyalkylgruppe mit 1-7 Kohlenstoffatomen, eine Mercaptoalky!gruppe mit 1-7 Kohlenstoffatomen, eine Aminoalkylgruppe mit 1-7 Kohlenstoffatomen, eine Guanidyl-N-alkylgruppe mit 1-7 Kohlenstoffatomen, eine AlkyImercaptoalkylgruppe, eine Carboxyalkylgruppe mit 2-8 Kohlenstoffatomen, eine Carboxamidoalkylgruppe mit 2-8 Kohlenstoffatomen, eine Arylgruppe, insbesondere eine Phenylgruppe, eine Aralkylgruppe, insbesondere eine Phenyl-(C₁-C.)-alkylgruppe, insbesondere Benzyl, oder eine substituierte Aralkylgruppe sind und η O oder 1 ist und das Sternchen die R- oder S-Konfiguration bezeichnet.

Spezielle Beispiele für die neue Verbindung der Formel (HIb) gemäß der Erfindung umfassen folgende:

(5) (2S,3R)-3-Amino-2-hydroxy-4-phenylbutanoyl-(S)-leucyl-(S)-leucin,

(6) (2S,3R)-3-Amino-2-hydroxy-4-phenylbutanoyl-(S)-leucyl-(S)-arginin,

(7) (2S, 3R) -S-Amino^-hydroxy-'i-phenylbutanoyl- (S) leucyl-(R)-leucin, '

(8) (2S,3R)-3-Amino-2-hydroxy-4-phenylbutanoyl-(S)-leucyl-(S)-glutaminsäure und

(9) (3R)-N-/"(2'S,3'R)-3'-Amino-2'-hydroxy-4'-phenylbutanoyl-2-leucyl_7-amino-(2S)-2-hydroxy-4-phenylbuttersäure.

^_1- 33^ _

ο» ο· *· *-ft β c e «a a. * * β * * „ * « _{β Λ} .*

CH₀-CH-CH-B

²I I

NHA OH

(IIIc)

geschaffen, worin A ein Wasserstoffatom oder eine Alkanoylgruppe mit 2 bis 5 Kohlenstoffatomen, insbesondere Acetyl, und B folgende Gruppe ist!

-CH₂OH,

-CONH-CH-CH₂OH₂₁

CH

CH.

CH,

-CONH-CH-CONH CH-CH₀OH,

CH,

CH

CH,

CH

CH₃ CH₃ CH₃

CH,

»Β · CI

-CONH-CH CONH-CH—COOH,

CH_n

CH

CH.

CH₃ CH₃

CH,

-CONH—CH-CONH—CH-COOH,

CH₂ CH CH₃ CH₃

NH C=NH

-CONH—CH-CONH—CH-COOH

CH,

CH

CH.

f₂ CH₂

COOH

oder

-CONH— CH-CONH—CH-CH—COOH

CH,

CH

CH₀ OH

CH

■CH.

Unter den neuen Verbindungen der allgemeinen Formel (III) gemäß der Erfindung kann die neue Verbindung der Formel (lila) nach einem Verfahren hergestellt werden, bei dem eine Verbindung der Formel (IV)

-CH-R,

(IV) ,

NHR₂ OH

-Jr-

6 I' \ ι» fr Λ ο

worin R₁ ein Wasserstoffatom oder eine Hydroxylgruppe ist, wie oben definiert, R₂ ein Wasserstoffatom oder eine Alkanoylgruppe oder Alkoxycarbonyigruppe, wie oben definiert, und R_Q die Gruppe

_oder

CONH-CH-CONH-CH-COOr₁ _

Ii ¹⁰

^RH ^R5

ist, worin R₄ und R_ jeweils eine Alkylgruppe mit 1-7 Kohlenstoffatomen, eine Hydroxyalkylgruppe mit 1-7 Kohlenstoffatomenj, eine Mercaptoalkylgruppe mit 1-7 Kohlenstoffatomen, eine Carboxaminoalkylgruppe mit 2 8 Kohlenstoffatomen, eine Aminoalkylgruppe mit 1-7 Kohlenstoffatomen,eine Guanidyl-N-alkylgruppe mit 1-7 Kohlenstoffatomen, eine Alkylmercaptoalkylgruppe mit 2-7 Kohlenstoffatomen, eine Carboxyalkylgruppe mit 2-8 Kohlenstoffatomen, eine Arylgruppe, insbesondere Phenyl, eine Aralkylgruppe mit 7-8 Kohlenstoffatomen, insbesondere Benzyl, oder eine substituierte Aralkylgruppe mit 7-8 Kohlenstoffatomen, und R- eine Alkylgruppe mit 1-7 Kohlenstoffatomen, insbesondere Methyl oder Äthyl, oder eine Aralkylgruppe mit 7-8 Kohlenstoffatomen, insbesondere Benzyl ist, und das Sternchen die R-" oder S-Konfiguration bezeichnet oder ein geschütztes Derivat der Verbindung (IV) mit geschützter funktioneller Gruppe, die an der Reduktion nicht teilnehmen sollte, reduziert wird und, wenn nötig, die verbliebene Schutzgruppe vom anfallenden Reduktionsprodukt in bekannter Weise entfernt bzw. abgespalten wird=

Die im obigen Verfahren eingesetzte Ausgangsverbindung (IV) liegt gewöhnlich in Form eines Alkyl- oder Aralkyl- (z.B. ]

j Benzyl-)-esters (Carboxylat) einer Aminosäure, eines Dipep- jj

tids oder Tripeptids vor, einer solchen Verbindung so ent- j

sprechend, daß die endständige Methylolgruppe (-CH₂OH) in "|

dem herzustellenden Endprodukt durch eine Alkyl- oder · f

Aralkylcarboxylatgruppe (-COOR.. ) ersetzt ist. Wenn die . j

Ausgangsverbindung (IV) in Form eines Alkylesters einer j

Aminosäure vorliegt, kann letztere z·.B. der Methylester |

] der (3R) -N-tert. -Butoxycarbonylamino- (2S) -hydroxy-4- \

pheny!buttersäure sein, der durch Schützen der Aminogruppe \ der (3R) -Amino-(2S)-hydroxy-4-pheny!buttersäure (Journal _; of Antibiotics, Band 29, Nr. 5, 600-601 (1976)) mit der bekannten Aminoschutzgruppe, tert.-Butoxycarbonyl, und dann Verestern des geschützten Produkts mit Diazomethan in Äthyläther, hergestellt werden kann. Wenn die Verbindung (IV) in Form eines Alkylesters eines Dipeptids vorliegt, kann letzterer z.B. der Methylester von (2S,3R)- ■" · 3-N-tert. -Butoxycarbonylamino-4-phenylbutanoyl- (S) leucin sein, der durch Schützen der Aminogruppe von Bestatin (US-PS 4 029 547) mit der tert.-Butoxycarbony1-gruppe und anschließendes Verestern des. N-geschützten Bestatins mit Diazomethan in Äthyläther hergestellt werden kann. Wenn die Ausgangsverbindung (IV) in Form eines Alkylesters eines Tripeptids vorliegt, kann letzterer durch Kondensieren in für die herkömmliche Synthese von Peptiden bekannterweise eines Alkylesters einer geeigneten Aminosäure mit N-Benzyloxycarbonylbestatin hergestellt werden, das wiederum durch Umsetzen von Bestatin mit einem Benzyloxycarbonylierungsmittel, wie Benzyloxycarbonyl-p-nitrophenylester, Benzoyloxycarbonylazid, Benzyloxycarbony.l-N-hy.droxysuccinimidester und Benzyloxycarbonyl-4,6-dimethyl-2-mercaptopyrimidin,· in wässrigem Dioxan, Tetrahydrofuran, Acetonitril oder Dimethylformamid, herstellbar ist.

SO»

Zur Herstellung der neuen Verbindung (lila) aus der Aus- · gangsverbindung (IV) wird letztere in einer für die herkömmliche Umwandlung eines niederen Alkylcarboxylats (Esters) in den entsprechenden Alkohol bekannten Weise reduziert, d.h. mit einem Reduktionsmittel, das gewöhnlich für diese Zwecke verwendet wird, z.B. mit Natriumborhydrid in einem niederen Alkanols entweder wässrig oder nichtwässriig>. bei Raumtemperatur. Nach beendeter Reduktion-wird die verbliebene Aminoschutzgruppe, wenn nötig, nach einer bekannten Abspaltungstechnik abge-■ spalten. Die Benzyloxycarbonyl-Aminoschutzgruppe kann durch katalytische Hydrogenolyse in bekannter Weise in Segenwart eines Palladiumkatalysators abgespalten werden, und die tert.-Butoxycarbonyl-Aminoschutζgruppe kann durch milde Acidolyse mit Bromwasserstoff in Essigsäure, mit Trifluoressigsäure oder mit Chlorwasserstoff in einem organischen Lösungsmittel abgespalten werden.

Die Verbindung der Formel (lila), in der R₀ eine Acrylgruppe bezeichnet, kann auch durch Acylieren einer entsprechenden Verbindung, in der R„ ein Wasserstoffatom bezeichnet, in an sich bekannter Weise mit einem Acylchlorid oder Anhydrid, das die als Gruppe R„ einzuführende Acylgruppe aufweist, hergestellt werden.

Unter den neuen Verbindungen der Formel (III) gemäß.der Erfindung wird die neu.e Verbindung der Formel (HIb) , die in Form eines Tripeptide vorliegt, nach einem Verfahren hergestellt, nach dem natürlich vorkommendes Bestatin (US-PS 4 029 547) ein Stoffwechselprodukt von Bestatin oder ein optisches Isomeres hiervon, der allgemeinen Formel (V)

/~\ a ·'
^Rl \ V-CH₂-CH CH-CONH-CH-COOH (V) ,

NHR₂ OH R„

Zl

worin R₁, R„, R_ und das Sternchen wie zuvor bezüglich der Formel (IHb) definiert, mit einer Aminosäure der Formel (VI)

H₂N-CH-/chX-COOH (VI)

worin R₀, η und das Sternchen jeweils wie zuvor für die Formel (HIb) definiert sind oder mit einem geschützten Derivat der Aminosäure (VI) mit geschützter funktioneller Gruppe (z.B. Aminogruppe, Hydroxylgruppe, Carboxylgruppe, Guanidylgruppe oder Mercaptogruppe, wenn vorhanden), die an der Kondensation nicht teilnehmen sollte, in für die herkömmliche Synthese von Peptiden an sich bekannter Weise kondensiert, und, wenn erforderlich, die restliche(n) Schutzgruppe(η) vom anfallenden Kondensationsprodukt abgespalten wird bzw. werden, um zu dem gewünschten Produkt (HIb) zu führen.

