DE2305727A1

DE2305727A1 - Pentapeptide und ihre verwendung als psychopharmaka

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Publication number: DE2305727A1
Application number: DE2305727A
Authority: DE
Inventors: Hendrik Marie Greven; David De Prof Dr Wied
Original assignee: Akzo NV
Current assignee: Akzo NV
Priority date: 1972-02-08
Filing date: 1973-02-06
Publication date: 1973-08-16
Also published as: FR2171188A1; DE2305727C2; JPS4891031A; ZA73585B; JPS595578B2; NL7201604A; HU169156B; NL175293B; US3835110A; GB1417318A; FR2171188B1; CH591428A5; NL175293C; SE392612B; CA1010022A

Description

betreffend
Pentapeptide und ihre Verwendung als Psychopharmaka

Die Erfindung betrifft Peptide mit psychopharmakologischen Eigenschaften.

Aus Neuropharmacol 157» 4-, (1965), ist es bekannt, daß bei Ratten, denen die Hypophyse oder anschließend ein Lungenlappen entfernt worden ist, das Nonapeptidderivat (Lys)-vasopressin-zink-tannat bestimmte psychopharmakologische Eigenschaften besitzt. Dieses Nonapeptid führte spezifisch zu einer Hemmung der Auslöschung der anlagebedingten Ausv/eichreaktion (avoidance response). Die sehr stark blutdruckerhöhende Wirksamkeit von Vasopressin und dessen funktionellen Derivaten sind jedoch eine sehr unerwünschte Nebenwirkung.

Überraschenderweise hat es sich jetzt gezeigt, daß Pentapeptide der allgemeinen Formel:

H-L-Cys-L-Tyr-L-Phe-L-Glu(X)-L-Asp(X)-OH I

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— 2. —

42

in der X eine Hydroxy- oder Aminogruppe bedeutet oder deren Dimere, die aus dem Pentapeptid durch. Oxidation erhalten werden (S-S Brückexibildung) sowie dessen funktioneile Derivate, die Auslöschung der anlagebedingten. ^{Ausweicllreakt}mxndestens ebenso stark hemmen aber eine geringere blutdruckerhöhende Wirkung besitzen»

Die erfindungsgemässen Peptide werden nach einem Verfahren hergestellt wie es üblicherweise zuv Herstellung derartiger Verbindungen angewandt wird«, Die am häufigsten für die Herstellung der erfindungsgemässen Verbindungen angewandten

,_ _ , können,, ., , _o ^j.-.

Verfahren iolgendermaßen zusammengefasst werden:

a) Kondensation einer Verbindung (Aminosäure, ^ Tnit einer freien Carboxylgruppe _s bei der die anderen reaktionsfähigen Gruppen geschützt sind, mit einer Verbindung (Aminosäure, ^ mit einer freien Araiaogruppe, bei der ebenfalls die anderen reaktionsfähigen Gruppen geschützt sind, in Gegenwart eines Kondensationsaittels^

b) Kondensation einer Verbindung (Aminosäure, -^P^Sdit einer aktivierten Carboxylgruppe und gegebenenfalls geschützten anderen reaktionsfähigen Grappea mit einer Verbindung (Aminosäure» ~^ep mit einer feeiea HHg-Gruppe und geschützten anderen reaktionsfähigen Gruppen,

c) Kondensation einer Verbindung (Aminosäure, ^eP^t;:Löinit einer freien Carboxylgruppe und geschützten anderen reaktionsfähigen Gruppen mit"eine? Verbindung (Aminosäure, Peptid) mit einer aktivierten Aminogruppe und gegebenenfalls geschützten anderen reaktionsfälligen Gruppen» wobei gegebenenfalls anschließend die Schutagrappen ©ntfemt werden.

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Die Aktivierung der Carboxylgruppe kann erreicht werden, z.B. durch Umwandlung der Carboxylgruppe in eine Säurehalogenid-, Acid_T Anhydrid- oder Imidazolidgruppe oder eine aktivierte Estergruppe, wie die N-Hydroxysuccinimidestergruppe und die p-Nitrophenylestergruppe.

Die Aminogruppe kann aktiviert werden durch Umwandlung in ein Phosphat amid oder nach der "Phosphor-azo"-Methode.

Die üblichen Verfahren für die oben angegebenen Kondensationsreaktionen sind: Das Carbodiimidverfahren, das Azidverfahren, das gemischte Anhydridverfahren und das Verfahren der aktivierten Ester (E. Schröder und K. Lübke in "The Peptides", Bd. I, 1965 (Academic Press)). Ferner kann Merrifield's "Feste Phasenmethode" (J. Am. Chem. Soc. 8j?, 2149 (1963)) zur Herstellung der erfindungsgemäßen Peptide und Peptidderivate angewandt werden.

