DE3126606C2

DE3126606C2 - (2S,3R)-3-Amino-2-hydroxy-4-phenylbutansäure-amide und -peptide sowie diese enthaltende Arzneimittel

Info

Publication number: DE3126606C2
Application number: DE3126606A
Authority: DE
Inventors: Takaaki Fujisawa Kanagawa Aoyagi; Shunzo Tokio/Tokyo Fukatsu; Kenji Zama Kanagawa Kawamura; Tomio Tokio/Tokyo Takeuchi; Hamao Tokio/Toyko Umezawa
Original assignee: Microbial Chemistry Research Foundation
Current assignee: Microbial Chemistry Research Foundation
Priority date: 1980-07-07
Filing date: 1981-07-06
Publication date: 1986-09-18
Also published as: GB2083046A; DE3153030C2; CA1178610A; FR2485924A1; IT8109465A0; DE3126606A1; US4370318A; FR2485924B1; GB2083046B; IT8109465A1; IT1167937B

Abstract

3-Amino-2-hydroxy-4-phenylbuttersäure und deren Ester sowie neue Derivate hiervon, die in ihrer chemischen Struktur mit Bestatin verwandt sind, sind die Immunreaktion in lebenden Tieren verstärkend aktiv.

Description

Die Erfindung betrifft den Gegenstand der Patentansprüche. Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind mit Bestatin verwandt.

Bestatin hat bekanntlich immunverstärkende Eigenschaften (vgl. die US-PS 40 29 547 und 4189 604). Bestatin ist (2S, 3R)-3-Amino-2-hydroxy-4-phenylbutanoyl-(S)-leucin und hat folgende Struktur:

OH

(S)

(I)

-CH₂-CH CH- CO — NH- CH- COOH

NH₂ CH₂

CH(CHj)₂

Es wurden einige Verbindungen chemisch synthetisiert, die in ihrer chemischen Struktur mit Bestatin verwandt sind und durch folgende allgemeine Formel wiedergegeben werden:

OH

R' — CH- CH- CO— NH- CH- COOH

R²

(II)

ist, worin R' Wasserstoff, Chlor, Methyl, Nitro, Hydroxy oder Amino und η O ode: 1 und R² (nieder)-Alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, Hydroxy-(nieder)-alkyi, Alkyltbioalkyl, Carboxamido-(nieder)-alkyl oder Carboxy-(niedcr)-alkyl ist, vorausgesetzt, daß, wenn R¹ Benzyl und R² Isobutyl ist, die Konfiguration der Verbindung (2S, 3 R, 2'R), (2S, 3S, 2'S) oder (2S, 3S, 2'R) IST (vgl. die US-PS 41 89 604). Die Verbindungen der Formel (II) sind die Dipeptide, die physiologisch aktiv sind, und Aminopeptidase B, Leucinaminopeptidase und Bleomycin-hydrolase inhibieren und die Antitumorwirkung von Bleomycin erhöhen.

Aus den DE-OS 26 32 396 und 27 25 732, sowie aus Chem. Abstracts 85 (1976) Referat Nr. 173376, J. Med. Chem. 20 (1977), 510-515 und H. Umezawa et al. »Bioactive Peptides Produced by Microorganisms«; John Wiley Verlag New York (1978), Seiten 143-151 sind Bestatinderivate bekannt, welche eine Hemmwirkung gegenüber Aminopeptidase B aufweisen. Im Gegensatz hierzu zeigen die erfindungsgemäßen Verbindungen jedoch eine immunverstärkende Wirkung und es besteht keine Proportionalität zwischen dieser immunverstärkenden Wirkung und der Hemmwirkung.

Aufgabe der Erfindung sind neue Bestatinderivate, die immunverstärkende Aktivität aufweisen,
ipieerfiriäungsgemäßen Verbindungen besitzen die folgende'ällgemeihe F,prmeIi(II j):'

25

30

35

40

45

50

55

60

CH₂-CH CH- C — R¹

I I Il

NHR² OH O

65

in der R¹ ein WasserstefTatom oder eine Hydroxygmppe und R² ein Wasserstoffatom oder eine Alkanoylgruppe mit 2 bis 7 Kohlenstoffatomen bedeuten und R³ eine der folgenden Gruppen ist:

(S) -NH-CH-CH₂OH

CH₂ CH

CH₃ CH₃

-NH-CH-CONH-CH-CH₂Oh CH₂

CH

CH₂

CH

CH₃ CH₃ CH₃ C-H₃

(S) (S) oder (R)

— NH — CH — CONH —CH-COOH CH₂

CH₂

CH CH

CH₃ CH₃ CH₃ CH₃

— NH — CH — CONH — CH-COOH CH₂ CH

CH₃ CH₃

(CH₂)₃ NH

C=NH NH₂

-NH-CH-CONH —CH-COOH CH₂ CH

CH, CH₃

CH₂ CH₂ COOH

_W1 —Nil — CH-CONH — CH-CH- COOH

CH₂

CH / \ CH₃ CH₃

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können in Form eines pharmazeutisch annehmbaren Säureadditionssalzcs oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes (Carboxylates) vorliegen und als solche in Arzneimitteln mit einem geeigneten Träger und/oder Verdünnungsmittel eingesetzt werden.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können nach einem Verfahren hergestellt werden, bei dem eine Verbindung der allgemeinen Formel IV: '

-CH₂-CH CH- Tl⁴ (IV)