Die Ausgangsverbindung der Formel (V) , wie in dem gerade zuvor erwähnten Verfahren eingesetzt, kann nach einem im "Journal of Medicinal Chemistry", Band 20, 510-515 (1977) beschriebenen Verfahren herstellt werden. Die Kondensation der Ausgangsverbindung (V) mit der Amino säure verbindung (VI) erfolgt bei einer Temperatur von -20 bis 25°C nach einem bekannten Verfahren für die Synthese von Peptiden, z.B. nach der Carbodiimid-Methode, unter Verwendung von Dicyclohexylcarbodiimid als Kondensationsmittel; nach der Methode der aktiven Ester (z.B. unter Verwendung von Hydroxysuccinimidester, nach der Methode der aktiven Imide unter. Verwendung von Imidazol ■und dgl., Nach der Methode der aktiven Azide unter Verwendung von beispielsweise Hydrazin oder nach, der Methode der gemischten Säureanhydride mit Chlorameisensäureäthylester. Das organische Lösungsmittel, in dem die

Kondensation durchgeführt wird, kann ein solches sein, wie es für die herkömmliche Synthese von Peptiden eingesetzt wird, und umfaßt z.B. Äther, wie Tetrahydrofuran und Dioxan, Ester, wie Äthylacetat, Ketone, wie Aceton, halogenierte Kohlenwasserstoffe, wie Methylenchlorid, Amide, wie Dimethylformamid, und Nitrile, wie Acetonitril. Das geschützte Derivat der Aminosäure (VI) liegt vorzugsweise in Form des Säureadditionssalzes vor (z.B. p-Toluolsulfonat oder Hydrochlorid eines Niederalkyl- oder Benzylesters der Aminosäure (VI)). Wenn die Ausgangsverbindung .*=*». ' (V) mit der Aminosäure (VI) kondensiert wird, wobei die funktioneile Gruppe blockiert ist, z.B. nach der Carbodiimid-Methode, erfolgt die Kondensation bevorzugt in Gegenwart eines organischen tert.-Amins, wie N-Methylmorpholin, Triäthylamin und dgl. Die Abspaltung der übrigen Äminoschutzgruppe vom Kondensationsprodukt kann nach einer in der Peptidchemie bekannten Abspaltungstechnik erfolgen. Beispielsweise kann die Aralkyloxycarbonyl-Aminoschutzgruppe,insbesondere die Benzyloxycarbonylgruppe, durch katalytische Hydrogenolyse in Gegenwart eines Palladiumkatalysators und die Älkoxycarbonylgruppe, wie die tert.-Butoxycarbony!gruppe, durch milde Acidolyse mit Bromwasserstoff in Essigsäure, mit Trifluoressigsäure

oder mit Chlorwasserstoff in einem organischen Lösungs-• . mittel, wie Dioxan, Tetrahydrofuran und Äthylacetat, abgespalten werden.

Ferner ist bekannt, daß 3-Amino-2-hydroxy-4-phenyl-buttersäure (nachfolgend als AHPA abgekürzt) durch Hydrolyse von Bestatin mit Salzsäure (US-PS 4 189 604) erhalten wird, und ein Niederalkylester und Benzylester von AHPA sowie Amidderivate von AHPA sind von den Erfindern und anderen hergestellt worden.

(2S,3R)-AHPA und ihre drei Stereoisomeren, nämlich (2R,3S)-

AHPA, (2S,3S)-AHPA und (2R,3R)-AHPA,wurden durch Acidolyse von S-N-Benzyloxycarbonylamino^-hydroxy^-phenylbutyronitril und anschließende Trennung, wie in der US-PS 4 189 604 beschrieben, synthetisiert. Diese US-PS sagt jedoch nichts über die physiologische Wirksamkeit von (2S,3R)-AHPA und deren Stereoisomeren. Nur im "Journal of Medicinal Chemistry", Band 20, Nr. 4, S. 510-515 " (1977) wird beschrieben, daß (2S,3R)-AHPA gegenüber · Aminopeptidase B eine schwach hemmende Aktivität entfaltet. In der Vergangenheit ist nicht darüber berichtet worden, ob (2S,3R)-AHPA und deren Stereoisomere die immunverstärkenden Aktivitäten haben, soweit den Er- ■ finderη bekannt. _:

Es wurde nun gefunden, daß (2S,3R)-AHPA und deren Stereoisomere sowie einige verwandte, bekannte Verbindungen, z.B. (2S, 3R)-AHPA-Amid und (2S,3R)-3-Amino-2-hydroxy-4-phydroxypheny!buttersäure (abgekürzt als (2S,3R)-p-OH-AHPA), die durch die allgemeine Formel (VII)

₁₁ . (VII) NH₀ OH

wiedergegeben werden, worin R₁ ein Wasserstoffatom oder eine Hydroxylgruppe und R₁₁ eine Hydroxylgruppe, eine Alkoxylgruppe mit 1-4 Kohlenstoffatomen, eine Benzyloxygruppe oder eine unsubstituierte oder substituierte Aminogruppe ist, eine immunverstärkende Aktivität besitzt, die höher als die von Bestatin bei geringerer Dosierung ist.

Der Alkylester und Benzylester von AHPA sowie die Amidderivate von AHPA können aus AHPA nach einer chemischen

Methode hergestellt werden, wie z.B. im "Journal of Antibiotics", Band 29, Nr. 5. S. 600-601 (1976) beschrieben. Es wurde nun gefunden, daß, wenn die Verbindung der Formel (VII) nach der Technik der verzögerten Hypersensitivität (D.ToH.) unter Verwendung von roten Schafblutzellen als Antigen, subkutan in die Fußsohle der Maus zu injizieren, getestet wird, sie selbst bei einer geringen Dosierung von 0,01 u;g bis 10 pg/Maus die Einstellung der D.TοH.-Reaktion gegen rote Schafblutzellen verstärkt und daß somit die bekannte Verbindung der Formel (VII) die zeilvermittelte Immunreaktion verstärkend hochaktiv ist.

Folglich wurde also nun gefunden, daß die neue Verbindung der allgemeinen Formel (I) und die bekannte Verbindung der allgemeinen Formel (VII) als Immunverstärker zur Verstärkung der zeilvermittelten Immunreaktion in lebenden Tieren (den Menschen eingeschlossen) brauchbar sind.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird also ein Arzneimittel zur Verfügung gestellt, das als Immunverstärker brauchbar ist und als aktiven Bestandteil die Verbindung der Formel (VIII)

J \—CH₂-CH CH-D (VIII)

NHR₀ OH

aufweist, worin R₁ ein Wasserstoffatom oder eine Hydroxylgruppe, R₂ ein Wasserstoff atom,, eine Alkanoylgruppe mit bis 7 Kohlenstoffatomen oder eine Alkoxycarbonylgruppe mit 2 bis 7 Kohlenstoffatomen oder eine Aralkyloxycarbonylgruppe mit 7 bis 8 Kohlenstoffatomen, insbesondere Benzyloxycarbonyl,ist,und D die Gruppe

v> I <£.

-Ve-

-COOH,

-COOR₁₂ · worin R-j 2 eine Alkylgruppe mit 1-4 C-Atomen ist

-COOCH

2
CONH₂,

CONHR,- worin R..., eine Alkylgruppe mit 1-4 C-Atomen ist,

CH₂OH,
CONH-CH-CH₂OH,

-CONH-CH-CONH-CH-Ch₀OH, or
ι ι ά

R₁₁	^R5	I \ ^R5
-CONH-CH-CONH-CH-, I <
I R₁,	^CH-
^0H.

VCOOH
η

ist, worin R. und Rj- gleich oder verschieden voneinander sein können und jeweils eine Alkylgruppe mit 1 bis 7 Kohlenstoffatomen, eine Hydroxyalkylgruppe mit 1 bis 7 Kohlenstoffatomen, eine Mercaptoalkylgruppe mit 1 bis 7 Kohlenstoffatomen, eine Carboxamidoalkylgruppe mit 2 bis 8 Kohlenstoffatomen, eine Aminoalkylgruppe mit 1 bis 7 Kohlenstoffatomen, eine Guanidyl-N-alkylgruppe mit 2 bis 7 Kohlenstoffatomen, eine Alkylmercaptoalkylgruppe mit 2 bis 7 Kohlenstoffatomen, eine Carboxyalkylgruppe mit 2 bis 8 Kohlenstoffatomen, eine Arylgruppe, insbesondere Phenyl, eine Aralkylgruppe mit 7 bis 8 Kohlenstoffatomen, insbesondere Benzyl, oder eine substituierte Aralkylgruppe mit 2 bis 8 Kohlenstoffatomen, η 0 oder 1 ist und das Sternchen die R- oder S-Konfiguration bezeichnet, in Kombination mit einem pharmazeutisch an-

■ nehmbaren Träger für- den aktiven Bestandteil»

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform dieses Aspektes der Erfindung wird ein Arzneimittel geschaffen, das als Immunverstärker brauchbar ist und als aktiven Bestandteil die neue Verbindung der obigen Formel (III) aufweist.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform dieses Aspektes der Erfindung wird ein Arzneimittel geschaffen, /***■ das als Immunverstärker brauchbar ist und als aktiven Bestandteil eine Verbindung der Formel (Villa)

CH^-CH CH-D' · ' (Villa)

I I NHA OH

aufweist, worin R₁ ein Wasserstoffatom oder eine Hydroxylgruppe , A ein Wasserstoffatom oder eine Alkanoylgruppe mit 2 bis 5 Kohlenstoffatomen, insbesondere Acetyl, und D¹
die Gruppe

-COOH,

-COOR₁₂, worin R.„ eine Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen,
-CONH₂ ,

O IZODUO

-CH₂OH,

-CONH-CH-CH₂	,OH,	/ CH	I CH₀ I d.
CH₂		I CH /V
CH		Xh 3 ^CH3
CH (
-CONH-CH— ι
I CH₂
I CH

	-CONH-CH-CH₀


CH₃ CH

-CONH-CH—C0NH—CH-C00H, CH₀ CH₀

I ² I ²

CH CH .

CH CH- CH CH

-CONH-CH-CONH-CH-COOH, I I

CH₂	(CH₂)₃	f² CH₂
CH	NH I	COOH
CH₃ CH	I C=NH I
	I NH₂
CONH-CH-CONH-CH-COOH I I
CH
CH UH

oder

-CONH-CH-CONH-CH-(Sh-COOH

CH₂ OH

ist, in Kombination mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger für den aktiven Bestandteil.

Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zum Verstärken.der Immunreaktion in einem lebenden Tier (den Menschen eingeschlossen) geschaffen, wobei dem Tier oral, parenteral oder intrarektal eine.immunverstärkend wirksame Menge der Verbindung der Formel (VIII) oder (Villa) verabreicht wird.

Von den neuen Verbindungen der Formel (III), einschließlich den neuen Verbindungen der Formeln (lila), und (HIb) gemäß der Erfindung, sowie den bekannten Verbindungen der Formel (VII), die erfindungsgemäß verwendet werden,sind die vorgenannten Verbindungen 1, 2, 3, 4 und 5 sowie die bekannten Verbindungen (2"S,3R)-AHPA, (2R, 3R)-AHPA, (2S,3R)-AHPA-amid und p-OH-ÄHPA in Wasser löslich und können vorteilhaft leicht zu einer injizierbaren wässrigen Lösung nach herkömmlicher pharmazeutischer Technik zusammengestellt werden, während die bekannte Verbindung, Bestatin, in Wasser kaum löslich ist und nicht, zu einer wässrigen Injektionslösung zusammengestellt werden kann.

Um die akute-Toxizität der Verbindung der Formel (VIII) abzuschätzen, wurde ein wenig Testverbindung Mäusen des ICR-Stammes (jeweils Gruppen mit 6 männlichen Mäusen in einem Alter von 5 Wochen, durchschnittliches Körpergewicht 20 g) intraperitoneal gegeben, wenn alle getesteten

\J I C W U SJ

Mäuse intraperitoneale Verabreichung von (2S ,3R)-AHPA; (2S)-2-N-/"(2'S,3' R) -3'-Amino-2'-hydroxy-4'-phenyl-butanoyl_7-amino-4-methyl-pentanol; (2S)-2-N-/"(2¹S,3¹R)-3'-Amino-2'-hydroxy-4'-phenylbutanoyl-(S)-leucyl_7-amino-4-methyl-pentanol; (2S,3R)-3-Amino-2-hydroxy-4-phenylbutanoyl-(S)-leucyl-(S)-leucin und (2S,3R)-3-Amino-2-hydroxy-4-phenyl-butanoyl-(S)-leucyl-(S)-arginin bei einer Dosierung von 100 mg/kg vertrugen.

Die erfindungsgemäßen Arzneimittel können dank ihrer hohen immunverstärkenden Aktivität weithin in einer immuntherapeutischen Behandlung von Tumoren und auch als Mittel zur Verhinderung bakterieller Infektionen verwendet werden. Das erfindungsgemäße Mittel kann für orale, parenterale oder intrarektale" Verabreichung zusammengestellt werden. Mittel in Form von Injektionslösungen können 0,1 bis 10,0 Gew.-% der Verbindung (VIII) oder (Villa) als aktiven Bestandteil sowie auch einen oder mehrere pH-Einsteller, Puffer, Stabilisatoren, Exzipientien, Lokalanästhetika und einen Zusatz, um die Lösung isotonisch zu machen, enthalten. Die injizierbare Lösung kann für subkutane, intramuskuläre oder intravenöse Injektion geeignet nach jeder herkömmlichen pharmazeutischen Tech-, nik hergestellt werden. Feste Mittel für orale Verabreichung, die in Form von Tabletten, überzogenen Tabletten, Granulaten, Pulver und Kapseln vorliegen können, können Exzipientienfür den aktiven Bestandteil und, wenn gewünscht, weitere Zusätze, einschließlich das Zerfallen fördernde Mittel, Gleitmittel, Farbstoffe, Aroma- oder Geschmacksstoffe und dgl. enthalten. Der Anteil der aktiven Verbindung zum Träger kann in einem Verhältnisbereich von 1:1 bis 1:100 auf .Gewichtsbasis liegen und kann gewöhnlich .in geeigneter Weise in Abhängigkeit von der Form der hergestellten, oral ,zu verabreichenden Rezeptur gewählt werden. Suppositorien können Exzipientien und, wenn nötig, Tenside und Gleitmittel zusätzlich zu

der aktiven Verbindung enthalten.

Die verabreichte optimale Dosierung der Verbindung (VIII) oder (Villa) hängt natürlich von der Art der Verabreichung und der bezweckten Behandlung ab. Für den Menschen enthält die Dosierungseinheit im allgemeinen 0,002 bis 200 mg der Verbindung (VIII) oder (Villa), die oral in unterteilten Dosen ein- oder mehrmals täglich verabreicht werden kann. Die im erfindungsgemäßen Mittel verwendete neue Verbindung der Formel (Ilia) oder (HIb) _*. · kann einer erwachsenen Person oral in einer Dosierung von 50 bis 200 mg einmal täglich verabreicht werden, während die im erfindungsgemäßen Mittel verwendete bekannte Verbindung der Formel (VI) oral einem Erwachsenen in einer Dosierung von 0,002 bis 200 mg einmal täglich verabreicht werden kann, was Richtwerte darstellt.

Die physiologischen Aktivitäten der erfindungsgemäßen oder erfindungsgemäß verwendeten Verbindungen werden wie folgt getestet:

Beispiel 1

Dieses Beispiel beschreibt die Aktivität der gegenüber Aminopeptidase B hemmend wirkenden Verbindung.

Die Aminopeptidase-B-hemmende Aktivität wurde nach einer abgewandelten Methode gemäß V.K. Hopsu et al., beschrieben in "Archives of Biochemistry and Biophysics", Band 114, 557 (1966) bestimmte So wurde ein Gemisch von 0,8 ml 0„1 mmolaren (S)-Ärginin-ß-naphthylamidsund 1,0 ml 0,1-molaren Tris-hydrochloridpuffers (pH 7,0) mit 0,7 ml 0,1m Tris-hydrochlorid-puffer (pH 7,0), die Testverbindung enthaltend, vermischt und dann 3 min auf 37 C erwärmt» Die

ο ι^ιυυ

enzymatische Reaktion wurde durch Zugabe von 0,2 ml einer Aminopeptidase-B-Lösung gestartet/ die nach der chromatographischen Methode von Hopsu et al. mit Sephadex G-100 gereinigt worden war. Nach 30minütiger Reaktion bei 37°C wurde die Reaktionslösung mit 0,6 ml 1,Om-Acetatpuffer (pH 4,2) mit 1,0 mg/ml Diazoniumsalz von o-Aminoazotoluol und 1,O % eines Tensids "Tween" zusammengemischt, um die enzymatische Reaktion zu stoppen und dann bei Raumtemperatur 15 min stehengelassen. Danach wurde die Extinktion (a) der Reaktionslösung bei 525 nm spektrophotometrisch gemessen. Zur Kontolle wurde die obige Arbeitsweise ohne die Testverbindung wiederholt und die Extinktion (b) gemessen. Die Prozentsätze der Hemmung gegenüber Aminopeptidase B wurden nach folgender Gleichung berechnet:

% Hemmung = χ 100

Die Prozentsätze der Hemmung bei verschiedenen Konzentrationen der Testverbindung wurden gemessen, und aus den Messwerten der Hemmung in % wurde die 50%ige Hemmkonzentration (HK₅₀) ermittelt. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle I zusammengestellt.

Tabelle

Test	Test-Verbindungen	HK₅₀ (pg/ml)
1	1	>5O
2	2	0,65
3	3	48,9
4	4	5,4
5	5	.0,11
6	6	0,20
7	7	15
8	8	53
9	Bestatin (Vergleich)	0,03

Anmerkungent

Verbindung ,1 :. (2S,3R)-3-Amino-2-hydroxy-ii-phenyl-l-

butanol-Hydrochlorid ( _s. Beispiel 6 (b)) Verbindung 2r (2S)-2-N-[(2'S,3'R)-3'-Amino-2'-hydroxy- ^'-phenylbutanoyl]amino-^-methyl-pentanol (_s. Beispiel 7 (b))

Verbindung 3: (2S)-2-N-[(2»S,3'R)-3'-N-A_Cetylamino-2·- ' hydroxy-lj' -phenylbutanoyl Jamino-iJ-methyl-pentanol ( s. Beispiel 8)

verbindung 4: ( 2S)-2-N-[(2·S₅3'R)-3'-Ämlno-2'-hydroxy-4 '-phenylbutanoyl-(S)-leucyl]amino-i|~methyl-pentanol ■ (s, Beispiel 10 (b))

Verbindung 5: (2S,3R)-3-Amino-2-hydroxy-iJ-phenyl-butanoyl-(S)-leucyl-(S)-arginin (gelegentlich nachfolgend als BST-L-Arg abgekürzt, s. Beispiel 12 (b)) :

ό i Z b b U b Af : Γ:-. .: : X. ".··: "!

.Verbindung 6: (₂S,3R)-3-Amlno-2-hydroxy-^phenylbutanoyl-(S)-leucyl-(S)-leucln (.gelegentlich nachfolgend als BST-L-Leu abgekürzt, s.- Beispiel 11 (b))

Verbindung 7: (2S,3R)-3^mino-2-h_ydroxy-ü-phenyibutanoyl-(S)-IeUCyI-(R)-IeUCIn-( gelegentlich nachfolgend als BST-D-Leu abgekürzt, s. Beispiel 13 (b))

Verbindung 8, (₃Η)-Μ-[(2·3.3·Η)-3'-Αΐη1ηο-2· phenyll)utanoyl-:(S)-leucyl3amlno-C2S)-2-hydroxy-i»-phenylbuttersäure ( gelegentlich nachfolgend als BST-AHPA , abgekürzt, s. Beispiel 15)

Beispiel 2

Dieses Beispiel beschreibt die Tests zur Auswertung der immunverstärkenden Aktivität der erfindungsgemäßen neuen Verbindung. So wurde der Einfluß der neuen Verbindung auf zellvermittelte Immunität nach einer bekannten Technik der verzögerten Hypersensitivität (D.T.H.) getestet (siehe P.H. Lagrange et al., "J. Exp. Med.", Band 139, 1529 - 1539 (1974), unter Verwendung von mit roten Schafblutzellen als Antigen immunisierten Mäusen, das in die Pfotensohle der Mäuse eingeimpft wurde..

