DE2518256C3

DE2518256C3 - Verfahren zur Herstellung von Peptiden

Info

Publication number: DE2518256C3
Application number: DE2518256A
Authority: DE
Inventors: Yoshikazu Tokio Isowa; Fukushima Koriyama; Katsumasa Kuroiwa; Takeshi Nagasawa; Koichi Narita
Original assignee: Nitto Boseki Co Ltd; Sagami Chemical Research Institute
Current assignee: Nitto Boseki Co Ltd; Sagami Chemical Research Institute
Priority date: 1974-04-24
Filing date: 1975-04-24
Publication date: 1980-11-06
Also published as: NL173183C; DE2518256A1; JPS5443076B2; FR2268792A1; JPS50140686A; FR2268792B1; NL7504254A; CA1046441A; DE2518256B2

Description

— A — B muß in der Formel (I) in der reaktiven Position vorliegen. Es können die verschiedensten Peptide eingesetzt werden, solange nur diese spezifische Partialstruktur vorliegt Die End-Gruppe der C-Komponente, d. h. die Aminogruppe in α-Position, muß durch eine Schutzgruppe für die Aminogruppe geschützt sein, z. B. durch eine Carbobenzoxygruppe (Z); eine substituierte Carbobenzoxygruppe, wie p-Methoxybenzyloxycarbonyl (pMZ); t-Butyloxycarbonyl (Boc) oder Tosyl (TOS) od. dgl.

Die Aminosäure oder das Peptid der Formel (II) (im folgenden als N-Komponente bezeichnet), welche bzw. welches als weiteres Ausgangsmaterial dient, muß in der reaktiven Position eine spezifische Aminosäure tragen, wie Phenylalanin, Leucin, Isoleucin, Tyrosin, S-Benzylcystein, O-Benzyl-serin, Tryptophan oder Methionin. Die endständigs Carboxylgruppe der N-Komponente muß duich eine Schutzgruppe für die Carboxylgruppe geschützt sein, z. B. in Form einer Estergruppe (Methylester, Äthylester, Benzylester, t-Butylester oder p-Nitrobenzylester); in Form einer Amidgruppe oder einer substituierten Amidgruppe, wie der 2,4,6-Trimethylbenzylamidgruppe (TMB), der Hydrazidgruppe oder einem Derivat derselben. Die N-Komponente kann in freier Form eingesetzt werden oder als Salz (vom Typ des Hydrochlorids, des Hydrobromids, des Trifluoracelats, des p-ToluoIsulfonats oder eines anderen anorganischen oder organischen Salzes).

Die N-Komponente und die C-Komponente können innerhalb des angegebenen Rahmens als Struktureinheiten des angestrebten Peptids ausgewählt werden. Die gewünschten Peptide können somit nach der Fragmentkondensationsmethode erhalten werden. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren können die beiden Komponenten (die C-Komponente und die N-Komponente) in äquivalenter Menge eingesetzt werden oder eine der Komponenten kann im Überschuß eingesetzt werden. Das Molverhältnis der N-Komponente zur C-Komponente liegt gewöhnlich im Bereich von 1 : 5 bis etwa 5 :1 und vorzugsweise im Bereich von 1 :2 bis etwa 2 :1.

Bei Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es bevorzugt, die N-Komponente in einem alkalischen Medium aufzulösen, welches als Alkali z. B.

ein Alkalimetallhydroxid oder ein Erdalkalimetallhydro- 45

xid enthalten kann. Es ist erforderlich, die Umsetzung in

einer Pufferlösung bei einem pH von etwa 2 bis etwa 6

und bei einer Temperatur von etwa 20 bis etwa 50⁰C durchzuführen. Als Pufferlösungen kommen Zitronen- berechnet (%) säure-Pufferlösung, Michaelis-Pufferlösung, Mcllvaine- 50 gefunden (%) Pufferlösung oder andere Pufferlösungen für den pH-Bereich von 2 bis 6 in Frage. Bevorzugt ist ein pH-Bereich von etwa 3 bis etwa 5 und optimal ist ein pH-Wert von etwa 4. Wenn die Temperatur unterhalb 20⁰C liegt, so bedarf es bis zur Vervollständigung der 55 I Imsetzung einer langen Zeitdauer. Wenn die Temperatur oberhalb 50⁰C liegt, so ist die Aktivität des Pepsins merklich herabgesetzt, und die Ausbeute ist gering. Die bevorzugte Temperatur beträgt 30 bis 40⁰C. Das erfindungsgemäß eingesetzte Pepsin ist ein Ver- 60 dauungsenzym vom Typ der Endopeptidasen. Pepsin mit einem Pepsintiter von 1:5000; 1:10 000 und 1 :60 000 kann leicht erhalten werden. Man kann auch Rohpepsin einsetzen, solange die Aktivität hoch ist. Pepsin wird in katalytischen Mengen eingesetzt. 55 Vorzugsweise verwendet man 0,4 bis 400 mg Pepsin pro lmmol der Ausgangsmaterialien. Die Umsetzung findet glatt in einem wäßrigen Medium statt oder in einem mit

Wasser mischbaren Medium, wie Methanol, Äthanol, Dioxan, Dimethylformamid. Das Produkt ist in Wasser oder in dem mit Wasser mischbaren Medium schwach löslich, und es fällt somit aus dem Reaktionssystem in Kristallform aus. Die ausgeschiedenen Kristalle werdeD abfiltriert und mit einer erwünschten schwach-alkalischen wäßrigen Lösung, schwach-sauren wäßrigen Lösung und Wasser gewaschen, wobei das reine Produkt erhalten wird. Die endständige Schutzgruppe der N-Komponente und die endständige Schutzgruppe der C-Komponente des Produkts werden, falls erwünscht, in herkömmlicher Weise entfernt

Im folgenden wird die Erfindung anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert

Beispiel 1
a) Fraginentkondensation
Eine Lösung von 0,753 g (1,5 mmol)
HCI · H-Phe-Gly-Leu-Met-NH₂

(Molekulargewicht 502,1) in 40 ml Zitronensäure-Pufferlösung (pH 4,0) wird zu einer Lösung von 1,26 g (2,5 mmoi)

