FI102379B - Uretaanisuojattuja aminohappo-N-karboksianhydridejä - Google Patents

Description

102379

Uretaanisuojattuja aminohappo-N-karboksianhydridejä - Uretanskyddade aminosyra-N-karboxyanhydrider

Keksinnön taustaa 5 I. Keksinnön sovellutusala Tämä keksintö koskee uutta N-suojattujen aminohappo-N-karboksianhydridien ja tiokarboksianhydridien luokkaa, nimittäin N-uretaanisuojattuja aminohappo-N-kar-boksianhydridejä ja N-uretaanisuojattuja N-tiokarboksianhydridejä, niiden valmistusta ja käyttöä peptidi-, polypeptidi- ja proteiinisynteesissä.

10 II. Aikaisempi tekniikka

Perinteisesti määrätyn rakennejärjestyksen omaavia polypeptidejä on valmistettu äärimmäisen työläällä tekniikalla, jossa välituotteet on eristetty jokaisen aminohappo-osan lisäyksen jälkeen. Tämä on mutkistanut pitkäketjuisten polypeptidien ja proteiinien synteesiä ja tehnyt niiden valmistuksen lähes mahdottomaksi johtuen 15 pienistä saannoista, rasemisoitumisesta ja/tai muista sivureaktioista. Vuonna 1963 '· Merrifield (J. Am. Chem. Soc., 85, 2149) ja Letsinger ja Komet (J. Am. Chem.

Soc., 85, 2045) ehdottivat liukenemattomien polymeeristen tukiaineiden käyttöä : peptidiketjun kasvattamiseen. Tämä prosessi, josta käytetään yleisesti nimitystä * ' : kiinteän faasin peptidisynteesi, teki mahdolliseksi kasvavan peptidiketjun "puhdis- : ;': 20 tuksen" eristämättä välituotetta.

« · · Tätä ennen yleisesti hyväksytyt menetelmät sekä perinteistä (nestefaasi) että kiinteän faasin polypeptidisynteesiä varten vaativat liitos- tai aktivointiaineen käyttöä reagoimaan muuten N-suojatun aminohapon karboksyyliryhmän kanssa karboksyy- • · · ·* liaktivoidun N-suojatun aminohapon saamiseksi. Tätä aktivoitua yhdistettä käytet- ;y. 25 täisiin sitten useilla tavoilla edistämään peptidisidoksen muodostumista. Esimerkiksi • · .···. aktivoidun, suojatun aminohapon annetaan reagoida suoraan aminohapon, amino- happoesterin tai aminohappoamidin vapaan aminoryhmän kanssa peptidisidoksen v · muodostamiseksi. Tämä on ollut useiden vuosien ajan valittu menettely peptidien valmistamiseksi. Aktivointivaiheeseen voi liittyä useita mahdollisia sivureaktioita. 30 Esimerkiksi, kun disykloheksyylikarbodi-imidi (DCC) on aktivoiva reagenssi, aktiivinen molekyyli voi "järjestäytyä uudelleen" inaktiiviseksi N-asyyliureaksi.

2 102379

Toinen karbodi-imidimenettelyn haitta on liukenemattomien ureoiden muodostuminen. Tämä on erityisen ongelmallista kiinteän faasin synteesissä ja sitä on oleellisesti mahdoton hyväksyä kiinteän faasin virtaussysteemeissä. Nämä ureat aiheuttavat myös vaikeita puhdistusongelmia liuosfaasireaktioissa.

5 Tutkijat ovat lievittäneet joitakin in situ aktivointiin liittyviä ongelmia antamalla ensin DCC-aktivoidun, N-suojatun aminohapon reagoida alkoholin tai fenolin kanssa (kuten p-nitrofenolin, pentakloorifenolin, N-hydroksisukkinimidin jne.) "aktiivisen esterin" muodostamiseksi, joka voidaan eristää ja puhdistaa ja antaa sitten liittyä seuraavan aminohapon vapaaseen amiiniin. Tämä lähestymistapa ei kuitenkaan ole 10 ongelmaton, koska vapautunut alkoholi tai fenoli voi osallistua muihin sivureaktioihin tai edistää niitä ja aktiivisen esterin liittymiset pyrkivät olemaan hitaita ja vaativat pitkiä reaktioaikoja.

Toinen yleinen menettely on muodostaa "symmetrinen anhydridi" antamalla kahden ekvivalentin N-suojattua aminohappoa reagoida yhden ekvivalentin kanssa DCC:a, 15 suodattamalla muodostunut DCU ja antamalla sitten "symmetrisen anhydridin" liittyä seuraavan aminohapon vapaaseen amiiniryhmään. Tällä menettelyllä on ilmaongelma sen lisäksi, että se vaatii käytettäväksi kaksinkertaisen määrän kallista N-suojattua aminohappoa.

Eräät tutkijat ovat alkaneet viime aikoina käyttää karbodi-imidejä, jotka muodosta-: ·': 20 vat liukoisia ureoita liittymisen jälkeen, mutta nämä ovat yhä alttiita uudelleenjärjes- : tymiselle N-asyyliureoiksi.

; Eri tyyppisiä N-suojaryhmiä on ehdotettu käytettäväksi peptidisynteesissä, mutta • · · ’· *·* yleisimmin hyväksytty N-suojaryhmien luokka ovat uretaanit. Uretaanien on laajasti tunnustettu aikaansaavan korkean suojaustason, minimoivan rasemisoitumista, niitä • · v.: 25 on helppo valmistaa ja ne ovat varastostabiileja. Voidaan valmistaa uretaanisuoja- • * · V : ryhmiä, jotka ovat labiileja heikoille hapoille (ts. t-butyylioksikarbonyyli), vahvoille .v. hapoille (ts. bentsyylioksikarbonyyli), erittäin heikoille hapoille (2-(p-bifenylyyli)- .••‘s isopropyylioksikarbonyyli), vedettömille emäksille (ts. 9-fluorenyylimetyylioksikar- • · T bonyyli)jne.

··· • · · * * · 30 Uretaanisuojattuja aminohappoja valmistetaan yleisesti antamalla alkyyli-, aiyyli-tai aralkyyliklooriformaatin (tai muun sopivasti aktivoidun formaatin tai karbonaatin) reagoida aminohapon kanssa alkalimetallihydroksidin tai karbonaatin läsnäollessa veden ja orgaanisen liuotimen sekasysteemissä (ts. Schotter-Bauman-olosuh-teissa). Reaktioseoksen hapotuksen jälkeen uretaanisuojattu aminohappo uutetaan 3 102379 orgaaniseen liuottimeen jättäen kaikki sivutuotteet vesifaasiin. Kiteytyksen jälkeen näitä yhdisteitä käytetään peptidisidoksien muodostamiseen edellä kuvatulla tavalla.

Aminohappojen reaktiivisen johdannaisen erityisen mielenkiintoinen tyyppi käytettäväksi peptidisidoksen muodostukseen ovat niin kutsutut N-karboksianhydridit tai 5 N-tiokarboksianhydridit, kuten

O

A

Ri—k0

R' O

jossa R, R' ovat tyypillisesti vetyatomeja tai yleisten aminohappojen sivuketjuja (tai suojattuna sivuketjuja), ja Z on happi- tai rikkiatomi.

Aminohappo-N-karboaksianhydridit (on ymmärrettävä että termi N-karboksianhyd-10 ridi sisältää tässä patenttimäärityksessä ja oheisissa patenttivaatimuksissa N-tiokarboksianhydridit) ovat hyvin tunnettuja ja reagoivat helposti useimpien vapaiden ;; amiinien kanssa. Pääasiallinen etu N-karboksianhydrideistä (NCA-yhdisteet) ja jopa suojatuista NCA-yhdisteistä käytettäessä niitä peptidisidoksen muodostukseen on : se, että ne ovat voimakkaita asylointiaineita (ks. Peptides, Voi. 9, s. 83). Ne antavat : 15 myös yleensä suuremmat peptidisaannot kuin DCC tai N-hydroksisukkinimidi :1 · *; (OSu)-esteriliitosmenettelyt. NCA-yhdisteille ei ole kuitenkaan löytynyt laajaa käyt- • töä polypeptidisynteesissä johtuen kyvyttömyydestä säätää tai rajoittaa liitosreaktio- ta. Kun NCA kerran reagoi aminohapon vapaan amiinin kanssa, hiilidioksidia . . vapautuu välittömästi ja muodostuu dipeptidiä, joka myös sisältää vapaata amiinia.

• · * 20 Tämä amiini reagoi sen jälkeen toisen NCA-yhdisteen kanssa muodostaen tripepti- • · · din jne. Tämä reaktio on sallinut aminohappo-N-karboksianhydridideille löytyvän :V: laajaa käyttöä poly-a-aminohappojen muodostuksessa, mutta se on oleellisesti estä- ..·***: nyt niiden käytön peräkkäisessä polypeptidin muodostuksessa. Hirschmann, et ai.

• · · (The Controlled Synthesis of Peptides in Aqueous Medium, VIII. The Preparation * ] 25 and Use of Novel α-Amino Acid N-Carboxyanhydrides. J.A.C.S., 93:11, 1971, sivut 2746-2774) ovat onnistuneet käyttämään aminohappo-N-karboksianhydridejä di- ja tripeptidien valmistukseen veden ja orgaanisen liuottimen systeemeissä säätämällä huolellisesti reaktioseoksen lämpötilaa, pH-arvoa, suolaa ja orgaanista liuotinta. Tämä menettely rajoittuu kuitenkin pieniin peptideihin johtuen edellä kuva-30 tusta NCA-yhdisteiden kemiasta. Lisäksi näistä liuosfaasireaktioista saadut tuotteet 4 102379 on puhdistettava perusteellisesti ennen kuin niitä käytetään suurempien peptidien valmistukseen.

Kiijallisuudessa on selostettu suurta joukkoa N-substituoituja amonihappo-N-kar-boksianhydridejä, kuten N-metyyli-, N-bentsyyli-, N-asetyyli-, N-nitrofenyylisulfe-5 nyyli-, N-ksantyyli-, 4,4'-dimetyylibenshydryyli-, trityylijohdannaisia yms. Useita näistä substituoiduista NCA-yhdisteistä on ehdotettu käytettäväksi peräkkäisessä peptidisynteesissä ja erityisesti kiinteän faasin peptidisynteesissä ja erityisesti kiinteän faasin peptidisynteesissä, mutta mikään niistä ei ole saavuttanut peptidike-mistien hyväksymistä yleiseen käyttöön.

10 Kricheldorf (Angew. Chem. Acta 85, 86-87, (1978)) ehdotti o-nitrofenyylisulfenyy-lillä (NPS) substituoitujen NCA:yhdisteiden käyttöä peräkkäisessä polypeptidi-synteesissä. Nämä valmistettiin antamalla o-nitrofenyylisulfenyylikloridin reagoida N-kar-boksianhydridin kanssa trietyyliamiinin läsnäollessa. Myöhemmin on osoitettu, että trietyyliamiini edistää NPS-NCA-yhdisteiden rasemisoitumista. Lisäksi oli-15 gomeroituminen, joka johtuu trietyyliamiinin vaikutuksesta NCA-yhdisteeseen, vaatii että NPS-NCA:n synteesin aikana on käytettävä hyvin ankaria reaktio-olosuhteita (ts. lämpötila < 0 °C ja hyvin hidas trietyyliamiinin lisäys reaktioseokseen). Halstrom, et ai. (Z. Physiol. Chem. 355, 82-84, (1974)) ehdottivat tästä johtuen NPS-NCA-yhdisteiden synteesiä antamalla fosgeenin reagoida NPS-aminohapon .: ; 20 kanssa, mutta saannot olivat hyvin pieniä (noin 20 %). Kun NPS-NCA-yhdisteet on ; ;' kerran valmistettu, niitä on vaikea varastoida ja ne pyrkivät "vuodattamaan pois" ' · : suojaavan ryhmän kondensaation aikana, mikä aiheuttaa moninkertaista liittymistä : ja muita sivureaktioita. Samoin saadun NPS-suojatun peptidin typellä on huomatta- ν'.: vaa nukleofiilisyyttä ja sille saattaa tapahtua lisäkondensaatioreaktioita.

