DE68916722T2

DE68916722T2 - Urethan geschützte aminosäuren-n-carboxyanhydride.

Info

Publication number: DE68916722T2
Application number: DE68916722T
Authority: DE
Inventors: Michael Phillip Cohen; William D Fuller; Murray Goodman; Fred R Naider
Original assignee: Bioresearch Inc
Current assignee: Bioresearch Inc
Priority date: 1988-03-11
Filing date: 1989-03-03
Publication date: 1994-11-03
Anticipated expiration: 2009-03-04
Also published as: RU2007396C1; KR900700469A; NO894503L; NO306304B1; AU4188789A; CA1321280C; IL89541A0; NZ228282A; FI102379B1; NO894503D0; FI102379B; EP0357750A1; JP2875834B2; CN1022412C; DD280322A5; PT89961B; FI895382A0; WO1989008643A1; ATE108438T1; US4946942A

Description

I. Hintergrund der Erfindung

Die Erfindung betrifft eine neue Klasse von N-geschützten Aminosäure-N- carboxyanhydriden und -thiocarboxyanhydriden, nämlich Urethan-geschützte Aminosäure- N-carboxyanhydride und N-Urethan-geschützte N-thiocarboxyanhydride, ihre Herstellung und ihre Verwendung in Peptid-, Polypeptid- und in Proteinsynthesen.