Die reaktionsfähigen Gruppen, die nicht an der Kondensationsreaktion teilnehmen sollen, werden wirksam geschützt durch die sogenannten Schutzgruppen, die leicht wieder entfernt werden können, z.B. durch Hydrolyse oder Reduktion. So kann z. B. eine Carboxylgruppe wirksam geschützt werden durch Veresterung mit Methanol, Äthanol, tert.-Butanol, Benzylalkohol oder p-Nitrobenzylalkohol oder durch Umwandlung in ein Amid. Diese zuletztgenannte Schutzgruppe kann jedoch nur sehr schwer entfernt werden, so daß es empfehlenswert ist, diese Gruppe nur zu verwenden, um die Carboxylgruppe der Aminosäure mit endständigem C-Atom in dem letzten Peptid zu schützen. In diesem Falle führt die Peptidsynthese direkt zu dem Amid des Peptide der allgemeinen Formel I.

Gruppen, die zum wirksamen Schutz einer Aminogruppe geeignet sind, sind üblicherweise Säuregruppen z.B. eine Säuregruppe, die abgeleitet ist von einer aliphatischen, .aromati-

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sehen, araliphatischen oder heterocyclischen Carbonsäure, wie der Essigsäure,Benzoesäure, Pyridincarbonsäure oder eine Säuregruppe, die abgeleitet ist von Kohlensäure wie eine Äthoxycarbonyl, Benzyloxycarbonyl- tert.-Butyloxycarbonyl oder p-Me thyloxybenzyl oxy Carbonyl gruppe oder eine Säuregruppe, die

die abgeleitet ist von einer SuIf onsäure wie p-Benzolsulf onyl- oder p-Toluolsulfonylgruppe. Es können jedoch auch andere Gruppen angewandt werden wie substituierte oder unsubstituierte Aryl- oder Aralkylgruppen z.B. Benzyl- und Triphenylmethylgruppen oder Gruppen wie die ortho- Mitro-phenylsulfenyl oder 2-Benzoyl-1-methylvinylgruppe.

Die Mercaptogruppe des Cysteine kann z.B. wirksam geschützt werden durch Acylierung oder (Ar)-Alkylierung. Zum Schutz der Mercaptogruppe häufig angewandte Acylgruppen sind die Acetyl- und Benzylgruppe. ( Ar )-Alkyl gruppen, die häufig angewandt werden, sind die tert.-Butylgruppe, die Benzyl^ p-Hitrobenzyl- und Tritylgruppe. Es ist auch möglich, die Acetamido-methylgruppe zum zeitweiligen Schutz der Thiolfunktion zu verwenden. Obwohl es nicht unbedingt notwendig ist, kann es manchmal empfehlenswert sein, die Hydroxylgruppe von Tyrosin ebenfalls zu schützen. Diese Gruppe wird vorzugsweise durch eine tert.-Butylgruppe geschützt.

Die Schutzgruppen können nacheinander oder gleichzeitig durch verschiedene übliche Verfahren entfernt werden, je nach der Art der betreffenden Gruppe, z.B. mit Trifluoressigsäure oder HF oder durch milde Reduktion, z.B. mit Wasserstoff und einem Katalysator wie Palladium oder mit HBr in Eisessig usw.

Das (iuonomere) Peptid kann gegebenenfalls durch Oxidation der Mercaptogruppen von zwei monomeren Peptidmolekülen zu einem Disulfid in das Dimere umgewandelt werden. Diese Oxidation wird nach einem Verfahren durchgeführt, wie es üblicherweise für ähnliche derartige Oxidationen ,angewandt wird, z.B. durch Oxi-

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dation mit Kaliumferrocyanid, Jod oder Äthyldio'odid oder durch Oxidation mit Luft oder Sauerstoff in Wasser oder flüssigem Ammoniak. Üblicherweise wird diese Oxidation mit einem Peptid durchgeführt, von dem zumindest die Schutzgruppen am Schwefelatom entfernt sind. Wenn eine geeignete Schutzgruppe am Schwefelatom gewählt worden ist, ist es jedoch möglich, die Oxidation an dem noch am Schwefelatom geschützten Peptid durchzuführen. Z.B. wird bei Behandlung eines S-Tritylpeptids mit Jod in einem geeigneten Lösungsmittel wie Methanol, die Tritylgruppe abgespalten und die entstehende SH-Gruppe gleichzeitig zu einer Disulfidbrücke oxidiert.

