HU205091B - Process for producing amino acid-n-carboxyanhydrides protected with urethane group - Google Patents

Description

A találmány tárgya eljárás uretáncsoporttal védett aminosav-N-karboxi-anhidridek előállítására.

Az adott szekvencíájú polipeptideket általában különleges laboratóriumi eljárásokkal állítják elő, amelynek során az intermediereket az egyes aminosavegységek hozzáadása után izolálják. Ez komplikálja a szintézist és hosszú láncú polipeptidek és fehérjék előállítását szinte lehetetlenné teszi az alacsony kitermelés, racemizálódás és/vagy a mellékreakciók miatt. Merrifield (J. Am. Chem. Soc. 85,2149, 1963), valamint Letsinger és Komét (J. Am. Chem. Soc. 85,2045, 1963) oldhatatlan polimer hordozóanyagok alkalmazását javasolják. Ez az eljárás, amelyet általában szilárd fázisú peptidszintézisnek neveznek, lehetővé teszi a növekvő peptidlánc „tisztítását” az intermedier izolálása nélkül.

Mind a klasszikus (folyadék fázisú), mind a szilárdfázisú polipeptidszintézis megvalósításánál általánosan alkalmazott módszer, hogy egy N-védett aminosav karboxilcsoportját kondenzáló vagy aktiválószerrel reagáltalak, és így karboxilaktivált N-védett aminosavat kapnak. Ezt az aktivált vegyületet különböző módon alkalmazzák a peptidkötés kialakításához. így például az aktivált védett aminosavat közvetlenül egy másik aminosav, aminosav-észter vagy aminosavamid szabad aminocsoportjával reagáltatják, és így peptidkötés alakul ki. Peptidek előállítása során éveken keresztül a fenti eljárások közül lehetett választani. Az aktiváló lépés egy sór mellékreakcióval van összekötve. így például, ha aktiválőszerként diciklohexil-karbodiimidet (DCC) alkalmazunk, az aktív molekula inaktív Nacil-karbamiddá alakulhat vissza.

A karbodiimid eljárás másik hátránya, hogy oldhatatlan karbamidok képződnek. Ez különösen sok nehézséget okoz a sziláid fázisú szintézisnél, gyakorlatilag alkalmazhatatlan a folyamatos szilárdfázisú rendszerekben, és tisztítási problémákat okoz a folyékony fázisú reakcióknál.

Az in situ aktiválással járó problémák kiküszöbölésére javasolták, hogy a DCC aktivált N-védett aminosavat egy alkohollal vagy fenollal (így p-nitrofenollal, pentaklór-fenollal, N-hidroxi-szukcinimiddel vagy hasonló vegyületekkel) aktív észterré alakítsák, amelyet izolálnak, tisztítanak és a következő aminosav szabad aminocsoportjával kapcsolnak. Ennek a megoldásnak azonban több hátránya van, egyrészt a felszabadult alkohol vagy fenol más mellékieakciókban vesz részt vagy ezeket elősegíti, valamint az aktív észteres kapcsolás viszonylag lassú és hosszú reakcióidőt igényel.

Egy másik ismert megoldás a „szimmetrikus anhidrid” képzés, amelynek során két ekvivalens N-védett aminosavat egy ekvivalens DCC-vel reagáltatnak, kiszűrik a képződött DCU-t és a szimmetrikus anhidridet a kővetkező aminosav szabad aminocsoportjával kapcsolják. Az eljárás során gondot okoz a felszabaduló karbamid, és további hátránya, hogy a költséges N-védett aminosavból kétszeres mennyiséget használnak.

Javasolták továbbá olyan karbodiimidek alkalmazását, amelyek a kapcsolás után oldható karbamidot képeznek, ezek azonban továbbra is hajlamosak az Nacil-karbamiddá történő átrendeződésre.

A peptidszintézisben különböző védőcsoportokat alkalmaznak, a legelterjedtebb N-védőcsoportok azonban az uretánok. Az metánokról közismert, hogy hatékonyan blokkolják a funkciós csoportokat, minimalizálják a racemizációt, könnyen előállíthatók és tárolhatók. Előállíthatók olyan uretán védőcsoportok, amelyek labilisak gyenge savakkal (például terc-butil-oxi-karbonil-csoport), erős savakkal (például benzil-oxi-karbonil-csoport), különösen gyenge savakkal [például 2-(p-bifenilil)-izopropil-oxi-karbonil-csoport], vízmentes bázisokkal (például 9-fluorenil-metil-oxi-karbonil-csoport) és hasonló anyagokkal szemben.

Az uretánnal védett aminosavak előállításához egy alkil-, aril- vagy aralkil-kloroformiátot (vagy más, megfelelően aktivált formiátot vagy karbonátot) az aminosavval reagáltatunk alkálifém-hidroxid vagy -karbonát jelenlétében víz/szerves oldószer elegyben (például Schotten-Baumann reakció). A reakcióelegy megsavanyítása után az uretánnal védett aminosav szerves oldószerrel kiextrahálható, míg a melléktermékek a vizes fázisban maradnak. Kristályosítás után ezek a vegyületek felhasználhatók peptidkötések kialakításához.

Peptidkötések kialakításához különösen előnyösen alkalmazható reakciőképes aminosav-származékok az úgynevezett N-karboxianhidridek vagy N-tiokarboxianhidridek, így az (A) általános képletű vegyületek, a képletben

RésR’ jelentése általában hidrogénatom vagy egy aminosav adott esetben védett oldallánca,

Z jelentése oxigénatom vagy kénatom.