.v. 25 Block ja Cox ("Peptides, Proc. of the 5th Europ. Symp., Oxford, September 1962", • · · l.l' Pergamon Press 1963, toim. G.T. Young, sivut 84-87) ehdottivat N-trityyliamino- • · 4 \ happo-N-karboksianhydridien käyttöä peptidisynteesissä, vaikka he kykenivät vai- • · :.v mistamaan vain yksinkertaisimpia N-trityyliaminohappo-NCA-yhdisteitä (ts. glysii- ·*..*·* niä ja alaniinia). Nämä yhdisteet valmistettiin N-trityyliaminohapon reaktiolla fos- 30 geenin kanssa. Tällä menettelyllä he kykenivät myös valmistamaan N-asetyyli-gly- * t « ' . siini-NCA-yhdistettä. Nämä tutkijat tiedostivat t-butyylioksikarbonyyliglysiini-N- karboksianhydridin ja bentsyylioksikarbonyyliglysiini-N-karboksianhydridin potentiaalisen käyttökelpoisuuden, mutteivät onnistuneet yrityksissään valmistaa niitä ja päättelivät, että uretaanisuojattuja aminohappo-N-karboksianhydridejä ei voitaisi 35 valmistaa. Vaikka kaikki N-trityyli-NCA-yhdisteet voitaisiin valmistaa, on hyvin tunnettua, että aminohappojen trityylisuojauksen käyttö eri kondensaatiomenetel- 5 102379 missä tuottaa pieniä saantoja johtuen trityyliryhmän aiheuttamasta huomattavasta eteerisestä esteestä. Trityyliryhmä on myös erittäin herkkä hapolle, mikä tekee tri-tyyli-NCA:n valmistuksen vaikeaksi ja se pyrkii "vuotamaan pois" normaalien kiinteän faasin käsittelyjen aikana.

5 Halström & Kovacs (Acta Chemica Scandinavica, Ser. B 1986, BYO (6), 462-465 ja US-patentti 4 267 344) tiedostivat myös N-suojattujen aminohappo-N-karboksi-anhydridien edut ja potentiaalisen käyttökelpoisuuden ja kykenivät valmistamaan useita N-substituoituja NCA-yhdisteitä, jotka heidän mielestään täyttäisivät kaikki vaatimukset, jotka ovat tarpeen niiden käyttämiseksi peptidisysteesissä. He kyke-10 nivät valmistamaan useita 9-ksantyyli- (ja lähisukuisia) substituoituja aminohappo-N-karboksianhydridejä. Väitettiin, että näitä yhdisteitä voidaan valmistaa ksanthyd-rolin suoralla kondensaatiolla sopivan NCA:n kanssa refluksoivassa bentseenissä, tolueenissa, ksyleenissä tai muussa alkyylibentseenissä. Kondensaation aikana muodostunut vesi poistettiin aseotrooppisesti. Tämä menettely kärsii NCA-yhdisteiden 15 epästabiilisuudesta lämmölle ja vedelle, mikä johtaa näin ollen pieniin saantoihin ja potentiaalisesti epäpuhtaisiin tuotteisiin. Nämä yhdisteet voidaan myös valmistaa fosgeenin (tai fosgeenia vastaavan yhdisteen) reaktiolla vastaavan 9-ksantyyliamino-hapon kansa ja itse asiassa useimmat tämän luokan susbtituoidut NCA-yhdisteet on :' ·.; valmistettu tällä menettelyllä.

• I

,! ; 20 Peptidisynteesissä käytettynä 9-ksantyyli-NCA-yhdisteiden on havaittu reagoivan ; hitaasti vaatien jopa 5 tuntia 50 °C:ssa liuossynteesissä ja 24 tuntia 25 °C:ssa kiin- • : teän faasin synteesissä. Tämä johtuu todennäköisesti 9-ksantyyliryhmän steerisestä *.· : esteestä ja/tai deaktivoivasta vaikutuksesta. Toinen ongelma, joka liittyy amiiniryh- mien 9-ksantyylisuojaukseen, on että liitosreaktion jälkeen muodostuneen 9-ksan-25 tyyliaminohapon typpiatomi on yhä nukleofiilinen ja sille voi tapahtua myöhemmin : V: kondensaatioreaktioita. Nämä ryhmät pyrkivät myös vuotamaan pois käsittelyn aikana. Tästä johtuen tähän saakka tämän tai jonkin muun tyyppisille substituoiduil-le aminohappo-N-karboksianhydrideille ei ole löytynyt laajaa käyttöä peptidisyntee- • · · sissä, varsinkaan kiinteän faasin peptidisynteesissä.

♦ · • « yr% 30 Kricheldorf, (Makromol. Chem. Voi. 178, sivut 905-939, 1977) on kuvannut mene-• · · * . telmää metoksikarbonyyliglysiini-NCA:n ja etoksikarbonyyliglysiini-NCA:n valmis tamiseksi. Kricheldorf ilmoittaa kuitenkin myös, että tällä menettelyllä ei kyetty tuottamaan uretaanisuojattuja NCA-yhdisteitä aminohapoista, joissa oli muu sivu-ketju kuin vetyatomi, johtuen steerisestä esteestä.

6 102379 Tämän vuoksi tämän keksinnön tavoitteena on saada aikaan tähän saakka saavuttamattomia korkeampien aminohappojen uretaanisuojattuja N-karboksianhydridejä ja N-tiokarboksianhydridejä.

Muuna tämän keksinnön tavoitteena on saada aikaan menettelyjä puhtaiden, kiteis-5 ten, stabiilien uretaanisuojattujen aminohappo-N-karboksianhydridien ja uretaani-suojattujen N-tiokarboksianhydridien valmistamiseksi.

Vielä muuna tämän keksinnön tavoitteena on saada aikaan menetelmä polypeptidien syntetisoimiseksi käyttäen hyväksi puhtaita, kiteisiä uretaanisuojattuja aminohappo-N-karboksianhydridejä, joka synteesi tarjoaa seuraavat pääedut verrattuna tavan-10 omaisiin polypeptidisynteesin menetelmiin: 1) Liitettävän karboksyyliryhmän esiaktivointi on tarpeetonta, mikä poistaa tavanomaisten aktivointimolekyylien muodostamat sivutuotteet.

2) Mitään lisäaineita, kuten N-hydroksibensotriatsolia, ei tarvita rasemisoitumisen ehkäisemiseksi.

15 3) Ainoa oheistuote liitosreaktiosta on hiilidioksidi.

4) Nämä N-suojatut karboksyyliaktivoidut aminohapot ovat stabiileja, varastoitavia, kiteisiä materiaaleja ja helpottavat ja yksinkertaistavat tämän vuoksi sekä kiinteän • että nestefaasin peptidisynteesiä, erityisesti automatisoiduissa pepetidisyntetisaatto-reissa poistamalla aktivointien, suodatusten ja liittämisten tarpeet ennen peptidi- : ; ; 20 sidoksen muodostusreaktiota. Näiden uusien yhdisteiden käyttö helpottaa suuresti . ·. ·. liuoksessa valmistettujen peptidien puhdistusta johtuen liitosaineiden muodostamien sivutuotteiden puuttumisesta.

· v.: 5) Menettely saa aikaan liittämisen jälkeen yleisesti hyväksytyt uretaanisuojaryhmät ·** v '· kasvavan peptidiketjun aminofunktioon, jota ketjua voidaan sitten käsitellä tavan- .·.*·. 25 omaisella tekniikalla.

• · · • · «·« * · * ·.. * Keksinnön yhteenveto • · · • · · * 9 » ' , Nämä tavoitteet saavutetaan uretaanisuojatulla aminohappo-N-karboksianhydridillä tai N-tiokarboksianhydridillä, jolla on rakenne: 7 102379

O I

R"-oAhT ^Z

R—(CH2)n-L R' O

jossa R ja R' ovat toisistaan riippumatta vetyatomeja, alkyyliryhmiä tai syklo-alkyyliryhmiä, joissa on 1-12 hiiliatomia; aryyliryhmiä, joissa on 6-20 hiiliatomia tai aralkyyli- tai alkaryyliryhmiä, joissa on 7-20 hiiliatomia, ja ainakin toinen 5 ryhmistä R ja R' on muu kuin vetyatomi; R" on alkyyli- tai sykloalkyyliryhmä, jossa on 1-12 hiiliatomia; aryyliryhmä, jossa on 6-20 hiiliatomia tai aralkyyli- tai alkaryyliryhmä, jossa on 7-20 hiiliatomia; Z on happi- tai rikkiatomi; ja n on 0, 1 tai 2.

10

Edullisia ryhmiä R, R' ja R" ovat alkyyliryhmät mukaan luettuna sykloalkyyliryh-mät, joissa on 1-12 tai useampia hiiliatomeja, aryyliryhmät, joissa on 6-20 tai useampia hiiliatomeja mukaan luettuna aralkyyli- ja alkaryyliryhmät, joissa on 7-20 :. tai useampia hiiliatomeja. Esimerkkejä sopivista alkyyliryhmistä ovat metyyli-, : V; 15 etyyli-, propyyli-, isopropyyli-, isobutyyli-, butyyli-, t-butyyli-, heksyyli-, syklopen-tyyli-, sykloheksyyli-, heptyyli-, oktyyliiyhmät yms. Tyypillisiä sopivia aiyyliryh- • ;' miä ovat fenyyli-, metyylifenyyli-, etyylifenyyli-, naftyyli-, metyylinaftyyli-, antra- . ; , syyliryhmät yms. Esimerkkejä sopivista aralkyyliryhmistä ovat bentsyyli-, p-metok- sibentsyyli-, 9-fluorenyylimetyyli-, fenyylietyyliryhmät yms. Sopivia alkaryyliryh- • · i 20 miä ovat tolyyli-, etyylifenyyli-, isopropyylifenyyliryhmät yms. Ryhmät R, R' ja R" . . voi olla myös substituoitu ei-häiritsevillä ryhmillä, kuten fluori-, metoksi-, t-butoksi- • · · karbonyyli-, amido-, bentsyylioksi-, hydroksi-, substituoidulla amino-, substituoi- Φ · φ V ‘ dulla hydroksi-, rikki-, substituoidulla rikki-, kloori-, bromiryhmällä yms. R ja R' ;*·*· ovat tyypillisesti suojattuja tai suojaamattomia ryhmiä, jotka ovat kiinnittyneet • · .**·. 25 aminohappojen tai niiden analogien α-hiiliatomiin (sivuketjut).

··· • v*r Useimmissa tapauksissa toinen ryhmistä R ja R' on tavallisesti H, kun taas toinen on *:··: sivuketju aminohapon, kuten lysiinin, leusiinin, arginiinin, seriinin, aspartiinihapon, alaniinin, asparagiinin, kysteiinin, kystiinin, glutaamihapon, histidiinin, glutamiinin, isoleusiinin, metioniinin, norleusiinin, omitiinin, fenyylialaniinin, treoniinin, trypto-30 faanin, tyrosiinin, valiinin, β-alaniinin, homoseriinin yms. α-hiiliatomissa. Esimerkkejä tällaisista sivuketjuista ovat: 8 102379

-(CH2)4-NH2 -(CH2)2-COOH

.N

-CH2-CH-CH3 f ^

i I

CH3 -(CH2)-NH

.NH

-(CH2)3-NH-Q^ -(CH2)2-CONH2 nh2 -ch-ch2-ch3 -ch2-cooh ch3 -ch3 -ch2-ch2s-ch3 0 -(CH2)3-CH3 -CH2-C-NH2 -(ch2)3-nh2 -CHrSH j-v r ^-(O) -ch2-s-s-ch2-ch-cooh >-f -ch-ch3

v:; ·™=·οη L

-CH2-CH2-OH : : : -CH-CH2CH3 : I -ch2- CH3 2 • · ·

:¾ -CH^^pVoH

• « • · · • « * .···. Nämä sivuketjut voidaan suojata vaaditulla tavalla käyttäen yleistä tekniikkaa ja • · suojaryhmiä, jotka ovat alaan perehtyneen hyvin tuntemia, kuten yleisesti käytettyjä • · · v · amino-, hydroksi-, tioli-ja karboksisuojaryhmiä.