II. Stand der Technik

Herkömmlicherweise werden Polypeptide einer definierten Sequenz mit Hilfe von überaus schwierigen Verfahrensweisen hergestellt, wobei die Zwischenprodukte nach Zugabe von jeder Aminosäurenkomponente isoliert werden. Dieser Umstand erschwert die Synthese und macht die Herstellung der langkettigen Polypeptide und Proteine aufgrund niedriger Ausbeuten, Racemisierung und/oder anderer Nebenreaktionen nahezu unmöglich 1963 schlugen Merrifield (J. Am Chem. Soc. 85, 2149) und Lehninger und Kornet (J. Am. Chem. Soc. 85, 2045) die Verwendung von unlöslichen polymeren Trägern für die Peptid- Kettenverlängerung vor. Dieses Verfahren, welches die Festphasenpeptid-Synthese betrifft, ermöglicht die "Reinigung" der anwachsenden Peptidketten ohne Isolierung der Zwischenprodukte.
Bisher erforderten zur Darstellung einer carboxy-aktivierten N-geschützten Aminosäure die weit und breit anerkannten Verfahren für die klassische (Flüssigphase) als auch für die Festphasenpolypeptid-Synthese die Verwendung eines Kopplungs- oder Aktivierungsmittels zur Umsetzung mit der Carboxy-Gruppe einer auf eine andere Weise N- geschützten Aminosäure. Diese aktivierte Sorte würde anschließend in unterschiedlichen Verfahrensweisen zur Förderung der Bildung der Peptid-Bindung verwendet werden. Zum Beispiel läßt man die aktivierte, geschützte Aminosäure direkt mit der freien Aminogruppe einer Aminosäure, eines Aminosäureesters oder eines Aminosäureamids zur Bildung der Peptid-Bindung reagieren. Das ist seit Jahren das Verfahren der Wahl zur Herstellung von Peptiden. Der Aktivierungsschritt kann durch eine Anzahl von möglichen Nebenreaktionen begleitet werden. Zum Beispiel kann das aktive Molekül zu einem in aktiven N- Acylharnstoff "umgebildet" werden, wenn Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) das Aktivierungsmittel ist.
Ein weiterer Nachteil des Carbodiimid-Verfahrens ist die Bildung von unlöslichen Harnstoffen. Dieser Umstand ist besonders in der Festphasensynthese störend und ist eigentlich in Festphasendurchflußsystemen nicht hinnehmbar. Diese Harnstoffe führen auch zu großen Reinigungsproblemen in Flüssigphasenreaktionen.
Fachleute verringerten einige der mit der in situ Aktivierung verbundenen Probleme, indem zuerst die DCC aktivierte N-geschützte Aminosäure mit einem Alkohol oder Phenol (wie p-Nitrophenol, Pentachlorphenol, N-Hydroxy-succinimid etc.) zur Bildung eines "aktiven" Esters reagierte, welcher isoliert und gereinigt werden konnte, und man anschließend ihn mit dem freien Amin der nächsten Aminosäure koppelte. Diese Vorgehensweise ist jedoch nicht ohne Mängel, da freigesetzter Alkohol oder Phenol in Nebenreaktionen beteiligt ist oder diese fördert, und die aktive Esterkopplung dazu neigt, zu langsam zu sein, und lange Reaktionszeiten erforderlich macht.
Ein weiteres herkömmliches Verfahren betrifft die Bildung eines "symmetrischen Anhydrids", indem man zwei Äquivalente einer N-geschützten Aminosäure mit einem Äquivalent DCC reagieren läßt, das DCU Produkt filtriert und anschließend das "symmetrische Anhydrid" mit der freien Amingruppe der nächsten Aminosäure koppeln läßt. Dieses Verfahren weist Harnstoffprobleme zusätzlich zu dem Erfordernis, daß zweimal soviel an teurer N-geschützter Aminosäure verwendet wird.
Einige Fachleute begannen jüngst Carbodiimide zu verwenden, die lösliche Harnstoffe nach der Kopplung bilden, diese neigen aber darüber hinaus zur Umbildung in N- Acylharnstoffe.
Verschiedene Sorten von N-Schutzgruppen sind zur Verwendung in Peptid- Synthesen vorgeschlagen worden, jedoch haben sich am meisten als N-Schutzgruppen die Urethane durchgesetzt. Urethane sind weit und breit anerkannt, da sie ein hohes Ausmaß an Schutz bieten, Racemisierung verringern, ohne weiteres herstellbar sind und lagerungsstabil sind. Urethan-Schutzgruppen können hergestellt werden, die gegenüber schwacher Säure (i.e. t-Butoxycarbonyl), starker Säure (i.e. Benzyloxycarbonyl), äußerst schwacher Säure (i.e. 2-(p-Biphenylyl)-isopropyloxycarbonyl), wassenfreier Base (i.e. 9- Fluorenylmethyloxycarbonyl) und so weiter labil sind.
Urethan-geschützte Aminosäuren stellt man üblicherweise durch Reaktion eines Alkyl-, Aryl- oder Aralkylchlorformiats (oder anderer entsprechend aktivierter Formiate oder Carbonate) mit der Aminosäure in Gegenwart eines Alkalimetallhydroxids oder -carbonats in einem gemischten wäßrigen/organischen Lösungsmittelsystem ( i.e. Schotten- Baumann-Bedingungen) her. Nach Ansäuerung des Reaktionsgemischs wird die Urethan- geschützte Aminosäure in einem organischen Lösungsmittel unter Zurücklassen aller Nebenprodukte in der wäßrigen Phase extrahiert. Nach Kristallisation werden diese Verbindungen für die Bildung der Peptid-Bindung, wie oben beschrieben, verwendet.
Ein besonders interessierender Typ eines reaktionsfähigen Derivats der Aminosäuren zur Verwendung in der Bildung der Peptid-Bindung sind die sogenannten N- Carboxyanhydride oder N-Thiocarboxyanhydride, wie
worin R, R' kennzeichnenderweise ein Wasserstoffatom oder die Seitenketten (oder die geschützte Seitenketten) der herkömmlichen Aminosäuren sind, und Z ein Sauerstoffatom oder ein Schwefelatom ist.
Aminosäure-N-carboxyanhydride (darunter versteht man, daß die Bezeichnung N- Carboxyanhydrid in dieser Beschreibung und den beigefügten Ansprüchen die N- Thiocarboxyanhydride einschließen soll) sind sehr bekannt und reagieren mit den meisten freien Aminen ohne weiteres. Ein erster Vorteil der N-Carboxyanhydride (NCA's) und sogar der geschützten NCA's zur Verwendung in der Bildung der Peptid-Bindung ist der Umstand, daß sie starke Acylierungsmittel sind (siehe Peptides, Vol. 9, Seite 83). Sie führen auch im allgemeinen zu höheren Peptidausbeuten als die DCC- oder N-Hydroxysuccinimid (OSu)- ester-Kopplungsverfahren. Die NCA's aber finden keine weite Anwendung in Polypeptid- Synthesen aufgrund der mangelnden Möglichkeit, Kopplungsreaktionen zu kontrollieren und zu begrenzen. Falls ein NCA mit dem freien Amin einer Aminosäure reagiert, werden sofort Kohlendioxid freigesetzt und ein Dipeptid gebildet, welches ein freies Amin enthält. Diese Amin reagiert später mit einem anderen NCA unter Bildung eines Tripeptids und so weiter. Diese Reaktion ermöglichte, daß Aminosäure-N-carboxyanhydride eine beträchtliche Anwendung in der Bildung von Poly-α-Aminosäuren finden, aber ihre Verwendung in der sequentiellen Polypeptid-Bildung im Grunde genommen ausschloß. Hirschmann et al. (The Controlled Synthesis of Peptides in Aqueous Medium. VIII.; The Preparation and Use of Novel α-Amino Acid N-Carboxyanhydrides. J.A.C.S. 93:11, 1971, Seiten 2746-2774) schlugen die Verwendung von Aminosäure-N-carboxyanhydriden zur Herstellung von Di- und Tripeptiden in wäßrigen-organischen Lösungsmittelsystemen bei sorgfältiger Kontrolle von Temperatur, pH, Salz und organischem Lösungsmittel des Reaktionsgemischs vor. Dieses Verfahren ist jedoch aufgrund der Chemie der NCA's, wie oben beschrieben, auf kleine Peptide beschränkt. Darüber hinaus müssen die nach diesen Flüssigphasenreaktionen hergestellten Produkte in sehr umfangreicher Weise gereinigt werden, bevor sie zur Herstellung größerer Peptide verwendet werden.
Eine Vielzahl N-substituierter Aminosäure-N-carboxyanhydride werden in der Literatur wie N-Methyl, N-Benzyl, N-Acetyl, N-Nitrophenylsulfenyl, N-Xanthyl, 4,4'- Dimethylbenzhydryl, Trityl und so weiter beschrieben. Einige dieser N-subsituierten NCA's werden zur Verwendung in der sequentiellen Polypeptid-Synthese und insbesondere in der Festphasenpeptid-Synthese vorgeschlagen, sie finden aber allgemein bei Peptidchemikern keinen Anklang.
Kricheldorf (Angew. Chem. Acta 85, 86-87, (1978)) schlug die Verwendung von o- Nitrophenylsulfenyl (NPS) substituierten NCA's zur Verwendung in der sequentiellen Peptid-Synthese vor. Diese wurden durch die Reaktion von o-Nitrophenylsulfenylchlorid mit einem N-Carboxyanhydrid in der Gegenwart von Triethylamin hergestellt. Später zeigte es sich, daß Triethylamin die Racemisierung der NPS-NCA's fördert. Darüber hinaus erfordert die Oligomerisierung infolge der Wirkung von Triethylamin auf die NCA's eine sehr genaue Einhaltung der Reaktionsbedingungen ( i.e. Temperatur < 0º C und sehr langsame Zugabe von Triethylamin zu dem Reaktionsgemisch) während der NPS-NCA-Synthese. Halstrom et al. (Z. Physiol. Chem. 355, 82-84, (1974)) schlug daher die Synthese von NPS-NCA's durch Reaktion von Phosgen mit einer NPS-Aminosäure vor, jedoch waren die Ausbeuten sehr gering (etwa 20 %). Nach Herstellung sind die NPS-NCA's schwierig zu lagern und neigen dazu, die Schutzgruppen während der Kondensation "auszubluten" und lassen Vielfach- Kopplungen als auch andere Nebenreaktionen ansteigen. Auch besitzt der Stickstoff des entstehenden NPS-geschützten Peptids eine beträchtliche nukleophile Eigenchaft und neigt zu zusätzlichen Kondensationsreaktionen.
Block und Cox ("Peptides, Proc. of the 5th Europ. Symp., Oxford, September 1962". Pergamon Press 1963, Ed. G. T. Young. Seiten 84-87.) schlugen den Gebrauch von N-Trityl-aminosäure-N-carboxyanhydriden zur Verwendung in Peptid-Synthesen vor, obwohl sie nur die einfachsten N-Trityl-aminosäure-NCA's (i.e. Glycin und Alanin) herstellen konnten. Diese Verbindungen wurden durch die Reaktion einer N-Trityl- aminosäure mit Phosgen hergestellt. In diesem Verfahren konnten sie auch N-Acetyl-glycin- NCA herstellen. Die Forscher erkannten die mögliche Nutzen von t-Butoxycarbonyl-glycin- N-carboxyanhydrid und Benzyloxycarbonyl-glycin-N-carboxyanhydrid, jedoch waren ihre Versuche, diese herzustellen, nicht erfolgreich, und sie schlossen, daß Urethan-geschützte Aminosäure-N-carboxyanhydride nicht hergestellt werden konnten. Sogar wenn alle N- Trityl-NCA's hergestellt werden könnten, ist es allgemein bekannt, daß die Verwendung des Trityl-Schutzes für Aminosäuren in verschiedenen Kondensationsverfahren zu niedrigen Ausbeuten aufgrund der durch die Trityl-Gruppe hervorgerufenen beträchtlichen sterischen Hinderung führt. Die Trityl-Gruppe ist gleichfalls äußerst empfindlich gegenüber Säuren, was die Herstellung des Trityl-NCA erschwert, und sie neigen dazu, während der herkömmlichen Festphasenschritte "auszubluten".
Halstroem & Kovacs (Acta Chemica Scandinavica, Ser. B 1986, BYO (6), 462-465 und U.S.Patent Nr. 4 267 344) erkannten auch die Vorteile und die mögliche Verwendbarkeit von N-geschützten Aminosäure-N-carboxyanhydriden und konnten einige N-substituierte NCA's herstellen, von denen sie glaubten, sie würden alle für die Verwendung in der Peptid-Synthese nötigen Erfordernisse erfüllen. Sie konnten eine Anzahl von 9-Xanthyl (und verwandte) substituierte Aminosäure-N-carboxyanhydride herstellen. Es wurde behautet, diese Verbindungen seien durch direkte Kondensation von Xanthydrol mit geeignetem NCA in Benzol, Toluol, Xylol oder anderen Alkylbenzolen unter Rückfluß herstellbar. Das während der Kondensation gebildete Wasser wurde azeotropisch entfernt. Dieses Verfahren leidet unter der Instabilität der NCA's gegenüber Hitze und Wasser, und führt dementsprechend zu geringen Ausbeuten und möglichen verunreinigten Produkten. Diese Verbindungen konnte man auch durch die Reaktion von Phosgen (oder Phosgenäquivalenten) mit der korrespondierenden 9-Xanthyl-aminosäure herstellen und tatsächlich konnten die meisten substituierten NCA's dieser Klasse nach diesem Verfahren hergestellt werden.
Bei Verwendung in der Peptid-Synthese zeigt es sich, daß 9-Xanthyl-NCA's träge reagierten und 5 Stunden bei 50ºC in Lösung und 24 Stunden bei 25ºC in der Festphasensynthese benötigten. Dieser Umstand wird auf die sterische Hinderung der 9- Xanthyl-Gruppe und/oder auf die deaktivierende Wirkung zurückgeführt. Ein weiteres mit dem 9-Xanthyl-Schutz der Aminogruppen verbundenes Problem ist, daß das Stickstoffatom von 9-Xanthyl-aminosäure, welches nach der Kopplungsreaktion gebildet wird, noch nucleophil ist und zur Durchführung weiterer Kondensationsreaktionen befähigt ist. Diese Gruppen neigen auch zum Ausbluten während des Verfahrens. Folglich fanden bis heute die substituierten Aminosäure-N-carboxyanhydride dieser oder irgendeiner anderen Sorte keine weite Verwendung in Peptid-Synthesen, insbesondere nicht in der Festphasenpeptid- Synthese.
Kricheldorf, (Makromol. Chem. Vol. 178, Seiten 905-939, 1977) beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von Methoxycarbonyl-glycin-NCA und Ethoxycarbonyl-glycin- NCA. Jedoch auch Kricheldorf berichtet, daß mit diesem Verfahren keine Urethan- geschützten NCA's der Aminosäuren mit einer anderen Seitenkette als mit derjenigen mit Wasserstoff aufgrund der sterischen Hinderung (siehe auch H.R. Kricheldorf, "α- Aminosäure-N-carboxyanhydrides and related Heterocycles", Springer-Verlag, 1987, Seiten 8-9) hergestellt werden konnten.
Aufgabe der Erfindung ist es daher, bis heute nicht herstellbare Urethan-geschützte Aminosäure-N-carboxyanhydride und N-thiocarboxyanhydride der höhermolekularen Aminosäuren herzustellen.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, Verfahren zur Herstellung von reinen, kristallinen, stabilen Urethan geschützten Aminosäuren-N-carboxyanhydriden und Urethan- geschützten N-thiocarboxyanhydriden anzugeben.
Ein weitere Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Synthese von Polypeptiden unter Verwendung reiner, kristalliner Urethan-geschützter Aminosäure-N- carboxyanhydride bereitzustellen, wobei diese Synthese die folgenden größeren Vorteile gegenüber den herkömmlichen Methoden zur Polypeptid-Synthese bietet:
1) Voraktivierung der anzukoppelnden Carboxy-Gruppe ist nicht erforderlich, daher werden Nebenprodukte, welche bei der herkömmlichen Aktivierung der Moleküle entstehen, verhindert.
2) Keine Zusätze wie N-Hydroxybenzotriazol werden zur Inhibierung der Racemisierung benötigt.
3) Das einzige Co-Produkt bei der Kopplungsreaktion ist Kohlendioxid.
4) Diese N- geschützten Carboxy-aktivierten Aminosäuren sind stabil, lagerfähig, und sind kristalline Substanzen und erleichtern und vereinfachen daher sowohl die Festphasen- als auch die Flüssigphasensynthesen, insbesondere im automatisierten Peptid- Synthetisator, indem Aktivierungen, Filtrationen und Kopplungen nicht mehr nötig sind, die vor der Reaktion der Bildung von Peptid-Bindungen stattfänden. Die Reinigung der in Lösung hergestellten Peptide wird in hohem Maße durch die Verwendung dieser neuen Verbindungen erleichtert wegen abwesender, durch die Kopplungsmittel üblicherweise hergestellten Nebenprodukten.
5) Das Verfahren stellt nach Kopplung in weitem Maße anerkannte Urethan- Schutzgruppen an der Aminofunktion der wachsenden Peptid-Kette bereit, welche anschließend mittels herkömmlicher Verfahren verändert werden können.
Die Aufgabe wird gelöst durch Urethan-geschütztes Aminosäure-N- carboxyanhydrid oder ein -N-thiocarboxyanhydrid mit der Struktur:
worin
R und R' unabhängig voneinander aus der aus Wasserstoffatom, Alkyl-Gruppen, welche Cycloalkyl-Gruppen von 1 bis 12 Kohlenstoffatomen enthalten, Aryl-Gruppen von 6 bis 20 Kohlenstoffatomen, welche Aralkyl- und Alkaryl-Gruppen von 7 bis 20 Kohlenstoffatomen enthalten, bestehenden Gruppe ausgewählt sind, wobei mindestens ein der Vertreter R und R' nicht ein Wasserstoffatom ist,
R" eine Alkyl- oder Cycloalkyl-Gruppe von 1 bis 12 Kohlenstoffatomen, eine Aryl- Gruppe von 6 bis 20 Kohlenstoffatomen oder eine Aralkyl- oder eine Alkaryl-Gruppe von 7 bis 20 Kohlenstoffatomen ist,
Z ein Sauerstoffatom oder Schwefelatom ist, und n 0, 1 oder 2 ist.
Die bevorzugten R, R' und R"-Grüppen sind Alkyl-Gruppen, die Cycloalkyl-Gruppen von 1 bis 12 oder mehr Kohlenstoffatome enthalten; Aryl-Gruppen von 6 bis 20 oder mehr Kohlenstoffatomen, die Aralkyl- und Alkaryl-Gruppen von 7 bis 20 oder mehr Kohlenstoffatomen enthalten. Beispiele der geeigneten Alkyl-Gruppen sind Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, Isobutyl, Butyl, t-Butyl, Hexyl, Cyclopentyl, Cyclohexyl, Heptyl, Octyl usw.. Beispiele der geeigneten Aryl-Gruppen sind Phenyl, Methylphenyl, Ethylphenyl, Naphthyl, Methylnaphthyl, Anthracyl usw.. Beispiele der geeigneten Aralkyl-Gruppen sind Benzyl, p-Methoxybenzyl, 9-Fluorenylmethyl, Phenylethyl usw.. Geeignete Alkaryl Gruppen umfassen Tolyl, Ethylphenyl, Isopropylphenyl usw.. Die R, R' und R"-Gruppen können auch mit nicht störenden Gruppen wie Fluoro, Methoxy, t-Butoxy, Carboxy, Amido, Benzyloxy, Hydroxy, substituierte Amino, substituierte Hydroxy, Schwefel, substituiertes Schwefel, Chloro, Bromo usw. substituiert sein. R und R' sind beispielhaft die geschützten oder nicht geschützten Gruppen, welche an dem α-Kohlenstoffatom (Seitenketten) der Aminosäuren oder an deren Analoga gebunden sind.