A továbbiakban a leírásban és az igénypontokban az N-karboxianhidrid kifejezés magában foglalja az N-tiokarboxianhidrideket is.

Az aminosav-N-karboxianhidridek általánosan ismertek és a legtöbb szabad aminnal könnyen reagálnak. Az N-karboxianhidridek (NCA) és védett NCA-k peptidszintézissel történő felhasználásának legnagyobb előnye, hogy ezek a vegyületek potenciális acilálószerek (Peptides, 9, 83). További előnyük, hogy általában nagyobb kitermeléssel adják a peptideket, mint a DCC vagy N-hidroxi-szukcinimid (OSu)-féle észter kondenzációnál. Az NCA felhasználása azonban mégsem terjedt el a polipeptid szintézisben, mivel nem képes szabályozni vagy korlátozni a kondenzációs reakciókat. Ha az NCA egy aminosav szabad aminocsoportjával reagál, azonnal szén-dioxid szabadul fel és szabad aminocsoportot tartalmazó dipeptid képződik. Ez az aminocsoport ismét reagál egy másik NCA-val, tripeptid képződik és a reakciősor így folytatódik. Ez a reakció lehetővé teszi az aminosav N-karboxianhidridek poliα-aminosavak előállításánál történő felhasználását, de gyakorlatilag kizárja az adott szekvenciával rendelkező polipeptidek előállításához történő felhasználást. Hirschmann és munkatársai (The Controlled Synthesis of Peptides in Aqueous Médium, Vili., The Preparation and Use of Novel-amino Acid N-Carboxyanhydrides, J. A. C. S., 93:11, 2746-2774, 1971) az aminosav-N2

HU 205 091 Β karboxianhidrideket di- és tripeptidek előállításához víz/szerves oldószer rendszerben úgy használják, hogy közben pontosan szabályozzák a hőmérsékletet, a pHértéket, a sótartalmat és a szerves oldószer mennyiségét. Ez az eljárás azonban az NCA fent ismertetett kémiája miatt csak kis peptidekhez használható. További hátrány, hogy a fenti folyadékfázisú reakcióval kapott terméket nagyobb peptidek előállításához történő felhasználás előtt alaposan meg kell tisztítani.

Az irodalom több N-szubsztituált aminosav-N-karboxianhidridet ismertet, ilyen például az Ν-metil-, Nbenzil-, N-acetil-, Ν-nitrofenil-szulfenil-, N-xantil-, 4,4’-dimetiI-benzhidril-, valamint tritilvegyület. A szubsztituált NCA-k közül néhányat felhasználnak az adott szekvenciájú peptidek szintézise során is, elsősorban a szilárdfázísú peptidszintézisnél, de a peptidkémián belül egyik sem alkalmazható általánosan.

Kricheldorf (Angew. Chem. Acta 85, 86-87, 1978) o-nitrofenil-szulfenil-csoporttal (NPS) szubsztituált NCA alkalmazását javasolja adott szekvenciájú polipeptid szintézisénél. Ennek előállításához o-nitrofenilszulfenil-kloridot N-karboxianhidriddel reagáltatnak trietilamin jelenlétében. Kimutatták azonban, hogy a trietilamin elősegíti az NPS-NCA racemizálódását. Emellett a trietilamin és az NCA reakciója miatt oligomerizáció következik be, és ezért nagyon szigorú reakciókörülményeket kell betartani (például hőmérséklet 0 °C alatt, nagyon lassú trietilamin adagolás). .Halstrom és munkatársai (Z. Physiol. Chem. 355, 82-84, 1974) az NPS-NCA előállításához foszgént NPS-aminosavval reagáltatnak, de a kitermelés nagyon alacsony (mintegy 20%). Az előállítás után az NPS-NCA nehezen tárolható és előfordul, hogy a védőcsoport a kondenzáció során „elvérzik”, ami növeli a többszörös kapcsolódás és más mellékreakciók veszélyét. Emellett, a kapott NPS védett peptid nitrogénatomja erős nukleofil jelleggel bír, és ezért további kondenzációs reakciókban vesz részt.

Block és Cox (Peptides Proc. of The 5th Europ. Symp., Oxford, 1962. szeptember, Pergamon Press 1963, Ed, G. T. Young, 84—87) N-tritil-aminosav-Nkarboxianhidridek alkalmazását javasolja a peptidszintézisben, bár csak a legegyszerűbb N-tritil-aminosav-NCA-kat (glicin és alanin) tudták előállítani. A vegyületek előállításához az N-tritil-aminosavat foszgénnel reagáltatják. Ezzel az eljárással N-acetil-glicinNCA-t is előállítottak. A szerzők felismerték a t-butiloxi-karbonil-glicín-N-karboxianhidrid és a benzil-oxikarbonil-glicin-N-karboxianhirid potenciális hasznát, de ezek előállítására vonatkozó kísérleteik eredménytelenek maradtak és levonták azt a következtetést, hogy uretánnal védett aminosav-N-karboxianhiridek nem állíthatók elő. Még, ha valamennyi N-tritil-NCA előállítható is, akkor is közismert, hogy az aminosavak tritilcsoporttal történő megvédése a különböző kondenzációs reakciókban alacsony kitermelést eredményez a tritilcsoport jelentős sztérikus gátlása miatt. További hátrány, hogy a tritilcsoport különösen érzékeny a savakra, ami megnehezíti a tritil-NCA előállítását és a szokásos szilárdfázisú szintézisben történő felhasználását.