< I

5 Keksinnön yhdisteet käsittävät myös tapaukset, joissa molemmat ryhmät R ja R' ovat sivuketjuja, jotka ovat kiinnittyneet aminohapon α-hiileen, kuten esim. isovalii-nin tapauksessa, jossa toinen ryhmistä R ja R' on -CH2CH3 ja toinen on metyyli-ryhmä.

9 102379 Tämän keksinnön yhdisteet sisältävät myös tapaukset, joissa R ja R' ovat osa syklisestä rakenteesta, kuten esim. 1-amino-l-sykloheksaanikarboksyylihapon tapauksessa.

Tämän keksinnön yhdisteet sisältävät myös sellaisia esimerkkejä kuin orto-amino-5 bentsoehapon tai l-amino-2-karboksisykloheksaanin, joissa ryhmistä R ja R’ peräisin olevat hiiliatomit ovat osa syklistä rengasta.

Tämän keksinnön toinen kohta koskee parannusta polypeptidiketjun synteesissä, jossa N-suojatusta aminohappokomponentista poistetaan suojaus ja suojauksesta vapautetun aminohappokomponentin annetaan reagoida toisen samanlaisen tai eri-10 laisen aktivoidun N-suojatun aminohappokomponentin kanssa ja prosessia toistetaan, kunnes saadaan haluttu polypeptidi, jossa parannuksessa käytetään aktivoituna N-suojattuna aminohappokomponenttina ainakin yhdessä mainituista reaktioista yhdistettä, jolla on rakenne:

0 J

RM-0-C-N

•;V; R--(CH2)n4v

’ Ϊ R’ O

; ’: 15 jossa R, R', R", Z ja n ovat samoja kuin edellä määriteltiin.

; . Vielä muu tämän keksinnön kohta koskee parannusta polypeptidiketjun kiinteän '·’·* faasin synteesissä liukenemattomalla kiinteällä tukiaineella, jossa synteesissä N- suojattu aminohappokomponentti liitetään kondensaatioreaktiolla liukenemattomaan \v kiinteään tukiaineeseen, joka sisältää substituenttiryhmiä, jotka ovat reaktiivisia • · · : 20 mainitun aminohappokomponentin karboksyylipääteryhmän kanssa, liitetystä N- suojatusta aminohappokomponentista poistetaan suojaus, toinen samanlainen tai eri- .···. lainen aktivoitu N-suojattu aminohappokomponentti liitetään mainittuun suojaukses- • · "* ta vapautettuun aminohappoyhdisteeseen ja prosessia toistetaan, kunnes saadaan * · · : haluttu polypeptidi, jossa parannuksessa käytetään aktivoituna, N-suojattuna amino- 25 happokomponenttina ainakin yhdessä mainituista reaktioista yhdistettä, jolla on rakenne: ίο 102379 o

Il

R"-0-C-N Z

R—(CH2)„-L R' O

jossa R, R', R", Z ja n ovat samoja kuin edellä määriteltiin.

Tämän keksinnön lisätoteutusmuotona siihen liittyy menetelmä keksinnön mukaisten uretaanisuojattujen aminohappo-N-karboksianhydridien valmistamiseksi, jossa 5 menetelmässä annetaan aminohappo-N-karboksianhydridin, jolla on rakenne.

O

H-N^^Z

R-(CH2)n-i R' O

jossa R, R', Z ja n ovat samoja kuin edellä määriteltiin, reagoida haloformaatin (tai ' · ‘ ' muun sopivasti reaktiivisen formaatin, kuten atsidoformaatin) kanssa, jolla on raken- : ne:

O

v : Il

10 R"-0-C-X

I · « jossa X on kloori-, bromi-, fluoriatomi, atsidiryhmä tms, ja R" on alkyyli-, aryyli- :V: tai aralkyyliryhmä, inertissä laimentimessa vedettömissä olosuhteissa ja N-metyyli- :T: morfoliinin läsnäollessa. Yllättäen on havaittu, että käyttämällä inerttiä laimenninta, vedettömiä olosuhteita ja valitsemalla N-metyylimorfoliini emäkseksi tässä reaktios- ; 15 sa, vältetään N-karboksianhydridien polymeroituminen ja tehdään muutoin mahdol- « · *·”* liseksi tähän saakka saavuttamattomien korkeampien aminohappojen uretaanisuojat- :T: tujen NCA- ja NTA-yhdisteiden valmistus.

Tämän keksinnön yksityiskohtainen kuvaus

Aminohappo-N-karboksianhydridit (NCA) ja N-tiokarboksianhydridit (NTA), jotka 20 toimivat lähtöaineina tämän keksinnön N-uretaanisuojattujen NCA- ja NTA-yhdisteiden valmistamiseksi, voidaan valmistaa lukuisilla menettelyillä, jotka ovat alaan 11 102379 perehtyneen hyvin tuntemia. Katso esim.: Fuller et ai., Biopolymers 15, n:o 9, 1869-1871 (1976); Kricheldorf, Chem. Ber. 104. 87-91 (1971); ja Halström ja Kovacs, Acta Chemica Scandinavica, B 40, 462-465 (1986).

Vaikka metaaneja voidaan yleensä käyttää nukleofiilisiä atomeja suojaavina ryhmi-5 nä, vain harvoille on löytynyt laajaa käyttöä peptidisynteesissä, esim. t-butyylikar-bonyylille (Boc); bentsyylioksikarbonyylille (Cbz); ja 9-fluorenometyylioksikarbo-nyylille (FMOC). Tästä johtuen näillä suojaavilla ryhmillä substituoidut aminohap-po-N-karboksianhydridit tai N-tiokarboksianhydridit ovat erityisen mielenkiintoisia. Näin ollen erittäin hyödyllisiä molekyylejä peptidisynteesiin ovat L-a-aminohappo-10 jen NCA-yhdisteet, jotka on suojattu jollakin edellä mainituista suojaavista ryhmistä, kuten: O O o ?Hi0 X I—( ? 1

CHj-C-O-C-N^P VcHrO-C-N

V:: P "H\>

;·; O O

' \Cj)~c h2-o-c-n^P ch2-o-c-n z ^ «I—k t «—k

R O £ RO

• · · • · · • · • « · v : joissa R on α-aminohapon sivuketju, Z on 0 tai S ja X on metoksiryhmä, kloori- atomi tms.

• · · • · 12 102379 aikaisemmin syntetisoidun NCA:n tai NTA:n reaktiolla sopivan haloformaatin kanssa vedettömässä, ei-häiritsevässä liuottimessa käyttäen tertiääristä amiinia emäksenä. Reaktio on edullista suorittaa huoneenlämpötilan alapuolella. Hyödyllisiä liuottimia reaktioon ovat tetrahydrofuraani, etyyliasetaatti, metyleenikloridi, toluee-5 ni, bentseeni, dioksaani yms.

Näin ollen tämän keksinnön uudet uretaanisuojatut aminohappo-N-karboksianhydri-dit ja N-tiokarboksianhydridit voidaan valmistaa liuottamalla NCA:a ei-häiritsevään liuottimeen (kuten tolueeniin) ja jäähdyttämällä saatu liuos hämmentäen. Haluttu haloformaatti (esim. bentsyyliklooriformaatti) lisätään sitten yhdellä kertaa. Tähän 10 seokseen lisätään tertiääristä amiiniemästä (kuten trietyyliamiinia, di-isopropyyli-etyyliamiinia, N-metyylimorfoliinia yms), joka edistää kondensaatiota ja poistaa reaktion aikana muodostuneen kloorivetyhapon. Yllättäen on havaittu, että tietyt tertiääriset amiiniemäkset, kuten N-metyylimorfoliini ja N-etyylimorfoliini eivät edistä NCA-yhdisteiden polymeroitumista. Nämä edulliset emäkset ovat niitä, joilla 15 on tarpeeksi alhainen pK-arvo, jotta ne eivät edistäisi NCA:n polymeroitumista, mutta tarpeeksi korkea katalysoidakseen NCA:n reaktiota haloformaatin kanssa. Tästä johtuen kun yhtä näistä edullisista emäksistä käytetään kondensaatioreaktios-sa, polymeroitumista ei initioida. Koska pelkoa polymeroitumisesta ei ole, emästä .: voidaan käyttää ylimäärin ja tuloksena olevat uretaanisuojatut NCA-yhdisteet on : V: 20 helppo eristää kiteyttämällä.

; ; Näiden havaintojen tuloksena oleellisesti mikä tahansa uretaanisuojattu NCA (tai '· NTA) voidaan valmistaa helposti suurella saannolla vain minimivarovaisuudella *.* ’ kosteuden poissulkemisen suhteen. Prosessin mittakaavaa on helppo suurentaa ja se • · :.v aikaansaa tuotteita, jotka ovat erittäin kiteisiä ja helposti puhdistettavissa yksinker- 25 täisellä tekniikalla (esim. kiteytyksellä) ja ne ovat varastostabiileja (täydellisen :Y: stabiileja 25 °C:ssa vähintään 6 kuukautta ja todennäköisesti paljon kauemmin).

Näin ollen näitä materiaaleja voidaan punnita, kuljettaa ja varastoida käytettäväksi .·. peptidisynteesiin tarvitsematta pelätä hajoamista.

* · « • « Pääetu, jonka uretaanisuojatut NCA-materiaalit tarjoavat muihin N-substituoituihin .···. 30 NCA-yhdisteisiin verrattuna on, että sen jälkeen, kun niitä on käytetty peptidiseok- • · · ‘ . sen muodostamiseen, saatu peptidi on suojattu N-pääteosastaan yhdellä yleisesti hyväksytyistä uretaanisuojaryhmistä, joita käytetään yleisesti peptidisynteesissä. Alaan perehtyneet tietävät hyvin näiden suojaryhmien saavan aikaan parhaan käytettävissä olevan suojauksen kasvavan peptidiketjun amiiniryhmälle.

13 102379 Näin ollen uretaanisuojattujen N-karboksianhydridien käyttö tarjoaa kaikki substitu-oimattomien NCA-yhdisteiden edut (suuren reaktiivisuuden, epämieluisten uudel-leenjärjestymistuotteiden muodostumisen puuttumisen ja C02:n ainoana sivutuotteena), mutta ilman substituoimattomien NCA-yhdisteiden haittoja (ts. epästabiili-5 suutta, polymeroitumista ja moninkertaisia kondensaatioita), jotka ovat rajoittaneet niiden käytön tarkasti kontrolloituihin vesipitoisiin olosuhteisiin. Näin ollen tämä keksintö aikaansaa varastoitavan, mutta kuitenkin erittäin reaktiivisen, esiaktivoidun reagenssin, joka tuottaa minimaalisesti sivutuotteita peptidisidoksen muodostuksen aikana. Tämä keksintö aikaansaa myös yleisesti hyväksytyn, hyvin ymmärretyn 10 uretaanisuojauksen peptidin N-pääteosan typpeen kondensaatioreaktion jälkeen.