NHR² OH

worin R¹ und R² die zuvor angegebenen Bedeutungen besitzen, und R⁴ ein dem Rest R-' entsprechender Rest, jedoch mit einer endständigen Gruppierung -COOR⁵ statt der entständigen Gruppierung -CH₂OH ist, wobei R⁵ eine Alkylgruppe mit 1 bis 7 Kohlenstoffatomen ist, insbesondere Methyl oder Äthyl, oder eine Aralkylgruppe mit 7 bis 8 Kohlenstoffatomen ist, insbesondere Benzyl, und reduziert wird, wobei andere funktionelle Gruppen, die an der Reduktion nicht teilnehmen sollen, geschützt sein können. Die bei diesem Verfahren einge-Sitzte Ausgangsverbindung JV l.jegt gewöhnlich in Form eines Alkyl- oder Aralkylesters der entsprechenden Aminosäure vor, d. h. einer Verbindung, in der die endständige Methylolgruppe, -CH₂OH, durch eine Alkyl- oder Aralkylcarboxylatgruppe, -COOR , ersetzt ist. Wenn die Ausgangsverbindung IV in Form eines Alkylesters der Aminosäure vorliegt, kann dies z. B. der Methylester der (3R)-N-tert.-Butoxycarbonylamino-(2S)-

j hydroxy-4-phenylbuttersäure sein, der durch Schützen der Aminogruppe der (3R)-Amino-(2S)-hydroxy-4-phe-

nylbuttersäure (Journal of Antibiotics, Band 29, Nr. 5,600-601 [1976]) mit der bekannten Aminoschutzgruppe, tert.-Butoxycarbonyl, und dann Verestern des geschützten Produkts mit Diazomethan in Äthyläther, hergestellt werden kann. Wenn die Verbindung (IV) in Form eines Alkylesters eines Dipeptids vorliegt, kann letzterer z. B. der Methylester von (2S, 3R)-3-N-tert.-Butoxycarbonylamino-4-phf;nylbutanoyl-(S)-leucin sein, der durch Schützen der Aminogruppe von Bestatin (US-PS 40 29 547) mit der f-irt.-Butoxycarbonylgruppe und anschließendes Verestern des N-geschützten Bestatins mit Diazomethan in Äthyläther hergestellt werden kann.

Zur Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen aus der Ausgangsverbindung (IV) wird letztere in einer für die herkömmliche Umwandlung eines niederen Alkylcarboxylats (Esters) in den entsprechenden jo Alkohol bekannten Weise reduziert, d. h. mit einem Reduktionsmittel, das gewöhnlich für diese Zwecke verwendet wird, z. B. mit Natriumborhydrid in einem niederen Alkanol, entweder wäßrig oder nichtwäßrig, bei Raumtemperatur. Nach beendeter Reduktion wird die verbliebene Aminoschutzgruppe, wenn nötig, nach einer bekannten Abspaltungstechnik abgespalten. Die Benzyloxycarbonyl-Aminoschutzgruppe kann durch katalytische Hydrogenolyse in bekannter Weise in Gegenwart eines Palladiumkatalysators abgespalten werden, und die tert.-Butoxycarbonyl-Aminoschutzgruppe kann durch milde Acidolyse mit Bromwasserstoff in Essigsäure, mit Trifluoressigsäure oder mit Chlorwasserstoff in einem organischen Lösungsmittel abgespalten werden.

Bei Verbindungen, bei denen eine endständige Gruppe -COOH vorliegt, kann die Herstellung nach einem Verfahren erfolgen, bei dem natürlich vorkommendes Bestatin (US-PS 40 29 547), ein Stoffwechselprodukt von Bestatin oder ein optisches Isomeres hiervon der allgemeinen Formel V:

-CH₂-CH CH — CONH —CH-COOH (V)

NHR² OH R⁶

worin R¹ und R² die zuvor angegebenen Bedeutungen besitzen und R⁶ eine sek. Butylgruppe ist, mit einer entsprechenden Aminosäure in Form von Leucin, Arginin, Glutaminsäure oder 3-Amino-2-hydroxy-4-phenylbuttersäure bzw. einem geschützten Derivat hiervon mit geschützten funktionellen Gruppen, die an der Kondensation nicht teilnehm-sn sollen, in für die herkömmliche Synthese von Peptiden an sich bekannter Weise konden siert, und, wenn erforderlich, die restliche(n) Schutzgruppe(n) vom anfallenden Kondensationsprodukt abgespalten wird bzw. werden, um zu dem gewünschten Produkt zu führen.

Die Ausgangsverbindung der Formel (V), wie in dem gerade zuvor erwähnten Verfahren eingesetzt, kann nach einem im »Journal ofMedicinal Chemistry«, Band 20,510—515 (1977) beschriebenen Verfahren hergestellt werden. Die Kondensation der Ausgangsverbindung (V) mit der Aminosäure verbindung erfolgt bei einer Temperatür von -20 bis 25°C nach einem bekannten Verfahren für die Synthese von Peptiden, z. B. nach der Carbodiimid-Methode, unter Verwendung von Dicyclohexylcarbodiimid als Kondensationsmittel; nach der Methode der aktiven Ester (z. B. unter Verwendung von Hydroxysuccinimidester, nach der Methode der aktiven Imide unter Verwendung von Imidazol, nach der Methode der aktiven Azide unter Verwendung von beispielsweise Hydrazin oder nach der Methode der gemischten Säureanhydride mit Chlorameisensäureäthylester). Das organische Lösungsmittel, in dem die Kondensation durchgeführt wird, kann ein solches sein, wie es für die herkömmliche Synthese von Peptiden eingesetzt wird, und umfaßt z. B. Äther, wie Tetrahydrofuran und Dioxan, Ester, wie Äthylacetat, Ketone, wie Aceton, halogeniert» Kohlenwasserstoffe, wie Methylenchlorid, Amide, wie Dimethylformamid, und Nitrile, wie Acetonitril. Das geschützte Derivat der Aminosäure liegt vorzugsweise in Form des Säureadditionssalzes vor (z. B. p-ToluoIsulfonat oder Hydrochlorid eines Niederalkyl- oder Benzylesters der Aminosäure). Wenn die Ausgangsverbindung (V) mit der Aminosäure kondensiert wird, wobei die funktionell Gruppe blockiert ist, z. B. nach der Carbodiimid-Methode, erfolgt die Kondensation bevorzugt in Gegenwart eines organischen tert.-Amins, wie N-Methylmorpholin oder Triäthylamin. Die Abspaltung der