Λ,ω-Boc-Lys-Phe-OH

(Molekulargewicht 505,6) in 5 ml IN NaOH gegeben, und dann gibt man 30 ml Wasser unter Rühren hinzu. Danach gibt man 0,2 g Pepsin (1 :5000) zu der Mischung (unter Rühren bei 40⁰C während 24 h), wobei die Umsetzung stattfindet. Der erhaltene weiße Niederschlag wird mit einem Glasfilter (G-3) abfiltriert und mit 5%igem Ammoniakwasser, 5%iger wäßriger Zitronensäurelösung und Wasser nacheinander gewaschen und dann unter vermindertem Druck bei 50⁰C über P2O5 getrocknet, wobei 1,25 g

α,ω - Boc- Lys-Phe-Phe-Gly- Leu-Met- NH₂

in einer Ausbeute von 88,2% erhalten werden (Fp. 207 bis 216° C (Zersetzung) und [«]·/ -38,8_x'c = 0,5 DMF)).

Elementaranalyse: (C₄₇H₇₂Oi₀N₈S; 941,210)

59 98
59,74

7,71
7,71

11,91
11,74

3,41
3,42

b) Abspaltung der Boc-Schutzgruppen

4,0 g
α,ω-Boc-Lys-Phe-Phe-Gly-Leu-Met-NH₂

werden in 100 ml Eisessig aufgelöst und HCl-Gas wird unter Rühren während 40 min eingeleitet, um die Schutzgruppe (Boc) zu entfernen. Nach der Umsetzung wird die Reaktionsmischung in 500 ml gekühlten Äther gegossen, wobei ein Niederschlag gebildet wird. Der Niederschlag wird abfiltriert und bei vermindertem Druck über NaOH getrocknet, wobei man 2,70 g

2 HCl · H-Lys-Phe-Phe-Gly-Leu-Met-NH₂

in einer Ausbeute von 78,0% erhält (Fp. 168 bis 170⁰C (Zersetzung); [«].-! 6,0 (c = 0,5 50% MeOH)).

Elementaranalyse: (C₃₇H₅₆O₆N₈S - 2 HCI -1 '/ι H₂O; 841,915)

H "N

Cl

berechnet (%) 52,97 7,04 13,31 3,52 8,66

gefunden (%) 52,84 7,33 13,33 3,81 8,42

40⁰C während 24 h umgesetzt, wobei 1,05 g pMZ-Gln-Phe-Phe-GIy-Leu-Met-NH₂

mit dem Schmelzpunkt 236 bis 237°C und [α],—22,8 (c = 1, DMSO) in einer Ausbeute von 77,5% erhalten werden.

IO Elementaranalyse: (C₄₅H₆₀OIoN₈S = 905,092)

Beispiel 2 Eine Lösung von 0,753 g(l,5 mmoi) HCl ■ H-Phe-GIy-Leu-Met-NH₂

(Molekulargewicht 502,1) in 40 ml Zitronensäure-Pufferlösung (pH = 4,0) wird zu einer Lösung von 1,0 g (2,5 mmol) pMZ-AIa-Phe-OH (Molekulargewicht 400,4) in 5 ml IN NaOH gegeben und dann gibt man noch 30 ml Wasser unter Rühren hinzu worauf man 0,2 g Pepsin (1 :5000) unter Rühren in einem Inkubator bei 40° C hinzugibt. Die Umsetzung findet während 24 h statt. Der erhaltene weiße Niederschlag wird abfiltriert und mit 5%igem wäßrigen NH4OH, 5%iger wäßriger Zitronensäurelösung und Wasser nacheinander gewaschen, und dann wird das Produkt bei vermindertem Druck bei 50° C über P₂O₅ getrocknet. Man erhält 1,14g

pMZ-Ala-Phe-Phe-Gly-Leu-Met-N^

mit dem Schmelzpunkt 229 bis 233" C in einer Ausbeute von 89,2% ([α] / -55,0 (c = 0,5 DMF)).

berechnet (%)
gefunden (%)

59,71
59,89

6,68 6,58

12,38 12,31

30 Beispiel 4 Gemäß Beispiel 1 werden 1 g(2,5 mmol)

pMZ-Ala-Phe-OH
(Molekulargewicht 400,4)und 0,93 g(l,5 mmol)

HCl · H-lle-Gly-Leu-Met-NHDmB (Molekulargewicht 618,2) umgesetzt, wobei 1,30 g pMZ-Ala-Phe-Ile-Gly-Leu-Met-NHDmB

mit dem Schmelzpunkt 225 bis 227° C und [«]. -25,4 (c= 1, DMF) in einer Ausbeute von 82,2% erhalten werden. Bei diesem Beispiel werden 0,4 g Pepsin eingesetzt. DmB bedeutet 2,4-Dimethoxybenzyl.

Elementaranalyse: (C₄₃H₅₇O₉S; 847,031) Elementaranalyse: (C₄₉H₆₉N₇O₁₁S; 964,192)

berechnet (%)
gefunden (%)

60,81
60,90

6,92 6,77

11,43 11,56

3,92 3,78

40 berechnet gefunden ( 61,04
61,17

7,21 7,35

10,17 10,09

3,33 3,33

Beispiel3

1,14 g (2,5 mmol) pMZ-GIn-Phe-OH (Molekulargewicht 457,5) und 0,75 g (1,5 mmol)

HCI · H-Phe-GIy-Leu-Met-NH₂

(Molekulargewicht 502,1) werden gemäß Beispiel 1 bei stellt. Beispiele5bis11

Gemäß Beispiel 1 werden 2,5 mmol der C-Komponente und 2,5 mmol der N-Komponente gemäß Tabelle ^! umgesetzt, wobei die entsprechenden Peptide erhalten werden. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammenge-

Tabelle 1

Bsp. C-Komponente

N-Komponente Produkt

5 α,ω-Boc-Lys-Phe-OH H-IIe-Gly-Leu-Met-NH₂

6 Boc-Ala-Phe-O'i desgl.

7 pMZ-Leu-Met-OH desgl.