Eine -Suspension von 10 roten Schafblutzellen in 0,05 ml physiologischer Salzlösung wurde im Zeitpunkt der Immunisierung in jede rechte Hinterpfote einer jeden im Test befindlichen CDF₁-MaUs (Weibchen, 8 Wochen alt, 5 Mäuse in jeder Gruppe) subkutan injiziert, um die verzögerte Hyper-

sensitivität herzustellen. Zugleich mit der Immunisierung erhielt jede im Test befindliche Maus oral 0,5 mg/kg der Testverbindung als Lösung, die durch Auflösen der Testverbindung in physiologischer Salzlösung und anschließendes Filtrieren der Lösung durch ein Mikroporenfilter (Porendurchmesser 0,22 um) hergestellt wurde. 5 Tage spä-

ter wurden 10 rote Schafblutzellen subkutan in die linke Hinterpfote einer jeden Testmaus zur Auslösung der verzögerten Hypersensitivitätsreaktion injiziert. 24 h nach der auslösenden Injektion wurde die Dickenzunahme der linken Hinterpfote mit Lehren oder Mikrometerschrauben gemessen, um den Grad der Anschwellung in der Pfote zu ermitteln. Der Schwellungsgrad ist ausgedrückt als durch die folgende Gleichung errechneter Wert:

Dickenzunahme der linken Pfote der mit der Testverbindung be-

Schwellungsgrad (%) = ^_^ _{1 Q}

. ^{y y} ' Dickenzunahme der linken Pfote

der unbehandelten Maus

Der Schwellungsgrad dient zur Auswertung des Ausmaßes der beteiligten zeilvermittelten Immunität. Zum Vergleich wurde eine Suspension von in Wasser dispergiertem Bestatin in gleicher Weise wie oben getestet. Die erzielten Testergebnisse sind in der folgenden Tabelle II zusammengefaßt:

3 1 2 b ö ü

34 ■ :Γ:·: : Γ : :

Tabelle II

Testverbindung Dosierungen (mg/kg) Schwellungsgrad (%)

1 0,5 129

.. 0,05 123

2 0,5 126

0,05 106

3 0,5 131

0,05 124

4 0,5 103

5 0,5 135

6 0,5 120

7 0,5 120 '

9 5 136

0,5 · 109

Bestatin (Vergleich) 0,5 14Ο.-15Ο

0,05 ' 120 -

Anmerkung:

Verbindung 9: (2S,3R)-S-Amino-^-hydroxy-^-phenyl-butanoyl-(S)-leucyl-(S)-glutaminester (s. Beispiel 14)

Beispiel3

Dieses Beispiel beschreibt die immunverstärkende Aktivitätder (2S, 3R)-AHPA, d.h. der (2S,3R) -Amino^-hydroxy-^- pheny!buttersäure unter den erfindungsgemäß verwendeten Verbindungen der Formel (VII).

(Ä) Einfluß von (23,3R)-AHPA auf die zellvermittelte Immunität

Der Einfluß der (28,3R)-AHPA auf die zellvermittelte Immunität wurde in der gleichen Weise xtfie im Beispiel 2 getestet,-nämlich nach der Technik der verzögerten Hypersensitivität unter Verwendung von mit roten Schafblutzellen als Antigen immunisierten Mäusen.

So wurde eine Suspension von 10 roten Schafblutzellen in 0,05 ml physiologischer Salzlösung zum Zeitpunkt der Immunisierung subkutan in die rechte Hinterpfote einer jeden im Test befindlichen CDF„-Maus (Weibchen,, 8 Wochen alt, 5 Mäuse in.jeder Gruppe) zur Herstellung der verzögerten Hypersensitivität injiziert» Zugleich mit dieser Immunisierung erhielt die im Test befindliche Maus oral 10 ng/Maus, 1 pg/Maus oder 0,1 pg/Maus der Testverbindung (2S,3R)-AHPA, als wässrige Lösung, die durch Lösen der Testverbindung in physiologischer Salzlösung und Filtrieren der Lösung durch ein Mikroporenfilter (Porendurchmesser 0,22 um) hergestellt wurde= 4 Tage später wurden 10 rote Schafblutzellen subkutan in die linke Hinterpfote einer jeden Testmaus zur Auslösung der verzögerten Hypersensitivitätsreaktion injiziert. 24 h nach der auslösenden Injektion wurde die Dickenzunahme der linken Hinterpfote mit Lehren oder Mikrometerschrauben zur Ermittlung des Schwellungsgrades in der Pfote gemessen. Der Schwellungsgrad wurde ermittelt. Die erzielten Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle III zusammengestellt. Zum Vergleich wurde Bestatin ebenso wie oben getestet. Es hat sich gezeigt, daß (2S,3R)-AHPA die verzögerte Hypersensitivitätsreaktion viel mehr verstärkt als Bestatin, solange die Dosierungen dieser Verbindungen unter 1 pg/Maus liegen.

J iZbbUb

T a b e 11 e III

Einfluß von (2S,3R)-AHPA und Bestatin, oral verabreicht zur Herstellung der verzögerten Hypersensitivitätsreaktion in mit roten Schafblutzellen als Antigen immunisierten Mäusen

Testverbindungen Dickenzunahme Schwellungsund Dosierungen der Pfote grad

(xO,1 mm)' (I S.A.) (%)

Kontrolle 7,9 ± 1,22 ■ . 100

(2S,3R)-AHPA, 10 pg/Maus 10,9 t 0,57 138 ⁺\

" , 1 pg/Maus 11,9 ± 0,97 ' 151 ⁺⁾

¹¹ ,0,1 pg/Maus 11,6 + 1,85 147 ⁺⁾

" 0,01 pg/Maus 10,6 ± 1,17 134

Bestatin, 10 pg/Maus 12,0 ^ 1,25 . 152 ⁺⁾

1 pg/Maus 10,3 + 0,96 130 ⁺⁾

0,1 pg/Maus 9,3+2,70 118

0,05

(B) Einfluß von (2S,3R)-AHPA bei geringer Dosierung auf zellvermittelte Immunität

Der Einfluß von (2S,3R)-AHPA auf die verzögerte Hypersensitivitätsreaktion wurde in gleicher Weise Wie bei der obigen Arbeitsweise (A) des Beispiels 3 durch orale Verabreichung von 1, 0,1 oder 0,01 pg/Maus (2S,3R)-AHPA einer jeden im Test befindlichen Maus ermittelt. Die erhaltenen Testergebnisse sind in der folgenden Tabelle IV zusammengefaßt, aus

der hervorgeht, daß (2S,3R)-AHPA selbst bei einer niedrigen Dosierung von 0,01 pg/Maus die zeilvermittelte Immunitätverstärkend aktiv ist.

Tabelle IV

Einfluß von (28,,3R)-AHPA und Bestatin, oral in geringen Dosen verabreicht, auf die Herstellung der verzögerten Hypersensitivitätsreaktion in mit roten Schafblutzellen als Antigen immunisierten Mäusen

Testverbindungen Dickenzuhahme Schwellungsund Dosierungen der Pfote grad.

(xO,1 mm)(ί S.A.) (%)

Kontrolle 8,1 t 1,13 100

(2S, 3R)-AHPA, 1 ug/Maus 10,8 ± 1,29 .. 133 ⁺⁾

■ " ,0,1 ug/Maus 11,1 + 0,82 137 ⁺⁾

" , 0,01 ug/Maus 10,1 ± 1,52 · 125 ⁺⁾

Bestatin, 1 pg/Maus 10,8 ■+ 1,08 " 133 ⁺'

ρ < 0,05

(C) Einfluß der Art der Verabreichung der (2S,3R)-AHPA auf die zellvermittelte Immunität

Der Einfluß der Art und Weise der Verabreichung von (2S,,3R) AHPA auf die verzögerte Hypersensitivitätsreaktion wurde in der gleichen Weise wie bei der Arbeitsweise (A) des Beispiels 3 ermittelt, mit der Ausnahme, daß die Testver-

■ tf U> V W .

bindung (als wässrige Lösung) statt oral verabreicht zu werden, intraperitoneal injiziert wurde. Die erhaltenen Testergebnisse sind in der folgenden Tabelle V zusammengefaßt : ·

Tabelle

Einfluß von (2S,3R)-AHPA, oral oder intraperitoneal verabreicht,auf die Herstellung der verzögerten Hypersensitivitätsreaktion in mit roten Schafblutzellen als Antigen immunisierten Mäusen

Testverbindung

Schwellungsgrad (%)

intraperitoneale orale Injektion Verabreichung

(2S,3R)-AHPA,·10 pg/Maus 1 pg/Maus

126 135

Bestatin
(als wässrige
Suspension) 1 pg/Maus

133

^; p < 0,05

Wie in Tabelle V gezeigt, wird klar, daß (2S,3R)-AHPA, entweder nach intraperitonealer Injektion oder nach oraler Verabreichung, die zeilvermittelte Immunität ebenso-stark oder noch stärker als Bestatin erhöht.

Wie aus den Ergebnissen der obigen Tabellen III, IV und V. klar wird, ergibt nach oraler Verabreichung eine Dosis an (2S,3R)-AHPA im Bereich von 0,01 bis 1 ug/Maus ein optimales

Ergebnis bei der Verstärkung der verzögerten Hypersensitivitätsreaktion in mit roten Schafblutzellen als Antigen immunisierten Mäusen, während die optimale Dosierung des Bestatins im Bereich von O₇1 bis 100 pg/Maus nach oraler Verabreichung liegt,, wie in der Japanischen Offenlegungs-. schrift "Kokai" Nr. 117435/77 beschrieben.

Beispiel 4

Wach der Arbeitsweise (A) des obigen Beispiels 3 wurde der immunverstärkende Einfluß von (2R,3S)-ÄHPA, (2S,3R)-AHPA und (2R,3R)-AHPA, die die Stereoisomeren der (2S,3R)-AHPA sindi nach der Technik der verzögerten Hypersensitivität ermittelt.- Die erhaltenen Testergebnisse sind in der folgenden Tabelle VI wiedergegeben.

Tabelle VI

Einfluß von (23,3S)-AHPA, (2R,3S)-AHPA und (2R,3R)-AHPA, oral verabreicht, auf die Herstellung der verzögerten Hypersensitivitätsreaktion in mit roten Schafblutzellen als Antigen immunisierten Mäusen

Testverbindungen Dickenzunahme Schwellungsund Dosierungen " der Pfote grad

(xO,1 mm)(+S.A.) (%)

(23,3S)-AHPA, 10 pg/Maus 11,9+1,36 135 ⁺⁾

" 1 ug/Maus 0,8 + 1,56 11.1

(2R,3S)-AHPA, 10 pg/Maus 10,6 + 0,97 120 ⁺*

1 pg/Maus 11,7 ± 1,15 133 ⁺⁾

J iZöbUb

Tabelle VI (Fortsetzung)

(2R,3R)-AHPA, 10 pg/Maus 9,6+0,65 109

" . 1 ug/Maus 11,9 ± 0,74 135

⁺⁾ ρ < 0,05

Beispiel5

Dieses Beispiel beschreibt den Einfluß eines Esters und eines Amids der (2S,3R)-AHPA auf die zellvermittelte Immunität.