übrigen Aminoschutzgruppe vom Kondensationsprodukt kann nach einer in der Peptidchemic bekannten Abspaltungstechnik erfolgen. Beispielsweise kann die Aralkyloxycarbonyl-Aminoschutzgruppe, insbesondere die Benzyloxycarbonylgruppe, durch katalytische Hydrogenolyse in Gegenwart eines Palladiumkalalysalors und die Alkoxycarbonylgruppe, wie die tert.-Butoxycarbonylgruppe, durch milde Acidolyse mit Bromwasscrstoff in Essigsäure, mit Trifiuoressigsäure oder mit Chlorwasserstoff in einem organischen Lösungsmittel, wie Dioxan, Tetrahydrofuran und Äthylacetat, abgespalten werden.

Ferner ist bekannt, daß ß-Amino^-hydroxy^-phenyl-buttersäure (nachfolgend als AHPA abgekürzt) durch Hydrolyse von Bestatin mit Salzsäure (US-PS 41 89 604) erhalten wird.

/2S, 3R)-AHPA und ihre drei Stereoisomeren, nämlich (2R, 3S)-AHPA, (2S, 3S)-AHPA und (2R, 3R)-AHPA, wurden durch Acidolyse von S-N-Benzyloxycarbonylamino^-hydroxy^-phenylbutyronitril und anschließende Trennung, wie in der US-PS 41 89 604 beschrieben, synthetisiert. Diese US-PS sagt jedoch nichts über die physiologische Wirksamkeit von (2S, 3R)-AHPA und deren Stereoisomeren. Nur im »Journal of Medicinal Chemistry«, Band 20, Nr. 4, S. 510-515 (1977) wird beschrieben, daß (2S, 3R)-AHPA gegenüber Aminopeptidase B eine schwach hemmende Aktivität entfaltet. In der Vergangenheit ist nicht darüber berichtet worden, ob (2S, 3R)-AHPA und deren Stereoisomere die immunverstärkenden Aktivitäten haben.

Es wurde nun festgestellt, daß die erfindungsgemäßen Verbindungen als Immunverstärker wirksam sind zur Verstärkung der zellvermittelten Immunreaktion in lebenden Tieren und beim Menschen.

Um die akute Toxizität der Verbindungen abzuschätzen, wurde die zu untersuchende Verbindung Mäusen des ICR-Stammes (jeweils Gruppen mit 6 männlichen Mäusen in einem Alter von 5 Wochen, durchschnittliches Körpergewicht 20 gj intraperitoneai gegeben, wenn aiie getesteten Mäuse intraperitoneale Verabreichung von (2S, 3R)-AHPA; (2S)-2-N-[(2'S,3'R)-3'-Amino-2'-hydroxy-4'-phenyl-butanoyl]-amino-4-methyl-pentanol; (2S)-2-N-[(2'S, 3'R)-3'-Amino-2'-hydroxy-4'-phenylbutanoyI-(S)-leucyl]-amino-4-methyl-pentanol; (2S, 3R)-3-Amino-2-hydroxy-4-phenyl-butanoyl-(S)-leucyl-(S)-leucin und(2S, 3R)-3-Amino-2-hydroxy-4-phenyl-butanoyl-(S)-leucyl-(S)-arginin bei einer Dosierung von 100 mg/kg vertrugen.

Die erfindungsgemäßen Arzneimittel können dank ihrer hohen immunverstärkenden Aktivität weiterhin in einer immuntherapeutischen Behandlung von Tumoren und auch als Mittel zur Verhinderung bakterieller Infektionen verwendet werden. Sie können für orale, parenterale oder intrarektale Verabreichung zusammengestellt werden. Mittel in Form von Injektionslösungen können 0,1 bis 10,0 Gew.-% der Verbindung als aktiven Bestandteil sowie auch einen oder mehrere pH-Einsteller, Puffer, Stabilisatoren, Exzipientien, Lokalanästhetika und einen Zusatz, urn die Lösung isotonisch zu machen, enthalten. Die injizierbare Lösung kann für subkutane, intramuskuläre oder intravenöse Injektion geeignet nach jeder herkömmlichen pharmazeutischen Technik hergestellt werden. Feste Mittel für orale Verabreichung, die in Form von Tabletten, überzogenen Tabletten, Granulaten, Pulver und Kapseln vorliegen können, können Exzipientien für den aktiven Bestandteil und, wenn gewünscht, weitere Zusätze, einschließlich das Zerfallen fördernde Mittel, Gleitmittel, Farbstoffe, Aroma-oder Geschmacksstoffe enthalten. Der Anteil der aktiven Verbindung zum Träger kann in einem Verhältnisbereich von 1 :1 bis 1 :100 auf Gewichtsbasis liegen und kann gewöhnlich in geeigneter Weise in Abhängigkeit von der Form der hergestellten, oral zu verabreichenden Rezeptur gewählt werden. Suppositorien können Exzipientien und, wenn nötig, Tenside und Gleitmitte! zusätzlich zu der aktiver. Verbindung enthalten.