Halstrom és Kovács (Acta Chemica Scnadinavica,

Ser. B 1986 BYO (6), 462-465, valamint 4267 344 számú USA-beli szabadalmi leírás) szintén felismerték az N-védett aminosav-N-karboxianhidridek előnyeit és potenciális hasznát és több N-szubsztituált NCA-t elő is állítottak, amelyek feltételezésünk szerint kielégítik a peptidszintézis valamennyi követelményét. Előállítottak több 9-xantil-csoporttal (és ezzel rokon szubsztituensekkel) szubsztituált aminosav-N-karboxianhidridet. A közlemények szerint ezek a vegyületek előállíthatók xanthidrol és a megfelelő NCA közvetlen kondenzálásával benzolban, toluolban, xilolban vagy más alkil-benzolban. A kondenzáció során képződő vizet azeotropikusan eltávolítják. Az eljárás hátránya, hogy az NCA hővel és vízzel szemben mutatott instabilitása miatt a kitermelés alacsony és a kapott termék erősen szennyezett. Ezek a vegyületek előállíthatók úgy is, hogy a megfelelő 9-xantil-aminosavat foszgénnel (vagy ezzel rokon reagenssel) reagáltatjuk, a gyakorlatban a legtöbb ilyen típusú szubsztituált NCA-t ezzel a reakcióval állítják elő.

A peptidszintézisben alkalmazva a 9-xantil-NCA lassan reagál, ezért a reakcióidő folyadékfázisban 50 °C hőmérsékleten 5 óra, szilárd fázisban 25 °C hőmérsékleten 24 óra. Ez a 9-xantil-csoport sztérikus gátlásával, valamint dezaktiválő hatással magyarázható. Az aminocsoport 9-xantil védőcsoporttal történő megvédése során jelentkező további probléma, hogy a kondenzációs reakció után képződött 9-xantil-aminosav nitrogénatomja továbbra is nukleofil tulajdonságú és további kondenzációs reakciókban vesz részt. Ennek következtében az ilyen és hasonló típusú szubsztituált aminosav-N-karboxianhidrideket a peptidszintézisben, elsősorban a szilárd fázisú peptidszintézisben nemigen alkalmazzák.

Kricheldorf (Makromol. Chem. 178, 905-939, 1977) metoxi-karbonil-glicin-NCA és etoxi-karbonilglicin-NCA előállítását ismerteti. Kricheldorf azonban utal arra is, hogy a sztérikus gátlás miatt ez az eljárás nem alkalmas hidrogéntől eltérő oldalláncot viselő aminosavak uretánnal védett NCA-származékainak előállítására.

A technika állása szerint tehát a magasabb aminosavak uretánnal védett N-karboxianhidridjei és N-tiokarboxianhidridjei nem állíthatók elő.

A találmány feladata olyan eljárás kidolgozása, amely lehetővé teszi tiszta, kristályos, stabil, uretánnal védett aminosav-N-karboxianhiridek és uretánnal védett N-tiokarboxianhidridek előállítását.

A találmány szerinti vegyületek felhasználásával olyan új polipeptid-szintézis dolgozható ki, amelynek során tiszta, kristályos, uretánnal védett aminosav-Nkarboxianhidridet alkalmazunk, amely szintézis az ismert polipeptid-szintézisekhez viszonyítva a következő fő előnyökkel jár

1. nincs szükség a kondenzációban részt vevő karboxilcsoport előzetes aktiválására, így a szokásos aktiválószerekkel kiváltott mellékreakciók kiküszöbölődnek,

2. a racemizálódás megakadályozására nincs szükség külön adalékanyag, így N-hidroxibenzotriazol adagolására,

3. a kondenzációs reakció melléktermékeként csak szén-dioxid képződik,

4. a találmány szerint előállított N-védett karboxiaktivált aminosavak stabilak, tárolhatók és kristályos anyagok, ezért mind a szilárd, mind a folyadékfázisú peptidszintézist elősegítik és leegyszerűsítik, elsősorban automatizált péptidszintetizáló alkalmazása esetén, mivel kiiktatják az aktiválás, szűrés, és peptidkötést képző reakció előtti addíció lépéseit, a kondenzálószer hiánya miatt melléktermékek nem képződnek, ezért az oldatban előállított peptid tisztítása jelentős mértékben leegyszerűsödik,

5. a növekvő peptidlánc aminocsoportján uretán védőcsoportot hordoz, amely széleskörűen és egyszerűen felhasználható.

A találmány értelmében tehát (I) általános képletű uretánnal védett aminosav-N-karboxianhidridet vagy N-tiokarboxianhídridet állítunk elő, a képletben R és R’ jelentése azonos vagy különböző 1-4 szénatomos alkilcsoport, vagy

R és R’ együtt 2-5 szénatomos alkilénláncot képeznek vagy

R jelentése hidrogénatom és

R’ alanin, valin, norvolin, leucin, norleucin, izoleucin, metionin, feniialanin, triptofán, szerin, treonin, aszparaginsav, glutaminsav, arginin vagy hisztidin adott esetben védett oldallánca,

R” 1-6 szénatomos alkilcsoport, amely adott esetben fenilcsoporttal vagy fluorenilcsoporttal szubsztituálva lehet, valamint fenilcsoport,

Z oxigénatom vagy kénatom, n értéke 0.