Der-Einfluß der verschiedenen Ester der (2S,3R)-AHPA auf die verzögerte Hypersensitivitätsreaktion wurde in der gleichen Weise, wie bei der Arbeitsweise (A) des Beispiels 3 durch; orale Verabreichung von 10 pg/Maus oder 1 pg/Maus an (2S,3R)-AHPA-methylester-Hydrochlorid oder (2S,3R)-AHPA-amid an jede im Test befindliche Maus ermittelt. Die erhaltenen Testergebnisse sind in der folgenden Tabelle VII zusammengestellt, aus der hervorgeht, daß der Ester der (2S,3R)-AHPA. praktisch ebenso aktiv ist wie die freie .Säureform der (2S,3R)-AHPA bei der Verstärkung der zögerten Hypersensitivitätsreaktion und folglich der zellvermittelten Immunität.

Tabelle VII

Einfluß des Methylesters oder Amids der (2S,3R)-AHPA, oral verabreicht, auf die Herstellung der verzögerten Hypersensitivitatsreaktxon in mit roten Schafblutzellen 'als Antigen immunisierten Mäusen

Te stverbindungen und Dosierungen	10	pg/M'aus	Dickenzunahme der Pfote ■ (xO,1 mm) (±S.Ä.)	8,7 +	0,65.	Schwellungs grad
Kontrolle	1	pg/Maus		1,5 +	1,12	100
(2S, 3R)-AHPA- methylester-	10	ug/Maus	1	1,7 +	1 ,29	132 ⁺⁾
Hydrochlorid	1	pg/Maus	1	1,5 +	1,20	134 ⁺⁾
(2S,3R)-AHPA-	10	pg/Maus	1	9,8 ±	0,82	.131 ⁺⁾
amid	1	pg/Maus		1,0 t	1,05	111
(25,3R)-AHPA	1	ug/Maus	1	1,7 +	1,29	126 ⁺⁾
		1	1,6 +	0,91	135 ⁺⁾
Bestatin		1	133 ⁺⁾

' P < 0,05

Anmerkungen: Das (2S,3R)-AHPA-amid ist die Verbindung der Formel:

Q(R) (S) CH₀-CH-CH-CONH₀ ■2 ι , 2

OH

J I Zböüö

Ilia*' -

Beispiel 6

Dieses Beispiel beschreibt den Einfluß eines substituierten Derivats der (2S,3R)-AHPA auf die zellvermittelte Immunität.

Der Einfluß von (2S,3R) -S-Amino-^-hydroxy-^-p-hydroxyphenylbuttersäure-((2S,.3R)-p-OH-AHPA) auf die verzögerte Hypersensitivxtatsreaktion wurde in der gleichen Weise wie bei der Arbeitsweise (A) des Beispiels 3 durch orale Verabreichtung von 10 oder 1 ug/Maus der (2S,3R)-p-OH-AHPA an jede im Test befindliche Maus ermittelt. Die erhaltenen Testergebnlsse sind in der folgenden Tabelle VIII zusammengefaßt. Aus den Ergebnissen der Tabelle VIII wird klar, daß das getestete Derivat der (2S,3R)-AHPA bei den Testdosierungen ebenso die zellvermittelte Immunität erhöht.

Tabelle VIII

Einfluß des hydroxylierten Derivats der (2S,3R)-AHPA auf die Herstellung der verzögerten Hypersensitivität in mit roten Schafblutzellen als Antigen immunisierten Mäusen " · .

Testverbindungen. und Dosierungen	Dickenzunahme der Pfote (xO,1 mm)(+S.A.)	Schwellungs grad
(2S,3R)-p- 10 pg/Maus	11,0 ί 1,75	129 ⁺⁾
1 pg/Maus	9,7 ί 0,54	114 ⁺⁾
Bestatin 1 pg/Maus (Vergleich)	10,3 ί 1,36	121 ⁺⁾
Kontrolle	8,5 ± 0,44	100

ρ < 0,05

Aus den Ergebnissen der Beispiele 3, 4, 5 und 6 ergibt sich, daß (2S,3R)-AHPA und einige ihrer Derivate, wie angegeben, bei niedriger Dosierung die zellvermittelte Immunität maßgeblich verstärkend aktiv sind, und auch, daß (2S,-3R)-AHPA, oral in einer Dosis von 0,01 bis 10 pg/Maus verabreicht, eine ebenso höhe iinmunverstärkende Aktivität zeigt wie oral in einer Dosierung von 1 bis 10 ug/Maus verabreichtes Bestatin, gemessen nach der verzögerten Hypersensitivitätsreaktion in mit roten Schafblutzellen als Antigen immunisierten Mäusen.

Die folgenden Beispiele 7 bis 16 veranschaulichen die Synthese-Arbeitsweise für die Herstellung der neuen erfindungsgemäßen Verbindungen gemäß der Formel (lila).

Be. ispiel 7

(a) Synthese von (2S,3R)-3-N-t-Butoxycarbonylamino-2-hydroxy-4 -phenyl-1 -butanol

⁽
CH₂-CH CH-CH₂OH

NH OH
0COC(CH₀).

N-t-Butoxycarbonyl- (2S, 3R)-S-amino-^-hydroxyM-phenyl-buttersäure-methylester (92,8 mg) wurde in 0,44 ml Äthanol gelöst, und zu der erhaltenen Lösung wurden bei Raumtemperatur 2,3 ml Äthylalkohol, die 46,6 mg Natriumborhydrid enthielten, getropft. Danach wurde das Gemisch 2 h bei Raumtemperatur gerührt, um die Reduktion der Carboxylatgruppe zu bewirken. Nach beendeter Reaktion wurde das

Reaktionsgemisch unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt und der feste Rückstand in 3 ml Äthylacetat aufgenommen. Die erhaltene Lösung wurde mit 2 ml einer wässrigen , 1%igen Zitronensäurelösung und dann mit drei 2 ml-Portionen gesättigter wässriger Natriumchloridlösung gewaschen. Die organische Lösungsmittelphase im Äthylacetat wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Gemisch filtriert, um das Magnesiumsulfat-Hydrat zu entfernen. Das Filtrat wurde zu 81 mg eines festen Rohstoffs, der Titelverbindung, bis zur Trockne eingeengt. Wurde dies aus einem Gemisch von 0,5 ml Äthyläther und 0,5 ml n-Hexan umkristallisiert, wurden 68 mg farblose Nadeln, Schmp. 113-115°C, erhalten. .Dieses Produkt lieferte einen m/e-Wert von 282 (M + 1) bei der massenspektrometrischen Analyse.

Elementaranalyse für ^c-i5^H23^NO4 (^MG 281,39): ber.: C 64,00, H 8,26, N 4,98 % gef.: C 63,69, H 8,31, N 4,70 %

(b) Synthese von (2S,3R)-3-Amino-2-hydroxy-4-phenyl-1-butanol-Mydrochlorid

Die in der obigen Stufe (a) erhaltene Verbindung (68 mg) wurde in 0,4 ml trockenem Methanol gelöst, das 20 % Chlorwasserstoff enthielt, und zwar unter Eiskühlung, und konnte dann 30 min stehen, um die t-Butoxycarbonylgruppe abzuspalten. Das Reaktionsgemisch wurde dann zur Trockne eingeengt und der Rückstand aus Äthanol/Äthyläther umkristallisiert, um 36 mg der Titelverbindung als farblose, plättchenartige Kristalle zu liefern. Schmp. 123-125°C, /α£7β⁵⁺ 28,4° (c = 1,0, 1n HCl.). Dieses Produkt ergab einen m/e-Wert von 182 bei der massenspektrometrischen Analyse.

3 Ί 26606

Q β. * Λ

ft. α β

Elementaranalyse für C₁₀H₁₆NO₂Cl (MG 217,72) ber. : C 55,30, H 7,42, N 6,44, Cl 16,3 % gef„: C 54,93, H 7,46, N 6,40, Cl 16,0 %

Beispi.e-18

<a) Synthese von (2S)-2-N-/~ (2'S,3¹R)-3'-N-t-Butoxycarbo nylamino-2 ' -hydroxy-4 ' -phenylbutanoyl_/-amino-4-methylpentanol

tf\ ■ (R) (S) (S)

ff VcHo-CH CH-CONH-CH-CH OH

V / ²Ii I ■

^N=^ NH OH CH_?

I I

OC-OC-(CH- )o ^CH I

(2.S, 3R) -S-N-t-Butoxycarbonylamino^-hydroxy^-phenylbutanoyl-(S)-leucin-methylester (440 mg) wurde in einem Gemisch aus 8 ml Äthanol und 8 ml destilliertem Wasser gelöst und die erhaltene Lösung mit Nätriumborhydrid ebenso wie in der Stufe (a) des Beispiels 7 zwecks Reduktion behandelt. Das so erhaltene Rohprodukt (347 ^m<3) wurde aus Äthylacetat/Äthyläther zu 230 mg der Titelverbindung, farblose Nadeln, umkristallisiert. Sqhm. 159,5-16O°C Massenspektroxnetrie: m/e 394 (M + 1)

Elementaranalyse für ^C21^H34^N2°5 ber.s C 63,92, H 8,70, N 7„10 % gef.ι C 63>92, H 8,76, N 7,14 %

OO * 9

(b) Synthese von (2S)-2-N-/ (2¹S,3¹R)-3'-Amino-2·-· hydroxy-4'-phenylbutanoyl_7-amino-4-methyl-pentanol

Die in der obigen Stufe (a) erhaltene Verbindung (300 mg) wurde in 3 ml trockenem Methanol mit 20 % Chlorwasserstoff und 1/0 % Anisol unter Eiskühlung gelöst und konnte dann 30 min stehen, um die t-Butoxycarbonylgruppe abzuspalten. Das Reaktionsgemisch wurde zur Trockne eingeengt und lieferte 210 mg des Hydrochlorids der Titelverbindung / das hygroskopisch war und einen m/e-Wert von 295 bei der massenspektrometrischen Analyse lieferte. Dieses Hydrochlorid wurde in einem Volumen Wasser aufgenommen und mit wässriger Natriumhydrogencarbonatlösung neutralisiert und die erhaltene wässrige Lösung mit n-Butanol extrahiert. Der Extrakt in n-Butanol wurde mit Wasser gewaschen und zur Trockne eingeengt, um die freie Base der Titelverbindung als Öl zu ergeben. Dieses ölige Produkt hatte einen m/e-Wert von 295 (M +1) bei der Massenspektrometrie,und die chemische Struktur wurde durch IR-und NMR-Daten bestätigt. f°iJ^ - 2,5° (c = 1,0, 1n HCl)