Die verabreichte optimale Dosierung der Verbindungen hängt natürlich von der Art der Verabreichung und der bezweckten Behandlung ab. Für den Menschen enthält die Dosierungseinheit im allgemeinen 0,002 bis 200 mg der Verbindungen, die oral in unterteilten Dosen ein- oder mehrmals täglich verabreicht werden kann. Die im erlindungsgemäßen Mittel verwendeten neuen Verbindungen können einer erwachsenen Person oral in einer Dosierung von 50 bis 200 mg einmal täglich verabreicht werden.

Die physiologischen Aktivitäten der erfindungsgemäßen Verbindungen werden wie folgt getestet:

Test 1

Dieser Test beschreibt die Aktivität der gegenüber Aminopeptidase B hemmend wirkenden Verbindung. Die Aminopeptidase-B-hemmende Aktivität wurde nach einer abgewandelten Methode gemäß V. K. Hopsu et al., beschrieben in »Archives of Biochemistry and Biophysics«, Band 114,557 (1966) bestimmt. So wurde ein Gemisch von 0,8 ml 0,1 molaren (S)-Arginin-jS-naphthylamids und 1,0 ml 0,1-molaren Tris-hydrochloridpuffers (pH 7,0) mit 0,7 ml 0,1 m Tris-hydrochlorid-puffer (pH 7,0), 1ie Testverbindung enthaltend, vermischt und dann 3 min auf37°C erwärmt. Die enzymatisch^ Reaktion wurde durch Zugabe von 0,2 ml einer Aminopeptidase-B-Lösung gestartet, die nach der chromatographischen Methode von Hopsu et al. mit Sephadex G-IOO gereinigt worden war. Nach 30minütiger Reaktion bei 37°C wurde die Reaktionslösung mit 0,6 ml 1,0 m-Acetatpuffer(pH 4,2) mit 1,0 mg/ml Diazoniumsalz von o-Aminoazotoluol und 1,0% eines Tensids (Sorbitanester) zusammengemischt, um die enzymatische Reaktion zu stoppen und dann bei Raumtemperatur 15 min stehengelassen. Danach wurde die Extinktion (a) der Reaktionslösung bei 525 nm spektrophotometrisch gemessen. Zur Kontrolle wurde die obige Arbeitsweise ohne die Testverbindung wiederholt und die Extinktion (b) gemessen. Die Prozentsätze der Hemmung gegenüber Aminopeptidase B wurden nach folgender Gleichung berechnet:

% Hemmung = x 100.
b

Die Prozentsätze der Hemmung bei verschiedenen Konzentrationen der Testverbindung wurden gemessen, und aus den Meßwerten der Hemmung in % wurde die 50%igc Hcmrnkonzentration (H K_5n) ermittelt. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 1 zusammengestellt.

3.1 26 606	Tabelle I	HK₅₀ (mcg/rtil)
Testverbindungen
Beispiel	0,65
1	48,9
2	5,4
4	0,11
6	0,20
5	15
7	53
9
Vergleich	0,03
12 (Bestatin)	2,1
13 (2S, 3S)-AHPA-L-leucin	18
14 (2R, 3S)-AHPA-L-leucin	0,041
15 (2S, 3S)-AHPA-D-leucin	5,6
16 (2R, 3S)-AHPA-D-leucin	>100
17 (2R, 3R)-AHPA-D-leucin

Test 2

DieserTest betrifft die Auswertung der immunverstärkenden Aktivität der erfindungsgemäßen neuen Verbindung. So wurde der Einfluß der neuen Verbindung auf zellvermittelte Immunität nach einer bekannten Technik der verzögerten Hypersensitivität(D.T. H.) getestet (siehe P.H. Lagrange eta|.,»J. Exp. Med.«, Band 139,1529— 1539 (1974), unter Verwendung von mit roten Schafblutzellen als Antigen immunisierten Mäusen, das in die Pfotensohle der Mäuse eingeimpft wurde.

Eine Suspension von 10⁸ roten Schafblutzellen in 0,05 ml physiologischer Salzlösung wurde im Zeitpunkt der Immunisierung in jede rechte Hinterpfote einer jeden im Test befindlichen DCFpMaus (Weibchen, 8 Wochen alt, 5 Mäuse in jeder Gruppe) subkutan injiziert, um die verzögerte Hypersensitivität herzustellen. Zugleich mit der Immunisierung erhielt jede im Test befindliche Maus oral 0,5 mg/kg der Testverbindung ajs Lösung, die durch Auflösen der Testverbindung in physiologischer Salzlösung und anschließendes Filtrieren der Lösung "durch ein Mikroporenfilter (Porendurchmesser 0,22 μΐη) hergestellt wurde. 5 Tage später wurden 10⁸ rote Schafblutzellen subkutan in die linke Hinterpfote einerjeden Testmaus zur Auslösung der verzögerten Hypersensitivitätsreaktion injiziert. 24 h nach der auslösenden Injektion wurde die Dickenzunahme der linken Hinterpfote mit Lehren oder Mikrometerschrauben gemessen, um den Grad der Anschwellung in der Pfote zu ermitteln. Der Schwellungsgrad ist ausgedrückt als durch die folgende Gleichung errechneter Wert:

Schwellungsgrad (%) =

Dickenzunahme der linken Pfote der mit der

Testverbindung behandelten Maus Dickenzunahme der linken Pfote der unbehandelten Maus

x 100.