Insbesondere kann R" ein niedermolekulares Alkyl, i.e. ein Alkyl mit höchstens 5 Kohlenstoffatomen, sein.
Vorwiegend ist ein Vertreter der R oder R' umfassenden Gruppe gewöhnlich H, wohingegen der andere die Seitenkette an dem α-Kohlenstoffatom einer Aminosäure wie Lysin, Leucin, Arginin, Serin, Asparaginsäure, Alanin, Asparagin, Cystein, Cystin, Glutaminsäure, Histidin, Glutamin, Isoleucin, Methionin, Norleucin, Ornithin, Phenylanin, Threonin, Tryptophan, Tyrosin, Valin, β-Alanin, Homoserin usw. ist. Beispiele solcher Seitenketten sind:
Diese Seitenketten können, falls erforderlich, geschützt werden, unter Verwendung herkömmlicher Verfahren und in der Fachwelt sehr bekannter Schutzgruppen wie die üblicherweise verwendeten Amino-, Hydroxy-, Thio- und Carboxy-Schutzgruppen.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen umfassen auch Ausführungsformen, bei denen R und R' Seitenketten sind, die an das α-Kohlenstoffatom einer Aminosäure gebunden sind, zum Beispiel im Falle von Isovalin, bei dem ein der Vetreteter R und R'-CH&sub2;CH&sub3; und der andere Methyl sind.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können auch Ausführungen umfassen, worin R und R' Teil einer cyclischen Struktur sind, zum Beispiel, im Falle von 1-Amino-1- cyclohexan-carbonsäure.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können auch Ausführungsformen umfassen, wie ortho-Aminobenzoesäure oder 1-Amino-2-carboxy-cyclohexan, worin die Kohlenstoffatome der R- und R'-Gruppen Teil eines cyclischen Rings sind.
Ein weitere Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Gegenstandes betrifft eine Verbesserung in der Synthese einer Polypeptid-Kette, worin ein N-geschützter Aminosäureteil ungeschützt (deprotected) gemacht wird, und man den ungeschützten Aminosäureteil mit einem zweiten ähnlichen oder nicht ähnlichen aktivierten N-geschützten Aminosäureteil reagieren läßt, und man das Verfahren bis zum Erhalt des gewünschten Polypeptids wiederholt, wobei die Verbesserung die Verwendung einer Verbindung als Teil der aktivierten N-geschützten Aminosäure in mindestens einer der Reaktionen mit der Struktur
umfaßt, worin R, R' R", Z und n, wie oben angegeben, definiert sind.
Ein weitere Ausführung des erfindungsgemäßen Gegenstandes umfaßt eine Verbesserung in der Festphasensynthese einer Polypeptid-Kette an einem unlöslichen festen Träger, wobei ein N-geschützter Aminosäureteil mittels Kondensationsreaktion an einem unlöslichen festen Träger gekoppelt wird, der Substituentengruppen trägt, welche mit dem carboxy-terminalen Ende des Aminosäureteils reaktionsfähig sind, der gekoppelte N- geschützte Aminosäureteil ungeschützt gemacht wird, ein zweiter ähnlicher oder unähnlicher aktivierter N-geschützter Aminosäureteil an die ungeschützte Aminosäureverbindung gekoppelt wird, und das Verfahren bis zur Darstellung des gewünschten Polypeptids wiederholt wird, wobei die Verbesserung die Verwendung einer Verbindung als Teil der aktivierten N-geschützten Aminosäure in mindestens einer der erwähnten Reaktionen mit der Struktur
umfaßt, worin R, R', R", Z und n, wie oben angegeben, definiert sind.
Eine weitere Ausführungsfonm des erfindungsgemäßen Gegenstandes ist das Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Urethan-geschützten Aminosäure-N- carboxyanhydride, welches die Reaktion eines Aminosäure-N-carboxyanhydrids mit der Struktur:
worin
R und R' unabhängig voneinander aus der aus Wasserstoffatom, Alkyl-Gruppen, welche Cycloalkyl-Gruppen von 1 bis 12 Kohlenstoffatomen enthalten, Aryl-Gruppen von 6 bis 20 Kohlenstoffatomen, welche Aralkyl- und Alkaryl-Gruppen von 7 bis 20 Kohlenstoffatomen enthalten, bestehenden Gruppe ausgewählt sind,
R" eine Alkyl- oder Cycloalkyl-Gruppe von 1 bis 12 Kohlenstoffatomen, eine Aryl- Gruppe von 6 bis 20 Kohlenstoffatomen oder eine Aralkyl- oder eine Alkaryl-Gruppe von 7 bis 20 Kohlenstoffatomen ist,
Z ein Sauerstoffatom oder Schwefelatom ist, und n 0, 1 oder 2 ist,
mit einem Halogenformiat (oder anderen geeigneten reaktionsfähigen Formiaten, wie Azidoformiat) mit der Struktur:
R"-O- -X
worin X Chlor, Brom, Fluor, Azid usw. ist und R" Alkyl, Aryl oder Aralkyl ist, in einem inerten Verdünnungsmittel unter wasserfreien Bedingungen und in der Gegenwart von N- Methylmorpholin, umfaßt. Überraschenderweise zeigt sich, daß die Verwendung eines inerten Verdünnungsmittels, wasserfreier Bedingungen und die Auswahl von N- Methylmorpholin als Base in dieser Reaktion die Polymerisation von N-Carboxyanhydriden verhindert und im übrigen die Herstellung von bis heute nicht herstellbaren Urethan- geschützten NCA's und NTA's der höhermolekularen Aminosäuren ermöglicht.
Die Aminosäure-N-carboxyanhydride (NCA's) und -N-thiocarboxyanhydride (NTA's), welche als Ausgangsmaterialien zur Herstellung; der erfindungsgemäßen N- Urethan-geschützten NCA's und NTA's dienen, können mittels einer Anzahl von in der Fachwelt gut bekannter Verfahren hergestellt werden. Siehe zum Beispiel: Fuller et al. Biopolymers 15, No. 9, 1869-1871 (1976); Kricheldorf, Chem. Ber. 104, 87-91 (1971); und Halstrom and Kovacs, Acta Chemica Scandinavica, B 40, 462-465 (1986).
Obwohl im allgemeinen Urethane als Schutzgruppen für nucleophile Atome verwendet werden, finden nur einige von ihnen eine weit verbreitete Verwendung in Peptid- Synthesen, zum Beispiel t-Butoxycarbonyl (Boc); Benzyloxycarbonyl (Cbz); und 9- Fluorenylmethyloxycarbonyl (FMOC). Folglich finden die mit diesen Schutzgruppen substituierten Aminosäure-N-carboxyanhydride oder -N-thiocarboxyanhydride besonderes Interesse. Dementsprechend sind die NCA's der L-α-Aminosäuren sehr brauchbare Moleküle für Peptid-Synthesen, welche durch eine der oben genannten Schutzgruppen geschützt werden, wie:
worin R die Seitenkette einer α-Aminosäure ist, Z O oder S ist, und X Methoxy, Chloro oder ähnliches ist.
Wie oben erwähnt, sind die erfindungsgemäßen N-Urethan-geschützten NCA's weder mittels der Reaktion von Phosgen mit Urethan-geschützten Aminosäuren wie bei Block und Cox ("Peptides, Proc. of the 5th Europ. Symp., Oxford, September 1962". Pergamon Press 1963, Ed. G.T. Young, Seiten 84-87) beschrieben, herstellbar noch sind die N-Urethan-geschützten NCA's der höhermolekularen Aminosäuren durch die Synthese nach Kricheldorf (Makromol. Chem. Vol. 176, Seiten 905-939, 1977) herstellbar. Man fand, daß Urethan-geschützte NCA's und NTA's durch die Reaktion eines kürzlich synthesierten NCA oder NTA mit einem geeigneten Halogenformiat in einem wasserfreien, nicht störenden Lösungsmittel unter Verwendung eines tertiären Amins als Base hergestellt werden konnten. Die Reaktion wird vorzugsweise unterhalb der Raumtemperatur durchgeführt. Geeignete Lösungsmittel für die Reaktion sind Tetrahydrofuran, Ethylacetat, Methylenchlorid, Toluol, Benzol, Dioxan oder ähnliche.
Auf diese Weise können die neuen erfindungsgemäßen Urethan-geschützten Aminosäure-N-carboxyanhydride und -N-thiocarboxyanhydride durch Auflösen eines NCA in einem nicht störenden Lösungsmittel (wie Toluol) und Abkühlen der entstehenden Lösung unter Rühren hergestellt werden. Anschließend wird das erwünschte Halogenformiat (e.g. Benzylchloroformiat) auf einmal zugegeben. Man gibt zu diesem Gemisch eine tertiäre Aminbase (wie Triethylamin, Diisopropylethylamin, N-Methylmorpholin etc.) hinzu, welche die Kondensation fördert und die während der Reaktion entstehende Salzsäure wegfängt. Überraschenderweise findet man, daß bestimmte tertiäre Aminbasen wie N- Methylmorpholin, und N-Ethylmorpholin die Polymerisation von NCA's nicht fördern. Solche bevorzugten Basen sind diejenigen mit einem pK, der niedrig genug ist, um nicht die NCA-Polymerisation zu fördern, aber hoch genug ist, um die Reaktion eines NCA mit einem Halogenformiat zu katalysieren. Wenn man dementsprechend eine dieser bevorzugten Basen in der Kondensationsreaktion verwendet, wird die Polymerisation nicht initiiert. Da eine Polymerisation nicht zu befürchten ist, können die Base im Überschuß verwendet und die entstehenden Urethan-geschützten NCA's leicht mittels Kristallisation isoliert werden.
Als Ergebnis dieser Untersuchungen, kann man tatsächlich irgendein Urethan- geschütztes NCA (oder NTA) leicht mit hohen Ausbeuten und mit nur geringer Vorsicht auf Ausschluß von Feuchtigkeit herstellen. Der Verfahrensmaßstab ist ohne weiteres vergrößerbar und das Verfahren stellt dabei Produkte bereit, welche hoch kristallin sind und ohne weiteres mittels einfacher Methoden (i.e. Kristallisation) gereinigt werden können sowie lagerungsstabil (bei 25ºC mindestens 6 Monate lang und wahrscheinlich noch viel länger) sind. Auf diese Weise kann man diese Materialien wiegen, transportieren und zur Verwendung in Peptid-Synthesen ohne Angst vor Zerfall lagern.
Der Hauptvorteil ist derjenige, daß die Urethan-geschützten NCA's gegenüber anderen N-substituierten NCA's die Möglichkeit eröffnen, daß, nachdem sie zur Herstellung einer Peptid-Bindung verwendet werden, das entstehende Peptid an seinem N-Terminus durch weit verbreitete Urethan-Schutzgruppen geschützt ist, welche üblicherweise in Peptid- Synthesen verwendet werden. Diese Schutzgruppen sind in der Fachwelt als diejenigen sehr bekannt, die den am besten verfügbaren Schutz der Amino-Gruppen einer anwachsenden Peptidkette bieten.
Die Verwendung der Urethan-geschützten N-carboxyanhydride bietet alle Vorteile der unsubstituierten NCA's (hohe Reaktivität, mangelnde Bildung von unerwünschten Umgruppierungsprodukten und Bildung von CO&sub2; als einziges Nebenprodukt), aber keine der Nachteile der unsubstituierten NCA's (i.e. Instabilität, Polymerisation, und Vielfachkondensationen), die den Einsatz auf sorgfältig kontrollierte wäßrige Bedingungen beschränken würden. Die Erfindung stellt somit ein lagerbares, doch hoch reaktionsfähiges, voraktiviertes Reagenz bereit, welches zu geringen Nebenprodukten während der Bildung der Peptid-Bindung führt. Die Erfindung stellt auch einen weit verbreiteten, gut verstandenen Urethanschutz an dem Stickstoffatom des N-Terminus des Peptids nach der Kondensationreaktion dar.
Während die erfindungsgemäßen Urethan-geschützten Aminosäure-N- carboxyanhydride in Polypeptid-Synthesen mittels klassischer Methoden unter Verwendung einer Reihe von die Schutzgruppe entfernenden (Deprotection) Reaktionen und Kopplungsreaktionen verwendet werden können, finden sie unzweifelhaft eine größere Verwendung in der Festphasenpolypeptid-Synthese. Unter der Bezeichnung "Polypeptide" sind, wie in der Beschreibung und den beigefügten Ansprüchen gebraucht, Peptide und Proteine zu verstehen. Auch wird gemäß der vorliegenden Erfindung die sequentielle Peptid- Synthese insoweit zu verstehen sein, als dabei N-geschützte Aminosäuren anders als die Urethan-geschützten Aminosäure-N-carboxyanhydride ebensogut wie mindestens ein Urethan-geschütztes NCA verwendet werden können. Tatsächlich wird jedoch der in jeder Sequenz verwendete Teil der N-geschützten Aminosäure mehr als üblich die erfindungsgemäßen Urethan-geschützten NCA's sein.
In der Festphasenpolypeptid-Synthese verwendet man einen unlöslichen festen Träger oder Matrix, vorzugsweise in Bettform. Solche festen Träger können irgendwelche polymeren Festphasensubstrate sein, die herkömmlicherweise für die Synthese von Polypeptiden verwendet werden. Typischer Vertreter solcher polymeren Harze sind quervernetzte Polystyrol-Harze, Glaskügelchen, Ton, Celite, quervernetztes Dextran, Polyacrylamide, Polyamid-Harze und ähnliche unlöslich feste Träger, die entweder ursprünglich reaktive Stellen zur Kopplung mit den Aminosäureteilen enthalten oder die für solche reaktiven Stellen vorgesehen sind.
Die erfindungsgemäße Festphasenpolypetid-Synthese kann, falls erwünscht, in einem Durchflußreaktor unter Druck, wie in US. Patent Nr. 4 192 798 beschrieben, auf den hierdurch durch diese Bezugnahme hingewiesen wird, ausgeführt werden, wobei jedoch die Anwendung eines überatmosphärischen Drucks nicht erforderlich ist.
Einige vorhergehende Schritte sind erforderlich, bevor man die Festphasensynthese eines Peptids ausführen kann. Zuerst muß das Trägerharz, welches den C-terminalen Aminosäureteil der beabsichtigten Peptid-Kette enthält, vorbereitet werden. Dieses kann durch irgendein der vielen der Fachwelt bekannten Verfahren bewerkstelligt werden. Viele dieser an verschiedene feste Träger gebundenen, N-geschützten Aminosäuren sind Handelswaren und können, falls nötig, erworben werden.
Die verbleibende Synthese zur Bildung der gewünschten Polypeptid-Sequenz wird folgendermaßen ausgeführt. Bevor die Kopplung des zweiten Aminosäure-Restes erfolgt, muß der erste Rest bereits an dem Träger ungeschützt gemacht werden (deprotected). Die Deprotektion des ersten Aminosäure-Restes an dem Harz als auch jeder der nachfolgend gekoppelten Aminosäure-Reste kann so ausgeführt werden, daß man den geschützten Aminosäure-Rest mit einem geeigneten Deprotektionsmittel in Verbindung bringt. Die für diesen Zweck verwendeten Deprotektionsmittel sind der Fachwelt auf dem Gebiet der Peptid-Synthese gut bekannt, wobei das besondere in irgendeinem angegebenen Beispiel verwendete Deprotektionsmittel verständlicherweise von der Schutzgruppe an der Aminosäure/Harz abhängt. Wenn zum Beispiel die Schutzgruppe t-Butoxycarbonyl ist, kann man Trifluoressigsäure in Dichlormethan oder Salzsäure in einem geeigneten Lösungsmittel wie Dioxan verwenden. Wenn andererseits die Schutzgruppe 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl ist, werden basische Bedingungen wie Piperidin in DMF die bevorzugte Methode sein. Die Konzentrationen des besonderen Deprotektionsmittels in dem Lösungsmittel wird unterschiedlich sein, und wiederum von dem besonderen Deprotektionsmittel abhängen, wobei sie üblicherweise in einem Bereich von etwa 5 bis 50 Vol. % liegen.
Nach dem Deprotektionsschritt wird das Harz mit einem geeigneten Lösungsmittel gewaschen, um die überschüssigen Deprotektionsmittel zu entfernen. Wenn das Deprotektionsmittel eine Säure ist, muß das Peptid an dem Harz durch Waschen mit einer geeigneten Base wie Triethylamin in einem Lösungsmittel wie Dichlormethan neutralisiert werden. Überschüssiges Triethylamnin und entstandenes Triethylammoniumchlorid oder Trifluoracetat können durch wiederholtes Waschen mit einem geeigneten Lösungsmittel wie Dichlormethan oder Dimethylformamid entfernt werden. Das auf diese Weise freie Amin kann nun der Kopplung mit der nächsten N-geschützten Aminosäure unterworfen werden.
Falls die nächste N-geschützte Aminosäure ein erfindungsgemäßes Urethan- geschütztes Aminosäure-N-carboxyanhydrid ist, muß es nicht aktiviert werden und kann direkt mit dem Träger umgesetzt werden, der nun die ungeschützte am Harz gebundene Aminosäure aufweist. Wenn jedoch der N-geschützte Aminosäureteil nach herkömmlicheren Verfahren gekoppelt werden soll, ist eine Aktivierung zuerst erforderlich, was das Überführen in eine reaktionsfähige Form bedeutet, zum Beispiel durch Überführen der Aminosäure in ein Anhydrid oder durch Aktivieren mit Dicyclohexylcarbodiimid, Carbonyldiimidazol oder andere Aktivierungsmittel. Im allgemeinen verwendet man einen Überschuß an aktiviertem N-geschütztem Aminosäureteil in der Reaktion.
Nach Kopplung des zweiten Aminosäureteils an den ersten Aminosäureteil wird anschließend das gekoppelte geschützte Dipeptid ungeschützt gemacht und, falls nötig, neutralisiert sowie, wie oben beschrieben, gewaschen, bevor die Kopplung des nächsten Aminosäurederivats ausgeführt wird. Dieses Verfahren wird wiederholt, bis sich die gewünschte Sequenz der Aminosäuren an den unlöslichen Träger befindet.
Aufgrund des Fehlens unerwünschter Nebenreaktionen und Nebenprodukten (CO&sub2; ist das einzige) bei der Urethan-geschützten NCA-Kopplung und wegen ihrer Stabilität kann das in der Kopplungsreaktion verwendete überschüssige Urethan-geschützte NCA leicht regeneriert, rekristallisiert und erneut verwendet werden, was auf diese Weise Kostengünstigkeit dieser Materialien merklich erhöht.
Das vervollständigte Peptid kann von dem unlöslichen Träger mittels Standardverfahren, wie Abspalten mit wasserfreier Fluorwasserstoffsäure, Transesterifikation, Aminolyse etc. entfernt werden.
Nach Abspaltung stellt man fest, daß das hergestellte Peptid bemerkenswert homogen ist und keine oder nur einer geringen Reinigung bedarf. Aufgrund der sehr geringen Anwesenheit von Nebenprodukten ist die Gesamtausbeute überraschenderweise hoch und, wenn überhaupt, ist die Reinigung anschließend recht leicht durchzuführen. Solche Reinigungen werden vorzugsweise mittels Verteilungschromatographie, Ionenaustauschchromatographie, oder durch Kombination beider Verfahren durchgeführt. Solche Verfahren sind der Fachwelt auf dem Gebiet der Peptidsynthesen gut bekannt.