8 Boc-Gly-Ala-Phe-OH desgl.

9 Boc-Gln-Gln-Phe-OH H-Phe-Gly-Leu-Met-NH₂

10 Boc-Ala-Phe-OH H-Phe-Gly-Leu-Met-NH₂

11 Boc-Pro-Ala-Phe-OH H-IIe-GIy-I.eu-Met-NH₂

ff,<y-Boc-Lys-Phe-Ile-Gly-Leu-Met-NH₂ Boc-Ala-Phe-IIe-Gly-Leu-Met-NHj pMZ-Leu-Met-Ile-Gly-Leu-Met-NH₂ Boc-Gly-Ala-Phe-IIe-Gly-Leu-Met-HN₂ Boc-GIn-Gln-Phe-Phe-Gly-Leu-Met-NH₂ Boc-AIa-Phe-Phe-Gly-Leu-Met-NH₂ Boc-Pro-Ala-Phe-IIe-Gly-Leu-Met-NH,

I	7 Tabelle l (Fortsetzung)	t , , ..;,_:,J ilL.yL,.!'.· ,iiÄlteji.. .-. ;	8	-26,6° (c = 0,5 DMF) C₁₆H₅₉N₇O₈A berechnet: 57,20 gefunden: 57,16	8,22 8,37	...._4l. ,.f,	S	und die Umsetzung durchgeführt. Der berechnet (%) mit einem Glasfilter gefunden (%)	C	II	N	*..„..am*	I
I^:	Bsp. Ausbeute Schmelzpunkt (%) ( C^-)	25 18 256	Optische Drehung [a]]) Elementaranalysc (%) C H	- 39,2° (c- = 0,5 DMF) C₃₉H₆₅N₇O₉S₃ berechnet: 55,76 gefunden: 55,58	• '/3 H₂O 7,96 8,05		3,53 3,41	66,30 66,23	6,28 6,23	7,48 7,53
i i e ; is		5 94,4 242 bis etwa 246 - 25,6° (c = 0,5 DMF) C₄₄H₇₄N₈Oi₀S berechnet: 58,26 gefunden: 58,29	- 30,0° (c = 0,5 DMF) C₃₈H₆₂O₉N₈S berechnet: 56,56 gefunden: 56,46	7,80 7,83	N	4,23 4,12	f
I i	6 63,3 231-238	-19,6°(f= 1 DMSO) C₄₆-H₆₈H₁₀O, berechnet: 55,97 cefunden: 55,90	7,74 7,78	12,25 12,24	7,63 7,84	I
I ; KS i»	7 96,9 247-250	-53,4° (C= 0,5 DMF) Ci₉IL₇O_xN₇S berechnet: 59,75 iiefunden: 59,49	,S-H₂O 7,15 7,10	12,97 12,80	3,97 4,12	5 I
l£ ft t	8 83,7 260 - 265	-45.3° (c = 0,5 DMSO) C₄,H„₆N_SO₉S- berechnet: 56.92 gefunden: 56,80	7,33 7,33	11,67 11,57	3,52 3,48	ί Ii fS
I ; l^:	9 62,0 249-252	7.92 7.68	13,88 13,57	4,09 4,18	P Ί
S 1 ΐί! i	10 47.9 240-245	14.19 14,21	3.71 3,46	S [
I	11 81.2 243-247	12,50 12,24	B e ι s ρ ι e 1 12 ^_c ^ _abfjltriert und mit 5%igem Ammoniakwasser und Fine Lösung von 0.539 g (2,5 inmol) r, danach mit Wasser gewaschen. Dann wird das Produkt HCl H Pl OCH unter vermindertem Druck getrocknet und aus Metha- ¹ nol umkristaHisiert. Man erhält (Molekulargewicht 215,67) in 40 TiI Zitronensäure-Puf- ..._ . , neu ferlösung (pH - 4,0) wird zu einer Lösung von 1,00 g pMZ.-AIa-Hne-Hne-UCH₃ (23tnmol) _M> mit dem Schmelzpunkt 189 bis 192° C und [α] -17,2 pMZ-Ala-Phe-OH ^(c = '.^DMF) i" einer Ausbeute von 59,3%. (Molekulargewicht 400.42) in 5 ml 1N NaOH gegeben Riementaranalyse: (C₃,H₃,N.,O₇:561,641)
	12,95 13,00	und dann gibt man noch 20 ml Wasser unter Rühren hinzu. Danach gibt man 0,2 g Pepsin (1 :5000) unter μ
		Rühren bei 40° C zu der Mischung, wird bei 40°C während 24 h erhaltene weiße Niederschlag wird