Beisp.iel 9

Synthese von (2S)-2-N-/~(2'S,3¹R)-3'-N-Acetylamino-2'- ' hydroxy-4'-phenylbutanoyl_/-amino-4-methyl-pentanol

Die Verbindung (42 mg) in Form der freien Base, in Stufe (b) des Beispiels 8 wie oben erhalten, wurde in 0,4 ml Methanol gelöst und die erhaltene Lösung mit 0,16 ml Essigsäureanhydrid vermischt, worauf bei Raumtemperatur über Nacht stehengelassen wurde, um die Aminogruppe der Verbindung zu acetylieren. Die Reaktionslösung wurde zur Trockne eingeengt und der Rückstand in 2 ml n-Butanol

3126608

aufgenommen. Die Lösung im n-Butanol wurde mit 2 ml Wasser, dann mit 2 ml gesättigter wässriger Natriumhydrogencarbonatlösung und schließlich mit Wasser gewaschen und anschließend zur Trockne eingeengt, um 32 mg eines rohen Feststoffs der Titelverbindung zu ergeben. Umkristallisieren aus Äthanol-Äthyläther lieferte 20 mg farblose Nadeln. Schmp. 188-189°C, Massenspektrometrie: m/e 336 (M )

Elementaranalyse für ^C-|3^H28^N2°4 *^{MG 336}'⁴⁸>^: ber.; C 64,25, H 8,40, N 8,33 % gef.ϊ C 64,14, H 8,35, N 8,30 %

Beispiel 10

Synthese von (2S)-2-N-/~ (2¹S,3¹R) -3'-N-Acetylamino-2'-hydroxy-4'-phenylbutanoyl_7-amino-4-methyl-pentanol

(2S,3R)-3-N-Acetylamino-2-hydroxy-4-phenylbütanoyl-(S)-leucin-methylester' (36,4. mg) wurde mit 16 mg Natriumborhydrid reduziert und dann in der Weise der Stufe (a) des Beispiels 8 isoliert, um 20,1 mg der Titelverbindung zu ergeben. Schmp. 187,5-189°C.

Beispiel 11

(a) Synthese von (2S)-2-N-/~ (2'S,3'R)-3'-N-Benzyloxycarbonylamino-2'-hydroxy-4'-phenylbutanoyl-(S)-leucyl_7-amino-4-methy1-pentano1

3126ÜÜ8 50 \ ΙΓ:Ί j :*'>':'<

ΛΥ

(R)(S) (S) (S)

-CH₀-CH-CH-CONH-CH-CONH-Ch-CH₀OH

X==/ ²II I- I ²

NH OH CH₀ CH₀

I I²I²

CO CH CH

I -■ I Ιο (CH₃)₂- (CH₃)₂

(2^lS_/3¹R)-3^l-N-Benzyloxycarbonylamino-2^I-hydroxy-4^lphenylbutanoyl-(S)-leucyl-(S)-leücin-benzylester (120 mg) wurde mit 38 mg Natriumborhydrid reduziert und dann in der gleichen Weise wie in Stufe (a) des Beispiels 7 isoliert/ um 100 mg der Titelverbindung als farbloses Pulver zu ergeben. Massenspektrometrie: m/e 528 (M+ 1).

Elementaranalyse für ^C _3O ^H43^N2°6 ^{(MG 527}'-⁷⁵)^: .ber. : C 68,27, H 8,23, N 5,31 % gef.: C 67,98, H 8,03, N 5,09 %

(b) Synthese von (2S)-2-N-/ (2'S,3'R)-3'-Amino-2'-hydroxy-4'-phenylbutanoyl-(S)-leucyl_/-amino-4-methyl-pentanol

Die in der Stufe (a) dieses Beispiels erhaltene Verbindung (100 mg) wurde in einem Gemisch aus 1 ml Methanol und 0,3 ml destilliertem Wasser gelöst und die Lösung mit 20 mg Palladiummohr als Katalysator zusammengemischt und dann- der Hydrogenolyse bei Raumtemperatür mit Wasserstoffgas von etwa 3 bar (3 at) über Nacht unterworfen- Das Reaktipnsgemisch wurde filtriert, um den Katalysator zu entfernen, und das Filtrat zu einem Sirup eingeengt. Dieser Sirup wurde mit 2 ml Äthylacetat und 3 ml 1n Salzsäure zusammengemischt und das erhaltene Gemisch mit Wasser

5 ϊ '«ίί*"!⁰*

extrahiert, um das gewünschte, von der Schutzgruppe befreite Produkt in Wasser zu überführen. Der wässrige Extrakt wurde zur Trockne eingeengt und lieferte 26 mg der Titelverbindung als farbloses Pulver. Schmp. 78-8O°C. Massenspektrometrie: m/E 408.

Die folgenden Beispiele 12 - 16 veranschaulichen die Herstellung der neuen erfindungsgemäßen Verbindungen gemäß der Formel (IIIb)o

Beispiel 12

(a) Synthese von (2S,3R)-S-N-Benzyloxycarbonylamino-^- hydroxy-4-phenylbutanoyl-(S)-leucyl-(S)-leucinbenzylester

q VCH₂-CH-CH-CONH-CH-CONh-CH-COOCH₂-/ J

NH OH - CH₀ CH₀

,2. ,2

CH CH

(2S, 3R) -3-N-BenzyloxycarbonylaInino-2-hydroxy-4-phenylbutanoyl-(S)-leucin (442 mg) und (S)-Leucin-benzylesterp-toluolsulfonat (393,3 mg) wurden mit 1 ml Tetrahydrofuran zusammengemischt, dann folgte Zugabe von 0,11 ml N-Methylmorpholin und 115 mg N-Hydroxysuccinimid. Die

»f> ti«

SX

anfallende Lösung wurde eisgekühlt und dann mit 227 mg Dicyclohexylcarbodiimid zusammengemischt, worauf 4 h unter.Eiskühlung gerührt wurde. Das Reaktionsgemisch wurde filtriert, um das gebildete Harnstoffderivat zu entfernen,und das Filtrat wurde unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt. ,Der feste Rückstand wurde in 5 ml Äthylacetat gelöst und die erhaltene Lösung mit 3 ml In Salzsäure, 3 ml 1n wässriger Natronlauge und schließlich mit 3 ml destilliertem Wasser gewaschen. Die organische Lösungsmxttelphase wurde mit wasserfreiem Magnesiumsulfat zum Trocknen gemischt und dann das Gemisch zum Entfernen des Magnesimmsulfat-hydrats filtriert. Die Lösung (das Filtrat) wurde unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt, um 573 mg eines rohen Feststoffs der Titelverbindung zu ergeben. Kristallisieren dieses Produkts aus Aceton/Äthyläther lieferte 444 mg farblose Nadeln. Die Massenspektrometrie dieses Reinprodukts ergab einen m/e-Wert von 646 (M + 1). Die chemische Struktur des Produkts wurde durch IR- und NMR-Daten bestätigt.

Elementaranalyse für C₃₇H₄₇N₃O₇ (MG 645,87) ber.: C 68,80, H 6,89, N 6,51% gef.: C 68,64, H 6,97, N 6,30%

(b) Synthese von (2S,3R)-3-Amino-2-hydroxy-4-phenylbutanoyl-(S)-leucyl-(S)-leucin

Die in der obigen Stufe (a) erhaltene Verbindung (200 mg) wurde in einem Gemisch aus 10 ml Dioxan und 0,2 ml destilliertem Wasser aufgenommen und die erhaltene Lösung mit 60 mg Palladiummo.hr als Hydrogenolyse-Katalysator versetzt. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur der Hydrogenolyse mit Wasserstoffgas bei 3 bar (3 at) 48 h unterzogen, um sowohl die die Aminogruppe schützende Benzyl-

ί* η * «

oxycarbonylgruppe als auch die die Carboxylgruppe schützende Gruppe abzuspalten= Das Reaktionsgemisch wurde filtriert, um den Katalysator zu entfernen, und das Filtrat wurde unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt.Umkristallisieren des festen Sückstands aus Methanol/Äthylacetat ergab 96,8 mg der Titelverbindung als farblose Nadeln. Schmp. 216-219°C (unter Schäumen). ft^J^ "37,0° (c = 1,0, 1n HCl). Massenspektrometries m/e 422 (M + 1).

Elementaranalyse für C_2?H_,-N₃O₅ (MG 421,60);

ber. : C 62,91., H 8,39, N 9,97 % ■ gef.s C 62,89, H 8,19, N 9,68 %.

Beispiel 13

(a) Synthese von (2S,3R)-3-N-Benzyloxycarbonylamino-2 hydroxy-4-phenylbut
arginin-benzy!ester

hydroxy-4-phenylbutanoyl-(S)-leucyl-(S)-N -nitro-

/} \ (R) (S) (S) (S) fl \- U VcH_n-CH- CH-CO-NH-CH-CO-NH-Ch-COOCH₂-^ J ^=^ NH OH CH₀ (CH, ^

CO CH NH

(CH₃)₂ C=NH NH

J I ZDDUD

(2S,3R)-3-N-Benzyloxycarbonylamino-2-hydroxy-4-phenylbutanoyl-(S)-leucin (88,4 mg) und N -Nitroarginin-benzylester-di-p-toluolsulfonat (130,8 mg) wurden in 1 ml Tetrahydrofuran gelöst, dann folgte Zugabe von 0,022 ml N-Methylmorpholin und 34 mg N-Hydroxysuccinimid. Die erhaltene Lösung wurde eisgekühlt und mit 84 mg Dicyclohexylcarbodiimid versetzt, dann wurde 24 h unter Eiskühlung gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde filtriert, um das gebildete Harnstoffderivat zu entfernen. Das Filtrat wurde zur Trockne eingeengt und der feste Rückstand in 5 ml Äthylacetat gelöst. Die Lösung wurde mit 5 ml In Salzsäure, 5 ml In wässriger Natronlauge und dann mit 5 ml destilliertem Wasser gewaschen und anschließend mit wasserfreiem Magnesiumsulfat zum Trocknen gemischt. Das Magnesiumsulfat-Hydrat wurde abfiltriert und das Filtrat zur Trockne eingeengt, um 142 mg der Titelverbindung als Pulver zu ergeben. Die Massenspektrometrie dieses Produkts ergab einen m/e-Wert von 734 (M + 1), und die chemische Struktur wurde durch IR- und NMR-Daten bestätigt.