Beispiel I

N-Carboxyanhydrid-Zerfall als eine Funktion einer Base

A. Valin-N-carboxyanhydrid (72 mg) wurde in trockenem, destilliertem Tetrahydrofuran (2 ml) aufgelöst und Triethylamin (30 ul) wurde zugegeben. Das Verschwinden von dem NCA wurde mittels Infrarotspektroskopie verfolgt.
B. Valin-N-carboxyanhydrid (72 mg) wurde in Tetrahydrofuran (2 ml) aufgelöst und N-Methylmorpholin (25 ul) wurde zugegeben. Das Verschwinden von dem NCA wurde mittels Infrarotspektroskopie verfolgt.
Die Ergebnisse von A und B werden in der graphischen Darstellung von Fig. 1 dargestellt.

Beispiel II

N-(9-Fluorenylmethyloxycarbonyl)-L-alanin-N-carboxyanhydrid

A. Ein Gemisch von L-Alanin (40,3 g, 0,45 mol) und Phosgen (275 ml einer 3,3 m Lösung in Tetrahydrofuran, 0,90 mol) wurde bei 62-64ºC 24 Stunden lang gerührt. Die entstehende Lösung ließ man auf Raumtemperatur abkühlen, filtrierte und entfernte die flüchtigen Stoffe unter erniedrigtem Druck. Das entstehende Öl wurde in 100 ml Tetrahydrofuran aufgelöst und 300 ml Hexan wurde unter Rühren zugegeben, gefolgt von einem Abkühlen auf -20ºC. Die Ausbeute an L-Alanin-N-carboxyanhydrid betrug 35,79 g (69 %).
B. Eine Lösung aus N-Methylmorpholin (8,15 g, 80,5 mmol) in Toluol (50 ml) wurde einem 0ºC-Gemisch aus L-Alanin-N-carboxyanhydrid (8,84 g, 76,8 mmol) und 9- Fluorenylmethyloxycarbonyl-chlorid (19,9 g, 76,8 mmol) in Toluol (200 ml) hinzugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde bei 0ºC 2 Stunden lang gerührt und filtriert. Das Lösungsmittelvolumen wurde auf 20 ml verringert und nach Zugabe von 100 ml Hexan fand eine Kristallisation statt, um eine Ausbeute von 21,4 g (82 %) 9-Fluorenylmethoxycarbonyl- L-alanin-N-carboxyanhydrid als Rohprodukt zu ergeben. Das Produkt wurde durch Zerreiben in Gegenwart von kaltem Diisopropylether, gefolgt von einer Rekristallisation aus Ethylacetat/Hexan, gereinigt: Schmelzpunkt 106-107ºC; IR (CH&sub2;Cl&sub2;) 1870, 1801,1740 cm&supmin;¹; NMR (CDCl&sub3;) δ 6,90-7,80 (m, 8 H), 3,95-4,55 (m, 4H), 1,35 (d, J = 7 Hz, 3 H). Anal. Berechnung für C&sub1;&sub9;H&sub1;&sub5;NO&sub5;: 67,65; H 4,48; N, 4,15. Gefunden: C, 67,73; H, 4,65; N 4,19.