Vaikka tämän keksinnön uretaanisuojattuja aminohappo-N-karboksianhydridejä voidaan käyttää perinteisin menetelmin tapahtuvassa polypeptidien synteesissä käyttäen sarjaa suojauksenpoisto- ja liitosreaktioita, niille löytyy epäilemättä laajempaa käyttöä kiinteän faasin polypeptidisynteesissä. On ymmärrettävä, että patenttimäärityk-15 sessä ja oheisissa patenttivaatimuksissa käytettynä termin "polypeptidit" tarkoitetaan sisältävän peptidit ja proteiinit. On myös ymmärrettävä, että tässä keksinnössä tarkastellaan peräkkäistä peptidisynteesiä, jossa käytetään muita N-suojattuja aminohappoja kuin uretaanisuojattuja aminohappo-N-karboksianhydridejä samoin kuin : ' . ; vähintään yhtä tämän keksinnän uretaanisuojattua NCA-yhdistettä. Käytännössä 20 kuitenkin jokaisessa vaiheessa käytetty N-suojattu aminohappokomponentti on : ’.': enemmän kuin todennäköisesti tämän keksinnön uretaanisuojattu NCA-yhdiste.

» I I

: · · Kiinteän faasin polypeptidisynteesissä käytetään liukenematonta kiinteää tukiainetta v ' tai matriisia, edullisesti pallosten muodossa. Tällaiset kiinteät tukiaineet voivat olla \v mitä tahansa kiinteäfaasisia polymeerisiä aineita, joita tavanomaisesti käytetään 25 polypeptidien synteesiin. Tyypillisiä tällaisia polymeerihartseja ovat silloitetut poly-:V: styreenihartsit, polyakryyliamidit, seliitti, silloitettu dekstraani, lasipalloset, savet, polyamidihartsit ja vastaavat liukenemattomat kiinteät tukiaineet, jotka joko luon-nostaan sisältävät reaktiivisia kohtia liitosreaktioon aminohappokomponenttien *; |; * kanssa tai jotka voidaan varustaa tällaisilla reaktiivisilla kohdilla.

• · • · • · · .···. 30 Haluttaessa tämän keksinnön kiinteän faasin polypeptidisynteesi voidaan suorittaa • · · '"t. virtausreaktorissa paineen alaisena, kuten on kuvattu US-patentissa 4 192 798, joka liitetään täten viitteenä tähän esitykseen, mutta ilmakehää korkeampien paineiden käyttö ei ole olennaista.

Useat alustavat toimenpiteet ovat tarpeen ennen kuin peptidin kiinteän faasin syn-35 teesi voidaan aloittaa. Ensiksikin on valmistettava tukihartsi, joka sisältää ehdotetun 14 102379 peptidiketjun C-päätteisen aminohappokomponentin. Tämä voidaan toteuttaa millä tahansa lukuisista alaan perehtyneen tuntemista menettelyistä. Monet näistä N-suojatuista aminohapoista, jotka on yhdistetty erilaisiin kiinteisiin tukiaineisiin, ovat kaupallisia tuotteita ja niitä voidaan haluttaessa ostaa.

5 Jäljelle jäävä synteesi halutun polypeptidijäqestyksen muodostamiseksi suoritetaan seuraavasti. Ennen kuin toisen aminohappojäännöksen liittäminen voi tapahtua, tukiaineella jo olevasta ensimmäisestä jäännöksestä on poistettava suojaus. Suojauksen poisto ensimmäisestä hartsissa olevasta aminohappojäännöksestä samoin kuin jokaisesta sen jälkeen liitetystä aminohappojäännöksestä voidaan suorittaa 10 saattamalla suojattu aminohappojäännös kosketukseen sopivan suojauksenpoistoai-neen kanssa. Tähän tarkoitukseen käytetyt suojauksenpoistoaineet ovat peptidien synteesiähän normaalisti perehtyneiden hyvin tuntemia ja missä tahansa annetussa tapauksessa kulloinkin käytetty suojauksenpoistoaine riippuu luonnollisesti amino-happo/hartsissa olevasta suojaavasta ryhmästä. Esimerkiksi jos suojaava ryhmä on t-15 butyylioksikarbonyyliryhmä, trifluorietikkahappoa dikloorimetaanissa tai kloori-vetyhappoa sopivassa liuottimessa, kuten dioksaanissa voidaan käyttää. Toisaalta jos suojaava ryhmä on 9-fluorenyylimetyylioksikarbonyyliryhmä, emäksiset olosuhteet, kuten piperidiini DMF:ssa, ovat edullinen menetelmä.

i . Kulloisenkin suojauksenpoistoaineen väkevyydet liuottimessa vaihtelevat riippuen 20 jälleen kulloinkin käytetystä suojausaineesta, mutta tavallisesti ne vaihtelevat välillä ; V n. 5-50 til.-%.

: : Suojauksenpoistovaiheen jälkeen hartsi pestään sopivalla liuottimella liiallisten suo- :y. jauksenpoistoaineiden poistamiseksi. Jos suojauksenpoistoaine on happo, hartsissa « oleva peptidi on neutraloitava pesemällä sopivalla emäksellä, kuten trietyyliamiinilla 25 liuottimessa, kuten dikloorimetaanissa. Mahdollinen ylimääräinen trietyyliamiini ja • · · muodostunut trietyyliammoniumkloridi tai trifluoriasetaatti voidaan poistaa toiste-**! tuilla pesuilla sopivalla liuottimella, kuten dikloorimetaanilla tai dimetyyliformami- v.: dilla. Näin valmistettu vapaa amiini on nyt valmis liitettäväksi seuraavaan N-suojat- tuun aminohappoon.

• · · v : 30 Jos seuraava N-suojattu aminohappo on tämän keksinnön uretaanisuojattu amino- ‘: : happo-N-karboksianhydridi, sitä ei tarvitse aktivoida ja sen voidaan antaa suoraan reagoida tukiaineen kanssa, joka sisältää nyt suojaamattoman hartsiin sidotun aminohapon. Jos kuitenkin N-suojattu aminohappokomponentti on määrä liittää tavanomaisemmin menettelyin, on tarpeen ensin aktivoida, ts. konvertoida se reaktiivi-35 seen muotoon esim. konvertoimalla aminohappo anhydridiksi tai aktivoimalla disyk- 15 102379 loheksyylikarbodi-imidillä, karbonyylidi-imidatsolilla tai muilla aktivointiaineilla. Yleensä reaktiossa käytetään ylimäärin aktivoitua, N-suojattua aminohappokompo-nenttia.

Sen jälkeen kun toinen suojattu aminohappokomponentti on liitetty ensimmäiseen 5 aminohappokomponenttiin, kiinnitetystä, suojatusta dipeptidistä poistetaan suojaus, se neutraloidaan tarvittaessa ja pestään edellä kuvatulla tavalla ennen kuin seuraa-van aminohappojohdannaisen liittäminen toteutetaan. Tätä menettelyä toistetaan, kunnes haluttu aminohappojen järjestys on koottu liukenemattomaan tukiaineeseen.

Johtuen epämieluisten sivureaktioiden ja sivutuotteiden (C02:n ollessa ainoa) puut-10 tuulisesta uretaanisuojatun NCA:n liittämisessä ja johtuen niiden stabiilisuudesta liitosreaktioissa käytetty ylimääräinen uretaanisuojattu NCA voidaan ottaa helposti talteen, kiteyttää ja käyttää uudelleen, mikä parantaa merkittävästi näiden materiaalien kustannustehokkuutta.

Valmiiksi saatu peptidi voidaan poistaa liukenemattomasta tukiaineesta millä tahan-15 sa standardimenetelmällä, kuten esim. lohkaisemalla vedettömällä fluorivedyllä, transesteröinnillä, aminolyysillä jne.

Lohkaisun jälkeen saadun peptidin havaitaan olevan huomattavan homogeeninen ja : V se ei vaadi lainkaan tai vain minimaalista puhdistusta. Johtuen erittäin pienestä sivu- ;tuotteen muodostamasta epäpuhtausmäärästä kokonaissaantojen havaitaan olevan ;. . . 20 hämmästyttävän suuria ja tarvittiinpa mitä tahansa puhdistusta, se voidaan suorittaa . suhteellisen helposti. Tällaiset puhdistukset on edullista suorittaa erotuskromato- grafialla, ioninvaihtokromatografialla tai molempien yhdistelmällä. Tällaiset menet-

• I I

* ‘ telyt ovat peptidisynteesialaan perehtyneen hyvin tuntemia.

: Esimerkki I

• · • * · • * ♦ • i < 25 N-karboksianhydridin hajoaminen emäksen funktiona « · i « · • ♦ « • « .···. A. Valiini-N-karboksianhydridiä (72 mg) liuotettiin kuivaan, tislattuun tetrahydro- ]·* furaaniin (2 ml) ja trietyyliamiinia (30 μΐ) lisättiin. NCA:n häviämistä seurattiin *·* ‘ infrapunaspektroskopialla.

B. Valiini-N-karboksianhydridiä (72 mg) liuotettiin tetrahydrofuraaniin (2 ml) ja N-30 metyylimorfoliinia (25 μΐ) lisättiin. NCA:n häviämistä seurattiin infrapunaspektroskopialla.

Kokeiden A ja B tulokset esitetään kuvion 1 käyrillä.

16 102379

Esimerkki II

N-(9-f1uorenyylimetyylioksikarbonyyli)-L-alaniini-N-karboksianhydridi A. L-alaniinin (40,3 g, 0,45 mol) ja fosgeenin (275 ml, 3,3-M liuosta tetrahydro-furaanissa, 0,90 mol) hämmennettiin 62-64 °C:ssa 4 tuntia. Saadun liuoksen annet- 5 tiin jäähtyä huoneenlämpötilaan, se suodatettiin ja haihtuvat aineet poistettiin alipaineessa. Saatu öljy liuotettiin 100 ml:an tetrahydrofuraania ja 300 ml heksaania lisättiin hämmentäen, minkä jälkeen seos jäähdytettiin -20 °C:seen. L-alaniini-N-karbok-sianhydridin saanto oli 35,79 g (69 %).

B. N-metyylimorfoliinin (8,15 g, 80,5 mmol) liuos tolueenissa (50 ml) lisättiin 10 0 °C:ssa olevaan seokseen, jossa oli L-alaniini-N-karboksianhydridiä (8,84 g, 76,8 mmol) ja 9-fluorenyylimetyylioksikarbonyylikloridia (19,9 g, 76,8 mmol) tolueenissa (200 ml). Reaktioseosta hämmennettiin 0 °C:ssa 2 tuntia ja suodatettiin. Liuo-tintilavuus pienennettiin 20 mlrksi ja kiteytys tapahtui lisäämällä 100 ml heksaania, jolloin saatiin 21,4 g (82 %) epäpuhdasta 9-fluorenyylimetyylioksikarbonyyli-L-15 alaniini-N-karboksianhydridiä. Tuote puhdistettiin hiertämällä kylmässä di-isopro-pyylieetterissä ja kiteyttämällä sen jälkeen uudelleen etyyliasetaatti/heksaanista: sp. 106-107 °C; IR (CH2C12) 1870, 1801, 1740 cm1; NMR (CDC13) δ 6,90-7,80 (m, ' i 8H), 3,95-4,55 (m, 4H), 1,35 (d, J = 7Hz, 3H). Analyysi, laskemalla kaavasta

CuH^NOj: C, 67,65; H, 4,48; N, 4,15. Kokeellisesti: C, 67,73; H, 4,65; N, 4,19.

• » « • ·

: , ·. 20 Esimerkki III

:'· N-(9-fluorenyylimetyylioksikarbonyyli)-L-leusiini-N-karboksianhydridi • t « « · « « · • « A. L-leusiini-N-karboksianhydridiä valmistettiin L-leusiinista 78 %:n saannolla esi-merkissä II a hahmotellulla menettelyllä.