	C-Komponente	Aus- F. [a] beute (%) ( O	25 18 256	ί 10	H— Tyi—OCH₃	H—Phe—GIy-NH₂	a) b)	a) b)	a) b)	63.80 6.16 7.70 63.87 6.13 7.19	Produkt \
	pMZ—Ala—Phe—OH		Beispiele 13 bis 21		H —Cvs—OCH₃ S-BzI		18.8 158-163 -23,0° a) (c= 1 MeOH) b)	a)	a) b)	63.24 6.14 6.91 63.09 5.98 6.97	pMZ—Ala — Phe—Tyr— OCH₃ j
	pMZ—Ala —Phe—OH	der C-Komponente und 2,5 mmol der N-KLomponente gemäß der η Tabelle 2 zusammengestellt.	H-IIe-OCH₃	Elementaranalyse C i-i N	90.4 158-163 -14.6° (c= 1 DMF)	13.9 242-244 -14.8° a) (c= 0.5 DM F) b)		64.15 6.98 8.08 63.99 7.00 8.22	pMZ—Ala—Phe—CyS-OCH₃ \
			H —Ser—OCH₃ I	45.6 179-183 +3.7° a) (c= 0.5 DMF) b)	55.6 241-242 -36.P (C= 1 DMF)	52.9 228-230 -21.8° (C=IDMF)	64.96 6.30 7.10 65.09 6.45 7.41	S-BzI
	pMZ—Ala —Phe—OH	N-Komponente	OBzI	48.4 164-166 -27.8° a) (c= 0,5 DMF) b)	51.4 232-233 -34.1° (c= 1 DMF)	69.69 6.16 6.59 69.76 5.99 6.49	pMZ—Akt—Phe—He —OCH₃ \|
	pMZ—Ala—Phe—OH	HCl	OH —H — Phe— OBzI	7.0 170-175 -14.2° (c= 1 DMF)	Bemerkungen: BzI = Benzylgruppe; a) = ber. b) =gef.	65.92 6.27 10.25 65.64 6.23 10.14	pMZ—Ala—Phe—Sei—OCH₃ j
		HCl	H —Phe —NH₂	68.08 6.18 8.58 68.00 6.29 8.79	OBzI j
	pMZ—Ala —Phe—OH		• H —Phe—NHOBzI	64.16 6.28 12.47 63.93 6.29 12.29	pMZ—AIa-Phe—Phe—OBzI \
	pMZ—Ala —Phe—OH	HCI	2HBr-H-Phe—NHNH₂	63.69 6.18 11.60 63.43 6.14 11.43	pMZ—AIa-Phe—Phe—NH₂ '\|
	pMZ—Ala—Phe—OH	HCI	HCl		pMZ—Ala —Phe—Phe—NHOBzI i
	pMZ—Ala—Phe—OH				pMZ—Ala—Phe—Phe—NHNH₂ \|
	pMZ—Ala —Phe—OH	Tos·	pMZ—Ala—Phe—Phe—GIy-NH₂ \| f
	Tabelle 2 (Fortsetzung)	HBr	ί
	Bsp.	TFA	S Umkristallisiert aus \| Ϊ I
	13	DMF-MeOH-H₂O \
	14	5.28 MeOH \ 5.15 I ;fl
	15	Äthylacetat-Petroläther I
	16	AcOEt-Petroläther I
	17	DMF-Äther-Petroläther \| I
	18	DMF-MeOH-Äther \|
	19	DMF-MeOH-H₂O 1
	20	DMF-MeOH-Äther \|
	21	DMF-MeOH-Äther j







9



Gemäß Beispiel 12 werden 2,5 mmol Tabelle 2 umgesetzt. Die Ergebnisse sind i
Tabelle 2
Bsp.
13
14

15
16

17
18
19
20
21

Beispiel 22

Das Verfahren gemäß Beispiel 12 wird wiederholt, wobei 3OmI Wasser und 0,1g Pepsin (1:10 000) eingesetzt werden. Die Umsetzung erfolgt während 18 h. Man erhält

pMZ-Ala-Phe-Phe-OCH₃

mit dem Schmelzpunkt 189 bis 193° C in einer Ausbeute von 51,3%.

Beispiel 23

Das Verfahren gemäß Beispiel 12 wird wiederholt, wobei 30 ml Wasser eingesetzt werden. Die Umsetzung erfolgt während 18 h. Man erhält

pMZ - AIa -Phe-Phe- OCH₃

mit dem Schmelzpunkt von 187 bis 192⁰C in einer Ausbeute von 59%.

Beispiel 24

Das Verfahren gemäß Beispiel 22 wird wiederholt, wobei 0,2 g Pepsin (1 :1000) eingesetzt werden. Man erhält

pMZ - AIa - Phe - Phe - OCH₃

mit dem Schmelzpunkt 188 bis 193°C in einer Ausbeute von 65,8%.

Beispiel 25

Das Verfahren gemäß Beispiel 12 wird wiederholt, wobei 30 ml Wasser eingesetzt werden und wobei die Umsetzung während 10 h durchgeführt wird. Man erhält das gleiche Produkt in einer Ausbeute von 50,0%.

Beispiel 26 Eine Lösung von 2,5 mmol
HCl · H-Leu-Met-NH₂

in 40 ml Zitronensäure-Pufferlösung (pH = 4,0) wird zu einer Lösung von 2,5 mmol

pMZ-Ala-Phe-OH

in 5 ml 1N NaOH und dann gibt man 0,2 g Pepsin gemäß Beispiel 8 hinzu. Die Umsetzung findet bei 40° C während 24 h statt Der erhaltene weiße Niederschlag wird gemäß Beispiel 8 gewaschen und getrocknet und aus MeOH-H₂O imkristallisiert, wobei man 1,02 g

pMZ-AIa-Phe-Leu-Met-NH₂

mit dem Schmelzpunkt 218 bis 219°C und [a]?31,6 (C = 0,5, DMFj in einer Ausbeute von 63,3% efhäii.

Elementaranalyse: (C₃₂H₄₅N₅O₇S = 643,809) ferlösung gemäß Beispiel 12 wird zu einer Lösung von 1,50 g (3,75 mmol)

pMZ-Ala-Phe-OH

in 7,5 ml IN NaOH gegeben und dann gibt man noch 30 ml Wasser unter Rühren hinzu. Die Reaktion wird gemäß Beispiel 12 durchgeführt. Der erhaltene Niederschlag wird gewaschen und getrocknet und aus

DMF-MeOH-Et₂O
umkristallisiert. Man erhält 0,945 g

pMZ-Ala-Phe-Phe-Gly-NHNH₂

mit dem Schmelzpunkt 208 bis 210⁰C und der optischen Drehung [α]" —31,8 (c = 1, DMF) in einer Ausbeute von 61,2%.

Elementaranalyse: (C₃₂H₃₈N₆O₇-¹AH₂O = 624,701)

berechnet (%)
gefunden (%)

61,52
61,38

6,23 6,25

Beispiel 28 Eine Lösung von 2,5 mmol
HCl- H-Phe-OCH₃

in 40 ml Zitronensäure-Pufferlösung gemäß Beispiel 8 wird zu einer Lösung von 1,47 g (40 mmol)

pMZ-Ala-Leu-OH

(Molekulargewicht 366,4) in 5 ml INNaOH gegeben, und dann wird die Umsetzung gemäß Beispiel 26 durchgeführt. Der erhaltene Niederschlag wird gewaschen und getrocknet, und man erhält 0,302 g

pMZ - AIa - Leu - Phe - OCH₃

mit dem Schmelzpunkt 187 bis 191°C und der optischen Drehung [«]c?-18,0 (c = 0,5, DMF) in einer Ausbeute von 22,9%.