Beispiel III

N-(9-Fluorenylmethyloxycarbonyl)-L-leucin-N-carboxyanhydrid

A. L-Leucin-N-carboxyanhydrid wurde aus L-Leucin mit 78 % Ausbeute nach dem in Beispiel IIA offenbarten Verfahren hergestellt.
B. Ein Gemisch aus L-Leucin-N-carboxyanhydrid (9,2 g, 58,4 mmol) und 9- Fluorenylmethyloxycarbonylchlorid (15,1 g, 58,4 mmol) in Toluol (125 ml) wurde auf 0ºC gekühlt und eine Lösung aus N-Methylmorpholin (6,5 g, 64 mmol) in 20 ml Toluol wurde tropfenweise zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde bei 0ºC 2,5 Stunden lang gerührt, filtriert und die Lösungsmittelvolumen auf 20 ml verringert. Hexan (480 ml) wurde zugegeben, und die Lösung auf -20ºC über Nacht gekühlt, um 18,8 g (85 %) N-(9- Fluorenylmethyloxycarbonyl)-L-leucin-N-carboxyanhydrid zu ergeben. Eine analytische Probe wurde durch Rekristallisation aus Ether/Methylenchlorid/Hexan erhalten: Schmelzpunkt 118-120ºC; NMR (CCl&sub4;) δ 7,35-7,91 (m, 8 H); 4,72 (t, J = 7 Hz, 2 H); 4,58 (m, 3 H); 4,37 (t, J = 7 Hz, 1 H); 2,05 (m, 2 H); 1,09 (t, J = 6 Hz, 6 H). Anal. Berechnung für C&sub2;&sub2;H&sub2;&sub1;NO&sub5;: 69,64; H 5,58; N, 3,69. Gefunden: C, 69,08; H, 5,97; N, 3,70.

Beispiel IV

N-α-(9-Fluorenylmethyloxycarbonyl-N-&epsi;-t-butoxycarbonyl-L-lysin-N-carboxyanhydrid

A. Ein Gemisch aus N-&epsi;-t-Butyloxycarbony-L-lysin (1,23 g, 5,0 mmol) und Chlorotrimethylsilan (1,08 g, 10,0 mmol) in Tetrahydrofuran (50 ml) wurde auf 0ºC gekühlt und eine Lösung aus Triethylamin (1,01 g, 10,0 mmol) in 5 ml Tetrahydrofuran tropfenweise zugegeben. Das Gemisch wurde bei 0ºC 2,5 Stunden lang gerührt, filtriert und einer Lösung aus Phosgen (10 mmol) in 15 ml Tetrahydrofuran hinzugegeben. Die Temperatur wurde auf 60ºC erhöht und die Lösung 2,0 Stunden lang, anschließend über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die flüchtigen Stoffe wurden durch Rotationsverdampfung entfernt, um 0,79 g (58 %) N-&epsi;-t-Butyloxycarbonyl-L-lysin-N-carboxyanhydrid zu ergeben: IR (CH&sub2;Cl&sub2;) 1860, 1795, 1710 cm&supmin;¹.
B. Ein Gemisch aus N-&epsi;-t-Butyloxycarbonyl-L-lysin-N-carboxyanhydrid (0,79 g, 2,90 mmol) und 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl-chlorid (0,75 g, 2,90 mmol) in Toluol (25 ml) wurde auf 0ºC gekühlt und eine Lösung von N-Methylmorpholin (0,32 g, 3,2 mmol) in Toluol (5 ml) tropfenweise zugegeben. Die Ansatz wurde nach Beispiel IIIB aufgearbeitet, um 0,88 g (66 %) N-α-(9-Fluorenylmethyloxycarbonyl)-N-&epsi;-t-butyloxycarbonyl-L-lysin-N- carboxyanhydrid zu ergeben: Schmelzpunkt 81-85ºC (Ethylacetat/Hexan); NMR (CDCl&sub3;) δ 7,3-7,7 (m, 8 H); 4,11-4,58 (m, 5 H), 2,95-3,20 (m, 2 H); 1,90-1,98 (m, 2 H); 0,9-1,4 (m. 13 H); Anal. Berechnung für C&sub2;&sub7;H&sub3;&sub0;N&sub2;O&sub7;: C, 65,57; H 6,11; N, 5,67. Gefunden: C, 66,33; H, 6,38; N, 5,67.

Beispiel V

N-Benzyloxycarbonyl-L-alanin-N-carboxyanhydrid

Eine Lösung aus N-Methylmorpholin (1,06 g, 10,5 mmol) in Ethylacetat (20ml) wurde tropfenweise einem Gemisch aus L-Alanin-N-carboxyanhydrid (aus IIA) (0,81 g, 7,0 mmol) und Benzyloxycarbonyl-chlorid (1,89 g, 10,5 mmol) in Ethylacetat (80 ml) bei 0ºC zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 1,5 Stunden lang bei 0ºC gerührt, filtriert, und das Lösungsvolumen auf 75 ml verringert. Hexan (75 ml) wurde unter Rühren zugegeben, gefolgt von Abkühlen auf -20ºC, um 1,20 g (71 %) N-Benzyloxycarbonyl-L-alanin-N- carboxyanhydrid zu ergeben: Schmelzpunkt 101-104ºC; NMR (CDCl&sub3;) δ 7,33 (s, 5 H), 5,27 (s, 2 H), 4,60 (q, J = 7 Hz, 1 H); 1,61 (d, J = 7 Hz, 3 H). Anal. Berechnung für C&sub1;&sub2;H&sub1;&sub1;NO&sub5;: C, 57;83; H 4,45; N, 5,62. Gefunden: C, 57,60; H, 4,50; N, 5,53.

Beispiel VI

N-Benzyloxycarbonyl-L-leucin-N-carboxyanhydrid

Eine Lösung aus N-Methylmorpholin (0,76 g, 7,50 mmol) in Ethylacetat (10 ml) wurde tropfenweise einer Lösung aus L-Leucin-N-carboxyanhydrid (0,79 g, 5,0 mmol) (aus IIIA) und Benzyloxycarbonyl-chlorid (1,35 g, 7,50 mmol) in Ethylacetat (50 ml) bei 0ºC zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde bei 0ºC 1,25 Stunden lang gerührt, filtriert und das Lösungsvolumen auf 5 ml verringert. Hexan (50 ml) wurde zugegeben, gefolgt von Abkühlen auf -20ºC, um 0,89 g (61 %) N-Benzyloxycarbonyl-l-leucin-N-carboxyanhydrid zu ergeben: Schmelzpunkt 72-73,5ºC (Ether/Hexan); NMR (CDCl&sub3;) δ 7,40 (s, 5 H), 5,33 (s, 2 H), 4,71 (t, J = 6 Hz, 1 H), 1,80-2,04 (m, 3 H), 0,91 (m, 6 H). Anal. Berechnung für C&sub1;&sub5;H&sub1;&sub7;NO&sub5;:.C, 61,84; H, 5,88; N, 4,81. Gefunden: C, 61,64; H, 6,02; N, 4,90.

Beispiel VII

N-Phenyloxycarbonyl-L-valin-N-carboxyanhydrid

A. L-Valin-N-carboxyanhydrid wurde aus L-Valin mit einer Ausbeute von 75 % nach Verfahren, beschrieben in Beispiel IIA, hergestellt.
B. Beispiel V wurde wiederholt, wobei Phenylchloroformiat Benzylchloroformiat und Valin-N-carboxyanhydrid Leucin-N-carboxyanhydrid ersetzten. Das Ergebnis war eine 78 % Ausbeute an N-Phenyloxycarbonyl-L-valin-N-carboxyanhydrid: Schmelzpunkt 105- 106ºC (Chloroform/Hexan); NMR (CDCl&sub3;) δ 7,30 (m, 5 H), 4,70 (d, J= 3,5 Hz, 1 H), 2,60 (m, 1 H), 1,22 (d, J=7Hz), 3H), 1,07 (d, J=7Hz, 3 H), 1,07 (d, J=7Hz, 3H). Anal. Berechnung für C&sub1;&sub2;H&sub1;&sub3;NO&sub5;: C, 59,31; H, 4,98; N, 5,32. Gefunden: C, 59,09; H, 4,91; N, 5,49.

Beispiel VIII

N-Ethyloxycarbonyl-L-alanin-N-carboxyanhydrid

Beispiel V wurde wiederholt, wobei Ethylchloroformiat Benzylchloroformiat ersetzte. Das Ergebnis war eine 62 % Ausbeute an N-Ethyloxycarbonyl-L-alanin-N- carboxyanhydrid: Schmelzpunkt 72-73,5 ºC (Ethylacetat/Hexan); NMR (CDCl&sub3;) δ 4,73 (q, J = 7 Hz, 2H), 4,33 (q, J = 7 Hz, 1 H), 1,70 (d, J = 7 Hz, 3H), 1,33 (t, J = 7 Hz, 3H). Anal. Berechnung für C&sub7;H&sub9;NO&sub5;: C, 44,92; H, 4,85; N, 7,49. Gefunden: C, 45,08; H, 5,03; N, 7,33.

Beispiel IX

Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanin-N-carboxyanhydrid

A. L-Phenylalanin-N-carboxyanhydrid wurde aus L-Phenylalanin mit einer Ausbeute von 53 % nach dem Verfahren, beschrieben in Beispiel IIA, hergestellt.
B. Zu einer Lösung aus L-Phenylalanin-N-carboxyanhydrid (2,5 g, 13 mmol) und Benzylchloroformiat (3,4 g, 20 mmol) in Ethylacetat (130 ml) wurde tropfenweise eine Lösung aus N-Methylmorpholin (2,0 g, 20 mmol) in Ethylacetat (10 ml) bei 0ºC zugegeben. Das entstehende Gemisch wurde bei 0ºC 2,5 Stunden gerührt und, wie Beispiel V beschrieben, aufgearbeitet, um 2,0 g (48 %) N-Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanin-N- carboxyanhydrid zu ergeben: Schmelzpunkt 108-1009ºC; NMR (CDCl&sub3;) δ 7,35 (s, 5 H), 7,00 (m, 5 H), 5,31 (s, 2 H), 4,83 (m, 1 H), 3,28 (m, 2H). Anal. Berechnung für C&sub1;&sub8;H&sub1;&sub7;NO&sub5;: C, 68,13; H, 5,40; N, 4,42. Gefunden: C, 68,11; H, 5,38; N, 4,20.