Unter funktioneilen Derivaten der erfindungsgemässen Peptide und Dimere sind zu verstehen:

1. Pharmazeutisch geeignete Säureadditionssalze der Peptide;

2. Peptide, bei denen eine oder mehrere freie Aminogruppen ersetzt sind durch eine Acylgruppe, die abgeleitet ist von einer aliphatischen Carbonsäure mit 1-6 Kohlenstoffatomen, besonders eine Acetylgruppe;

3. unsubstitüierte Amide oder alkylsubstituierte Amide der Peptide, wobei die Alkylgruppe 1-6 Kohlenstoffatome besitzt, wie eine -NHCH,, N(CEU)₂ oder -N(C₂H,-)₂-Einheit;

4. Ester der Peptide, die abgeleitet sind von aliphatischen oder araliphatischen Alkoholen mit 1-18 Kohlenstoffatomen, wie Methanol, Äthanol, Pentanol, Hexanol, Cyclohexanol, Octylalkohol, Undecylalkohol, Hexadecylalkohol, Oleylalkohol, Octadecylalkohol, Benzylalkohol, Phenyläthylalkohol, Phenylpropylalkohol oder Cinnamylalkoholi

5. Metallkomplexe, die gebildet worden sind, indem man die Peptide zusammenbringt mit einem wenig löslichen Salz, Hydroxid oder Oxid eines Metalls, vorzugsweise von Zink, oder ein Gemisch der erfindungsgemässen Peptide mit einer

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polymeren Substanz wie Gelatine, um eine verlängerte Wirksamkeit zu erreichen.

Die Säureadditionssalze werden erhalten durch Umsetzung der erfindungsgemässen Peptide mit einer pharmazeutisch geeigneten Säure wie einer Halogenwasserstoff säure, Phosphorsäure, Essigsäure, Maleinsäure, Weinsäure oder Zitronensäure.

Wie oben schon kurz gesagt, besitzen die erfindungsgemässen Peptide und deren funktioneile Derivate wertvolle psychopharmakologische Aktivitäten. Die erfindungsgemässen Peptide hemmen die Auslöschung der anlagebedingten Ausweichreaktion. Das bedeutet, daß sie allgemein als anti-depressive Mittel angewandt werden können«, Besonders können sie angewandt werden zur Behandlung bestimmter Geistesstörungen_t wobei eine Stimulation der geistigen Reaktion (mental performance) erwünscht ist, wie bei bestimmten Arten von Sfeurose und "bei Altersschwäche (Senilität)«

Die erfindungsgemässen Peptide und die oben angegebenen Derivate können oral, parenteral oder transnasal verabreicht werden. Vorzugsweise werden die Peptide als Jnjektionszubereitung angewandt, wofür sie in einer geeigneten Flüssigkeit gelöst, suspendiert oder emulgiert werden., Aber im Gemisch mit geeigneten Hilfsmitteln und Füllstoffen können sie auch in einer Form hergestellt werden, die zur oralen Verabreichung geeignet ist wie als Pillen, Tabletten oder Dragees« Die erfindungsgemässen Peptide können auch in Form von Suppositorien oder Sprays verabreicht werden.

Die Peptide werden vorzugsweise in täglichen Dosen von 0,001 bis 1 mg/kg Körpergewicht verabreicht, ge nach der Form, in der sie verabreicht werden. Besonders günstige Zubereitungen werden erhalten, wenn die erfindungsgemässen Peptide in einer Form zubereitet werden, in der sie eine längere Wirksamkeit

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besitzen, z.B. eingebaut in Gelatine oder vorzugsweise in Form von Metallkomplexen. Diese Metallkomplexe können erhalten werden, indem man die Peptide mit schwer löslichen Metallsalzen, Metallhydroxiden oder Metalloxiden zusammenbringt. Als schwerlösliche Metallsalze werden üblicherweise die Metallphosphate, Met allpyrophosphat e und Metallpolyphosphate verwendet.

Metalle, die für dieses Verfahren angewandt werden können, sind die Metalle, die zu den b-Gruppen des Periodensystems gehören,. z.B. Cobalt, Nickel, Kupfer, Eisen und vorzugsweise Zink sowie die Metalle, die zu den Hauptgruppen des Periodensystems gehören und Komplexe bilden können, wie Magnesium und Aluminium.

Die Herstellung dieser Metallkomplexe findet auf die übliche Weise statt. Sie können erhalten werden durch Zugabe des Peptide und eines schwerlöslichen Metallsalzes, Metallhydroxids oder Metalloxids zu einem wässrigen Medium. Sie können auch erhalten werden durch Zugabe eines alkalischen Mediums zu einer wässrigen Lösung des Peptids und eines unlöslichen Metallsalzes, wobei ein unlöslicher Peptid-Metallhydroxid-Komplex entsteht. Außerdem können die Metallkomplexe erhalten werden durch Zugabe des Peptids, eines löslichen Metallsalzes und eines löslichen Salzes zu einem wässrigen, vorzugsweise alkalischen Medium, wobei man den unlöslichen Peptid-Metallsalz-Komplex in situ erhält.

Die Metallkomplexe können sofort verwendet oder z.B. lyophilisiert und anschließend wieder suspendiert werden.