Elementaranalyse: (C₂₈H₃₇N₃O₇- '/3H₂O = 533,628)

kor^knsl (0ΙΛ

gefunden (%)

62,90

7,11 6,97

berechnet (%)
gefunden (%)

59,70
59,94

7,05 7,19

10,88 10,78

4,98 4,92

Beispiel 27

Eine Lösung von 0,995 g (2,5 mmol) 2HBr- H-Phe-Gly-NHNH₂ (Molekulargewicht 398,105) in 40 ml Zitronensäure-Puf-

Beispiel 29

Eine Lösung von 0,793 g(2,5 mmol) HBr · H-Phe-Gly-OCHj

^Molekulargewicht 317,18) in Zitronensäure-Pufferiösung gemäß Beispiel 8 wird zu einer Lösung von 1,50 g (3,75 mmol)

pMZ-AIa-Phe-OH

in 5 ml INNaOH gegeben, und dann gibt man noch 20 ml Wasser hinzu. Die Umsetzung wird gemäß Beispiel 8 durchgeführt Der erhaltene Niederschlag wird gewaschen, getrocknet und umkristallisiert, wobei

man 1,46 g

pMZ-Ala-Phe-Phe-Gly-OCHs

mit dem Schmelzpunkt 227 bis 229⁰C und der optischen Drehung [α]"—26,7 (c = 1, DMF) in einer Ausbeute von 94,9% erhält.

Elementaranalyse: (C₃₃H₃₅N₄O₈;618,693)

berechnet (%)
gerunden (%)

64,07
63,79

6,19 6,32

9,06 8,96

lcmentaranalyse: (C₂₇H₃₅N₃O₇S; 545,660)

berechnet (7..)
{!(Munden ("/..)

59,43
59,82

6,47 6,38

7,70 7J8

5,88 5,54

I lcmenlaranalyse: (C₃IH₄₂N₄O₈; 598,703)

IO

Beispiel 30 Gemäß Beispiel 28 wird die Umsetzung mit 4,0 mmol

pMZ-Ala-Met-OH
und 2,5 mmol

HC! · H-Phe-OCH₃
durchgeführt, wobei man 0,3413 g
pMZ-AIa-Met-Phe-OCH₃

mit einem Schmelzpunkt von 153 bis 167°C und der optischen Drehung [α]ί —17,4 (c = 0,5, DMF) in einer Ausbeute von 24,6% erhält.

Beispiel 32
Eine Lösung von 1,5 mmol
HCl · H-IIe-GIy-LeU-MeI-NH₂

(Molekulargewicht 468,1) in 40 ml Zitronensäure-Pufferlösung gemäß Beispiel 12 wird zu einer Lösung von 2,5 mmol

pMZ-Ala-Phe-OH

in 5 ml INNaOH gegeben, und die Umsetzung wird während 48 h bei 40⁰C in Gegenwart von 0,2 g Pepsin gemäß Beispiel 12 durchgeführt. Der erhaltene Niederschlag wird über P₂O₅ bei 6O⁰C während 18 h getrocknet, und man erhält 1,10 g

pMZ-AIa-Phe-Ile-Gly-Leu-Met-NH₂

mit dem Schmelzpunkt 253,5 bis 255°C und der optischen Drehung [α]?—42,4 (c = 1, AcOH) in einer Ausbeute von 90%.

25

Beispiel 33

Eine Lösung von 0,702 g (1,5 mmol)
HCl · H-He-GIy-Leu-MeI-NH₂

(Molekulargewicht 468,1) in 40 ml Zitronensäure-Pufferlösung gemäß Beispiel 12 wird zu einer Lösung von 1,15 g (2,5 mmol)

BOC - Asn - AIa - Phe - OH

(Molekulargewicht 450,5) in 5 ml INNaOH gemäß Beispiel 22 gegeben, und der Niederschlag wird mit 5%igem Ammoniakwasser, 5%iger wäßriger Zitronen-'säurelösung und Wasser nacheinander gewaschen und dann über P2O5 getrocknet, wobei man 1,052 g

BOC-Asn-AIa-Phe-He-GIy-Leu-Met-NHj

mit dem Schmelzpunkt 256 bis 260⁰C und [x]"- 36,2 AO (c= 0,5, DMF)in einer Ausbeute von 81,0% erhält.

Beispiel 31

Die Umsetzung gemäß Beispiel 28 wird wiederholt, wobei man 2,5 mmol

HCl - H-Phe-Gly-OEl
anstelle von

HCI-H-Phe-OCH₃

(2,5 mmol) einsetzt. Das Produkt wird mit 5%igem Ammoniakwasser gewaschen und dann mit Wasser gewaschen und dann über P2O5 getrocknet. Man erhält 0.8153 g

pMZ-AIa-Leu-Phe-GIy-OEt

mil dem Schmelzpunkt 175 bis 192°Cund der optischen Drehung [rx] - 23,4 (c = 0,5. DMG) in einer Ausbeute \ on 54.5%.

Elementaranalyse: (C_4nII₍,_sN.,OnS = 864,082)

berechnet (%)
gefunden (%)

55,60
55,43

7,58
7,69

14,59
14,31

M)

berechnet (%)
üclundcn (%)

62,19
62.06

7,07 7.01

9,36 9.20

Beispiel 34

Das Verfahren gemäß Beispiel 28 wird wiederholt, wobei man 1,32 g(2,5 mmol)

pMZ - GIn - AIa - Phe - OH
(Molekulargewicht 528,5)und 0,702 g(l,5mmol)

2 HCl -H -He-GIy-Leu-Met-NH₂
(Molekulargewicht 468,1) anstelle von

pMZ-AIa-Leu-OHundHCl-H-Phe-OCH₃ einsetzt. Man erhält 1,04 g
pMZ-Gln- AIa- Phe- lle-Gly -Leu-Met- NH₂

mit dem Schmelzpunkt von 258 bis 26O⁰C (Zersetzung) in einer Ausbeute von 74,5%.