Az alkilcsoportra példaként említhető a metilcsoport, etilcsoport, propilcsoport, izopropilcsoport, izobutilcsoport, butilcsoport, terc-butilcsoport, hexilcsoport, heptilcsoportés oktilcsoport.

Előnyösen alkalmazhatók azok az (I) általános képletű vegyületek, amelyek képletében R’ jelentése valamely aminosav ct-szénatomjához kapcsolódó oldallánc, ahol az aminosav lehet lizin, leucin, szerin, alanin, fenil-alanin, treonin, valin, aszparaginsav, arginin, glutaminsav, hisztidin, izoleucin, metionin, norleucin vagy triptofán,

R jelentése hidrogénatom.

Ez az oldallánc kívánt esetben a szokásos módon és a megadott jelentésbe eső védőcsoportokkal, így t-butil-csoporttal, benzilcsoporttal vagy t-butil-oxikarbonil-csoporttal blokkolható.

Bizonyos esetekben mind R’, mind R valamely aminosav α-szénatomjához kapcsolódó oldalláncot jelent, ilyen például az α-amino-vajsav, ahol R’ és R jelentése metilcsoport.

Egyes esetekben R és R’ valamely ciklikus rendszer részét képezi, ilyen például az 1-amino-l-ciklohexánkarbonsav.

A találmány értelmében az (I) általános képletű uretánnal védett aminosav-N-karboxianhidrideket úgy állítjuk elő, hogy egy (II) általános képletű aminosav-Nkarboxianhidridet, a képletben

R,R’,

Z és n jelentése a fenti,

R”-O-CO-X általános képletű halogénformiáttal vagy más reakcióképes formiáttal, így azidoformiáttal reagáltatunk, a képletben

R” jelentése a fenti,

X jelentése klór-, bróm vagy fluoratom vagy azidocsoport, inért oldószerben vízmentes körülmények között és N-metil-morfolin jelenlétében.

Meglepő módon azt találtuk, hogy inért oldószer, vízmentes körülmények és bázisként N-metil-morfolin alkalmazásával elkerülhető az N-karboxianhidrid polimerizációja és lehetővé válik magasabb aminosavak uretánnal védett NCA és NTA származékainak előállítása.

A nitrogénatomján uretánnal védett NCA és NTA előállításához kiindulási anyagként alkalmazott aminosav-N-karboxianhidríd (NCA) és N-tiokarboxianhidrid (NTA) ismert módon előállítható. Példaként említjük: Fullerés munkatársai: Biopolymers 15, 9,1869-1871, 1976, Kricheldorf: Chem. Bér. 104, 87-91, 1971, Halstrom és Kovács: Acta Chemica Scandinavica, B40 462-465,1986.

Bár az uretánok általánosan alkalmazhatók nukleofil atomok megvédésére, a peptidszintézisben csak néhány csoport terjedt el. Ilyen például a t-butil-oxi-karbonil-csoport (Boc), benzil-oxi-karbonil-csoport (Cbz) és 9-fIuorén-metil-oxi-karbonil-csoport (FMOC). Különösen előnyösek a fenti védőcsoportokkal szubsztituált aminosav-N-karboxianhidridek vagy N-tiokarboxianhidridek. Ennek megfelelően, a peptidszintézisben különösen előnyösen alkalmazhatók a fenti védőcsoportok egyikével védett cc-aminosav-NCA-származékok, így az (I)-(Hl) általános képletű vegyületek, ahol R’ és Z jelentése a fenti.

Mint fent említettük, a nitrogénatomján uretánnal védett NCA nem állítható elő sem foszgén és nitrogénatomján uretánnal védett aminosav reakciójával (Blockés Cox: Peptides, Proc. of the 5th Europ. Symp. Oxford, 1962. szeptember, Pergamen Press 1963, Ed. G. T. Young 84—87), sem Kricheldorf módszerével (Makromol. Chem. 178. kötet, 905-939, 1977). Az uretánnal védett NCA és NTA a találmány értelmében előállítható azonban, ha előzetesen szintetizált NCA-t vagy NTA-t megfelelő halogénformiáttal reagáltatunk vízmentes, inért oldószerben, bázisként tercier amin alkalmazásával. Az eljárás során előnyösen szobahőmérséklet alatti hőmérsékleten járunk el. Oldószerként előnyösen alkalmazható a tetrahidrofurán, etil-acetát, metilén-klorid, toluol, benzol és dioxán.

Az (I) általános képletű vegyületek előállítása során tehát egy NCA-t inért oldószerben (így toluolban) oldunk és a kapott oldatot kevertetés közben hűtjük. A kívánt halogénformiátot (például benzil-kloroformiátot) egy részletben adjuk az oldathoz. Ehhez az elegyhez bázisként tercier amint (így trietilamint, diizopro4

HU 205 091 Β pil-etilamint, N-metilmorfolint) adunk, amely elősegíti a kondenzációt és a reakció során keletkező sósav eltávolítását. Meglepő módon azt találtuk, hogy bizonyos tercier aminok, így az N-rnetil-morfolin és az N-etil-morfolin nem segítik az NCA polimerizációját. így bázisként előnyösen alkalmazhatók azok, amelyek pK-értéke elég alacsony ahhoz, hogy ne segítse elő az NCA polimerizációját, de elég magas ahhoz, hogy katalizálja az NCA és a halogénformát közötti reakciót. Ennek következtében, ha valamely fenti bázist alkalmazunk a kondenzációs reakcióhoz, akkor az nem vált ki polimerizációt. Ennek következménye, hogy a bázis feleslegben alkalmazható és a kapott uretánnal védett NCA kristályosítással könnyen izolálható.