(b) Synthese von (2S, 3R) -S

butanoyl-(S>-leucyl-(S)-arginin

Die in derobigen Stufe (a) erhaltene Verbindung (117 mg) wurde mit einem Gemisch aus 2,5 ml Dioxan, 0,25 ml destilliertem Wasser und 0,25 ml Eisessig zusammengemischt, gefolgt von der Zugabe von 25 mg Palladiummobdr ·. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur der Hydrogenolyse mit Wasserstoffgas von 3 bar (3 at) 72 h unterworfen und das Reaktionsgemisch zum Entfernen des Katalysators filtriert. Das Filtrat wurde eingeengt, und die eingeengte Lösung mit einem kleinem Volumen destillierten Wassers vermischt und durch Zugabe von 6n Salzsäure auf pH 2,0 eingestellt. Die angesäuerte Lösung' wurde durch eine

O η ο *

Säule mit 100 mg Aktivkohle für die Chromatographie geführt, um das gewünschte Produkt zu adsorbieren= Zur Reinigung wurde die Aktivkohlesäule mit destilliertem Wasser entwickelt und das Eluat zur Trockne eingeengt, um 156 mg des gereinigten Produkts als Pulver zu ergeben . Schmp. 147-152°C. /^L7q⁵ -23,5° (c = 1, 1n HCl). Massenspektro-

metriei m/e 465. Dieses Produkt zeigte eine positive Reaktion gegenüber Sakaguchi-Reagens.

Beisp. i e 1 1 4

Synthese von (2S,3R)-S-Amino^-hydroxy^-phenylbutanoyl-(S)-leucyl-(R) -leucin

(2S,3R)-3-N-Benzyioxycarbonylamino-2-hydroxy~4-phenylbutanoyl-(S)-leucin. (1,11 g) wurde mit 983,3 mg (R)-Leucinbenzylester-p-toluolsulfonat umgesetzt und das erhaltene Kondensationsprodukt in der gleichen Weise wie in Stufe (a) des Beispiels 12 isoliert, um 1,39 g des 3-N-Benzyloxycarbony!-geschützten Derivats des (2S,3R)-3-Ämino-2-hydroxy-4-phenylbutanoyl-(S)-leucyl-(R)-leucins als Pulver zu ergeben. Dieses geschützte Produkt zeigte einen m/e-Wert von 646 bei der massenspektrometrischen Analyse.

Dieses geschützte Produkt wurde der Hydrogenolyse mit Wasserstoff über Palladiummohr in der gleichen Weise wie in Stufe (b) des Beispiels 12 zwecks Schutzgruppenabspaltung unterworfen, um ein Rohpulver der Titelverbindung zu ergeben. Umkristallisieren dieses Pulvers aus Methanol lieferte 510 mg farblose, plättchenartige Kristalle= Schmp.240-243 C. Massenspektrometrie: m/e 422. Wenn dieses Produkt auf einer Kieselgelplatte (Art. 5715 der Merck Co.) der Kieselgeldünnschichtchromatographie unterzogen wurde, ent-

J I ZDDUb

St

4*6· -

wickelt mit einem Mischlösungsmittel aus Butylacetat/n-Butanol/ Essigsäure/Wasser (4:4:1:1 Vol.) zeigte es einen Rf-Wert von 0,33. Das Isomerprodukt des Beispiels 12 (b) dagegen zeigte einen Rf-Wert von 0,39 bei der gleichen Kieselgeldünnschichtchromatographie wie oben.

Elementaranalyse für ^C22^H35^N3°5^: ber.: C 62,91, H 8,39, N 9,97 % gef.: C 63,10, H 8,09, N 9,70 %

Beispiel 15

Synthese von (2S,3R)-3-Amino-2-hydroxy-4-phenylbutanoyl-(S)-leucyl-(S)-glutaminsäure

V VCH^-CH—CH-CONH-CH-CONH-CH-COOH

\ / ² ! I . I I

^^ NH₂ OH CH₂ CH₂

CH CH_Q

II²

CCH-J₂ COOH

(2S, 3R) -S-N-Benzyloxycarbonylamino^-hydroxy^-phenylbutanoyl-(S)-leucin (442 mg) wurde mit 500 mg (S)-Glutaminsäure-benzylester-p-toluolsulfonat μmgesetzt, und das anfallende Kondensationsprodukt wurde in der gleichen Weise wie in Stufe (a) des Beispiels· 12 zu 667 mg des 3-N-Benzyloxycarbonyl-geschützten Derivats der (2S,3R)-3-N-Amino-2-hydroxy-4-phenylbutanoyl-(S)-leucyl-(S) glutaminsäure isoliert, das einen m/e-Wert von 662 (M"+ 1) bei der massenspektrometrischen Analyse lieferte. Dieses geschützte Produkt (200 mg) wurde in der gleichen Weise wie in Stufe (b) des Beispiels 12 zwecks Schutzgruppen-

OO O P C· f!

abspaltung der Hydrogenolyse unterzogen, um 73 mg der· Titelverbindung als farbloses Pulver zu ergeben. Schmp. 143-146°C. C^J^ -24,7° (c = 1
spektrometrie; m/e 438 (M + 1).

143-146°C. C^J^ -24,7° (c = 1,0, 1n HCl). MassenElementaranalyse für C^H₃₁N₃O₇;

ber„s C 57,64, H 7,16, N 9,61 % gef.; C 57,21, H 7,31, N 9,30 %

Beispiel 16

Synthese von (3R)-N-/" (2¹S,3'R)-3'-Aminö-2'-hydroxy-4'· phenylbutanoy1)- (S)-leucyl_/-amino-(2S)-2-hydroxy-4-pheny!buttersäure

(R) (S) (S) (R) (S) H-CH—CH-CONH-CH-CONH-CH—CH-COOH

²II I Ii

NH₂ OH CH₂ CH₂ OH

(2S, 3R) -S-^N-Benzyloxycarbonylamino^-hydroxy^-phenylbutanoyl-(S)-leucin (309 mg) wurde mit (2S,3R)-3-Amino-2-hydroxy-4-phenylbuttersäure-benzylester-Hydrochlorid (225 mg) umgesetzt und das erhaltene Kondensationsprodukt in der gleichen Weise wie in Stufe (a) des Beispiels 12 isoliert, um 440 mg des 3-N-Benzyloxycarbonylgeschützten Derivats der (3R)-N-/~(2'S,3'R)-3'-amino-2'-hydroxy-4—phenylbutanoyl-(S)-leucyl_7-amino-(2S)-2-hydroxy-4-phenylbuttersäure als farblose Nadeln zu ergeben. Schmp. 152-154 C, Massenspektrometrie: m/e 710 (M + 1) .

- 4βΓ -

Dieses N-geschützte Produkt (100 mg) wurde in der gleichen Weise wie in Stufe (b) des Beispiels 12 zwecks Schutzgruppenabspaltung der Hydrogenolyse unterzogen, um 67 mg eines rohen Pulvers der Titelverbindung zu ergeben. Umkristallisieren aus Methanol/Ä'thylacetat ergab 42 mg farblose Nadeln. Schmp. 217-218°C. /Öc_7q+17,O° (c = 1,0, 1n HCl). Massenspektrometrie: m/e 486 (M + 1)

Elementaranalyse für C_o,H_QC.N_0, (MG: 485,64)-

ber.: C 64,30, H 7,28, N 8,66 % gef.: C 64,20, H 7,33, N 8,51 % ■

Die folgenden Beispiele 17 - 19 veranschaulichen die Zu sammenstellung pharmazeutischer Mittel gemäß der Erfin-. dung.

Beispiel17

(2S,3R)-Amino-2-hydroxy-4-pheny!buttersäure, d.h. (2S/3R)-AHPA (0,1 g) und Mannit (5 g) wurden in destilliertem Wasser zu einem Gesamtvolumen von 1000 ml aufgenommen und die erhaltene Lösung in herkömmlicher Weise sterilisiert. Die sterilisierte Lösung wurde in 2 ml-Portionen in Glasfläschchen gebracht und dann gefriergetrocknet. Zum Gebrauch wurde das lyophilisierte Produkt in sterilem destilliertem Wasser gelöst, um eine Injektionslösung herzustellen.

Beispiel 18

Ein Gew.-Teil (2S,3R)-AHPA wurde gut mit 2000 Gew.-Teilen Lactose gemischt und das Gemisch durch ein Sieb mit einer

*■ Λ β

lichten Siebmaschenweite von etwa 0,30 mm (50 mesh) geführt, um eine pulvrige Zusammenstellung zu ergeben.

Beispiel 19

Ein Gew.-Teil (2S,3R)-AHPA, 770 Teile Lactose, 200 Teile Maisstärke und 30 Teile Polyvinylpyrrolidon (als Binder) wurden gut zusammengemischt. Das Gemisch wurde mit einem Volumen Äthanol befeuchtet und granuliert. Die Granula wurden mit 0,5 Teilen fein verteiltem Magnesiumstearat als Gleitmittel gemischt und in die Form von Tabletten von pweils 1 mg Gewicht gepreßt.

Claims

Patentansprüche

ft ·. +

6. Juli 1981 79153

Γ1. |7

er bindung der allgemeinen Formel

\ V

NHR₂ OH

(III),

worin R' ein Wasserstoffatom oder eine Hydroxylgruppe, R₂ ein Wasserstoffatom oder eine Alkanoy!gruppe mit 2-7 Kohlenstoffatomen oder eine Alkoxycarbonylgruppe mit 2-7 Kohlenstoffatomen ist und R₃ unter

ι 4. υ υ ν y

-CONH-CH-CH₂OH,

-CONH-CH-CONH-CH-CH^OH and

I I ²

^RH ^R5
-CONH-CH-CONH-CH-ZCH-VCOOH

ausgewählt ist, worin R. und R₅ gleich oder verschieden voneinander sein können und jeweils eine Alkylgruppe mit

1 bis 7 Kohlenstoffatomen, eine Hydroxyalkylgruppe mit 1 bis 7 Kohlenstoffatomen, eine Mercaptoalkylgruppe mit"1 bis 7 Kohlenstoffatomen, eine Carbox-amidoalkylgruppe mit

2 bis 8 Kohlenstoffatomen, eine Aminoalkylgruppe mit 1 bis 7 Kohlenstoffatomen, eine Guanidyl-N-alkyl-Gruppe mit

1 bis 7 Kohlenstoffatomen, eine Alkylmercaptoalkylgruppe mit 2 bis 7 Kohlenstoffatomen, eine Carboxyalkylgruppe mit

2 bis 8 Kohlenstoffatomen, eine Arylgruppe, insbesondere eine Phenylgruppe, eine Aralkylgruppe mit 7 bis 8 Kohlenstoffatomen oder eine substituierte Aralkylgruppe mit 7 bis 8 Kohlenstoffatomen sind, η Null oder 1 ist und das die R- oder S-Konfiguration oder deren Kombination bezeichnet.