Der Schwellungsgrad dient zur Auswertung des Ausmaßes der beteiligten zeüvermittelten Immunität. Zum Vergleich wurde eine Suspension von in Wasser dispergiertem Bestatin in gleicher Weise wie oben getestet. Die erzielten Testergebnisse sind in der folgenden Tabelle II zusammengefaßt:

Tabelle II	Dosierungen	Schwellungsgrad
Testverbindung	(mg/kg)	(%)

Beispiel	0,5	129
1	0,05	123
	0,5	126
2	0,05	106

	31 26 606	Schwellungsgrad (%)
Fortsetzung
Testverbindung	Dosierungen (mg/kg)	131 124
Beispiel		103
4	0,5 0,05	135
6	0,5	120
5	0,5	120
	0,5	136 109
7	0,5	140-150 120-130
8	5 0,5
Bestatin (Vergleich)	0,5 0,05

Die Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen wird anhand der folgenden Beispiele näher erläutert.

Beispiel 1

(a) Synthese von (2S>-2-N-[(2'S, S'RiO'-N-t-Butoxycarbonylamino^'-hydroxy^'-phcnylbulanoylJ-amino-4-methylpentanol

CH — CH — CONH — CH — CHjOH

OH CH₂

(CHj)₂

(2S, 3R)-3-N-t-Butoxycarbonylamino-2-hydroxy-4-phenylbutanoyl-(S)-leucin-methyIester(440 mg) wurde in einem Gemisch aus 8 ml Äthanol und 8 ml destilliertem Wasser gelöst und die erhaltene Lösung mit Natriumborhydrid unter zweistündigem Rühren bei Zimmertemperatur zur Reduktion des Carboxylates behandelt. Das so erhaltene Rohprodukt (347 mg) wurde aus Äthylacetat/Äthyläther zu 230 mg der Titelverbindung, farblose Nadeln, umkristallisiert. Schm. 159,5-160⁰C. Massenspektrometrie: m/e394 (M + 1)

Elementaranalyse für C₂, H₃₄N₂O₅ (MG 394,57):

50 ber.: C 63,92, H 8,70, N 7,10% gef.: C 63,92, H 8,76, N 7,14%

(b) Synthese von (2S)-2-N-[(2'S, 3'R)-3'-Amino-2'-hydroxy-4'-phenylbutanoyl]-amino-4-methyI-pentanol

Die in der obigen Stufe (a) erhaltene Verbindung (300 mg) wurde in 3 ml trockenem Methanol mit 20% Chlorwasserstoff und 1,0% Anisol unter Eiskühlung gelöst und konnte dann 30 min stehen, um die t-Butoxycarbonylgruppe abzuspalten. Das Reaktionsgemisch wurde zur Trockne eingeengt und lieferte 210 mgdes Hydrochlorids der Titelverbindung, das hygroskopisch war und einen /n/e-Wertvon295 bei dermassenspektrometrischen Analyse lieferte. Dieses Hydrochlorid wurde in einem Volumen Wasser aufgenommen und mitwäßrigerNatriumhydrogencarbonatlösung neutralisiert und die erhaltene wäßrige Lösung mit n-Butanol extrahiert. Der Extrakt in n-Butanol wurde mit Wasser gewaschen und zur Trockne eingeengt, um die freie Base derTitelverbindung als Öl zu ergeben. Dieses ölige Produkt hatte einen m/e-Wert von 295 (M + 1) bei der Massenspektrometrie, und die chemische Struktur wurde durch IR- und NMR-Daten bestätigt. [α]% - 2,5° (c = 1,0, In HCl).

Beispiel 2

Synthese von (2S)-2-N-[(2'S, 3'R)-3'-N-Acetylamino-2'-hydroxy-4'-phenylbutanoyI]-

amino-4-methyl-pentanoI

Die Verbindung (42 mg) in Form der freien Base, in Stufe (b) des Beispiels 1, wie oben erhalten, wurde in 0,4 ml Methanol gelöst und die erhaltene Lösung mit 0,16 ml Essigsäureanhydrid vermischt, woraufbei Raumtemperatur über Nacht stehengelassen wurde, um die Aminognippe der Verbindung zu acetylieren Die Reaktionslösung wurde zur Trockne eingeengt und der Rückstand in 2 ml n-Butanol aufgenommen. Die Lösung im n-Butanol wurde mit 2 ml Wasser, dann mit 2 ml gesättigter wäßriger Natriumhydrogencarbonatlösung und schließüch mit Wasser gewaschen und anschließend zur Trockne eingeengt, um32 mg eines rohen Feststoffs der Titelverbindung zu ergeben. Umkristallisieren aus Äthanol-Äthyläther lieferte 20 mg farblose Nadeln. Schmp. 188-189°C, Massenspektrometer /7i/e336 (M⁺).

Elementaranalyse für C,_SH_2SN₂O₄ (MG 336,48):

ber.: C 64,25, H 8,40, N 8,33% gef.: C 64,14, H 8,35, N 8,30%

15

Beispiel 3

Synthese von (2S)-2-N-[(2'S, 3'R)-3'-N-Acetylamino-2'-hydroxy-4'-phenylbutanoyl]-

amino-4-methyl-pentanol

(2S, 3R)-3-N-Acetylamino-2-hydroxy-4-phenylbutanoyl-(S)-leucir,-methyIester (36,4 mg) wurde mit 16 mg Natriumborhydrid reduziert und dann in der Weise der Stufe (a) des Beispiels 1 isoliert, um 20,1 mg derTitelverbmdungzu ergeben. Schmp. 187,5-189°C.