Beispiel X

Phenyloxycarbonyl-L-alanin-N-thiocarboxyanhydrid

A. O-Ethyl-S-methylxanthat. Man gab zu einer Lösung aus Kaliumethylxanthat (16,0 g, 100 mmol) in Wasser (50 ml) tropfenweise Dimethylsulfat (12,6 g, 100 mmol) bei 4 +/- 1ºC hinzu. Nach vollständiger Zugabe wurde das Reaktionsgemisch mit Dichlormethan (2 x 40 ml) gewaschen und die vereinigten organischen Fraktionen wurden getrocknet (MgSO&sub4;) und ankonzentriert. Der ölartige Rückstand wurde in Methanol aufgelöst und ankonzentriert, um O-Ethyl-S-methylxanthat mit hinreichender Reinheit zur Verwendung in dem nächsten Schritt zu ergeben.
B. Ethoxycarbonyl-L-alanin. Man gab zu dem, wie oben angegeben, hergestellten O- Ethyl-S-methylxanthat eine Lösung aus L-Alanin (8,9 g, 100 ml) und NaOH (4,0 g, 100 mmol) in Wasser (100 ml) hinzu. Die Lösung wurde auf 45ºC 2,3 Stunden lang erhitzt. Während mit N&sub2; ausgetrieben wurde, gab man Methanol (50 ml) hinzu und rührte das Gemisch bei 45ºC zusätzlich 0,7 Stunden lang. Das Reaktionsgemisch ließ man auf Raumtemperatur abkühlen, wusch mit Dichlormethan (3 x 25 ml), säuerte auf pH 2,5 mit konzentrierter HCl an und extrahierte mit Ethylacetat (2 x 50 ml). Die vereinigten organischen Lösungen wurden getrocknet (MgSO&sub4;) und ankonzentriert. Die Zugabe von Hexan zu dem entstehenden Öl ergab 9,5 g (54 %) Ethyloxythiocarbonyl-L-alanin als farblose Festsubstanz, welche bei 74-78ºC schmolz. Diese Substanz l wurde weiter gereinigt mittels Rekristallisation aus Ether/Hexan: Schmelzpunkt 77-79ºC: IR (CCl&sub4;) 3397, 1716 cm&supmin;¹.
C. L-Alanin-N-thiocarboxyanhydrid. Man gab in einer Lösung aus Ethyloxythiocarbonyl-L-alanin (3,0 g, 17 mmol) und Imidazol (1,2 g, 17 mmol) in THF (20 ml) tropfenweise PBr&sub3; (5,4 g, 20 mmol) bei 20ºC. hinzu. Das Rühren wurde fortgesetzt, bis die feste Masse eine feine Suspension ergab. Das Reaktionsgemisch wurde in eine Mischung aus gesättigtem NaHCO&sub3; (200 ml) und Ethylacetat (150 ml) überführt. Die organische Schicht wurde getrennt, mit 1 m HCl (2 x 100 ml), gesättigtem NaHCO&sub3; (100 ml) und Salzlösung (100 ml) gewaschen, getrocknet (MgSO&sub4;) und ankonzentriert. Das entstehende Öl verfestigte sich beim Stehenlassen. Rekristallisation der Festsubstanz ergab 0,75 g (34 %) L-Alanin-N-thiocarboxyanhydrid: Schmelzpunkt (CCl&sub4;) 1750, 1695 cm&supmin;¹.
D. Phenyloxycarbonyl-L-alanin-N-thiocarboxyanhydrid. Man gab einer Lösung aus L-Alanin-N-thiocarboxyanhydrid (0,49 g, 3,8 mol) in 50 ml Ethylacetat Phenylchloroformiat (0,95 g, 6,1 mmol) bei 0ºC hinzu, gefolgt von der tropfenweisen Zugabe einer Lösung N- Methylmorpholin (0,57 g, 5,6 mmol) in Ethylacetat (10 ml) bei 0ºC. Das entstehende Gemisch wurde bei 0ºC 3 Stunden lang gemischt, filtriert und zu einer weißen halbfesten Substanz ankonzentriert. Die halbfeste Substanz wurde in 20 ml Ethylacetat aufgelöst, Hexan wurde hinzugegeben und das Gemisch auf -20ºC abgekühlt, um 0,55 g (62 %) Phenyloxycarbonyl-L-alanin-N-thiocarboxyanhydrid zu ergeben: Schmelzpunkt 110-111ºC; NMR (CDCl&sub3;) δ 7,18 (m,5H), 4,83 (q, 1H, J=7Hz), 1,71 (d, 3H, J=7Hz),), IR (CH&sub2;CL&sub2;) 1810, 1740 (Dublett), 1715 (Schulter). Anal. Berechnung für C&sub1;&sub1;H&sub9;NO&sub4;S: C, 52,58; H, 3,61; N, 5,58; S 12,76. Gefunden: C, 52,75; H, 3,72; N, 5,36; S 12,98.

Beispiel XI

N-(9-Fluorenylmethyloxycarbonyl)-O-t-butyl-L-threonin-N-carboxyanhydrid

A. O-t-Butyl-L-threonin-N-carboxyanhydrid wurde aus O-t-Butyl-L-threonin mit einer Ausbeute von 57 % unter Verwendung des Trimethylsilyl-Verfahrens, beschrieben in Beispiel IVA, hergestellt.
B. Man gab einer Lösung aus O-t-Butyl-L-threonin-N-carboxyanhydrid (0,80 g, 4,0 mmol) und 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl-chlorid (1,0 g, 4,0 mol) in Toluol (50 ml) tropfenweise eine Lösung aus N-Methylmorpholin (0,49 g, 4,8 mmol) in 8 ml Toluol bei 0ºC hinzu. Das Ansatz wurde bei 0ºC 3 Stunden lang gerührt, filtriert und die flüchtigen Stoffe unter erniedrigtem Druck entfernt. Der Rückstand wurde aus Ether/Hexan kristallisiert, um 1,0 g (60 %) N-(9-Fluorenylmethyloxycarbonyl)-O-t-butyl-L-threonin zu ergeben: Schmelzpunkt 124-127 ºC; NMR (CDCl&sub3;) δ 7,08-7,78 (m, 8 H), 4,05-4,61 (m, 4 H), 1,18 (s, 9H), 1,16 (d, 3H, J = 7 Hz). Anal. Berechnung für C&sub2;&sub4;H&sub2;&sub5;NO&sub6;: C, 68,07; H, 5,95; N, 3,31. Gefunden: C, 67,89; H, 5,96; N, 3,28.

Beispiel XII

Ethyloxycarbonyl-α-aminoisobuttersäure-N-carboxyanhydrid

A. α-Aminoisobuttersäure-N-carboxyanhydrid wurde mit 67 % Ausbeute nach dem Verfahren, beschrieben in Beispiel IIA, hergestellt.
B. Beispiel VIIIB wurde wiederholt, wobei α-Aminoisobuttersäure-N- carboxyanhydrid-L-Alanin-N-carboxyanhydrid ersetzte, um eine 16 % Ausbeute an Ethyloxycarbonyl-α-aminoisobuttersäure-N-carboxyanhydrid zu ergeben: Schmelzpunkt 68-70ºC (Chloroform/Hexan); NMR (CCl&sub4;) δ 4,59 (q, 2 H, J = 7 Hz), 2,00 (s, 6 H), 1,65 (t, 3 H, J = 7 Hz). Anal. Berechnung für C&sub8;H&sub1;&sub1;NO&sub5;: C, 47,76; H, 5,51; N, 6,96. Gefunden: C,47,67; H, 5,51; N, 7,14.

Beispiel XIII

N-t-Butyloxycarbonyl-L-alanin-N-carboxyanhydrid

Man gab einer Lösung aus t-Butylalkokol (1,25 g, 16,9 mmol) und Phosgen (3,4 ml einer 5 m Lösung in Dioxan, 17 mmol) in 80 ml Ethylacetat tropfenweise N- Methylmorpholin (3,4 g, 34 mmol) bei -50ºC hinzu. Das Reaktionsgemisch wurde 0,5 Stunden lang gerührt. L-Alanin-carboxyanhydrid (0,23 g, 2,0 mmol) in Ethylacetat (10 ml) wurde zugesetzt und das Gemisch bei -50ºC zusätzlich 0,5 Stunden lang gerührt. N- Methylmorpholin (1,0 g, 10 mmol) wurde zugesetzt und das Rühren für weitere 0,75 Stunden bei -50ºC fortgesetzt. Die Feststoffe wurden mittels Filtration entfernt, die Lösung wurde ankonzentriert und das Produkt nach Zerreiben in Gegenwart von Hexan erhalten. Rekristallisation aus Toluol ergab 0,28 g (65 %) N-t-Butyloxycarbonyl-L-alanin-N- carboxyanhydrid. Schmelzpunkt 103-104,5ºC; NMR (CDCl&sub3;) δ 4,71 (q, 1 H, J = 7 Hz), 1,80 (d, 3 H, J = 7 Hz), 1,70 (s, 9 H). Anal. Berechnung für C&sub8;H&sub1;&sub3;NO&sub5;: C, 50,23; H, 6,09; N, 6,51. Gefunden: C. 50,66; H, 6,36; N, 6,38.

Beispiel XIV

N-(t-Butyloxycarbonyl)-O-benzyl-L-serin-N-carboxyanhydrid

A. O-Benzyl-L-serin-N-carboxyanhydrid wurde mit einer 68 % Ausbeute nach dem Verfahren nach Beispiel IIA hergestellt.
B. Beispiel XIII wurde wiederholt, wobei Benzyl-L-serin-N-carboxyanhydrid-L- Alanin-N-carboxyanhydrid ersetzte, um N-(t-Butyloxycarbonyl)-O-benzyl-L-serin-N- carboxyanhydrid mit 52 %Ausbeute zu ergeben: Schmelzpunkt 98-99,5ºC; NMR (CCl&sub4;) δ 7,30 (m, 5 H), 4,64 ( m, 3 H, Benzyl CH&sub2; und NCA Ring Proton), 4,09 (dd, 1 H, J = 15, 5 Hz), 3,88 (dd, 1 H, J = 1 S, 5 Hz), 1,65 (s, 9 H); Anal. Berechnung für C&sub1;&sub5;H&sub1;&sub9;NO&sub6;: C, 59,80; H, 5,96; N, 4,36. Gefunden: C, 59,71; H; 6,25; N, 4,05.

Beispiel XV

Phenyloxycarboxy-Ableitung von 1-Amino-1-cyclohexancarbonsäure-N-carboxyanhydrid

A. 1-Amino-1-cyclohexancarbonsäure-N-carboxyanhydrid wurde aus 1-Amino-1- cyclohexancarbonsäure mit 50 % Ausbeute nach dem Verfahren nach Beispiel IIA hergestellt.
B. Man gab einer Lösung aus N-Carboxyanhydrid, hergestellt in A, (0,85 g, 5,0 mmol) und Phenylchloroformiat (1,2 g, 7,5 mmol) in Ethylacetat (30 ml) bei 0ºC eine Lösung aus N-Methylmorpholin (0,76 g, 7,5 mmol) in 8 ml Ethylacetat hinzu. Das Reaktionsgemisch wurde bei 0ºC 2 Stunden lang gerührt und ankonzentriert. Der weiße, halbfeste Rückstand wurde aus Ethylether/Methylenchlorid/Hexan rekristallisiert,um 0,92 g (66%) N-Carboxyanhydrid zu ergeben: Schmelzpunkt 156,5-158ºC; NMR (CDCl&sub3;) δ 7,28 (m, 5H), 1,20-3,10 (m, 10H). Anal. Berechnung für C&sub1;&sub5;H&sub1;&sub5;NO&sub5;: C, 62,27; H, 5,23; N, 4,84. Gefunden: C. 62,03; H, 5,22; N, 4,77.