2. Verbindung nach Anspruch 1 der Formel

-H V—CH -CH CH-R,- (TTTa ">

NHR₂ OH

worin R^ ein Wasserstoffatom oder eine Hydroxylgruppe, R₂ ein Wasserstoffatom oder eine Alkanoylgruppe mit 2 bis 7 Kohlenstoffatomen oder eine Alkoxycarbonylgruppe mit 2 bis

3126608

β ο e ft *

U (J β ft

(ft. Λ d

7 Kohlenstoffatomen und R,- die Gruppe

-CH₂OH₅

-CONH-CH-GH₂OH₅ oder

CONH-CH-CONH-CH-CH₀Oh

■- ι ι ²

ist, worin R^ und Rr wie in Anspruch 1 definiert sind, 3 c Verbindung nach Anspruch 1 der Formel

H -CH CH-CONH-CH-CONH-CH₇^hVCOOH

NHR₂ OH R₇ R₈ ^V0H/_n

ρ JV-CH

¹A / ²

worin R₁ ein Wasserstoffatom oder eine Hydroxylgruppe, R₂ ein Wasserstoffatom oder eine Alkanoylgruppe mit 2 bis 7 Kohlenstoffatomen oder eine Alkoxycarbonylgruppe mit 2 bis 7 Kohlenstoffatomen ist und R₇ und R_g gleich oder verschieden voneinander sein können und jeweils eine Alkylgruppe mit 1 bis 7 Kohlenstoffatomen, eine Hydroxyalky!gruppe mit 1 bis 7 Kohlenstoffatomen, eine Mercaptoalky!gruppe mit 1 bis 7 Kohlenstoffatomen„ eine Aminoalkylgruppe mit 1 bis 7 Kohlenstoffatomen? eine Guanidyl-N-alkyl-Gruppe mit 1 bis 7 Kohlenstoffatomen, eine AlkyImercaptoalky!gruppe, eine Carboxyalky!gruppe mit 2 bis 8 Kohlenstoffatomen, eine Carboxamidoalky!gruppe mit 2 bis 8 Kohlenstoffatomen, eine Arylgruppe, insbesondere eine Phenylgruppe, eine Aralky!gruppe, insbesondere eine Phenyl (C--C^)alkylgruppe_? insbesondere eine Benzy!gruppe, oder eine substituierte Äralkylgruppe

ύ ί

sind und η Null oder 1 ist und das jeweils die R- oder S-Konfiguration bezeichnet.

4. Verbindung nach Anspruch 1 der Formel

CH₀-CH-CH-B

² I I NHA OH

(HIc),

worin A ein Wasserstoff atom oder eine Alkanoylgruppe mit 2 bis 5 Kohlenstoffatomen, insbesondere Acetyl, und B folgende Gruppe ist:

-CH₂OH, ·

-CONH-CH-CH₂OH, CH₂

CH

CH.

OH₃

-CONH-CH—CONH-CH-CH₂OH,

CH,

I ' CH

CH,

CH CH₃ ~CH₃ CH₃ CH₃

-CONH-CH—CONH—CH-COOH,

CH,

CH

CH,

CH CH₃ "CH₃ CH₃ CH₃

-CONH-CH—CONH—CH-COOH,

CH,

CH

CH.

CH.

(CH₂)

NH

I C=NH

-CONH—CH-CONH—CH-COOH, oder

CH

CH₀

I ²

CH, CH- COOH

-CONH—CH-CONH—CH CH-COOH

CH_n CH₀ OH

1 ²

CH

5 ο Verbindung nach Anspruch 2, ausgewählt unter (2S_J3R)-3-Amino-2-hydroxy-il-phenyl-l-butanol_J ((2S)-2-N-[(2^fS_s3'R)-3'-Amino-2'-hydroxy-V-phenylbutanoyl ]amino-4-methyl-pentanol j (2S )-2-N-[ (2'3,3¹R)-S' -N-Acetylamino-2' -hydroxy-*»' -

phenylbutanoyl]amino-4-methyl-pentanol und (2S )-2-N-[ (2> S, 3' R)-3' -Amino-2' -hydroxy-*]' -phenyl- · butanoyl-(S)-leucyl]amino-ⁱt~methyl-pentanol

5. Verbindung nach Anspruch 3, ausgewählt unter (2S,3R)-3-Amino-2-hydroxy-i}-phenylbutanoyl-(S)-

leucyl-(S)-leucin _s
(2S_J3R)-3-Amino-2-hydroxy~4-phenylbutanoyl-(S)-

leucyl-(S)-arginin- ₃
C 2S _s 3R) - 3-Arnino-2-hydroxy-ⁱ)-phenylbutanoy 1- (S)-

leucyl-(R)-leucin ₃

1 L O Q U Q

* * «τβ

(2S,3R)-3-Amino-2-hydroxy-i|-phenylbutanoyl-(S)-

leucyl-(S)-glutaminsäure. und. (3R)-N-[(2'8,3¹R)-S¹-Amlno-2·-hydroxy-H'-phenylbutanoyl-(S)-leucyl]amino-(2S)-2-hydroxy-H-

phenylbuttersäure.

7. Arzneimittel, insbesondere als Immunverstärker brauchbar, als aktiven Bestandteil enthaltend die Verbindung der Formel (VIII)

CH₀-CH-

-CH-D

(VIII),

NHR₂ OH

worin R-' ein Wasserstoff atom oder eine Hydroxylgruppe, R₂ ein Wasserstoffatom, eine Alkanoylgruppe mit 2 bis 7 Kohlenstoffatomen oder eine Alkoxycarbonylgruppe mit 2 bis 7 Kohlenstoffatomen oder eine Aralkyloxycarbonylgruppe mit 7 bis 8 Kohlenstoffatomen, insbesondere eine Benzyloxycarbonylgruppe und D die Gruppe

-COOH,

, worin

-COOCH₂
-CONH₂,

-CONHR₁₃ · , worin

C^-Alkyl ist

ist.

-CHpOH,

-CONH-CH-CH₂OH, Ri.

31266Q6

— *7 — * ■» - β λα»,

9ft » *. r

+ O ο α α ·

O r> fe

-CONH-CH-CONH-Ih-CH₂OH oder

- C ONH- CH- C ONH-cW cW C 00H

worin R, und R₅ gleich oder verschieden voneinander sein können und jeweils eine Alkylgruppe mit 1 bis 7 Kohlenstoffatomen/ eine Hydroxy-alky!gruppe mit 1 bis 7 Kohlenstoffatomen, eine Mercaptoalky!gruppe mit 1 bis 7 Kohlenstoffatomen, eine Carboxamidoalkylgruppe mit 2 bis 8 Kohlenstoffatomen, eine Aminoalky!gruppe mit 1 bis 7 Kohlenstoffatomen, eine Guanidyl-N-alky!-Gruppe mit 2 bis 7 Kohlenstoffatomen, eine Alkylmercaptoalky!gruppe mit 2 bis 7 Kohlenstoffatomen, eine Carboxyalky!gruppe mit 2 bis 8 Kohlenstoffatomen, eine Ary!gruppe, insbesondere eine Pheny!gruppe, eine Aralky!gruppe mit 7 bis 8 Kohlenstoffatomen, insbesondere eine Benzy!gruppe _t oder eine substituierte Aralkylgruppe mit 2 bis 8 Kohlenstoffatomen sind, η Null oder 1 ist und das * die R- oder S-Konf iguration bedeutet, in Kombination mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger für den-aktiven Bestandteil»

8. Arzneimittel nach Anspruch 7, als aktiven Bestandteil enthaltend eine Verbindung der Formel

CH₀-CH—-CH-D» (Villa) ,

NHA OH

worin R₁ ein Wasserstoffatom oder eine Hydroxylgruppe, A ein Wasserstoffatom oder eine Alkanoylgruppe mit 2 bis Kohlenstoffatomen, insbesondere Acetyl, und D¹ die Gruppe

-COOH,
-COOR

/ worin R₁₂ C, ^-Alkyl ist,"

CONH₂ > CH₂OH > CONH- -CH-CH₂OH, I
CH₂
CH' 3 ^CH^ CONH—CH—CONH—CH—
I I ι ι
CH₀ CH₀

I I

CH CH

CH₃ CH CH₃ CH₃

-CONH—CH—.CONH—CH—COOH,

CH„ CH₀

I ² I ²

CH CH

CH₃ CH₃ CH₃ CH₃

-CONH—CH—CONH-CH—COOH,

CH NH

CH_ CH- C=NH

^{3 3} I

312660a

-CONH—CH-CONH—CH-COOH₅ oder

CH
I 3 2 3 CH₀
I ² CH CH₀
ι ^ CH ^XCH COOH

-CONH—CH—CONH—CH—ΪΗ—COOH

CH₀ CH₀ OH

CH

• CH CH₃

in Kombination mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger für den aktiven Bestandteil.

9i Arzneimittel nach Anspruch 7, als aktiven Bestandteil enthaltend eine Verbindung der Formel

B-. V V^n₀O

NHR₂ OH

worin R-j ein Wasser stoff atom oder eine Hydroxylgruppe, R₂ ein Wasserstoff atom oder eine Alkanoy !gruppe mit 2 bis Kohlenstoffatomen oder eine Alkoxycarbonylgruppe mit 2 bis 7 Kohlenstoffatomen ist und R₃ unter

CONH-CH-CH₀OH₉ i ²

CONH-CH-CONH-CH-Ch₀OH und

I 1 ²

-conh-ch-conh-ch-ZchVcooh

_Ri} R₅ ^0H/_n

ausgewählt ist, worin R. und R₅ gleich oder verschieden voneinander sein können und jeweils eine Alkylgruppe mit 1 bis 7 Kohlenstoffatomen, eine Hydroxyalkylgruppe mit 1 bis 7 Kohlenstoffatomen, eine Mercaptoalkylgruppe mit 1 bis 7 Kohlenstoffatomen, eine Carboxamidoalkylgruppe mit 2 bis 8 Kohlenstoffatomen, eine Aminoalkylgruppe mit 1 bis 7 Kohlenstoffatomen·, eine Guanidyl-N-alkyl-Gruppe mit 1 bis 7 Kohlenstoffatomen, eine AlkyImercaptoalkylgruppe mit 2 bis 7 Kohlenstoffatomen, eine· Car boxy alky lgruppe mit 2 bis 8 Kohlenstoffatomen, eine Arylgruppe, insbesondere eine Phenylgruppe, eine Aralkylgruppe mit 7 bis 8 Kohlenstoffatomen oder eine substituierte Aralkylgruppe mit 7 bis 8 Kohlenstoffatomen sind, η Null oder 1 ist und das die R- oder S-Konfiguration bezeichnet.