A felismerés eredményeként bármely uretánnal védett NCA vagy NTA magas kitermeléssel könnyen előállítható, ahol az egyedüli feltétel a nedvesség kizárása. Az eljárás könnyen megvalósítható, a kapott termék kristályos felépítésű, ezért egyszerű módon, például kristályosítással tisztítható, továbbá stabilan tárolható (25 °C hőmérsékleten legalább hat hónapon keresztül és feltehetően hosszabb ideig is teljesen stabil). A termék tehát lemérhető, szitálható és a peptidszintézisben történő felhasználásig tárolható a bomlás veszélye nélkül.

Az uretánnal védett NCA legnagyobb előnye a többi N-szubsztituált NCA származékkal szemben, hogy peptidszintézisben történő felhasználása esetén N-terminális végén a peptidszintézisben általánosan alkalmazott uretán védőcsoportok egyikével védett pepiidet kapunk. Ezek a védőcsoportok szakember számára közismertek és a növekvő peptidlánc aminocsoportján a legelőnyösebb védelmet biztosítják.

Az uretánnal védett N-karboxianhidridek alkalmazása biztosítja a szubsztituálatlan NCA valamennyi előnyét (magas reaktivitás, nemkívánatos átrendeződési termékek képződésének kizárása és egyetlen melléktermékként szén-dioxid-képződés), de kiküszöböli a szubsztituálatlan NCA valamennyi hátrányát (instabilitás, polimerizálódás és többszörös kondenzáció), amely utóbbiak szigorúan szabályozott vizes közegre korlátozták azok alkalmazhatóságát. A találmány szerinti eljárás tehát jól tárolható, erősen reaktív, előre aktivált reagenst biztosít, amely a peptidkötés kialakítása során minimális mellékterméket eredményez. A találmány szerinti eljárás biztosítja továbbá a kondenzációs reakcióval kapott pepiid N-terminális nitrogénatomjának a jól ismert uretán védőcsoporttal történő blokkolását.

Bár a találmány értelmében alkalmazott, uretánnal védett, aminosav-N-karboxianhidridek előnyösen használhatók a védőcsoport-eltávolítás és kapcsolási reakció sorozatából álló klasszikus polipeptid-szin tézisnél, ezek előnyös tulajdonságaikat elsősorban a szilárd fázisú polipeptid-szintézisnél fejtik ki. A leírásban és az igénypontokban alkalmazott polipeptid kifejezés különböző peptidekre és fehérjékre vonatkozik. Adott szekvenciájú peptidszintézisnél uretánnal védett aminosav-N-karboxianhidridtől eltérő N-védett aminosavakat és legalább egy uretánnal védett NCA-t alkalmazunk. A gyakorlatban azonban N-védett aminosav komponensnél minden szekvencia esetén elsősorban uretánnal védett NCA-t alkalmazunk.

A szilárd fázisú polipeptid-szintézisnél oldhatatlan szilárd hordozóanyagot vagy mátrixot alkalmazunk, előnyösen gömb alakú szemcsék (gyöngy) formájában. A találmány szerinti eljárás során szilárd hordozóként a peptidszintézisben alkalmazott bármely szokásos szilárd fázisú polimer szubsztrát felhasználható. Az ilyen típusú polimer-gyantákra példaként említhető a keresztbe kapcsolt polisztirol-gyanta, üveggyöngy, agyag, cellit, keresztbe kapcsolt dextrán, poliakrilamid, poliamidgyanta és hasonló oldhatatlan szilárd hordozók, amelyek az aminosav komponens kapcsolására alkalmas reakcióképes funkció csoportokkal rendelkeznek vagy ilyenekkel elláthatók.

A szilárd fázisú polipeptid-szintézis megvalósítható például a 4192 798 számú USA-beli szabadalmi leírásban alkalmazott nyomás alatti folyamatos reaktorban, bár a légkörinél nagyobb nyomás alkalmazása nem szükségszerű.

A szilárd fázisú peptidszintézis megkezdése előtt néhány előzetes műveletet kell végrehajtani. Először olyan hordozógyantát kell előállítani, amely tartalmazza a kívánt peptidlánc C-terminális aminosav komponensét. Ez a szokásos módon megvalósítható, illetve a kereskedelemben többféle olyan, nitrogénatomján védett aminosav kapható, amelyek különböző szilárd hordozóanyagokhoz vannak hozzákapcsolva.