• · · • · ··« ? B. Seos, jossa oli L-leusiini-N-karboksianhydridiä (9,2 g, 58,4 mmol) ja 9-fuore- 25 nyylimetyylioksikarbonyylikloridia (15,1 g, 58,4 mmol) tolueenissa (125 ml), jääh- .···, dytettiin 0 °C:seen ja N-metyylimorfoliinin (6,5 g, 6,4 mmol) liuos 20 mlissa toluee- *j* nia lisättiin tipoittain. Reaktioseosta hämmennettiin 0 °C:ssa 2,5 h, suodatettiin ja v : liuottimen tilavuus pienennettiin 20 ml:ksi. Heksaania (480 ml) lisättiin ja liuos « jäähdytettiin -20 °C:seen yön yli, jolloin saatiin 18,8 g (85 %) N-(9-fluorenyyli-30 metyylioksikarbonyyli)-L-leusiini-N-karboksianhydridiä. Analyyttinen näyte saatiin kiteyttämällä uudelleen eetteri/metyleenikloridi/heksaanista: sp. 118-120 °C; NMR (CCU) δ 7,35-7,91 (m, 8H); 4,72 (t, J = 7 Hz, 2H); 4,58 (m, 3H); 4,37 (t, J = 7 Hz, 17 102379 1H); 2,05 (m. 2H); 1,09 (t, J = 6 Hz, 6H). Analyysi, laskemalla kaavasta C22H21NO5: C, 69,64; H, 5,58; N, 3,69. Kokeellisesti: C, 69,08; H, 5,97; N, 3,70.

Esimerkki IV

N-a-(9-fluorenyylimetyyIioksikarbonyyli)-N-E-t-butyyliokoksikarbonyyli-L-ly-5 siini-N-karboksianhydridi A. Seos, jossa oli Ν-ε-t-butyylioksikarbonyyli-L-lysiiniä (1,23 g, 5,0 mmol) ja kloo-ritrimetyylisilaania (1,08 g, 10,0 mmol) tetrahydrofuraanissa (50 ml), jäähdytettiin 0°C:en ja trietyyliamiinin (1,01 g, 10,0 mmol) liuos 5 ml:ssa tetrahydrofuraania lisättiin tipoittain. Seosta hämmennettiin 0 °C:ssa 2,5 tuntia, suodatettiin ja lisättiin 10 fosgeenia (10 mmol) liuokseen 15 ml:ssa tetrahydrofuraania. Lämpötila nostettiin 60 °C:seen ja liuosta hämmennettiin 2,0 tuntia ja sitten yli yön ympäristön lämpötilassa. Haihtuvat aineet poistettiin kiertohaihduttamalla, jolloin saatiin 0,79 g (58 %) Ν-ε-t-butyylioksikarbonyyli-L-lysiini-N-karboksianhydridiä: IR (CH2CI2) 1860, 1795, 1710 cm'1.

15 B. Seos, jossa oli Ν-ε-t-butyylioksikarbonyyli-L-lysiini-N-karboksianhydridiä (0,79 g, 2,91 mmol) ja 9-fluorenyylimetyylioksikarbonyylikloridia (0,75 g, 2,90mmol) tolueenissa (25 ml), jäähdytettiin 0°C:seen ja N-metyylimorfoliinin 4 * . (0,32 g, 3,2 mmol) liuos tolueenissa (5 ml) lisättiin tipoittain. Reaktioseos puhdistet- ; .·. tiin kuten esimerkissä III B, jolloin saatiin 0,88 g (66 %) N-a-(9-fluorenyylimetyy- : 20 lioksikarbonyyli)-N-E-t-butyylioksikarbonyyli-L-lysiini-N-karboksianhydridiä: sp.

81-85 °C (etyyliasetaatti/heksaani); NMR (CDC13): δ 7,3-7,7 (m, 8H); 4,11-4,58 (m, *;*.* 5H); 2,95-3,20 (m, 2H); 1,90-1,98 (m, 2H); 0,9-1,4 (m, 13 H). Analyysi laskemalla *·*·* kaavasta C27H30N2O7: C, 65,57; H, 6,11; N, 5,67. Kokeellisesti: C, 66,33; H, 6,38; N, 5,67.

• · • · · • · ·

25 Esimerkki V

• · « :Y: N-bentsyylioksikarbonyyli-L-alaniini-N-karboksianhydridi • ·· • » • · N-metyylimorfoliinin (1,06 g, 10,5 mmol) liuos etyyliasetaatissa (20 ml) lisättiin ««· ; tipoittain seokseen, jossa oli L-alaniini-N-karboksianhydridiä (esimerkistä II A) "·”· (0,81 g, 7,0 mmol) ja bentsyylioksikarbonyylikloridia (1,89 g, 10,5 mmol) etyyli-

30 asetaatissa (80 ml) 0 °C:ssa. Reaktioseosta hämmennettiin 1,5 h 0 °C:ssa, suodatettiin ja liuoksen tilavuus pienennettiin 75 ml:ksi. Heksaania (75 ml) lisättiin hämmentäen, minkä jälkeen liuos jäähdytettiin -20 °C:seen, jolloin saatiin 1,20 g (71 %) N-bentsyylioksikarbonyyli-L-alaniini-N-karboksianhydridiä: sp. 101-104 °C; NMR

18 102379 (CDC13), δ 7,73 (s, 5H), 5,27 (s, 2H), 4,60 (q, J = 7 Hz, 1H), 1,61 (d, J = 7 Hz, 3H). Analyysi, laskemalla kaavasta C12H11NO5: C, 57,83; H, 4,45; N, 5,62. Kokeellisesti: C, 57,60; H, 4,50; N, 5,53.

Esimerkki VI

5 N-bentsyylioksikarbonyyli-L-leusiini-N-karboksianhydridi N-metyylimorfoliinin (0,76 g, 7,50 mmol) liuos etyyliasetaatissa (10 ml) lisättiin tipoittain liuokseen, jossa oli L-leusiini-N-karboksianhydridiä (0,79 g, 5,0 mmol) (esimerkistä III A) ja bentsyylioksikarbonyylikloridia (1,35 g, 7,50 mmol) etyyliasetaatissa (50 ml) 0 °C:ssa. Reaktioseosta hämmennettiin 0 °C:ssa 1,25 h, suodatettiin 10 ja liuoksen tilavuus pienennettiin 5 ml:ksi. Heksaania (50 ml) lisättiin, minkä jälkeen liuos jäähdytettiin -20 °C:en, jolloin saatiin 0,89 g (61 %) N-bentsyylioksi-karbonyyli-L-leusiini-N-karboksianhydridiä: sp. 72-73,5 °C (eetteri/heksaani); NMR (CDCI3), δ 7,40 (s, 5H), 5,33 (s, 2H), 4,71 (t, J = 6 Hz, 1H), 1,80-2,04 (m, 3H), 0,91 (m, 6H). Analyysi, laskemalla kaavasta Ci5Hi7N05: C, 61,84; H, 5,88; N, 4,81.

15 Kokeellisesti: C, 61,64; H, 6,02; N, 4,90.

Esimerkki VII

N-fenyylioksikarbonyyli-L-valiini-N-karboksianhydridi A. L-valiini-N-karboksianhydridiä valmistettiin L-valiinista 75 %:n saannolla ; :': esimerkissä IIA kuvatulla menettelyllä.

20 B. Esimerkki V toistettiin korvaamalla bentsyyhklooriformaatti fenyylikloorifor-*··’ maatilla ja leusiini-N-karboksianhydridi valiini-N-karboksianhydridillä. Tuloksena oli 78 %:n saanto N-fenyylioksikarbonyyli-L-valiini-N-karboksianhydridiä: sp. 105-*.V: 106 °C (klooriformi/heksaani): NMR (CDC13), δ 7,30 (m, 5H), 4,70 (d, J = 3,5 Hz, 1H); 2,60 (m, 1 H), 1,22 (d, J = 7 Hz, 3H), 1,07 (d, J = 7 Hz, 3H), 1,07 (d, J = 7 Hz, ,·*·. 25 3H). Analyysi, laskemalla kaavasta C12H13NO5: C, 59,31; H, 4,98; N, 5,32.

I.'.' Kokeellisesti: C, 59,09; H, 4,91; N, 5,49.

• · * · ·

Esimerkki VIII

• · · N-etyylioksikarbonyyli-L-alaniini-N-karboksianhydridi

Esimerkki V toistettiin korvaamalla bentsyyhklooriformaatti etyyliklooriformaatilla. 30 Tuloksena oh 62 %:n saanto N-etyylioksikarbonyyli-L-alaniini-N-karboksianhydri-diä: sp. 72-73,5 °C (etyyliasetaatti/heksaani); NMR (CDCI3), δ 4,73 (q, J = 7 Hz, 19 102379 2H), 4,33 (q, J = 7 Hz, 1H), 1,70 (d,J = 7 Hz, 3H), 1,33 (t, J = 7 Hz, 3H). Analyysi, laskemalla kaavasta C7H9NO5'. C, 44,92; H, 4,85; N, 7,49. Kokeellisesti: C, 45,08; H, 5,03; N, 7,33.

Esimerkki IX

5 Bentsyylioksikarbonyyli-L-fenyylialaniini-N-karboksianhydridi A. L-fenyylialaniini-N-karboksianhydridiä valmistettiin L-fenyylialaniinista 53 %:n saannolla esimerkin IIA menettelyllä.

B. Liuokseen, jossa oli L-fenyylialaniini-N-karboksianhydridiä (2,5 g, 13 mmol) ja bentsyyliklooriformaattia (3,4 g, 20 mmol) etyyliasetaatissa (130 ml), lisättiin tipoit- 10 tain liuos, jossa oli N-metyylimorfoliinia (2,0 g, 20 mmol) etyyliasetaatissa (10 ml) 0 °C:ssa. Saatua seosta hämmennettiin 0 °C:ssa 2,5 h ja se puhdistettiin esimerkissä V kuvatulla tavalla, jolloin saatiin 2,0 g (48 %) N-bentsyylioksikarbonyyli-L-fenyylialaniini-N-karboksianhydridiä: sp. 108-109 °C; NMR (CDCI3), δ 7,35 (s, 5H), 7,00 (m, 5H), 5,31 (s, 2H), 4,83 (m, 1H), 3,28 (m, 2H). Analyysi, laskemalla 15 kaavasta CisHpNOs: C, 68,13; H, 5,40; N, 4,42. Kokeellisesti: C, 68,11; H, 5,38; N, 4,20.

Esimerkki X

Fenyylioksikarbonyyli-L-alaniini-N-tiokarboksianhydridi A. O-etyyli-S-metyyliksantaatti. Kaliumetyyliksantaatin (16,0 g, 100 mmol) liuok-/ 20 seen vedessä (50 ml) lisättiin tipoittain dimetyylisulfaattia (12,6 g, 100 mmol) '·'· 4+1 °C:ssa. Lisäyksen päätyttyä reaktioseos pestiin dikloorimetaanilla (2x40 ml) ja yhdistetyt orgaaniset jakeet kuivattiin (MgS04) ja väkevöitiin. öljymäinen jäännös • · liuotettiin metanoliin ja väkevöitiin, jolloin saatiin riittävän puhdasta O-etyyli-S-:* Γ r metyyliksantaattia käytettäväksi seuraavassa vaiheessa.

• v.‘ 25 B. Etoksitiokarbonyyli-L-alaniini. Edellä valmistettuun O-etyyli-S-metyyliksantaat- tiin lisättiin liuos, jossa oli L-alaniinia (8,99 g, 100 mmol) ja NaOH (4,0 g, 100 mmol) vedessä (100 ml). Liuos lämmitettiin 45 °C:en 2,3 tunniksi. Samalla kun liuosta huuhdeltiin N2:lla, metanolia (50 ml) lisättiin ja seosta hämmennettiin 45 °C:ssa vielä 0,7 h. Reaktioseoksen annettiin jäähtyä huoneenlämpötilaan, se 30 pestiin dikloorimetaanilla (3x25 ml), hapotettiin pH-arvoon 2,5 väkevällä HCl:lla ja uutettiin etyyliasetaatilla (2x50 ml). Yhdistetyt orgaaniset liuokset kuivattiin (MgS04) ja väkevöitiin. Heksaanin lisäys saatuun öljyyn tuotti 9,5 g (54 %) etyyli- 20 102379 oksitiokarbonyyli-L-alaniinia värittömänä kiinteänä aineena, joka suli 74-78 °C:ssa. Tämä materiaali puhdistettiin edelleen kiteyttämällä uudelleen eetteri/heksaanista: sp. 77-79 °C; IR (CCL,): 3397, 1716 cm'1.