Beispiel 4

(a) Synthese von (2S)-2-N-[(2'S, S'R^'-N-Benzyloxycarbonylamino^'-hydroxy^'-phenylbutanoyMSj-leucyl]-

amino-4-methyl-pentanol

<f >—CH₂—CH — C.H — CONH — CH—CONH —CH-CH₂OH

^x=^/ Ii I I

NH OH CH₂ CH₂

CH

(CHj)₂

CH
(CH₃I,

40 45

(2'S, 3'R)-3'-N-Benzyloxycarbonylamino-2'-hydroxy-4'-phenylbutanoyl-(S)-leucyl-(S)-Ieucin-benzylester (120 mg) wurde mit 38 mg Natriumborhydrid reduziert und dann das Reaktionsgemisch unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt und der feste Rückstand in 3 ml Athylacetat aufgenommen. Die erhaltene Lösung wurde mit 2 ml einer wäßrigen, l%igen Zitronensäurelösung und dann mit drei 2-ml-Portionen gesättigter wäßriger Natriumchloridlösung gewaschen. Die organische Lösungsmittelphase im Athylacetat wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Gemisch filtriert, um das Magnesiumsulfat-Hydrat zu entfernen. Das Filtrat wurde zu 81 mg eines festen Rohstoffs, der Titelverbindung, bis zur Trockne eingeengt, um 100 mg derTitelverbindung als farbloses Pulver zu erheben. Massenspektrometrie: m/e 528 (M + 1).

Elementaranalyse für C₃₀H₄₃N₂O₆ (MG 527,75):

ber.: C 68,27, H 8,23, N 5,31%

gef.: C 67,98, H 8,03, N 5,09%

(b) Synthese von (2S)-2-N-[(2'S, 3'R)-3'-Amino-2'-hydroxy-4'-phenylbutanoyl-(S)-leucyl]-

amino-4-methyl-pentanol

Die in der Stufe (a) dieses Beispiels erhaltene Verbindung (100 mg) wurde in einem Gemisch aus 1 ml Methanol und 0,3 ml destilliertem Wasser gelöst und die Lösung mit 20 mg Palladiummohr als Katalysator zusammen-

CH- CH- CONH — CH- CONH—CH-COOCH₂

gemischt und dann der Hydrogenolyse bei Raumtemperatur mit Wasserstoffgas von etwa 3 bar über Nacht unterworfen. Das Reaktionsgemisch wurde filtriert, um den Katalysator zu entfernen, und das Filtrat zu einem Sirup eingeengt. Dieser Sirup wurde mit 2 ml Athylacetat und 3 ml In Salzsäure zusammengemischt und das erhaltene Gemisch mit Wasser extrahiert, um das gewünschte, von der Schutzgruppe befreite Produkt in Wasser zu überführen. Der wäßrige Extrakt wurde zur Trockne eingeengt und lisferte 26 mg der Titelverbindung als farbloses Pulver. Schmp. 78-80⁰C. Massenspektrometrie: m/e40S.

Beispiel 5

(a) Synthese von (2S, 3R)-3-N-Benzylox>^rcarbonyiamino-2-hydroxy-4-phenylbutanoyl-(S)-leucyl-(S)-leucin-benzylester

(2S, 3R)-3-N-Benzyloxycarbonylamino-2-hydroxy-4-phenylbutanoyl-(S)-leucin (442 mg) und (S)-Leucin-benzylester-p-toiuo!sulfonat (393,3 mg) wurden mit 1 ml Tetrahydrofuran zusammengemischt, dann folgte Zugabe von 0,11 ml N-Methylmorpholin und 115 mg N-Hydroxysuccinimid. Die anfallende Lösung wurde eisgekühlt uatf dann mit 227 mg Dicyclohexylcarbodiimid zusammengemischt, worauf 4 h unter Eiskühlung gerührt wurde. Das Reaktionsgemisch wurde filtriert, um das gebildete Harnstoffderivat zu entfernen, und das Filtrat |

wurde unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt. Der feste Rückstand wurde in 5 ml Athylacetat gelöst |

und die erhaltene Lösung mit 3 mi in Salzsäure. 3 mi in wäßriger Natronlauge und schließlich mit 3 mi destilliertem Wasser gewaschen. Die organische Lösungsmittelphase wurde mit wasserfreiem Magnesiumsulfat zum Trocknen gemischt und dann das Gemisch zum Entfernen des Magnesiumsulfat-hydrats filtriert. Die Lösung (das Fiitrat) wurde unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt, um 573 mg eines rohen Feststoffs der Titelverbindung zu ergeben. Kristallisieren dieses Produkts aus Aceton/Äthyläther lieferte 444 mg farblose Nadeln. Die Massenspektrometrie dieses R.einprodukts ergab einen m/e-Wert von 646 (Λ/+ 1). Die chemische Struktur des Produkts wurde durch IR- und NMR-Daten bestätigt.

Elementaranalyse für C₃₇H₄-N₃O₇ (MG 645,87):

I

ber.: C 68,80, H 6,89, N 6,51%
gef.: C 68,64, H 6,97, N 6,30%

(b) Synthese von (2S, SRjO-Amino^-hydroxy^-phenylbutanoyKSHeucyHSHeucin

Die in der obigen Stufe (a) erhaltene Verbindung (200 mg) wurde in einem Gemisch aus 10 ml Dioxan und 0,2 ml destilliertem Wasser aufgenommen und die erhaltene Lösung mit 60 mg Palladiummohr als Hydrogenolyse-Katalysator versetzt. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur der Hydrogenolyse mit Wasserstoffgas bei 3 bar 48 h unterzogen, um sowohl die die Aminogruppe schützende Benzyloxycarbonylgruppe als auch die die Carboxylgruppe schützende Gruppe abzuspalten. Das Reaktionsgemisch wurde filtriert, um den Katalysator zu entfernen, und das Filtrat wurde unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt. Umkristallisieren des festen Rückstands aus Methanol/Äthylacetat ergab 96,8 mg der Titelverbindung als farblose Nadeln. Schmp. 216-219°C (unter Schäumen). [a\o -37,0° (c = 1,0, In HCl). Massenspektrometrie: m/e422 (M + 1).