Biologische Wirksamkeit

a) Pol -Springtest (aktiver Ausweichtest) Männliche weiße Ratten, mit einem Gewicht von ungefähr 125 g» wurden mit Hilfe des sogenannten Pol -Springtests

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konditioniert. Der konditionierende Stimulus war ein Licht über dem Käfig, auf das nach 5 Sekunden der nicht konditionierte (unconditioned) Stimulus eines Schocks durch den Gitterboden des Käfigs folgte. In drei aufeinanderfolgenden Tagen wurden 10 Versuche pro Tag durchgeführt mit einem mittleren Abstand von .60 Sekunden. Fach dieser Anpassungsperiode wurde die Auslöschung an drei aufeinanderfolgenden Tagen untersucht. Alle die Tiere, die bei dem ersten Auslöschungsversuch 8 oder mehrmals reagierten, wurden mit der zu untersuchenden Substanz oder einem Placebo behandelt und 24- und 48 Stunden später erneut einem Auslöschungsversuch von 10 Versuchen unterworfen.

Die Anzahl der positiven Reaktionen (höchstens 10) im Vergleich mit den mit einem Placebo erhaltenen Ergebnissen, ist ein Maß für den Grad, in dem das Lernen und Benehmen behindert wird.

Substanz

Anpassungsperiode (insgesamt 30 Versuche) mittlere Anzahl der Reaktionen pro Ratte

Mittlere Anzahl der Reaktionen pro Ratte bei 10 Versuchen

24- Stunden nach 4-8 Stunder Behandlung den nach

der Behandlung

Placebo 15

Pentapeptid- 16,5

dimer*

(1 /Ug subc.)

8
9

1 8

* Das Pentapeptiddimer ist das entsprechend Beispiel ΙΓ.1. hergestellte Peptid.

- 9 309833/1144

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b) "Passiver Ausweichtest"

Die experimentelle Vorrichtung bestand in einem erhöhten Lauf weg, der durch eine Tür mit einer dunklen Kammer verbunden war. Der erhöhte Lauf weg war mit einer 15 W Lampe beleuchtet, die ungefähr 40 cm oberhalb der Mitte des erhöhten Laufwegs angebracht war. Der Boden der dunklen Kammer bestand aus einem Metallgitter, durch das den in der Kammer eingeschlossenen Hatten ein elektrischer Schock versetzt werden konnte.

Am ersten Tag des Versuches wurden männlivihe weiße Ratten mit einem Gewicht von 180 bis 2OQ g 2 Minuten in die dunkle Kammer gesetzt (Jede Ratte einzeln). Anschließend folgte ein Versuch, bei dem die Ratten auf den erhöhten beleuchteten Laufweg gesetzt wurden und in die dunkle Kammer laufen durften, woraufhin sich die Falltüre schloß.

Am zweiten Versuchstag wurde der zuletzt genannte Versuch dreimal in einem Intervall von ungefähr 2 Minuten wiederholt. Am letzten Tag der drei aufeinanderfolgenden Versuche erhielt die Ratte unmittelbar,nachdem sie in die Kammer eintrat, einen elektrischen Schock· Die Ratte wurde dann mit der zu untersuchenden Substanz behandelt und nach 24 und 48 Stunden erneut dem Versuch unterworfen, ohne daß sie einen elektrischen Schock erhielt. Es wurde die Zeit notiert, zu der die Ratte auf den erhöhten Lauf weg gesetzt wurde und die Zeit, zu der das Tier in die dunkle Kammer eintrat. Eine Dauer von300 Sekunden wurde als maximale Beobachtungszeit pro Ratte angesehen.

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Substanz	Dosis	1	0,0625	/Ug	Mittlere Zeitdau er pro Ratte bei 3 Versuchen vor dem Schock (g.ek.)	Mittlere Zeitdauer pro Ratte bei einem Versuch nach dem Schock (sek.) 24 Stunden 48 Stunden nach der Be- nach der B handlung handlung	5
Placebo	Lysin-va- 1 so-pressin 0,25	^0,5 0,125	/Ug /Ug	3	11	287 127
	0,03125	/Ug	6 5	300 190	8
Pentapep tiddimer '		/Ug /Ug	5 '	13	297 193
	/Ug	5 6	300 212	25
6	36

* Das Pentapeptiddimer ist das Peptid, das hergestellt worden ist entsprechend Beispiel F.1.

Die oben angegebene !Tabelle zeigt, daß Lysin-vasopressin und das Pentapeptiddimer beide eine starke Hemmung der Auslöschung des Lernens und Benehmens zeigen. Bei einem Vergleich der Dosen kann man den Schluß ziehen, daß das Dimer mehr als zweimal so wirksam ist in dieser Beziehung wie.Lysin-vasopressin.

Für die folgenden Beispiele und die Ansprüche gilt folgendes:

I wenn keine optische Konfiguration erwähnt ist, ist die L-Porm gemeint.