C. L-alaniini-N-tiokarboksianhydridi. Liuokseen, jossa oli etyylioksitiokarbonyyli-5 L-alaniinia (3,0 g, 17 mmol) ja imidatsolia (1,2 g, 17 mmol) THF:ssa (20 ml), lisättiin tipottain PBr3:a (5,4 g, 20 mmol) 20 °C:ssa. Hämmentämistä jatkettiin, kunnes kiinteä massa oli hajonnut hienojakoiseksi suspensioksi. Reaktioseos kaadettiin kyllästetyn NaHC03:n (200 ml) ja etyyliasetaatin (150 ml) seokseen. Orgaaninen kerros erotettiin, pestiin 1-M HCl:lla (2x100 ml), kyllästetyllä NaHC03:lla (100 10 ml) ja suolaliuoksella (100 ml), kuivattiin (MgS04) ja väkevöitiin. Saatu öljy jähmettyi seistessään. Kiinteän aineen uudelleenkiteytys tuotti 0,75 g (34 %) L-alanii-ni-N-tiokarboksianhydridiä: mp. 91-92 °C; IR(CCLi): 1750, 1695 cm'1.

D. Fenyylioksikarbonyyli-L-alaniini-N-tiokarboksianhydridi. Liuokseen, jossa oli L-alaniini-N-tiokarboksianhydridiä (0,49 g, 3,8 mol) 50 ml:ssa etyyliasetaattia, lisät- 15 tiin fenyyliklooriformaattia (0,95 g, 6,1 mmol) 0 °C:ssa. Saatua seosta hämmennettiin 3 h 0 °C:ssa, suodatettiin ja väkevöitiin valkoiseksi puolikiinteäksi aineeksi. Puolikiinteä materiaali liuotettiin 20 ml:an etyyliasetaattia, heksaania (150 ml) lisät-. . tiin ja seos jäähdytettiin -20 °C:en, jolloin saatiin 0,55 g (62 %) fenyylioksikar- ; bonyyli-L-alaniini-N-tiokarboksianhydridiä: sp. 110-111C; NMR (CDC13): δ 7,18 ' V 20 (m. 5H), 4,83 (q, 1H, J = 7 Hz), 1,71 (d, 3H, J = 7 Hz); IR (CH2C12); 1810, 1740 : ·' (dupletti), 1715 (olkapää). Analyysi, laskemalla kaavasta C11H9NO4S: C, 52,58; H, : : : 3,61; N, 5,58; S, 12,76. Kokeellisesti: C 52,75; H, 3,72; N, 5,36; S, 12,98.

• · ·

Esimerkki XI

• · · • · N-(9-fIuorenyylimetyylioksikarbonyyli)-0-t-butyyli-L-treoniini-N-karboksian-25 hydridi «·« • · · • I ( A. O-t-butyyli-L-treoniini-N-karboksianhydridiä valmistettiin O-t-butyyli-L-treonii- • · · v·* nista 57 %:n saannolla käyttäen esimerkissä IV A kuvattua trimetyylisilyylimenette- C: lyä.

• · · • · · ' B. Liuokseen, jossa oli O-t-butyyli-L-treoniini-N-karboksianhydridiä (0,80 g, 4,0 30 mmol) tolueenissa ja 9-fluorenyylimetyylioksikloridia (1,06, 4,0 mmol) (50 ml), lisättiin tipoittain N-metyylimorfoliinin (0,49 g, 4,8 mmol) liuos 8 mlrssa tolueenia 0 °C:ssa. Reaktioseosta hämmennettiin 3 tuntia 0 °C:ssa, suodatettiin ja haihtuvat aineet poistettiin alipaineessa. Jäännös kiteytettiin eetteri/heksaanista, jolloin saatiin 1,0 g (60 %) N-(9-fluorenyylimetyylioksikarbonyyli)-0-t-butyyli-L-treoniinia: sp.

21 102379 124-127 °C; NMR (CDC13): δ 7,08-7,78 (m, 8H), 4,05-4,61 (m, 4H), 1,18 (s, 9H), 1,16 (d, 3H, J = 7 Hz). Analyysi, laskemalla kaavasta C24H25N06: C, 68,07; H, 5,95; N, 3,31. Kokeellisesti: C, 67,89; H, 5,96; N, 3,28.

Esimerkki XII

5 Etoksikarbonyyli-a-aminoisobutyyrihappo-N-karboksianhydridi A. α-aminoisobutyyrihappo-N-karboksianhydridiä valmistettiin 67 %:n saannolla esimerkissä IIA kuvatulla menettelyllä.

B. Esimerkki VIII B toistettiin korvaamalla L-alaniini-N-karboksianhydridi a-arni-noisobutyyrihappo-N-karboksianhydridillä, jolloin saatiin 16 %:n saanto etyylioksi- 10 karbonyyliaminoisobutyyrihappo-N-karboksianhydridiä: sp. 68-70 °C (kloroformi/-heksaani); NMR (CCL,: δ 4,59 (q, 2H, J = 7 Hz), 2,00 (s, 6H), 1,65 (t, 3H, J = 7 Hz). Analyysi, laskemalla kaavasta CgHiiN05: C, 47,76; H, 5,51; N, 6,96. Kokeellisesti: C, 47,67; H, 5,51; N, 7,14.

Esimerkki XIII

15 N-t-butyylioksikarbonyyli-L-alaniini-N-karboksianhydridi

. ·. ·. Liuokseen, jossa oli t-butyylialkoholia (1,25 g, 16,9 mmol) ja fosgeenia (3,4 ml 5-M

liuosta dioksaanissa, 17 mmol) 80 ml.ssa etyyliasetaattia, lisättiin tipoittain N-me-j 1 tyylimorfoliinia (3,4 g, 34 mmol) -50 °C:ssa. Reaktioseosta hämmennettiin 0,5 h. L- alaniini-N-karboksianhydridiä (0,23 g, 2,0 mmol) etyyliasetaatissa (10 ml) lisättiin 20 ja seosta hämmennettiin -50 °C:ssa vielä 0,75 h. N-metyylimorfoliinia (1,0 g, 10 *·’·' mmol) lisättiin ja hämmentämistä jatkettiin vielä 0,75 h -50 °C:ssa. Kiinteät aineet poistettiin suodattamalla, liuos väkevöitiin ja tuote saatiin sen jälkeen, kun sitä oli • · hierretty heksaanissa. Uudelleenkiteytys tolueenista tuotti 0,28 g (65 %) N-t-butyy-:Tr lioksikarbonyyli-L-alaniini-N-karboksianhydridiä, sp. 103-104,5 °C; NMR(CDCL3): 25 δ 4,71 (q, 1H, J = 7 Hz), 1,80 (d, 3H, J = 7 Hz), 1,70 (s, 9 H). Analyysi, laskemalla l.'.' kaavasta CsHi3N05: C, 50,23; H, 6,09; N, 6,51. Kokeellisesti: C, 50,66; H, 6,36; N, :T* 6,38.

«·· • · *

Esimerkki XIV

t · N-(t-butyylioksikarbonyyli)-0-bentsyyli-L-seriini-N-karboksianhydridi 30 A. O-bentsyyli-L-seriini-N-karboksianhydridiä valmistettiin 68 %:n saannolla esimerkin IIA menettelyllä.

22 102379 B. Esimerkki XIII toistettiin korvaamalla L-alaniini-N-karboksianhydridi O-bent-syyli-L-seriini-N-karboksianhydridillä, jolloin saatiin N-(t-butyylioksikarbonyyli)- 0- bentsyyli-L-seriini-N-karboksianhydridiä 52 %:n saannolla: sp. 98-99,5 °C; NMR (CCI4): δ 7,30 (m, 5H), 4,64 (m. 3H, bentsyyli -CH2 ja NCA-rengasprotoni), 4,09 5 (dd, 1H, J = 15, 5 Hz), 3,88 (dd, 1H, J = 15, 5 Hz), 1,65 (s, 9H). Analyysi, laskemalla kaavasta C15H19NO6: C, 59,80; H, 5,96; N, 4,36. Kokeellisesti: C, 59,71; H, 6,25; N, 4.05.

Esimerkki XV

1- amino-l-sykloheksaanikarboksyylihappo-N-karboksianhydridin 10 fenyylikarbonyylijohdannaisen valmistus A. 1-amino-1-sykloheksaanikarboksyylihappo-N-karboksianhydridiä valmistettiin 1-amino-l-sykloheksaanikarboksyylihaposta 50 %:n saannolla esimerkissä II A kuvatulla menettelyllä.

B. Liuokseen, jossa oli kohdassa A valmistettua N-karboksianhydridiä (0,85 g, 15 5,0 mmol) ja fenyyliklooriformaattia (1,2 g, 7,5 mmol) etyyliasetaatissa (30 ml) 0 °C:ssa, lisättiin N-metyylimorfoliinin (0,76 g, 7,5 mmol) liuos 8 ml:ssa etyyli- • · : asetaattia. Reaktioseosta hämmennettiin 2 h 0 °C:ssa, suodatettiin ja väkevöitiin.

• . Valkoinen puolikiinteä jäännös kiteytettiin uudelleen etyylieetteri/metyleeniklori- di/heksaanista, jolloin saatiin 0,92 g (66 %) N-karboksianhydridiä: sp. 156,5-; 20 158 °C; NMR (CDC13): δ 7,28 (m. 5 H), 1,20-3,10 (m, 10 H). Analyysi, laskemalla . ;·; kaavasta C15H15N05: C, 62,27; H, 5,23; N, 4,84. Kokeellisesti: C, 62,03; H, *:V 5,22; N, 4,77.

« « · • ·

Esimerkki XVI

• · • · · * · · N-(9-fluorenyyIimetyylioksikarbonyyli)-L-leusiini-N-karboksianhydridi • < 25 A. L-leusiini-N-karboksianhydridiä valmistettiin L-leusiinista 78 %:n saannolla esi- .··«, merkissä II A hahmotellulla menettelyllä.

• * • · · :*·*: B. L-leusiini-N-karboksianhydridin (9,2 g, 58,4 mmol) seos kuivassa, tislatussa .; ·.; etyyliasetaatissa (150 ml) jäähdytettiin -10 °C :en ja trietyyliamiinin (9 ml, 64 mmol) liuos 20 ml:ssa etyyliasetaattia lisättiin tipoittain 5 minuutin kuluessa. Jäähdytys 30 lopetettiin ja reaktioseoksen annettiin sekoittua 15 minuuttia. Pieni määrä vedetöntä kloorivetyhappoa dioksaanissa (4,4-M, 5 ml) lisättiin, jotta varmistettaisiin, että kaikki trietyyliamiini oli neutraloitu. Reaktioseos suodatettiin ja liuotin poistettiin 23 102379 alipaineessa. Saatu epäpuhdas tuote liuotettiin etyylieetteriin, suodatettiin ja tuote saatiin uudelleenkiteytyksellä heksaanin lisäyksen jälkeen.

Kolmen huolellisen lisäkiteytyksen jälkeen N-(9-fluorenyyli-metyylioksikarbonyy-li)-L-leusiini-N-karboksianhydridiä saatiin 16 %:n saannolla (3,6 g). Analyyttiset 5 tulokset olivat olennaisesti identtiset esimerkissä III saatujen kanssa.