Elementaranalyse OJrC₂₂H₅₅N₁O₅ (MG 421,60): . ,

ber.: C 62,91, H 8,39, N 9,97%
gef.: C 62,89, H 8,19, N 9,68%

Beispiel 6

(a) Synthese von (2S, SRi^-N-Benzyloxycarbonylamino^-hydroxy^-phenylbutanoyl-

(S)-leucyl-(S)-N^G-nitroarginin-benzylester

,— CH-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-COOCH₁-^f ^>
Il I I X=/

CH₂ (CH₂)J

CH NH

(CU₃), C = NH

I

NH

I
NO₂

(2S, 3R)-3-N-Benzyloxycarbonylamino-2-hydroxy-4-phenylbutanoyl-(S)-leucin (88,4 mg) und N^u-Nitroarginin-benzylester-di-p-toluolsulfonat (130,8 mg) wurden in 1 ml Tetrahydrofuran gelöst, dann folgte Zugabe von 0,022 ml N-Methylmorpholin and 34 mg N-Hydroxysuccinimid. Die erhaltene Lösung wurde eisgekühlt und mit 84 mg Dicyclohexylcarbodiimid versetzt, dann wurde 24 h unter Eiskühlung gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde filtriert, um das gebildete Harnstoffderivat zu entfernen. Das Filtrat wurde ^ur Trockne eingeengt und der feste Rückstand in 5 ml Äthylacetat gelöst. Die Lösung wurde mit 5 ml In Salzsäure, 5 ml In wäßriger Natronlauge und dann mit 5 ml destilliertem Wasser gewaschen und anschließend mit wasserfreiem Magnesiumsulfat zum Trocknen gemischt. Das Magnesiumsulfat-hydrat wurde abfiltriert und das Filtrat zur Trockne eingeengt, um 142 mg der Titelverbindung als Pulver zu ergeben. Die Massenspektrometrie dieses Produkts ergab einen m/e-Wert von 734 (M + 1), und die chemische Struktur wurde durch IR- und NMR-Daten bestätigt.

(b) Synthese von (IS, 3R)-3-Amino-2-hydroxy-4-phenylbutanoyl-(S)-Ieucyl-(S)-arginin

Die in der obigen Stufe (a) erhaltene Verbindung (117 mg) wurde mit einem Gemisch aus 2,5 ml Dioxan, 0,25 ml destilliertem Wasser und 0,25 ml Eisessig zusammengemischt, gefolgt von der Zugabe von 25 mg PaIIa ■ diummohr. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur der Hydrogenolyse mit Wa&serstoffgas von 3 bar 72 h unterworfen und das Reaktionsgemisch zum Entfernen des Katalysators filtriert. Das Filtrat wurde*, mgeengt, und die eingeengte Lösung mit einem kleinem Volumen destillierten Wassers vermischt und durch Zugabe von 6n Salzsäure auf pH 2,0 eingestellt. Die angesäuerte Lösung wurde durch eine Säule mit 100 mg Aktivkohle für die Chromatographie geführt, um das gewünschte Produkt zu adsorbieren. Zur Reinigung wurde die Aktivkohlensäurc mit destilliertem Wasser entwickelt und das Eluat zur Trockne eingeengt, um 156 mg des gereinigten Produkts als Pulver zu ergeben. Schmp. I47-152°C. \a]'o -23,5° (c = 1, InHCI). Massenspektrometrie: m/e465. Dieses Produkt zeigte eine positive Reaktion gegenüber Sakaguchi-Reagens.

Beispiel 7
Synthese von (2S, 3R)-3-Amino-2-hydroxy-4-phenylbutanoyI-(S)-Ieucyl-(R)-leucin

(2S, SRJ-S-N-Benzyloxycarbonylamino^-hydroxy^-phenylhutsnoyHSHeucin (1,11 g) wurde mit 983,3 mg (R)-Leucinbenzylester-p-toluolsuIfonat umgesetzt und das erhaltene Kondensationsprodukt in der gleichen Weise wie in Stufe (a) des Beispiels 5 isoliert, um 1,39 g des 3-N-Benzyloxycarbonyl-geschützten Derivats des (2S, 3R)-3-Amino-2-hydroxy-4-phenylbutanoyl-(S)-!eucyl-(R)-Ieucins als Pulver zu ergeben. Dieses geschützte Produkt zeigte einen m/e-Wert von 646 bei der massenspektrometrischen Anal>se.

Dieses geschützte Produkt wurde der Hydrogenolyse mit Wasserstoff über Palladiummohr in dergleichen Weise wie in Stufe (b) des Beispiels 5 zwecks Schutzgruppenabspaltung unterworfen, um ein Rohpulver der Titel verbindung zu ergeben. Umkristallisieren dieses Pulvers aus Methanol lieferte 510 mg farblose, plättchenartige Kristalle. Schmp. 240-243⁰C. Massenspektrometrie: m/e422. Wenn dieses Produkt auf einer Kjeselgelplatte (Art. 5715 der Merck Co.) der KJeselgeldünnschichtchromatpgraphie unterzogen wurde, entwickelt mit einem Mischiösungsmittel aus Butylacetat/n-Buta'nöi/EssigsäuFe/Was'ser (4:4:1:1 Vol.), zeigte es einen Rf-Wert von 0,33. Das Isomerprodukt des Beispiels 5 (b) dagegen zeigte einen Rf-Wert von 0,39 bei der gleichen Kieselgeldünnschichtchromatograpnie wie oben.