II Als Schutz gruppen wurden in den Beispielen die folgenden Gruppen verwendet:

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	- 11 -	2305727
	= Benzyloxycarbonyl	42 534
Z	= tert.-Butyloxy-carbonyl
Boc	= tert.-Butyl
tBu	= Methyl
Me	= p-Nitrophenyl	•
ONP	= Benzyl .
BzI	= Tosyl
Tos

III Für die verwendeten Lösungsmittel oder Reagenzien werden in den Beispielen die folgenden Abkürzungen verwendet:

Bz = Benzol

Bu = Butanol

Py = Pyridin

Ac - Essigsäure

Wa = Wasser

Am = Amyl-alkohol

DMF = Dimethylformamid

THF = Tetrahydrofuran

DCCI = Dicyclohexylcarbodi-imid

DCCU = Dicyclohexylharnstoff

IV Für die Aminosäuregruppen werden die folgenden Abkürzungen verwendet:

Cys = Cysteinyl "

Tyr = Tyrosyl

Phe = Phenylalanyl

GIu(X)=Glutamyl (X = OH)

GIu(X)=Glutaminyl (X =

Asp(X)=Aspargyl (X = OH)

Asp(X)=Asparaginyl (X =

^ =Cystinyl Cys

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Beispiel 1

A.1. Z-Cys(Bzl)-Tyr-OMe

14 g Z-Cys(BzI)-OH wurden in 60 "cur gereinigtem DI-IF gelöst, woraufhin 8 g H-Tyr-OMe zugegeben wurden. Diese Suspension wurde auf O⁰C .abgekühlt und anschließend wurden 8,4 g DCCI zugegeben. Dann wurde die Temperatur unter Rühren auf ungefähr 20°C erhöht. Anschließend wurde 20 Stunden gerührt. Das entstehende DCCU wurde abfiltriert und das Filtrat im Vakuum eingedampft und der Rückstand in Äthylacetat/Wasser gelöst. Die organische Phase wurde mit 0,1 η Salzsäure, Wasser, 5 %iger Natriumbicarbonatlösung und Wasser gewaschen und anschließend das Äthylacetat getrocknet und im Vakuum abdestilliert. Der Rückstand wurde aus Äthylacetaifc-Petroläther umkristallisiert. Ausbeute: 18,1 g; Fp: 92-96°C.

A.2. Z-Cys(BzI)-Tyr-0H

8 g der oben genannten Verbindung wurden in 20 cnr Methanol gelöst, zu dem 2 Äquivalent Natriumhydroxid zugegeben wurden. Nach einstündigem Rühren bei Raumtemperatur wurde die Lösung auf einen pH-Wert von 3 angesäuert und mit 20

7. O

cnr Wasser verdünnt. Nach einstündigem Rühren bei 0 C wurde der Niederschlag abfiltriert. Ausbeute: 6,2 g; Fp: 200-203⁰C
Rf in Bz: EtOH (8:2) = 0,10 (SiO₂).

B.1. H-GIu(NH₂)-Asp(OBzI)-OBzI.HCl

3,67 g Boc-Glu(NHo)ONP und 3,13 6 H-Asp(OBzI)-OBzI wurden in 25 cm Dimethylformamid gelöst. Das Reaktionsgemisch wurde 8 Stunden bei O⁰C und dann weitere 40 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum abgedampft und der Rückstand in feuchtem Äthylacetat auf-

. 309833/114 4 - 13 -

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genommenj mit Wasser, 5 %iger Natriumbicarbonatlösung
und Wasser gewaschen und anschließend das Äthylacetat
im Vakuum abgedampft. Das entstehende öl wurde in trokkenem Methylenchlorid gelöst und anschließend trockenes
Chlorwasserstoffgas 1 Stunde lang durchgeleitet. Das Dipeptid fiel während dieses Prozesses aus und konnte

abfiltriert werden. Ausbeute: 2,7 g; Fp: 17O°C(Zers.) Hf in Am:Py:Wa (5:3:2) - 0,37 (SiO₂).

B.2. H-Glu(OBzI)-Asp(OBzl·)-OBzI.HCl

Auf die gleiche Weise, wie unter B.1. beschrieben, wurde Boc-Glu(0Bzl)-0NP mit H-Asp(OBzl)-OBzI gekuppelt und dann von der tert.-Butyloxycarbonylgruppe befreit.
Rf in Am:Py:Wa (5:3:2) = 0,43 (SiO₂).

B.3. H-Glu(OBzl)-Asp(NHCH^)-OBzl.HCl

Auf die gleiche Weise, wie unter B.1. beschrieben, wurde Boc-Glu(0Bzl)-0NP mit Η-Asp(NHCH,)-OBzl gekuppelt und anschließend die Boc-Gruppe entfernt.
Rf in Am:Py:Wa (5:3:2) = 0

B.4. H-Glu(OBzl)-Asp(NH₂)-OBzl.HCl

Auf die gleiche Weise, wie unter B.1. beschrieben, wurde Boc-Glu(OBzl)-ONP mit H-Asp(NH₂)-0Bzl gekuppelt und anschließend die Boc-Gruppe entfernt.
Rf in Am:Py:Wa (5:3:2) - 0,38 (SiO₂).