A kívánt polipeptid-szekvenciát előállító eljárást az alábbi módon hajtjuk végre. A második aminosav maradék hozzákapcsolása előtt a hordozón lévő első maradékról eltávolítjuk a védőcsoportot. A gyantán lévő első aminosav maradék, valamint a kapcsoláshoz felhasznált valamennyi későbbi aminosav maradék védőcsoportja eltávolítható valamely megfelelő lehasítószer alkalmazásával. A védőcsoportok eltávolítására alkalmas lehasítószerek szakember számára ismertek, és ezek kiválasztása elsősorban az adott védőcsoporttól függ. Ha például a védőcsoport t-butil-oxi-karbonilcsoport, akkor előnyösen alkalmazható a trifluor-ecetsav diklórmetánban vagy a sósav megfelelő oldószerben, így dioxánban. Ha a védőcsoport azonban 9-fluorenil-metil-oxi-karbonil-csoport, a lehasítás előnyösen elvégezhető bázikus körülmények között, például piperidinnel dimetil-formamid jelenlétében. A lehasítószer koncentrációja a reakcióelegyben az adott védőcsoporttól függ, értéke általában mintegy 5-50 tömeg%.

A védőcsoport lehasítása után a gyantát megfelelő oldószerrel mosva eltávolítjuk a lehasítószer feleslegét. Savas lehasítószer alkalmazása esetén a gyantán lévő pepiidet megfelelő bázissal, így trietilaminnal oldószerben, így diklórmetánban mosva semlegesítjük. A trietilamin és a képződött trietil-ammónium-klorid vagy trifluor-acetát feleslege megfelelő oldószerrel, így diklórmetánnal vagy dimetil-formamiddal mosva távolítható el. Az így előállított szabad amin a következő N-védett aminosavhoz kapcsolható.

Ha a következő N-védett aminosavként a találmány értelmében uretánnal védett aminosav-N-karboxian5

HU 205091 Β hidridet alkalmazunk, aktiválásra nincs szükség és a kondenzáció közvetlenül végrehajtható. Ha azonban az N-védett aminosav komponenst a szokásos módon kívánjuk kapcsolni, előzetes aktiválásra van szükség, vagyis az N-védett aminosav komponenst például anhidriddé alakítva vagy diciklohexil-karbodiimid, karbonildiimidazol vagy más aktiválószer segítségével aktiváljuk. Az aktivált N-védett aminosav komponenst általában feleslegben alkalmazzuk.

A második védett aminosav komponensnek az első aminosav komponenshez történő hozzáadása után a kapott védett dipeptidről eltávolítjuk a védőcsoportot, kívánt esetben semlegesítjük és mossuk, majd a következő aminosav származékkal kapcsoljuk. Ezt az eljárást addig ismételjük, míg az oldhatatlan hordozón a kívánt szekvenciájú aminosavat kapjuk.

Mível metánnal védett NCA alkalmazása esetén nemkívánatos mellékreakciók nem játszódnak le, és melléktermékek (az egyetlen szén-dioxid kivételével) nem képződnek, az metánnal védett NCA feleslege könnyen kinyerhető, átkristályosítható és ismét felhasználható, ami jelentős mértékben csökkenti az eljárás költségeit.

’ Az előállított peptid az oldhatatlan hordozótól a szokásos módon eltávolítható, amelynek során például vízmentes hidrogén-fluoriddal történő hasítást, átészterezést vagy aminolízist alkalmazunk.

A hordozóról történő eltávolítás után a kapott peptid homogén és legfeljebb minimális tisztítást igényel. A szennyezőanyagok hiánya miatt a kitermelés meglepően magas és az esetlegesen szükséges tisztítás könnyen megvalósítható. Tisztítás során előnyösen alkalmazható a parciális kromatográfia, ioncserés kromatográfia vagy ezek kombinációja. Ezek az eljárások a peptidszintézisben általánosan ismertek.

1. példa

N-Karboxianhidrid elbontása

A) 72 mg valin-N-karboxianhidridet 2 ml száraz, desztillált tetrahidrofuránban oldunk és hozzáadunk 30 μΐ trietilamint. Az NCA eltűnését infravörös spektroszkópiával követjük.

B) 72 mg valin-N-karboxianhidridet 2 ml tetrahidrofuránban oldunk és hozzáadunk 25 μΐ N-metil-morfolint. Az NCA eltűnését infravörös spektroszkópiával követjük.

Az A) és B) kísérlet eredményét az (1) ábrán ábrázoljuk.

2. példa

N-(9-Fluorenil-metil-oxi-karbonil)-L-alanin-N-karboxianhidríd

A) 40,3 g (0,45 mól) L-alanin és 275 ml 3,3 mól/1 koncentrációjú, tetrahidrofurános foszgénoldatot 4 órán keresztül 62-64 °C hőmérsékleten keverünk. A kapott oldatot hagyjuk szobahőmérsékletre hűlni, szűrjük és az illékony réteget csökkentett nyomáson eltávolítjuk. A kapott olajat 100 ml tetrahidrofuránban oldjuk, keverés közben 300 ml hexánt adunk hozzá és -20 °C hőmérsékletre hűtjük. Az L-alanin-N-karboxianhidrid kitermelése 35,79 g (69%).

B) 8,15 g (80,5 mól) N-metil-morfolin 50 ml toluolban felvett oldatát 8,84 g (76,8 mmól) L-alanin-N-karboxianhidrid és 19,9 g (76,8 mmól) 9-fluorenil-metiloxi-karbonil-klorid 200 ml toluolban felvett és 0 °C hőmérsékletre hűtött elegyéhez adjuk. A reakcióelegyet 2 órán keresztül 0 °C hőmérsékleten keverjük, majd szűrjük. Az oldószer térfogatát 20 ml-re bepároljuk, majd 100 ml hexánt hozzáadva 21,4 g (82%) nyert 9-fluorenil-metil-oxi-karbonil-L-alanin-N-karboxianhidridet kapunk kristályos formában. A terméket hideg diizopropil-éterben eldörzsöljük, majd etil-acetát/hexán elegyből átkristályosítjuk. Olvadáspont 106110 °C.