Elcmentaranalyse für C₂₂Hj₅NjO₅:

her.: C 62,91, H 8,39, N 9,97%

gel".: C 63,10, H 8,09, N 9,70%

Beispiel 8
Synthese von (2S, 3R)-3-Amino-2-hydroxy-4-phenylbutanoyl-(S)-leucyl-(S)-gIutaminsäure

<f V-CH₂-CH-CH—CONH—CH-CONH —CH-COOH

IO

NH₂	OH	CH₁ I	CH, I
		I CH I	I CH₂
		(CH₃J₂	I COOH

f2S, 3R)-3-N-BenzyIoxycarbonylamino-2-hydroxy-4-phenylbutanoyl-(S)-leucin (442 mg) wurde mit 500 mg (S)-Glutaminsäure-benzylesier-p-toIuolsulfonat umgesetzt, und das anfallende Kondensationsprodukt wurde in der gleichen Weise wie in Stufe (a) des Beispiels 5 zu 667 mg des 3-N-Benzyloxycarbonyl-geEchützten Derivats der (2S, 3R)-3-N-Amino-2-hydroxy-4-phenylbutanoyl-(S)-Ieucyl-(S)-glutaminsäure isoliert, das einen /n/e-Wert von 662 (M + 1) bei der massenspektrometnschen Analyse lieferte. Dieses geschützte Produkt (200 mg) wurde in der gleichen Weise wie in Stufe (b) des Beispiels 5 zwecks Schutzgruppenabspaltung der T Vdrogenolyse unterzogen, urn 73 mg der Tiieiverbindung als farbloses Pulver zu ergeben. Schmp. 143-146'³C {a]]s -24,7° (c= 1,0, In HCl). Massenspektrometrie. /n/e438 (M + I).

Elementaranalyse für C_n H₅[N₁O₇:

25

ber.: C 57,64, H 7,16, N 9,61%
gef.: C 57,21, H 7,31, N 9,30%

Beispiel 9

Synthese von (3R)-N-[(2'S, 3'R)-3'-Amino-2'-hydroxy-4'-phenylbutanoyI)-(S)-leucyI]-amino-(2S)-2-hydroxy-4-phenyIbuttersäure

^—^ (R) (S) (S) (R) (S)

ζ CK₂ — CH — CH — CONH — CH — CONH — CH — CH — COOH

NH₂ OH CH₂

CH

(CHj)₂

(2S, 3R)-3-N-Benzyloxycarbonylamino-2-hydroxy-4-phenylbutanoyl-(S)-leucin (309 mg) wurde mit (2S, SRi-J-Arnino^-hydroxy^-phenylbuttersäure-benzylester-hydrochlorid (225 mg) umgesetzt und das erhaltene Kondensationsprodukt in der gleichen Weise wie in Stufe (a) des Beispiels 5 isoliert, um 440 mg des 3-N-Benzyloxycarbonylgeschützten Derivats der (3R)-N-[(2'S,3'R)-3'-amino-2'-hydroxy-4-phenylbutanoyl)-(S)-lcucyI]-amino-(2S)-2-hydroxy-4-phenylbuttersäure als farblose Nadeln zu ergeben. Schmp. 152-154°C, Masscnspektrometrie: m/el\0 (M+ 1).

Dieses N-geschützte Produkt (100 mg) wurde in der gleichen Weise wie in Stufe (b) des Beispiels 5 zwecks Schutzgruppenabspaltung der Hydrogenolyse unterzogen, um 67 mg eines rohen Pulvers der Titelverbindung zu ergeben. Umkristallisieren aus Methanol/Äthylacetat erg^b 42 mg farblose Nadeln. Schmp. 2I7-2I8°C. [a\h⁵ +17,0° (c = 1,0, In HCl). Massenspektrometrie: m/e4S6 (M+ 1).

55

Elementaranalyse Tür C₂₍,H,^N₃O₆ (MG: 485,64)

60 65

12

ber.:	C	64	,30,	H	7,28,	N	8,66%
gef:	C	64	,20,	H	7,33,	N	8,51%

Claims

Patentansprüche: 1. (2S, 3R)-3-Amino-2-hydroxy-4-phenyIbutansäure-amide und -peptide der allgemeinen Formel:

(R) (S) ,— CH CH-C —R³

"I i Il

NHR² OH

in der R¹ ein WasserstofTatom oder eine Hydroxygruppe und R² ein Wasserstoffatom oder eine Alkanoylgruppe mit 2 bis 7 Kohlenstoffatomen bedeuten und R³ eine der folgenden Gruppen ist:

15 (S)

-NH—CH-CH₂OH

CH₂

20 CH

CH₃ CH₃

25 (S) (S)

—NH — CH — CONH—CH—CHjOH

I I

CH₂ CH₂

I I

30 CH CH

CH₃ CH, CH₃ CH₃

35 (S) (S) oder (R)

— NH — CH — CONH — CH — COOH

CH₂ CH₂

⁴⁰ CH CH

CH₃ CH₃ CH₃ CH₃

45 (S) (S)

— NH-CH-CONH —CH-COOH

CH₂ (CH₂)₃

⁵⁰ CH NH

CH₃ CH₃ C = NH

NH₂

— NH- CH- CONH — CH-COOH

60 CH₂ CH₂

CH CH₂

CH₃ CH₃ COOH

— NH-CH-CONH —CH- CH-COOH

CH₂

CH

CH₃ CH₃

sowie deren pharmazeutisch annehmbare Additionssalze oder pharmazeutisch annehmbare Salze.
2. Arzneimittel, enthaltend wenigstens eine Verbindung gemäß Anspruch 1 zusammen mit pharmazeutisch annehmbaren Trägern und/oder Verdünnungsmitteln.