Esimerkki XVII

L-leusyyli-L-valiini 9-fluorenyylimetyylioksikarbonyyli-L-valiinia, joka oli esteröity p-alkoksibentsyyli-alkoholilla derivoituun, 2-%:isesti silloitettuun polystyreeniin (0,25 g, 0,13 mmol 10 valiinia), asetettiin kiinteän faasin peptidisynteesiastiaan. Dimetyyliformamidi poistettiin ja paisunutta hartsia käsiteltiin kahdesti 10-%:isella piperidiinin dimetyyli-formamidiliuoksella (5 ml 5 min ajan ja senjälkeen 5 ml 15 min ajan) 9-fluorenyyli-metyylioksikarbonyylisuojaryhmän poistamiseksi. Hartsi pestiin dimetyyliformami-dilla (4x5 ml) ja sen annettiin reagoida 9-fluorenyylimetyylioksikarbonyyli-L-leusii-15 ni-N-karboksianhydridin (145 mg, 0,38 mmol) kanssa dimetyyliformamidissa (6 ml) 45 min ajan. Fluorenyylimetyylikarbonyylisuojaryhmä poistettiin kuten edellä ja hartsi pestiin dimetyyliformamidilla (3x5 ml) ja metyleenikloridilla (3x5 ml). Saatu dipeptidi lohkaistiin hartsista käsittelemällä metyleenikloridi/trifluorietikkahapolla (6 ml, 1/1) 45 min ajan. Liuos poistettiin ja hartsi pestiin metyleenikloridilla (3x5 20 ml) ja metanolilla (2x5 ml). Yhdistetyt liuos ja pesunesteet haihdutettiin alipainees-‘' sa puolikiinteäksi aineeksi, joka liuotettiin tislattuun veteen ja suodatettiin. Vesi- '; / liuos pakastekuivattiin, saatua kiinteää ainetta hierrettiin eetterissä (3 x) hartsiperäis- * · ‘ · ‘ ten epäpuhtauksien poistamiseksi ja kuivattiin alipaineessa, jolloin saatiin L-leusyy- li-L-valiinia yli 90 %:n saannolla. Dipeptidin identtisyys varmistettiin HPLC-ana- • · v.: 25 lyysillä (virtausnopeus = 1,5 ml/min, detektio aallonpituudella 215 nm, 30 % meta- • · · v * nolia 0,5-M:ssa perkloorihapossa) sen eluoitumisesta samanaikaisesti tunnetun standardin kanssa (retentioaika 8,49 min). Puhtauden määritettiin olevan yli 97 % • · · I.·' kaikkien epäpuhtauksien ollessa jäljitettävissä hartsiin. Mitään D-leusyyli-L-valiinia *" (retentioaika 3 2 min) ei voitu todeta (detektiorajat <0,1 %).

··· • » · • « « 30 Esimerkki XVIII L-leusyyli-L-valiini

Esimerkki XVI toistettiin paitsi, että 9-fluorenyylimetyylioksikarbonyyli-L-leusiini-N-karboksianhydridin annettiin reagoida hartsissa olevan L-valiinin vapaan amiinin 24 102379 kanssa käyttäen metyleenikloridia (5 ml) dimetyyliformamidin sijasta liuottimena. Tulokset olivat verrattavissa esimerkkiin XVI.

Esimerkki XIX

L-leusyyli-L-alanyyli-L-vaiiini (FMOC-menettely) 5 Esimerkin XVI menettelyä käytettiin L-leusyyli-L-alanyyli-L-valiinin valmistamiseen. Hartsista lohkaisun ja eetteripesujen jälkeen tripeptidi saatiin yli 88 %:n saannolla valkoisena kiinteänä aineena. HPLC-analyysi käyttäen esimerkissä XVI kuvattuja olosuhteita varmisti tuotteen identtisyyden sen eluoituessa samanaikaisesti tunnetun standardin kanssa (retentioaika 16,28 min). Valinnaisia molekyylirakenteita, 10 kuten L-leusyyli-L-valiinia ja L-alanyyli-L-valiinia ei todettu (detektiorajat < 0,1 %).

Esimerkki XX

L-leusyyli-L-alanyyli-L-valiini (Boc-menettely) t-butyylioksikarbonyyli-L-valiinia esteröitynä metyloituun, 2-%:isesti silloitettuun 15 polystyreeniin (ts. Merryfield-hartsiin) (0,50 g, 0,23 mmol valimia) asetettiin kiin-:. teän faasin peptidisynteesiastiaan. Metyleenikloridia (5 ml) lisättiin ja lietettä ravis tettiin 30 minuuttia. Liuotin poistettiin ja hartsia käsiteltiin metyleenikloridi/tri-:' ’': fluorietikkahapolla (6 ml suhteessa 1/1) 30 min t-butyylioksikarbonyylisuojaryhmän poistamiseksi. Hartsi pestiin metyleenikloridilla (3x5 ml), neutraloitiin 10-%:isella . 20 trietyyliamiinilla metyleenikloridissa (5 ml), pestiin metyleenikloridilla (3x5 ml) ja . , annettiin sitten reagoida t-butyylioksikarbonyyli-L-alaniini-N-karboksianhydridin (200 mg, 1,0 mmol) liuoksen kanssa metyleenikloridissa (5 ml) 45 min ajan. Saatu suojattu dipeptidihartsi pestiin metyleenikloridilla (3x5 ml). Hartsi suojattiin jälleen, pestiin, neutraloitiin ja pestiin edellä kuvatulla tavalla.

• r · « 4 • .·*·. 25 t-butyylioksikarbonyyli-L-leusiini-N-karboksianhydridiä, (240 mg, 1,0 mmol) mety- • · » leenikloridissa (6 ml) lisättiin hartsiin ja seosta ravisteltiin 45 min. Liuos poistettiin • · ja hartsi pestiin metyleenikloridilla (3x5 ml), metanolilla (3x5 ml) ja metyleeniklori- • · ♦ v ; dilla (3x5 ml) ja kuivattiin suurtyhjössä. t-butyylioksikarbonyylisuojatun tripeptidi- :": hartsin annettiin reagoida nestemäisen fluorivedyn kanssa 0 °C:ssa 30 minuutin ajan.

30 Fluorivety poistettiin ja jäännös kuivattiin suurtyhjössä. Peptidi liuotettiin veteen ja hartsi poistettiin suodattamalla. Liuos pakastekuivattiin, jolloin saatiin lähes kvantitatiivinen saanto L-leusyyli-L-alanyyli-L-valiinia. HPLC-analyysitulokset olivat verrattavissa esimerkkiin XVIII.

Esimerkki XXI

25 102379 L-aianyyli-L-fenyylialaniini (täyden suojamenettelyn kautta) A. L-fenyylialaniinibentsyyliesteri-p-tolueenisulfonaattiin (1,07 g, 2,5 mmol) tetra-hydrofuraanissa (20 ml) 0 °C:ssa lisättiin N-metyylimorfoliinia (0,25 g, 2,5 mmol). 5 Seosta hämmennettiin 0,5 h 0 °C:ssa ja N-bentsyylioksikarbonyyli-L-alaniini-N-kar-boksianhydridiä (0,50 g, 2,0 mmol) lisättiin. Reaktioseosta hämmennettiin 2 h 0 °C:ssa ja vettä (20 ml) ja dikloorietaania (50 ml) lisättiin. Kerrokset erotettiin ja vesikerros pestiin dikloorimetaanilla (25 ml). Yhdistetyt orgaaniset jakeet pestiin 0,5-M HCl:lla (2x50 ml), 10-%:isella natriumbikarbonaatilla (50 ml) ja vedellä 10 (2x50 ml), kuivattiin (MgS04) ja väkevöitiin. Kiteytyminen tapahtui lisättäessä hek- saania, jolloin saatiin 0,66 g (72 %) N-bentsyylioksikarbonyyli-L-alanyyli-L-fenyylialaniinibentsyyliesteriä: sp. 118,5-119 °C; NMR (CDC13): δ 7,64 (s, 1H), 6,82-7,39 (m, 6H), 5,04 (s, 2H), 5,00 (s, 2H), 4,58-4,92 (m, 2H), 3,07 (d, J = 6 Hz, 2H), 1,29 (d, J = 7 Hz, 3H).

15 B. Seosta, jossa oli N-bentsyylioksikarbonyyli-L-alanyyli-L-fenyylialamiinibent-syyliesteriä (0,50 g, 1,1 mmol) ja 10 % Pd sisältävää palladium/hiilikatalyyttiä (0,1 g) etyylialkoholissa (150 ml), ravisteltiin Parr-hydrauslaitteella 6,5 h 20 °C:ssa. :, Reaktioseos suodatettiin ja suodos huuhdeltiin vedellä (100 ml). Liuos väkevöitiin, :Y: jolloin saatiin 0,26 g (100 %) L-alanyyli-L-fenyylialaniinia. HPLC-analyysi osoitti i ·': 20 yli 9 %:n puhtautta eikä siinä ollut merkkejä rasemisoitumisesta.

Esimerkki XXII

* · I

:' L-alanyyli-L-fenyylialaniini (osittaisen suojausmenettelyn kautta) . . A. Liuokseen, jossa oli L-fenyylialaniinia (0,33 g, 2,0 mmol) 0,20-M kaliumkarbo- • · · *·[·’ naatissa (20 ml) ja asetonitriilissä (30 ml), lisättiin tipoittain N-bentsyylioksikarbo- ' 25 nyyli-L-alaniini-N-karboksianhydridin (0,45 g, 1,8 mmol) liuos asetonitriilissä (5 ml) 0 °C:ssa. Seosta hämmennettiin 40 min 0 °C:ssa ja laimennettiin etyyliasetaa- ♦ · .·*·. tiliä (50 ml) ja 1-M kloorivetyhapolla (10 ml). Kerrokset erotettiin ja vesikerros .·. uutettiin etyyliasetaatilla (2x35 ml). Yhdistetyt orgaaniset jakeet pestiin suolaliuok- ’·* sella (30 ml), 0,5-M kloorivetyhapolla (2x50 ml) ja vedellä (2x50 ml), kuivattiin : 30 (MgS04) ja väkevöitiin. Jäännös kiteytettiin uudelleen kloroformi/heksaanista, jolloin saatiin 0,26 g (39 %) N-bentsyylioksikarbonyyli-L-alanyyli-L-fenyylialanii-nia: sp. 121-122 °C; NMR (DMSO-tk): 6 12,71 (s, 1H), 8,06 (m, 1H), 7,30 (m, 5H), 5,01 (s, 2H), 4,43 (m, 1H), 4,06 (m, 1H), 2,99 (m, 2H), 11,19 (d, 2H, J = 7 Hz).

26 102379 B. Seosta, jossa oli N-bentsyylioksikarbonyyli-L-alanyyli-L-fenyylialaniinia (0,208 g, 0,562 mmmol) ja 10 %:sta palladium/hiilikatalyyttiä (0,1 g) 95-%:isessa etyylialkoholissa (50 ml), ravisteltiin Parr-hydrauslaitteella 16 h 20 °C:ssa. Reaktio-seos suodatettiin ja suodos huuhdeltiin vedellä (100 ml). Yhdistetyt liuokset väke-5 voitiin, jolloin saatiin 0,122 g (92 %) L-alanyyli-L-fenyylialaniinia valkoisena kiinteänä aineena. HPLC-analyysi osoitti yli 99,5-%:ista puhtautta eikä siinä ollut merkkejä rasemisoitumisesta.