IR (CH₂C1₂) 1870,1801,1740 cm¹

NMR (CDC1₃) δ 6,90-7,80 (m, 8H), 3,95-4,55 (m,

4H), l,35(d, J=7 Hz, 3H),

Elemanalízis a C₁₉H₁₅NO₅ összegképlet alapján: számított: C 67,65% H4,48% N4,15% talált: C 67,73% H4,65% N4,19%.

3. példa

N-(9-Fluorenil-metil-oxl-karbonil-L-leucin-N-karboxianhidrid

A) A 2A) példa szerint L-leucinból 78%-os kitermeléssel L-leucin-N-karboxianhidridet állítunk elő.

B) 9,2 g (58,4 mmól) L-leucin-N-karboxianhidrid és 15,1 g (58,4 mmól) 9-fluor-oxil-metil-oxi-karbonil-klorid 125 ml toluolban felvett elegyét 0 °C hőmérsékletre hűtjük és cseppenként 6,5 g (64 mmól) N-metil-morfolin 20 ml toluolban felvett oldatát adjuk hozzá. A reakcióelegyet 2,5 órán keresztül 0 °C hőmérsékleten keverjük, szűrjük, és az oldószer térfogatát 20 ml-re csökkentjük. Hozzáadunk 480 ml hexánt és az oldatot egy éjszakán keresztül -20 °C hőmérsékleten hűtjük. így 18,8 g (85%) N-(9-fluorenil-metil-oxi-karbonil)-L-leucin-N-karboxianhidri det kapunk. Ennek részletét analitikai vizsgálatokhoz éter/metilén-klorid/hexán elegyből átkristályosítjuk. Olvadáspont 118-120 °C.

NMR (CC1₄) δ 7,35-7,91 (m, 8H), 4,72 (t, J=7 Hz, 2H), 4,58 (m, 3H), 4,37 (t, J=7 Hz, IH), 2,05 (m, 2H), 1,09 (t, J=6 Hz, 6H),

Elemanalízis a C₂₂H₂₁NO₅ összegképlet alapján: számított: C 69,64%, H5,58% N3,69%, talált: C 69,08% H5,97% N3,70%.

4. példa

N-a-(9-Fluorenil-metil-oxi-karbonil)-N-t-butil-oxikarbonil-L-lizin-N-karboxianhidrid

A) 1,23 g (5,0 mmól) Ν-ε-t-butil-oxi-karbonil-L-lizin és 1,08 g (10,0 mmól) klór-trimetil-szilán elegyét 50 ml tetrahidrofuránban 0 °C hőmérsékletre hűtjük és 1,01 g (10,0 mmól) trietilamin 5 ml tetrahidrofuránban felvett oldatát csepegtetjük hozzá. A reakcióelegyet 2,5 órán keresztül 0 °C hőmérsékleten keverjük, szűrjük, és 10 mmól foszgén 15 ml tetrahidrofuránban felvett oldatához adjuk. A reakcióelegy hőmérséklete 60 °C-ra emelkedik, majd 2,0 órán keresztül ezen a hőmérsékleten és egy éjszakán keresztül szobahőmérsékleten keverjük. Az illékony réteget forgó vákuumbepárlóban

HU 205 091 Β eltávolítva 0,79 g (58%) Ν-ε-t-butil-oxi-karbonil-L-lizin-N-karboxianhidridet kapunk.

IR (CH₂C1₂) 1860,1795,1710 cm-’·

B) 0,79 g (2,90 mmól) Ν-ε-t-butil-oxi-karbonil-Llizin-N-karboxianhidrid és 0,75 g (2,90 mmól) 9fluorenil-metil-oxi-karbonil-klorid 25 ml toluolban felvett elegyét 0 °C hőmérsékletre hűtjük, és cseppenként 0,32 g (3,2 mmól) N-metil-morfolin 5 ml toluolban felvett oldatával elegyítjük. A reakcióelegyet a 3B) példában megadott módon feldolgozva 0,88 g (66%) N-a-(9-fluorenil-metil-oxi-karbonil)-N-e-t-butiloxi-karbonil-L-lizin-N-karboxianhidridet kapunk, olvadáspont 81-85 °C (etil-acetát/hexán elegyből).

NMR (CDClj) δ 7,3-7,7 (m, 8H), 4,11-4,58 (m,

5H), 2,95-3,20 (m, 2H), 1,90-1,98 (m, 2H), 0,91,4 (m, 13H).

Elamanalízis a C₂₇H₃₀N₂O₇ összegképlet alapján: számított: C65,57% H6,11% N5,67% talált: C 66,33% H6,38% N 5,67%.