	15	930,142)	25	18	256 16
Elementaranalyse:	(C₇₄H₆₇N₇O₁₁S =	N			Beispiel 37
	C H	13,55 13,49	S		Das Verfahren gemäß Beispiel 12 wird wiederholt, wobei 2,5 mmol
berechnet (%) gefunden (%)	56,82 7,26 56,56 7,16		3,45 3,25	5	pMZ-Ala-Phe-Ala-Phe-OH und 2,5 mmol
					HCl · H-Leu-Met-NH-DMB
	Beispiel 35		10	eingesetzt werden. Die Umsetzung erfolgt während

1,60 g (4 mmol) pMZ-AIa — Phe—OH werden in IN NaOH aufgelöst und andererseits werden 0,54 g (2,5 mmol) HCl · H-Phe-OCH₃ jeweils in40 ml Zitronensäure-Pufferlösung mit verschiedenen pH-Werten aufgelöst Beide Lösungen werden jeweils vermischt und mit 30 ml Wasser versetzt und danach mit 0,2 g Pepsin gemäß Beispiel 12, und die Mischung wird bei 40° C während 24 h uragesetzL Der erhaltene Niederschlag wird mit 5%igem Ammoniakwasser und danach mit 5°/oiger wäßriger Zitronensäurelösung und dnach mit Wasser gewaschen, und das Produkt wird über P₂O₅ bei 50° C getrocknet, wobei man

pMZ-Ala-Phe-Phe-OCH₃

erhält. Die nachstehende Tabelle 3 zeigt die Ausbeuten und den pH-Wert der eingesetzten Zitronensäure-Pufferlösung.

Tabelle 3

14 h. Man erhält
pMZ-Ala-Phe-Ala-Phe-Leu-Met-NH-DmB

mit einem Schmelzpunkt von 250 bis 268° C und [α] -21,0 (c= 0,4, DMF) in einer Ausbeute von 70%.

pH	Ausbeute Fp. (%) ( <■)	170-173 185-189 186-189 189-190	la] (ί·= 1,DMF)
2,38 3,28 4,08 5,02	61,1 74,6 99,9 64,0	Beispiel 36	-18,4° -16,7° -18.0° -17,2°

Beispiel 38

Das Verfahren gemäß Beispiel 12 wird wiederholt, wobei 2,5 mmol

pMZ-AIa-Phe-AIa-Phe-OH
und 2,5 mmol

HCl-H-IIe-GIy-OEt
während 9 h umgesetzt werden. Man erhält

pMZ - AIa - Phe - AIa - Phe - He - GIy - OEt

mit dem Schmelzpunkt 248 bis 252⁰C in einer Ausbeute von 63%.

Beispiel 39

Eine Lösung von 0,216 g (10 mmol)
HCl-H-Phe-OCH₃

(Molekulargewicht 215,5) in 40 ml Zitronensäure-Pufferlösung (pH = 4,0) wird zu einer Lösung von 0,495 g (10 mmol)

Z-Pro-Val-Phe-OH

Eine Lösung von 2 mmol
2 HBr ■ H-Phe-Gln-NHNH₂

in 40 ml Zitronensäure-Pufferlösung (pH = 4,0) wird zu einer Lösung von 3,75 mmol

pMZ-Ala-Tyr-OH

in IN NaOH gegeben, und dann gibt man noch 0,2 g Pepsin bei 25⁰C während 48 h zu der Mischung, und die Umsetzung erfolgt gemäß Beispiel 8, wobei man

pMZ-Ala-Tyr-Phe-Gln-NHNH₂

mit dem Schmelzpuhkt 245 bis 248° C (Zersetzung) und [(x]»-^ (c = 1, DMSO) in einer Ausbeute von 57,8% erhält.

(Molekulargewicht 495) in 10 ml INNaOH gegeben, und dann gibt man noch 30 ml Wasser unter Rühren hinzu und dann 0,1 g Pepsin (1 :10 000). Die Mischung wird während 24 h bei 4O⁰C unter Rühren umgesetzt. Der erhaltene weiße Niederschlag wird mit einem Glasfilter (G-3) abfiltriert und mit 5%igem Ammoniakwasser, 5%iger wäßriger Zitronensäurelösung und Wasser nacheinander gewaschen, und dann wird das Produkt unter vermindertem Druck bei 50"C über P₂Os getrocknet, wobei man 0,244 g

Z - Pro - VaI - Phe - Phe - OCH₃

mit dem Schmelzpunkt 199 bis 201⁰C und [α] -33,2 (c = 1, DMF) in einer Ausbeute von 37,2% erhält.

Elementaranalyse: (C₃₅H₄₅N₇O₈-H₂O = 752,806)

berechnet (%)
gefunden (%)

57,92
57,98

6,52
6,35

13,52 13,54

Beispiel 40

Eine Lösung von 0,216 g(lOmmol)

HCl- H-Phe-OCH₃
(Molekulargewicht 215,5) in 40 ml Zitronensäure-Puf-

030 245/214

ferlosung(pH = 4,0) wird zu einer Lösung von 0,421 g BOC-GIy-Val-Phe-OH

(Molekulargewicht 421) in 10 ml INNaOH gegeben, und dann gibt man noch 30 ml Wasser unter Rühren hinzu. Sodann gibt man zu der Mischung unter Rühren in einem Inkubator bei 40⁰C 0,1 g Pepsin (1 ; 10 000), und die Umsetzung erfolgt während 24 h. 0,414 g

BOC-GIy- VaI-Phe-Phe-OCH₃

Beispiel 42 Beispiel 43 Beispiel 44

10

mit dem Schmelzpunkt 193 bis 196°C und [α]?-14,8 (c = 1, DMF) in einer Ausbeute von 71,2% werden erhalten.

Beispiel 41

Das Verfahren gemäß Beispiel 39 wird wiederholt, wobei das Molverhältnis

Z-Pro-VaI-Phe-OH zu HCl ■ H-Phe-OCH₃

mit 2 :1 gewählt wird. Man erhält 0,297 g des Produkts gemäß Beispiel 39 in einer Ausbeute von 51 %.