» • I < • < ' « i i • « • · • · « • · < • « •« · • « * * · < • t • I · • · < • · • I « • · • · • · · ··· f » +

Claims (16)

102379

1. Uretaanisuojattu aminohappo-N-karboksianhydridi tai aminohappo-N-tiokar-boksianhydridi, tunnettu siitä, että sillä on rakenne: 5 ° \ R"-0-C-N^ R-(CH2)„-L R’ O jossa R ja R' ovat toisistaan riippumatta vetyatomeja, alkyyliryhmiä tai syklo-alkyyliryhmiä, joissa on 1-12 hiiliatomia; aryyliryhmiä, joissa on 6-20 hiiliatomia 10 tai aralkyyli- tai alkaryyliryhmiä, joissa on 7-20 hiiliatomia, ja ainakin toinen ryhmistä R ja R' on muu kuin vetyatomi; R" on alkyyli- tai sykloalkyyliryhmä, jossa on 1-12 hiiliatomia; aryyliryhmä, jossa on 6-20 hiiliatomia tai aralkyyli- tai alkaryyliryhmä, jossa on 7-20 hiiliatomia; Z on happi- tai rikkiatomi; ja 15 n on 0, 1 tai 2.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen uretaanisuojattu aminohappo-N-karboksian-hydridi tai -N-tiokarboksianhydridi, tunnettu siitä, että R" on 1-20 hiiliatomia sisältävä alkyyliryhmä. : . 20 • · · ***** 3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen uretaanisuojattu aminohappo-N-karboksian- hydridi tai -N-tiokarboksianhydridi, tunnettu siitä, että R" on alempi alkyyliryhmä, v.; eli enintään 5 hiiliatomia sisältävä alkyyli. • ti • · e » · ( • m

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen uretaanisuojattu aminohappo-N-karboksian- .···. hydridi tai -N-tiokarboksianhydridi, tunnettu siitä, että R" on t-butyyliryhmä. • · • · · • · · : 5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen uretaanisuojattu aminohappo-N-karboksian- ‘:": hydridi tai -N-tiokarboksianhydridi, tunnettu siitä, että R" on aryyli- tai substituoitu 30 aryyliryhmä. 102379

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen uretaanisuojattu aminohappo-N-karboksi-anhydridi tai -N-tiokarboksianhydridi, tunnettu siitä, että R" on fenyyli- tai substi-tuoitu fenyyliryhmä.

7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen uretaanisuojattu aminohappo-N-karboksian- hydridi tai -N-tiokarboksianhydridi, tunnettu siitä, että R" on aralkyyli- tai substitu-oitu aralkyyliryhmä.

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen uretaanisuojattu aminohappo-N-karboksian-10 hydridi tai -N-tiokarboksianhydridi, tunnettu siitä, että R" on bentsyyli- tai substi- tuoitu bentsyyliryhmä.

9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen uretaanisuojattu aminohappo-N-karboksian-hydridi tai -N-tiokarboksianhydridi, tunnettu siitä, että R" on p-metoksibentsyyli- 15 ryhmä.

10. Patenttivaatimuksen 7 mukainen uretaanisuojattu aminohappo-N-karboksian-hydridi tai -N-tiokarboksianhydridi, tunnettu siitä, että R" on 9-fluorenyylimetyyli-tai substituoitu 9-fluorenyylimetyyliryhmä. 20

11. Jonkin patenttivaatimuksen 1-10 mukainen uretaanisuojattu aminohappo-N-karboksianhydridi tai -N-tiokarboksianhydridi, tunnettu siitä, että ainakin toinen ! ryhmistä R ja R' on suojatun tai suojaamattoman aminohapon sivuketju. ' 25 12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen uretaanisuojattu aminohappo-N-karboksian- :·:·* hydridi tai -N-tiokarboksianhydridi, tunnettu siitä, että R tai R' on valittu seuraa- vista: • · » • · · ♦ · : T: alaniinin sivuketju; .·]·. 30 arginiinin tai sopivasti suojatun arginiinin sivuketju; • · · 1.1' aspartiinihapon tai sopivasti suojatun aspartiinihapon sivuketju; *;*’ asparagiinin tai sopivasti suojatun asparagiinin sivuketju; • · · . * : kysteiinin tai sopivasti suojatun kysteiinin sivuketju; •: · i kystiinin sivuketju; 35 glutaamihapon tai sopivasti suojatun glutaamihapon sivuketju; glutamiinin tai sopivasti suojatun glutamiinin sivuketju; histidiinin tai sopivasti suojatun histidiinin sivuketju; isoleusiinin sivuketju; 102379 sopivasti suojatun lysiinin sivuketju; leusiinin sivuketju; metioniinin sivuketju; norleusiinin sivuketju; 5 sopivasti suojatun omitiinin sivuketju; fenyylialaniinin sivuketju; seriinin tai sopivasti suojatun seriinin sivuketju; treoniinin tai sopivasti suojatun treoniinin sivuketju; tryptofaanin tai sopivasti suojatun tryptofaanin sivuketju; 10 tyrosiinin tai sopivasti suojatun tyrosiinin sivuketju; valiinin sivuketju; tai homoseriinin tai sopivasti suojatun homoseriinin sivuketju.

13. Patenttivaatimuksen 1 mukainen uretaanisuojattu aminohappo-N-karboksian-15 hydridi tai -N-tiokarboksianhydridi, tunnettu siitä, että se on valittu seuraavasta ryhmästä: N-9-fluorenyylimetyylioksikarbonyyli-L-leusiini-N-karboksianhydridi, N-9-fluorenyylimetyylioksikarbonyyli-L-alaniini-N-karboksianhydridi, N-a-(9-fluorenyylimetyylioksikarbonyyli)-N-£-t-butyylioksikarbonyyli-L-lysiini-N- .· . ; 20 karboksianhydridi, . ·. ·. N -bentsyylioksikarbonyyli-L-alaniini-N-karboksianhydridi, .! ! N-bentsyylioksikarbonyyli-L-leusiini-N-karboksianhydridi, ; ; N-fenyylioksikarbonyyli-L-valiini-N-karboksianhydridi, ·';; (: N-etyylioksikarbonyyli-L-alaniini-N-karboksianhydridi, ‘ 25 N-bentsyylioksikarbonyyli-L-fenyylialaniini-N-karboksianhydridi, ;:· N-fenyylioksikarbonyyli-L-alaniini-N-tiokarboksianhydridi, N-(9-fluorenyylimetyylioksikarbonyyli)-0-t-butyyli-L-treoniini-N-:Vr karboksianhydridi, :' i : N-9-fluorenyylimetyylioksikarbonyyli-P-alaniini-N-karboksianhydridi, .\ 30 N-t-butyylioksikarbonyyli-L-alaniini-N-karboksianhydridi, *; [; ’ N-(t-butyylioksikarbonyyli)-0-bentsyyli-L-seriini-N-karboksianhydridi, • · •... * N-fenyylioksikarbonyyli-1 -amino-1 -karboksisykloheksaani-N-karboksianhydridi, ja : ‘! *: N-etyylioksikarbonyyli-a-aminoisobutyyrihappo-N-karboksianhydridi.

14. Menetelmä polypeptidiketjun syntetisoimiseksi, jossa N-suojatun aminohappo- komponentin annetaan reagoida toisen samanlaisen tai erilaisen aminohappokompo-nentin kanssa ja prosessia toistetaan, kunnes saadaan haluttu polypeptidi, tunnettu siitä, että käytetään suojattuna aminohappokomponenttina ainakin yhdessä maini- 102379 tuista reaktioista jonkin patenttivaatimuksen 1-13 mukaista yhdistettä, jolla on yleinen rakenne: O o I R"-0-C-N R'-CCH.Xrl R' O 5 jossa R ja R' ovat toisistaan riippumatta vetyatomeja, alkyyliryhmiä tai syklo-alkyyliryhmiä, joissa on 1-12 hiiliatomia; aryyliryhmiä, joissa on 6-20 hiiliatomia tai aralkyyli- tai alkaryyliryhmiä, joissa on 7-20 hiiliatomia, ja ainakin toinen ryhmistä R ja R' on muu kuin vetyatomi;

10 R" on alkyyli- tai sykloalkyyliiyhmä, jossa on 1-12 hiiliatomia; aryyliryhmä, jossa on 6-20 hiiliatomia tai aralkyyli- tai alkaryyliryhmä, jossa on 7-20 hiiliatomia; Z on happi- tai rikkiatomi; ja n on 0, 1 tai 2. . · 15 15. Menetelmä polypeptidiketjun syntetisoimiseksi kiinteässä faasissa liukenemat- ;; ; tomalle tukiaineelle, jossa menetelmässä N-suojattu aminohappokomponentti liite- tään kondensaatioreaktiolla tukiaineeseen, joka sisältää substituenttiryhmiä, jotka ] , ·. reagoivat mainitun aminohappokomponentin karboksyylipääteryhmän kanssa, liite- '! J‘ tystä, suojatusta aminohappokomponentista poistetaan suojaus, se neutraloidaan tar- ; . 20 vittaessa ja toinen samanlainen tai erilainen suojattu aminohappokomponentti liite- • · · *·*·* tään mainittuun suojauksesta poistettuun aminohappoyhdisteeseen ja prosessia tois tetaan, kunnes saadaan haluttu polypeptidi, tunnettu siitä, että käytetään suojattuna v.· aminohappokomponenttina ainakin yhdessä mainituista reaktioista jonkin patentti- t V vaatimuksen 1-13 mukaista yhdi stettä, j olla on yleinen rakenne: /.·. 25 O • · · « · « · !:! 0 i : ·; R"-o-c->i ^z R--(CH2)n-i R' O 102379 jossa R ja R' ovat toisistaan riippumatta vetyatomeja, alkyyliryhmiä tai syklo-alkyyliryhmiä, joissa on 1-12 hiiliatomia; aryyliiyhmiä, joissa on 6-20 hiiliatomia tai aralkyyli- tai alkaryyliiyhmiä, joissa on 7-20 hiiliatomia, ja ainakin toinen ryhmistä R ja R' on muu kuin vetyatomi;

5 R" on alkyyli- tai sykloalkyyliryhmä, jossa on 1-12 hiiliatomia; aryyliiyhmä, jossa on 6-20 hiiliatomia tai aralkyyli- tai alkaryyliryhmä, jossa on 7-20 hiiliatomia; Z on happi- tai rikkiatomi; ja n on 0, 1 tai 2.

16. Menetelmä uretaanisuojattujen aminohappo-N-karboksianhydridien tai -N-tio- karboksianhydridien valmistamiseksi, joilla on rakenne: O ? A R"-0-C-N Z R—(CH2)„-L R’ O • 15 jossa R ja R' ovat toisistaan riippumatta vetyatomeja, alkyyliryhmiä tai syklo- alkyyliryhmiä, joissa on 1-12 hiiliatomia; aryyliryhmiä, joissa on 6-20 hiiliatomia tai aralkyyli- tai alkaryyliryhmiä, joissa on 7-20 hiiliatomia, ja ainakin toinen « · ; ! ryhmistä R ja R' on muu kuin vetyatomi; A." R" on alkyyli- tai sykloalkyyliryhmä, jossa on 1-12 hiiliatomia; aryyliryhmä, jossa '; ’, 20 on 6-20 hiiliatomia tai aralkyyli- tai alkaryyliryhmä, jossa on 7-20 hiiliatomia; *·*·* Z on happi- tai rikkiatomi; ja n on 0, 1 tai 2, tunnettu siitä, että annetaan aminohappo-N-karboksianhydridin tai -N-tiokarboksi- • « \ v anhydridin, jolla on rakenne: • ·' A o • < • · « • * < « · • · · *” Η-Ν/Λχζ ·"·: R-(CH2)„-i

25 R' O 102379 jossa R, R' ja Z ovat samoja kuin edellä määriteltiin, reagoida haloformaatin kanssa, jolla on rakenne: O II R"-0-C-X 5 jossa X on halogeeniatomi ja R" on sama kuin edellä määriteltiin, inertissä laimenti-messa vedettömissä olosuhteissa ja tertiäärisen amiiniemäksen läsnäollessa. 10