Beispiel XVI

N-(9-Fluorenylmethyloxycarbonyl)-L-leucin-N-carboxyanhydrid

A. L-Leucin-N-carboxyanhydrid wurde aus L-Leucin mit 78 % Ausbeute nach Verfahren in Beispiel IIA hergestellt.
B. Ein Gemisch aus Leucin-N-carboxyanhydrid (9,2 gm, 58,4 mmol) in trockenem, destilliertem Ethylacetat (150 ml) wurde auf -10ºC gekühlt und eine Lösung aus Triethylamin (9 ml, 64 mmol) in 20 ml Ethylacetat wurde tropfenweise über 5 Minuten zugegeben. Das Kühlen wurde beendet und den Ansatz ließ man 15 Minuten lang rühren. Eine kleine Menge wasserfreier Salzsäure in Dioxan (4,4 m, 5 ml) wurde hinzugegeben, um sicherzustellen, daß das gesamte Trithylamin neutralisiert wurde. Der Ansatz wurde filtriert und das Lösungsmittel unter Vakuum entfernt. Das entstehende Rohprodukt wurde in Ethylether aufgenommen, filtriert und das Produkt mittels Kristallisation nach Zugabe zu Hexan erhalten.
Nach drei zusätzlichen, sorgfältigen Kristallisationen wurde N-(9-Fluorenylmethyloxycarbonyl)-L-leucin-N-carboxyanhydrid in einer Ausbeute von 16 % (3,6 g) erhalten. Analytische Ergebnisse waren mit denen von Beispiel III erhaltenen im wesentlichen identisch.

Beispiel XVII

L-Leucyl-l-valin

Man gab 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl-L-valin, verestert an p-Alkoxybenzylalkohol des derivatisierten 2 % quervernetzten Polystyrols (0,25 g, 0,13 mmol Valin) in ein Festphasenpeptid-Synthesegefäß. Dimethylformamid (5 ml) wurde zugegeben und die Aufschlämmung 30 Minuten lang geschüttelt. Das Dimethylformamid wurde entfernt und das gequollene Harz zweimal mit 10 % Piperidin in Dimethylformamid (5 ml 5 Minuten lang, gefolgt von 5 ml 15 Minuten lang) behandelt, um die 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl- Schutzgruppe zu entfernen. Das Harz wurde mit Dimethylformamid (4 x 5 ml) gewaschen und mit 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl-L-leucin-N-carboxyanhydrid (145 mg, 0,38 mmol) in Dimethylformamid (6 ml) 45 Minuten lang umgesetzt, die Fluorenylmethyloxycarbonyl- Schutzgruppe wurde, wie oben erwähnt, entfernt und das Harz mit Dimethylformamid (3 x 5 ml) und Methylenchlorid (3 x 5 ml ) gewaschen. Das entstehende Dipeptid wurde von dem Harz abgespalten mittels einer 45 minütigen Behandlung mit Methylenchlorid/Trifluoressigsäure (6 ml, 1/1). Die Lösung wurde entnommen und das Harz mit Methylenchlorid (3 x 5 ml) und Methanol (2 x 5 ml) gewaschen. Die vereinigten Lösungs- und Waschfraktionen wurden im Vakuum zu einem halbfesten Stoff eingeengt, welcher in destilliertem Wasser aufgenommen und filtriert wurde. Die wäßrige Lösung wurde gefriergetrocknet, der entstehende Feststoff wurde mit Ether (3x) zerrieben, um Harz bedingte Verunreinigungen zu entfernen, und unter erniedrigtem Druck getrocknet um L- Leucyl-L-valin in einer Ausbeute von > 90 % zu ergeben. Die Identität des Dipetids wurde mittels HPLC-Analyse (Flußrate = 1,5 ml/min, Nachweis bei 215 nm, 30 % Methanol in 0,5 m Perchlorsäure) durch Co-elution mit einem bekannten Standard (Retentionszeit 8,49 Minuten) bestätigt. Die Reinheit wurde als > 97 % bestimmt wobei Gesamtverunreinigungen vom Harz herrührten. Kein D-Leucyl-L-valin (Retentionszeit 32 Minuten) konnte bestimmt werden (Nachweisgrenzen < 0,1 %).

Beispiel XVIII

L-Leucyl-L-valin

Beispiel XVI wurde wiederholt, außer daß 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl-L-leucin- N-cartboxyanhydrid mit dem freien Amin von L-Valin an dem Harz reagierte unter Verwendung von Methylenchlorid (5 ml) statt Dimethylformamid als Lösungsmittel. Das Ergebnis war mit dem von Beispiel XVI vergleichbar.

Beispiel XIX

L-Leucyl-L-alanyl-l-Valin (FMOC-Verfahren)

Das Verfahren von Beispiel XVI wurde verwendet, um L-Leucyl-L-alanyl-L-valin herzustellen. Nach Abspaltung von dem Harz und Ether-Waschungen wurde das Tripeptid in einer Ausbeute von > 88 % als ein weißer Feststoff erhalten. HPLC-Analysen, unterVerwendung der oben in Beispiel XVI genannten Bedingungen bestätigten die Identität des Produktes, welches mit einem bekannten Standard co-eluiert wurde. (Retentionszeit 16,28 Minuten). Deletionssequenzen wie L-Leucyl-L-valin und L-Alanyl-L-valin waren nicht festzustellen (Nachweisgrenzen < 0,1 %).

Beispiel XX

L-Leucyl-L-alanyl-L-valin (BOC-Verfahren)

Man gab t-Butyloxycarbonyl-L-valin, verestert an methyliertem 2 % quervernetztem Polystyrol (i.e. Merrifield-Harz) (0,50 gm 0,23 mmol Valin), in ein Festphasenpeptid- Synthesegefäß. Methylenchlorid (5 ml) wurde zugegeben und die Aufschlämmung 30 Minuten lang geschüttelt. Das Lösungsmittel wurde entfernt und das Harz mit Methylenchlorid/Trifluoressigsäure (6 ml von 1/1) 30 Minuten lang behandelt, um die t- Butyloxycarbonyl-Schutzgruppe zu entfernen. Das Harz wurde mit Methylenchlorid (3 x 5 ml) gewaschen, mit 10 % Triethylamin in Methylenchlorid (5 ml) neutralisiert, mit Methylenchlorid gewaschen (3 x 5 ml) gewaschen und anschließend mit einer Lösung t- Butyloxycarbonyl-L-alanin-N-carboxyanhydrid (200 mg, 1,0 mmol) in Methylenchlorid (5 ml) 45 Minten lang umgesetzt. Das entstehende geschützte Dipeptid-Harz wurde mit Methylenchlorid (3 x 5 ml) gewaschen. Das Harz wurde wieder abgetrennt, gewaschen, neutralisiert und gewaschen, wie oben beschrieben. t-Butyloxycarbonyl-L-leucin-N- carboxyanhydrid (240 mg, 1,0 mmol) in Methylenchlorid (6 ml) wurde dem Harz hinzugegeben und das Gemisch 45 Minuten lang geschüttelt. Die Lösung wurde abgetrennt und das Harz mit Methylenchlorid (3 x 5 ml), Methanol (3 x 5 ml) und Methylenchlorid (3 x 5 ml) gewaschen und unter starkem Vakuum getrocknet. Das t-Butyloxycarbonyl-geschützte Tripeptid-Harz wurde mit Fluorwasserstoffsäurelösung bei 0ºC 30 Minuten umgesetzt. Die Fluorwasserstoffsäure wurde entfernt und der Rückstand unter starkem Vakuum getrocknet. Das Peptid wurde in Wasser aufgenommen und das Harz mittels Filtration entfernt. Die Lösung wurde gefriergetrocknet, um eine nahezu quantitative Ausbeute an L-Leucyl-L- alanyl-L-valin zu ergeben. Die Ergebnisse der HPLC Analysen waren mit denen von Beispiel XVIII vergleichbar.

Beispiel XXI

L-Alanyl-L-phenylalanin (mittels Vollschutzverfahren)

A-. Man gab zu L-Phenylalanin-benzylester-p-Toluolsulfonat (1,07 g, 2,5 mmol) in Tetrahydrofuran (20 ml) bei 0ºC N-Methylmorpholin (0,25 g, 2,5 mmol) hinzu. Das Gemisch wurde 0,5 Stunden lang bei 0ºC gerührt und N-Benzyloxycarbonyl-L-alanin-N- carboxyanhydrid (0,50 g, 2,0mmol) wurde hinzugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 2 Stunden lang bei 0ºC gerührt und Wasser (20 ml) und Dichlormethan (50 ml) hinzugegeben. Die Schichten wurden abgetrennt und die wäßrige Schicht mit Dichlormethan (25 ml) gewaschen. Die vereinigten organischen Fraktionen wurden mit 0,5 m HCl (2 x 50 ml), 10 % Natriumbicarbonat (50 ml) und Wasser (2 x 50 ml) gewaschen, getrocknet (MgSO&sub4;) und ankonzentriert. Eine Kristallisation fand nach Zugabe von Hexan statt, um 0,66 g (72 %) N-Benzyloxycarbonyl-L-alanyl-L-phenylalanin-benzylester zu ergeben: Schmelzpunkt 118,5-119ºC; NMR (CDCl&sub3;) δ 7,64 (s, 1 H), 6,82-7,39 (m, 6H), 5,04 (s, 2 H), 5,00 (s, 2 H), 4,58-4,92 (m, 2H), 3,07 (d, J = 6 Hz, 2H), 1,29 (d, J = 7 Hz, 3 H).
B. Ein Gemisch aus N-Benzyloxycarbonyl-L-alanyl-L-phenylalanin-benzylester (0,50 g, 1,1 mmol) und 10 % Pd Palladium auf Kohlenstoff (0,1 g) in Ethylalkohol (150 ml) wurde in einem Parr Hydrierapparat 6,5 Stunden lang bei 20ºC geschüttelt. Das Reaktionsgemisch wurde filtriert und das Filtrat mit Wasser (100 ml) gespült. Die Lösung wurde ankonzentriert, um 0,26 g (100 %) L-Alanyl-L-Phenylalanin zu ergeben. HPLC-Analysen zeigten eine Reinheit von > 99% und keinen Nachweis von Racemisierung.