30

Das Verfahren gemäß Beispiel 40 wird wiederholt, wobei Weinsäure-Pufferlösung (pH = 4) anstelle von Zitronensäure-Pufferlösung eingesetzt wird. Man erhält 0,426 g des Produkts gemäß Beispiel 40 in einer Ausbeute von 73,3%.

40

Das Verfahren gemäß Beispiel 40 wird wiederholt, wobei man Dinatriumhydrogenphosphat-Pufferlösung (pH = 4) anstelle der Zitronensäure-Pufferlösung einsetzt. Man erhält 0,396 g des Produkts gemäß Beispiel 40 in einer Ausbeute von 68%.

50

Das Verfahren gemäß Beispiel 39 wird wiederholt, wobei man 0,2 g Pepsin (1 :5000) einsetzt. Die Umsetzung wird während 20 h durchgeführt. Man erhält 0,230 g des Produkts gemäß Beispiel 35 in einer Ausbeute von 35%.

60

Beispiele 45 bis 65

Das Verfahren gemäß Beispiel 39 wird wiederholt, wobei 10 mmol der C-Komponente und 10 mmol der N-Komponente gemäß Tabelle 4 eingesetzt werden und wobei die entsprechenden Peptide erhalten werden. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 zusammengestellt.

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Ί Beispiel 66

3

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Q

Ι EineLösungvonO,47g(10mmol)

H

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On

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I (Molekulargewicht 468,1) in 40 ml Zitronensäure-Puf-

5

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59;

5—248

I ferlösung wird zu einer Lösung von 0,38 g (10 mmol)

Ό
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0—216

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OO
J

1 pMZ—Ala—Glu—OH

3 's

CS

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O

OO

1

S

65,

§

I (Molekulargewicht 382,4) in 10 ml IN NaOH gegeben,

I und dann gibt man noch 30 ml Wasser unter Rühren

15

5 hinzu. Dann gibt man 0,1 g Pepsin (1 :10 000) unter

S Rühren bei 40⁰C während 24 h zu der Mischung. Der

jj erhaltene weiße Niederschlag wird mit einem Glasfilter

η?

I (G-3) abfiltriert und mit 5°/oigem Ammoniakwasser und

8

3?

33

3?

Ü dann mit 5%iger wäßriger Zitronensäurelösung und

20

ι
ν
J=

ι

U
O
I

f

I dann mit Wasser gewaschen, und dann wird das Produkt

α.
I

-GIy-

υ

1 über P₂O₅ unter vermindertem Druck bei 50⁰C

I

ι

(Ί
33

I
'S

ι

§ getrocknet, wobei man 0,48 g

1_§

Leu-

U
O
I

I

U

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5

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33
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I pMZ—Ala—Glu—lie—Gly—Leu —Met—NH₂

25

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30

3
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I
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I
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I (c = 0,5, DMF) in einer Ausbeute von 60,3% erhält. Die

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-Ali

O.

■Ali

δ

I Elementaranalyse des Produkts entspricht innerhalb der

Dh

I

N

I

δ

I Toleranz dem theoretischen Wert.

S

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35

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D.

N

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3?

I Beispiel 67

-Phe-

U
O
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I Das Verfahren gemäß Beispiel 66 wird wiederholt,

I
33

-NH;

ö

-Met-

I wobei das Molverhältnis

-Met-

-Met-

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ΐ pMZ—Ala —Glu—OH

40

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33

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ί zu HCl · H —He-Gly —Leu—Mel—NH₂

45

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Ό
33

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33

-Phe-

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33

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33

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33

mit 2 :1 gewählt wird. Man erhält 0,68 g des Produkts

50

O

ΰ

g

Ö
33

ö
33

gemäß Beispiel 66, in einer Ausbeute von 85,3%.

'he-

33

Beispiel 68

I '■τ

O

Das Verfahren gemäß Beispiel 67 wird wiederholt,

55

I £Η
I

rp—

; wobei Dinatriumhydrogerlphosphat-Zitronensäure-Puf-

33

! ferlösung (pH = 4) anstelle der Zitronensäure-Pufferlö

B

α.

O

—AIa-

O

O
I

sung eingesetzt wird. Man erhält das Produkt gemäß

1
O
I

I
α

rp—

N

Ja

υ ·

O
I

• Beispiel 67 in einer Ausbeute von 84%.
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O

S

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I

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cd
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I

3Iu-Pl

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i Das Verfahren gemäß Beispiel 66 wird wiederholt,

rf.

N

CS

N

I

i wobei 10 mmol der C-Komponente und 10 mmol der

Bsi

CL

D.

N

M-Komponente gemäß Tabelle 5 eingesetzt werden.

65

Man erhält die entsprechenden Peptide. Die Ergebnisse

O

cn

V-I

ί sind in Tabelle 5 zusammengestellt.

23

Eine Lösung von 2 mmol

Z(OMe) - AIa - Asp - OH wird gemäß Beispiel 1 mit 1 mmol

H · He-GIy-Leu-Met-NH₂

Beispiel 76

bei pH 4,0 und 40° C während 24 h in Gegenwart von Pepsin umgesetzt. Man erhält

Z(OMe)- Ala- Asp-He-GIy-Leu-Met-NH₂

mit einem Schmelzpunkt von 280°C (Zersetzung) in einer Ausbeute von 17%.