B.5. B-GIU(NHo)-ASp(OBzI)-NR₁R₂.HCl (R₁, R₂ = Wasserstoff oder

Methyl)

Auf die gleiche Weise, wie unter B.1. beschrieben, wurde BoC-GIu(NH₂)-ONP mit H-ASp(OBzI)-NR₁R₂ gekuppelt und anschließend die Boc-Gruppe entfernt.
Rf in Am:Py:Wa (5:3:2) » 0,34 (SiO₂) (für R₁ und R₂ = H) und 0,36 für R₁ und R_P * Methyl.

- 14 309833/ 1 1 Ui*

- 14 - 42 534

B.6. H-Glu(HH₂)-Asp(0Bzl)-0R.HCl (R = -CH₅ oder -C₁₁ Auf die gleiche Weise, wie unter B.1. beschrieben, wurde BoC-GIu(NH₂)-ONP mit H-Asp(OBzI)-OR (R = CH₃ oder -C₁₁H₂ gekuppelt und anschließend die Boc-Gruppe entfernt.

0.1. H-Phe-Glu(NH_o)-Asp(NH₀)~0H ·

3,8 g Tos-Phe-Glu(NH₂)-Asp(NH₂)-0H (J.A.C.S. £6, 6202, 1954) wurden in 100 cnr trockenem Ammoniak gelöst. Dann wurde Natrium zugegeben, bis die blaue Farbe bestehen blieb und anschließend die Lösung gerührt, woraufhin die Farbe durch Zugabe von Ammoniumchlorid entfernt wurde. Der Ammoniak durfte in die Luft entweichen und anschlies-• send wurde der Rückstand im Wasser aufgenommen und mit Äther extrahiert. Die wässrige Phase wurde lyophilisiert. Der Rückstand wurde im Wasser aufgenommen und die Lösung mit reinem Alkohol verdünnt«, Der entstehende Niederschlag wurde abfiltriert und dann über Phosphorpentoxid getrocknet. Ausbeute: 2,6; Fp: 227°C (Zers.) Rf in Bu:Py;Ac:Wa (4:3/4i1/4:i) = 0,15.

C.2. H-Phe-Glu(NH₂)-Asp(OH)-OH

2,1g Z-Phe-ONP in 25 cm⁵ Äthyl-acetat und 2,4 g H-GIu(NH₂)-Asp(OBzI)-OBzI (frei von Hydrochlorid und entsprechend Beispiel B.1. hergestellt) in 10 cnr DEF₁ wurden vermischt und 20 Stunden bei O⁰C gerührt. Der entstehende Nieder- ** schlag wurde abfiltriert, mit trockenem Äthylacetat gewaschen und getrocknet. Fp: 17O-173°C· Ef in BzrEtOH (8:2) - 0,74 (SiO₂).

2,9 g dieses geschützten Peptids wurden in 35 cnr Eisessig gelöst und anschließend 10 % Palladium auf Kohle zugegeben und Wasserstoff durchgeleitet. Nach Entfernung des Lösungsmittels durch Verdampfen inrurde der Rückstand in Wasser

- 15 3 0-98 3 3/IUA

- 15 - 42

aufgenommen und lyophilisiert.

Rf in Am:Py:Wa (5:3:2) = 0,14 (SiO₂).

C.3. Auf die gleiche Weise, wie in Beispiel C.2. beschrieben, wurde Z-Phe-ONP gekuppelt an die entsprechend B.2., 3, 4, 5 und 6 erhaltenen Peptide,nachdem von diesen die Schutzgruppen entfernt worden waren.

Peptid Rf in Am;Py:Wa (5:3:2)

C.3-1. H-Phe-Glu(OH)-AspCOH)-OH 0,12

C.3.2. H-Phe-Glu(OH)-Asp(NHCH₃)-OH 0,15

C.3.3. H-Phe-Glu(OH)-Asp(NH₂)-OH 0,15

C.3.4. H-Phe-Glu(NH₂)-Asp(0H)-NH₂ 0,17

C.3.5- H-Phe-Glu(NH₂)-Asp(OH)-N(CH₃)₂ 0,19

C.3.6. H-Phe-Glu(NH₂)-Asp(OH)-OCH₃ 0,22

C.3.7- H-PhC-GIu(NH₂)^Sp(OH)-OC₁₁H₂₃ 0,24

D.1. Z-Cys(Bzl)-Tyr-Phe-Glu(NH₂)-Asp(NH₂)-0H Zu 1 g Z-Cys(Bzl)-Tyr-OH (Beispiel A.2.) in 10 cm^ THF wurden 0,26 cm* N-Äthylmorpholin zugegeben und anschliessend die Lösung auf -10°C abgekühlt und 0,26 cnr Isobutylchlorformiat zugegeben. Die Lösung wurde 10 Minuten bei -10°C gerührt und anschließend wurden 0,8 g H-Phe-Glu(NHp)-ASp(NHO-OH (Beispiel C.1.) und 0,26 cm^ N-Äthylmorpholin in 10 cnr gekühltem DMP zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 30 Minuten bei -10⁰C, 2 Stunden bei O⁰C und 18 Stunden bei 20⁰C gerührt und anschließend in Wasser gegossen und der pH-Wert auf 3-4 eingestellt und anschließend die gebildete Substanz abzentrifugiert.