Beispiel XXII

L-Alanyl-L-phenylalanin( mittels Teilschutzverfahren)

A. Man gab einer Lösung aus L-Phenylalanin (0,33 g, 2,0 mmol) in 0,2 m Kaliumcarbonat (20 ml) und Acetonitril (30 ml) tropfenweise eine Lösung N- Benzyloxycarbonyl-L-alanin-N-carboxyanhydrid (0,45 g, 1,8 mmol) in Acetonitril (5 ml) bei 0ºC hinzu. Das Gemisch wurde bei 0ºC 40 Minuten lang gerührt und mit Ethylacetat (50 ml) und 1 m Salzsäure (10 ml) verdünnt. Die Schichten wurden getrennt und die wäßrige Schicht mit Ethylacetat (2 x 35 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Fraktionen wurden mit Salzlösung ( 30 ml), 0,5 m Salzsäure (2 x 50 ml) und Wasser (2 x 50 ml) gewaschen, getrocknet (MgSO&sub4;) und ankonzentriert. Der Rückstand wurde aus Chloroform/Hexan rekristallisiert, um 0,26 g (39 %) N-Benzyloxycarbonyl-L-alanyl-L- phenylalanin zu ergeben: Schmelzpunkt 121-122ºC; NMR (DMSO-d&sub6;) δ 12,71 (s, 1 H), 8,06 (m, 1 H), 7,30 (m, 5 H), 5,01 (s, 2 H), 4,43 (m, 1 H), 4,06 (m, 1 H), 2,99 (m, 2 H), 11,19 (d, 2H, J = 7Hz).
B. Ein Gemisch aus N-Benzyloxycarbonyl L-alanyl-L-phenylalanin (0,208 g, 0,562 mmol) und 10 % Pd auf Kohlenstoff (0,1 g) in 95 % Ethylalkohol (50ml) wurde in einem Parr Hydrierapparat bei 20ºC 16 Stunden lang geschüttelt. Das Reaktionsgemisch wurde filtriert und das Filtrat mit Wasser (100 ml) gespült. Die vereinigten Lösungen wurden ankonzentriert, um 0,122 g (92 %) L-Alanyl-L-phenylalanin als weißer Feststoff zu ergeben. HPLC-Analysen zeigten eine Reinheit von > 99,5 % un d keine Anzeichen für Racemisierung.
Ein weiteres Beispiel der erfindungsgemäßen Verbindung ist N-9- Fluorenylmethyloxycarbonyl-β-alanin-N-carboxyanhydrid.

Claims

1. Urethan-geschütztes Aminosäure-N-carboxyanhydrid oder -N- thiocarboxyanhydrid mit der Struktur:

worin

R und R' unabhängig voneinander aus der aus Wasserstoffatom, Alkyl-Gruppen, welche Cycloalkyl-Gruppen von 1 bis 12 Kohlenstoffatomen enthalten, Aryl-Gruppen von 6 bis 20 Kohlenstoffatomen, welche Aralkyl- und Alkaryl-Gruppen von 7 bis 20 Kohlenstoffatomen enthalten, bestehenden Gruppe ausgewählt sind, wobei mindestens ein der Vertreter R und R' nicht ein Wasserstoffatom ist,

R" eine Alkyl- oder Cycloalkyl-Gruppe von 1 bis 12 Kohlenstoffatomen, eine Aryl- Gruppe von 6 bis 20 Kohlenstoffatomen oder eine Aralkyl- oder eine Alkaryl-Gruppe von 7 bis 20 Kohlenstoffatomen ist,

Z ein Sauerstoffatom oder Schwefelatom ist, und n 0, 1 oder 2 ist.

2. Urethan-geschütztes Aminosäure-N-carboxyanhydrid oder -N- thiocarboxyanhydrid nach Anspruch 1, worin R" eine Alkyl-Gruppe von 1 bis 20 Kohlenstoffatomen ist.

3. Urethan-geschütztes Aminosäure-N-carboxyanhydrid oder -N- thiocarboxyanhydrid nach Anspruch 2, worin R" ein niedermolekulares Alkyl, i.e. ein Alkyl mit höchstens 5 Kohlenstoffatomen, ist.

4. Urethan-geschütztes Aminosäure-N-carboxyanhydrid oder -N- thiocarboxyanhydrid nach Anspruch 3, worin R" t-Butyl ist.

5. Urethan-geschütztes Aminosäure-N-carboxyanhydrid oder -N- thiocarboxyanhydrid nach Anspruch 1, worin R" Aryl oder substituiertes Aryl ist.

6. Urethan-geschütztes Aminosäure-N-carboxyanhydrid oder -N- thiocarboxyanhydrid nach Anspruch 5, worin R" Phenyl oder substituiertes Phenyl ist.

7. Urethan-geschütztes Aminosäure-N-carboxyanhydrid oder -N- thiocarboxyanhydrid nach Anspruch 1, worin R" Aralkyl oder substituiertes Aralkyl ist.

8. Urethan-geschütztes Aminosäure-N-carboxyanhydrid oder -N- thiocarboxyanhydrid nach Anspruch 7, worin R" Benzyl oder substituiertes Benzyl ist.

9. Urethan-geschütztes Aminosäure-N-carboxyanhydrid oder -N- thiocarboxyanhydrid nach Anspruch 8, worin R" p-Methoxybenzyl ist.

10. Urethan-geschütztes Aminosäure-N-carboxyanhydrid oder -N- thiocarboxyanhydrid nach Anspruch 7, worin R" 9-Fluorenylmethyl oder substituiertes 9- Fluorenylmethyl ist.

11. Urethan-geschütztes Aminosäure-N-carboxyanhydrid oder -N- thiocarboxyanhydrid nach einem der Ansprüche 1-10, worin mindestens ein der Vertreter R oder R' die Seitenkette einer geschützten oder ungeschützten Aminosäure ist.

12. Urethan-geschütztes Aminosäure-N-carboxyanhydrid oder -N- thiocarboxyanhydrid nach Anspruch 11, worin R oder R' ausgewählt ist aus:

der Seitenkette von Alanin;

der Seitenkette von Arginin oder entsprechend geschütztem Arginin;

der Seitenkette von Asparaginsäure oder entsprechend geschützter Asparaginsäure;

der Seitenkette von Asparagin oder entsprechend geschütztem Asparagin;

der Seitenkette von Cystein oder entsprechend geschütztem Cystein;

der Seitenkette von Cystin;

der Seitenkette von Glutaminsäure oder entsprechend geschützter Glutaminsäure;

der Seitenkette von Glutamin oder entsprechend geschütztem Glutamin;

der Seitenkette von Histidin odert ensprechend geschütztem Histidin;

der Seitenkette von Isoleucin;

der Seitenkette von entsprechend geschütztem Lysin;

der Seitenkette von Leucin;

der Seitenkette von Methionin;

der Seitenkette von Norleucin;

der Seitenkette von einem entsprechend geschützten Ornithin;

der Seitenkette von Phenylalanin;

der Seitenkette von Serin oder entsprechend geschütztem Serin;

der Seitenkette von Threonin oder entsprechend geschütztem Threonin;

der Seitenkette von Tryptophan oder entsprechend geschütztem Tryptophan;

der Seitenkette von Tyrosin oder entsprechend geschütztem Tyrosin;

der Seitenkette von Valin; und

der Seitenkette von Homoserin oder entsprechend geschütztem Homoserin;

13. Urethan-geschützte Aminosäure-N-carboxyanhydrid- oder -N- thiocarboxyanhydrid-Verbindung nach Anspruch 1, ausgewählt aus der aus

N-9-Fluorenylmethyloxycarbonyl-L-leucin-N-carboxyanhydrid,

N-9-Fluorenylmethyloxycarbonyl-L-alanin-N-carboxyanhydrid,

N-α-(9-Fluorenylmethyloxycarbonyl)-N-&epsi;-t-butyl-oxycarbonyl-L-lysin-N- carboxyanhydrid,

N-Benzyloxycarbonyl-L-alanin-N-carboxyanhydrid,

N-benzyloxycarbonyl-L-leucin-N-carboxyanhydrid,

N-phenyloxycarbonyl-L-valin-N-carboxyanhydrid,

N-Ethyloxycarbonyl-L-alanin-N-carboxyanhydrid,

N-Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanin-N-carboxyanhydrid,

N-Phenyloxycarbonyl-L-alanin-N-thiocarboxyanhydrid,

N-(9-Fluorenylmethyloxycarbonyl)-O-t-butyl-L-threonin-N-carboxyanhydrid,

N-9-Fluorenylmethyloxycarrbonyl-β-alanin-N-carboxyanhydrid,

N-t-Butyloxycarbonyl-L-alanin-N-carboxyanhydrid,

N-(t-Butyloxycarbonyl)-O-benzyl-L-serin-N-carboxyanhydrid,

N-phenyloxycarbonyl-1-amino-1-carboxy-cyclohexan-N-carboxyanhydrid, und

N-Ethyloxycarbonyl-α-aminoisobuttersäure-N-carboxyanhydrid bestehenden Gruppe ausgewählt ist.

14. Verfahren zur Herstellung einer Polypeptid-Kette, worin man einen N- geschützten Aminosäureteil mit einem zweiten ähnlichen oder unähnlichen Aminosäureteil reagieren läßt und das Verfahren wiederholt, bis man das gewünschte Polypeptid erhält, gekennzeichnet durch die Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 - 13 als Teil der geschützten Aminosäure in mindestens einer der Umsetzungen mit der allgemeinen Struktur

worin

R" eine Alkyl- eine Cycloalkyl-Gruppe von 1 bis 12 Kohlenstoffatomen, eine Aryl- Gruppe von 6 bis 20 Kohlenstoffatomen oder eine Aralkyl- oder eine Alkaryl-Gruppe von 7 bis 20 Kohlenstoffatomen ist,

Z ein Sauerstoffatom oder Schwefelatom ist, und n 0, 1 oder 2 ist.

15. Verfahren zur Festphasensynthese einer Polypeptid-Kette an einem unlöslichen Träger, worin ein N-geschützter Aminosäureteil durch eine Kondensationsreaktion an den Träger gekoppelt wird, welcher mit dem Carboxy-terminalen Ende des Aminosäureteils reaktionsfähige Substituentengruppen enthält; der gekoppelte, geschützte Aminosäureteil ungeschützt gemacht wird, falls nötig, neutralisiert wird, ein zweiter ähnlicher oder unähnlicher geschützter Aminosäureteil an den nicht geschützten Aminosäureteil gekoppelt wird, und das Verfahren wiederholt wird, bis man das gewünschte Polypeptid erhält,

gekennzeichnet durch die Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1-13 als Teil der geschützten Aminosäure in mindestens einer der Reaktionen mit der allgemeinen Struktur

worin

Z ein Sauerstoffatom oder Schwefelatom ist, und n 0, 1 oder 2 ist.

16. Verfahren zur Herstellung von Urethan-geschützten Aminosäure-N- carboxyanhydriden oder -N-thiocarboxyanhydriden mit der Struktur

worin

R und R' unabhängig voneinander aus der aus Wasserstoffatom, Alkyl-Gruppen, welche Cycloalkylgruppen von 1 bis 12 Kohlenstoffatomen enthalten, Aryl-Gruppen von 6 bis 20 Kohlenstoffatomen, welche Aralkyl- und Alkaryl-Gruppen von 7 bis 20 Kohlenstoffatomen enthalten, bestehenden Gruppe ausgewählt sind,

Z ein Sauerstoffatom oder Schwefelatom ist, und n 0, 1 oder 2 ist;

welches die Umsetzung eines Aminosäure-N-carboxyanhydrids oder -N- thiocarboxyanhydrids mit der Struktur

worin R und R' wie oben definiert sind, mit einem Halogenformiat mit der Struktur

R"-O- -X

worin X Halogen ist und R" wie oben definiert ist, in einem inerten Verdünnungsmittel, unter wasserfreien Bedingungen sind in der Gegenwart einer tertiären Aminbase umfaßt.