Claims

Patentanspruch:

Verfahren zur Herstellung von Peptiden der allgemeinen Formel

X-A-B-C-Y,

in der die Symbole A, B, C, X und Y folgende Bedeutungen haben:

A: Ala, GIn, Asn, ω-tert-Butoxycarbonyl-Lys, Leu, GIy, GIu, GIu(OCH₃), Pro oder Ai-A₂, wobei A, dieselben Bedeutungen wie A hat und A2 VaI, Met, Leu oder GIn bedeutet,

B: Phe, Tyr, Leu, Met, GIu, Asp, Asn oder Trp,

C: Phe, Leu, He, Tyr, Cys-(S-Benzyl), Ser-(O-Benzyl), Trp oder Met,

X: eine cc-Amino-Schutzgruppe, ein N-terminal eine Schutzgruppe tragender Aminosäurerest oder ein N-terminal eine Schutzgruppe tragender Peptidrest,

Y: eine Carboxyl-Schutzgruppe, ein C-terminal eine Schutzgruppe tragender Aminosäurerest oder ein C-terminal eine Schutzgruppe tragender Peptidrest,

dadurch gekennzeichnet, daß man ein Peptid der allgemeinen Formel

X-A-B-OH

mit einer Aminosäure oder einem Peptid der allgemeinen Formel

M-C-Y

in Gegenwart des Enzyms Pepsin in wäßrigem Medium bei 20 bis 50°C in einer Pufferlösung von pH 2 bis 6 umsetzt.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Peptiden der allgemeinen Formel

X-A-B-C-Y,

in der die Symbole A, B, C, X und Y folgende Bedeutungen haben:

A: Ala, GIn, Asn, ω-tert-Butoxycarbonyl-Lys, Leu, GIy, GIu, GIu(OCHj), Pro oder A₁-A₂, wobei A, dieselben Bedeutungen wie A hat und A₂ VaI, Met, Leu oder GIn bedeutet,

B: Phe, Tyr, Leu, Mel, GIu, Asp, Asn oder Trp,

C: Phe, Leu, He, Tyr, Cys-(S-Benzyl), Ser-(O-Benzyl), Trp oder Met,

X: eine a-Amino-Srhutzgruppe, ein N-terminal eine Schutzgruppe tragender Aminosäurerest oder ein N-terminal eine Schutzgruppe tragender Peptidrest,

Y: eine Carboxyl-Schutzgruppe, ein C-terminal eine Schutzgruppe tragender Aminosäurerest oder ein C-terminal eine Schutzgruppe tragender Peptidrest,

und ist dadurch gekennzeichnet, daß man ein Peptid der allgemeinen Formel

X-A-B-OH

mit einer Aminosäure oder einem Peptid der allgemeinen Formel

H-C-Y
in Gegenwart des Enzyms Pepsin in wäßrigem Medium bei 20 his 50⁰C in einer Pufferlösung von pH 2 bis 6 umsetzt

Es sind in jüngster Zeit verschiedenste Peptide mit physiologischer Aktivität untersucht worden, und es besteht ein großes Interesse, solche Peptide zu synthetisieren. Typische herkömmliche Verfahren zur Peptidsynthese sind die Azidmethode; die mit gemischten Säureanhydriden arbeitende Methode; die Dicyclohexyl-carbodiimidmethode und die mit aktivem Ester arbeitende Methode. Bei den herkömmlichen Verfahren treten jedoch verschiedenste Schwierigkeiten auf, z. B. Racemisierungen, Nebenreaktionen, kompliziert 5 Temperatursteuerung, lange Reaktionsdauer usw. Insbesondere bei der Methode der Fragmentkondensation fällt der Nachteil der nicht-vermeidbaren Racemisierung stark ins Gewicht. Das Racemisierungsproblem ist bei Peptid-Synthesen allgemein schwerwiegend. Wenn Racemisierung eintritt, so ist die Reinheit des gebildeten Produkts herabgesetzt, und die Abtrennung des verunreinigenden Isomeren ist mit großen Schwierigkeiten verbunden und bei der industriellen Durchführung des Verfahrens nachteilig.

Neben den rein organisch-chemischen Verfahren sind bereits Peptidsynthesen bekannt, bei denen das Enzym Papain eingesetzt wird (zum Beispiel O. K.. Behrens und M. Bergmann; J. Biol. Chem., 129, 587 [1939], und H. B. Milne und Warren Kolday; J. Org. Chem., 30,64 [1965]). Der hier verwendete Ausdruck »Peptid« folgt der Definition von Harry D. Law; »The Organic Chemistry of Peptides« (Wiley, Interscience 1970), Seite 6. Es ist bevorzugt, Peptide (einschließlich Polypeptide und Oligopeptide) als Ausgangsmaterial einzusetzen, welche in dem Medium eine mindestens geringe Löslichkeit aufweisen, da Peptide ohne Löslichkeit in dem Medium inaktiv sind. Der Ausdruck »Papain« und insbesondere der Papaintker sind in Anson, M.; »]. Gen. Physiol.«, Band 22, Seite 79,1938, erläutert. Mit diesem bekannten Verfahren wird das Racemisierungsproblem gelöst. Es werden jedoch nur Di-peptide oder Tri-peptide erhalten.

Bei der Synthese von Tetra-peptiden oder höheren Peptiden unter Verwendung von Papain mit verschiedener Substratspezifität treten Nebenreaktionen ein (Hydrolyse des Peptids; Transpeptidisierung; Bildung von Plastein). Daher eignet sich dieses Verfahren nicht zur industriellen Peptid-Synthese.

Den Erfindern ist es nun gelungen, Polypeptide und insbesondere höhere Peptide als Tri-peptide durch Verwendung des Enzyms Pepsin herzustellen, das zu den proteolytischen Enzymen und speziell zu den Endopeptidasen gehört. Es wurde festgestellt, daß Pepsin sich zur Synthese von Peptiden eignet und bei einfacher Arbeitsweise zu hohen Ausbeuten führt. Insbesondere eignet sich das erfindungsgemäße Verfahrein für die Methode der sequentiellen Peptidsynthese und für die Methode der mit Fragmentkondensation arbeitenden Peptidsynthese.

Gegenüber der sequentiellen Methode weist die Fragmentkondensationsmethode erhebliche Vorteile auf. Das erfindungsgemäße Verfahren ist nun insbesondere von Bedeutung für die Fragmentkondensationsmethode.

Bei der erfindungsgemäßen Peptidsynthese wird ein Peptid der Formel (I) (im folgenden als C-Komponente

b5 bezeichnet) als Ausgangsmaterial eingesetzt. Die C-Komponente muß eine Partialstruktur haben, bei der zwei oder drei spezifische Aminosäuren in spezifischer Verknüpfung kondensiert sind, d. h., die Bindung