Das so erhaltene Produkt wurde aus Äthanol/Wasser (1:1) umkristallisiert. Fp: 219⁰C (Zers.). Rf in Bu:Py:Ac:Wa (4:3/4:1/4:1) = 0,44

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D.2. Z-Cys(BzI)-TyT-PiIe-GIu(NH₂)-Asp(OH)-OH Auf die gleiche Weise, wie in Beispiel D.1. beschrieben, wurde 1 g des Dipeptide Z-Cys(Bzl)-Tyr-OH in das gemischte Anhydrid umgewandelt. Zu diesem Anhydrid wurde eine Lösung von 0,8 g H-Phe-Glu(NH₂)-Asp(0H)-0H (Beispiel C.2.) und 0,52 cm^ N-Äthylmorpholin in DMF zugegeben. Ausbeute nach dem Aufarbeiten des Reaktions/gemisches wie oben beschrieben: 1,3 6·
Ef in Bu:Py:Ac:Wa (4:3/4:1/4:1) = 0,44 auf SiO₂. Auf die gleiche Weise, wie unter D.1. und D.2. beschrieben, wurden die folgenden Peptide hergestellt durch Kuppeln von Z-Cys(BzI)-Tyr-0H an die unter C.3« erwähnten Peptide. „

Hf in Bu:Py:Ac:Wa (4:3/4:1/4:1)

D.3.1. Z-Cys(Bzl)-Tyr-Phe-Glu(OH)-Asp(OH)-OH 0,24

D.3.2. Z-Cys(Bzl)-Tyr-Phe-Glu(0H)-Asp(]m₂)-0H 0,34

D.3.3. Z-Cys(Bzl)-!Eyr-Phe-Glu(OH)-Asp(NHGH₃)-OH 0,34

D.3.4. Z-Cys(Bzl)-Tyr-Phe-Glu(]m₂)-Asp(0H)-HH₂ 0,40

D.3.5. Z-Cys(Bzl)-Tyr-Phe-Glu(NH₂)-Asp(OH)-H(CH₃)₂ 0,45

D.3.6. Z-Cys(Bzl)-Tyr-Phe-Glu(IiH₂)-Asp(OH)-OCH₃ 0,52

D.3-7- Z-Cys(Bzl)-Tyr-Phe-Glu(MH₂)-Asp(OH)-OC_1iH₂₅ 0,58

E. Entfernung der Schutzgruppen bei den unter D. erhaltenen Peptiden \ *-

mg eines Pentapeptids,das entsprechend Beispiel D. erhalten worden war, wurden in 50 cm^ trockenem flüssigem Ammoniak in sauerstoffreier Stickstoffatmosphäre gelöst. Zu dieser Lösung wurde Natrium zugegeben, bis die blaue Farbe bestehen blieb, die durch Zugabe von Ammoniumchlorid entfernt wurde und anschließend ließ man den Ammoniak in die Luft entweichen. Der verbleibende Huckstand wurde noch unter sauerstoffreier Stickstoffatmosphäre in 50 Cm^ sauer-

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■stofffreiem HCl (0,02 η) aufgenommen und 10 cup davon lyophilisiert. Der !Rückstand sollte unter Stickstoff aufbewahrt werden.

Auf diese Weise wurden die -HCl-SaIze der folgenden Ver bindungen hergestellt:

Ef in Bu:Py:Ac:Wa (4:3/4:1/4:1)

E.1. H-Cys-Tyr-Phe-GluCüHg)-Asp (NH₂)-°^H °

E.2. H-Cys-Tyr-Phe-Glu(liH₂)-Asp(0H)-0H 0,10

E.3- H-Cys-Tyr-Phe-Glu(OH)-Asp(OH)-OH 0,08

E.4. H-CyS-TyT-PlIe-GIu(OH)-ASp(NH₃)-OH 0,10

E.5. H-Cys-Tyr-Phe-Glu(OH)-Asp(NHCH₅)-OH 0,10

E.6. H-Cys-0?yr-Phe-Glu(im₂)-Asp(OH)-NH₂ 0,12

E.7- H-Cys-Tyr-Phe-Glu(NH₂)-Asp(OH)-N(CH₃)₂ 0,12

E.8. H-CyS-TyT-PUe-GIu(NH₂)-Asp(OH)-OCH₅ 0,14

E.9- H-CyS-TyT-PlIe-GIu(NH₂)^Sp(OH)-OC₁₁H₂₅ 0,15

Diniere der Pentapeptide nach E.

Die restlichen 40 cm? der in Beispiel E. erhaltenen Pentapeptidlösung wurden weiter für die Umwandlung des Pentapeptids in die dimere Form verwendet. Diese Dimere wurden erhalten durch Oxidation von 2 Molekülen des Pent ap ept id's, wodurch die beiden SH-Gruppen zu einer S-S-Brücke oxidiert wurden.

Der pH-Wert dieser 40 enr lösung wurde auf 6,6 eingestellt, woraufhin Luft durchgeleitet wurde, bis zur neutralen Eeaktion der SH-Gruppen, wodurch das Pentapeptid in das Dimer umgewandelt wurde. Die Lösung wurde dann wieder mit Essigsäure auf einen pH-Wert von 4 eingestellt und das Gemisch anschließend lyophilisiert. Die erhaltene

309833/1 IU - ¹⁸ ■

- 18 - ,42 534.

Substanz wurde in etwas kaltes Wasser eingerührt, wobei sieb, die (anorganischen) Salze lösten, aber das dimere Peptid nicht. Nach dem Abfiltrieren wurde die feste Substanz getrocknet. Nan erhielt die Dimere der folgenden Pentapeptide:

Rf in Bu:Py:Ac:Wa (4:3/4:1/4:1)

F.1. H-Cys-Tyr-Phe-Glu(KH₂)-Asp(KH₂)-OH 0,15

F.2. H-Cys-3iyr-Phe-Glu(KH₂)-Asp(0H)-0H 0,10 F.3. H-Cys-!yr-Phe-Glu(OH)-Asp(OH)-OH"' ' ^f ' 0,08

1.4. H-Cys-Tyr-Phe-Glu(OH)-Asp(KH₂)-OH 0,13

F.5. H-Cys-Tyr-Phe-Glu(OH)-Asp(KHCH₃)-OH 0,13

F.6. H-Cys-5!yr-Phe-Glu(KH₂)-Asp(0H)-KH₂ 0,16

F.7. H-Oys-5!yr-Phe-Glu(liH₂)-Asp(OH)-K(CH^)₂ 0,16

F.8. H-Cys-3?yr-Phe-Glu(KH₂)-Asp(OH)-OCH₃ 0,16

F.9. H-CyS-SyT-PhC-GIu(KH₂)^Sp(OH)-OC₁₁H₂₅ 0,18

Beispiel II

A. Es wurde eine Zubereitung zur oralen Verabreichung aus den folgenden Bestandteilen hergestellt:

Pentapeptid-dimer (Beispiel F.1.) 0,5 mg

Sorbit 200 mg

Natriumbenzοat 1 mg

Äthanol 100 % 0,05

Wasser (destilliert und pyrogenfrei) ,auf 1

B. Eine Zubereitung für InJ ektionszwecke wurde aus den folgenden Bestandteilen hergestellt:

Pentapeptid-dimer (Beispiel F.1.) 1,0 mg

NaOl 9,0 mg

3 0 9 8 3 3/1144 - 19 -

- 19 - 42 534·

Methyloxybenzoat 1,2 mg

destilliertes pyrogenfreies Wasser auf 1,0 cm .

C. Ein Grundgranulat wurde hergestellt, bestehend aus:

Carboxymethylcellulose 2,5 mg

Stärke 20,0 mg

Lactose 68,5

Dieses Granulat wurde mit 7» 5 mg des Pent apept iddimers entsprechend F.3-i 1 mg Talkum und 0,5 mg Magnesiumsteafat vermischt und das Gemisch zu Tabletten von 100 mg gepresst.

Patentansprüche

309833/ IH

Claims

DR. ING. F. WUHSTIIOFF DR. E. ν. PECHM ANN DRYING. D.:HEIIKENS DIPL. ING. R. GOETZ PATENTANWÄLTE * . nicht geandeit - 8-MUNOIII' SCIIWEIOEIt: 3ÜÖQ&727 (0811) 00 20 TKLEI ."5 24 070 TEI-EOIlAMMTi t PBOTECTPATENT MÜNCHEN - 20 - 1A-4-2 534- Patentansprüche

1. Pentapeptid der Formel:

H-L-Cys-L-Tyr-L-Phe-L-Glu(X)-L-Asp(X)-OH,

in der X eine Hydroxy- oder Amino gruppe bedeutet .oder ein Dimer (über S-S-Brückenbindang) dieses Pentapeptids sowie dessen funktioneile Derivate.

2. Pentapeptid nach. Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß es die Formel:

H-Cys-Tyr-Phe-Glu(X)-Asp(X)-OH II-Cys-Tyr-Phe-Glu(X)-Asp (X) -OH

besitzt, in dor X eine Hydroxy- oder Aminogruppe bedeutet.

3. Verwendung der Pentapeptide nach Anspruch 1 oder 2 als

Psychopharmaka.

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