5, példa

N-Benzil-oxi-karbonil-L-alanin-N-karboxlanhidrid 1,06 g (10,5 mmól) N-metil-morfolin 20 ml etil-acetátban felvett elegyét cseppenként 0,81 g (7,0 mmól) L-alanin-N-karboxianhidrid [2A) példa] és 1,89 g (10,5 mmól) benzil-oxi-karbonil-klorid 80 ml etil-acetátban felvett elegyéhez adagoljuk 0 °C hőmérsékleten. A reakcióelegyet 1,5 órán keresztül 0 °C hőmérsékleten keverjük, szűrjük és a térfogatát 75 ml-re csökkentjük. Keverés közben hozzáadunk 75 ml hexánt, -20 °C hőmérsékletre hűtjük és így 1,20 g (71%) N-benziloxi-karbonil-L-alanin-N-karboxianhidridet kapunk, olvadáspont 101-104 °C.

NRM (CDC1₃) δ 7,33 (s, 5H), 5,27 (s, 2H), 4,60 (q, J = 7 Hz, IH), 1,61 (d, J = 7 Hz, 3H),

Elemanalízis a C_i2HhNO5 összegképlet alapján:

számított: C 57,83% H4,45% N5,62% talált: C 57,60% H4,50% N5,53%.

6. példa

N-Benzll-oxi-karbonil-L-leuciri-N-karboxianhidrid 0,76 g (7,50 mmól) N-metil-morfolin 10 ml etilacetátban felvett oldatát cseppenként 0,79 g (5,0 mmól) L-leucin-N-karboxianhidrid [3A) példa] és 1,35 g (7,50 mmól) benzil-oxi-karbonil-klorid 50 ml etil-acetátban felvett elegyéhez adagoljuk 0 °C hőmérsékleten. A reakcióelegyet 0 °C hőmérsékleten

1,25 órán keresztül keverjük, szűrjük és az oldat térfogatát 5 ml-re csökkentjük. Hozzáadunk 50 ml hexánt és -20 °C hőmérsékletre hűtjük. így 0,89 g (61%) N-benzil-oxi-karbonil-L-leucin-N-karboxianhidridet kapunk, olvadáspont 72-73,5 °C (éter/hexán elegyből).

NMR (CDClj) δ 7,40 (s, 5H), 5,33 (s, 2H), 4,71 (t, J- 6 Hz, IH), 1,80-2,04 (m, 3H), 0,91 (m, 6H). Elemanalízis aC₁₅H₁₇NO₅ összegképlet alapján:

számított: C 61,84% H5,88% N4,81% talált: C 61,64% H6,02% N4,90%.

7. példa

N-Fenil-oxi-karbonil-L-valin-N-karboxianhidrid

A) A 2A) példában leírt módon L-valinból 75%-os kitermeléssel L-válin-N-karboxianhidridet állítunk elő.

B) Az 5. példában leírt módon járunk el azzal a különbséggel, hogy benzil-kloroformiát helyett fenilkloroformátot, valamint leucin-N-karboxianhidrid helyett valin-N-karboxianhidridet alkalmazunk. így 78%os kitermeléssel N-fenil-oxi-karbonil-L-valin-N-karboxianhidridet kapunk, olvadáspont 105-106 °C (kloroform/hexán elegyből).

NMR (CDClj) δ 7,30 (m, 5H), 4,70 (d, J = 3,5 Hz,

IH), 2,60 (m, IH), 1,22 (d, J-7 Hz, 3H), 1,07 (d, J = 7 Hz, 3H), 1,07 (d, J = 7 Hz, 3H),

Elemanalízis a C₁₂H₁₃NO₅ összegképlet alapján:

számított: C 59,31% H4,98% N5,32% talált: C 59,09% H4,91% N5,49%.

8. példa

N-Etil-oxi-karbonil-L-alanin-N-karboxianhidrid

Az 5. példában leírt módon járunk el azzal a különbséggel, hogy benzil-kloroformiát helyett etil-kloroformátot alkalmazunk. így 62%-os kitermeléssel N-etiloxi-karbonil-L-alanin-N-karboxianhidridet kapunk.

Olvadáspont 72-73,5 °C °C (etil-acetát/hexán elegyből).

NMR (CDClj) δ 4,73 (q, J-7 Hz, 2H), 4,33 (q,

J = 7 Hz, IH), 1,70 (d, J = 7 Hz, 3H), 1,33 (t, J-7

Hz, 3H).

Elemanalízis a C₇H₉NO₅ összegképlet alapján: számított: C 44,92% H4,85% N7,49% talált: C 45,08% H5,03% N7,33%.

9. példa

Benzil-oxi-karbonil-L-fenil-alanin-N-karboxianhidrid

A) A 2A) példában leírt módon L-fenil-alaninból 53 %-os kitermeléssel L-fenil-alanin-N-karboxianhidridet állítunk elő.

B) 2,5 g (13 mmól) L-fenil-alanin-N-karboxianhidrid és 3,4 g (20 mmól) benzil-kloroformiát 130 ml etilacetátban felvett oldatához cseppenként 2,0 g (20 mmól) N-metil-morfolin 10 ml etil-acetátban felvett oldatát adagoljuk 0 °C hőmérsékleten. A reakcióelegyet 2,5 órán keresztül 0 °C hőmérsékleten keverjük, majd az 5. példában leírt módon feldolgozva 2,0 g (48%) N-benzil-oxi-karbonil-L-fenil-alanin-N-karboxianhidridet kapunk, olvadáspont 108-109 °C.

NMR (CDC1₃) δ 7,35 (s, 5H), 7,00 (m, 5H), 5,31 (s,

2H), 4,83 (m, IH), 3,28 (m, 2H),

Elemanalízis a C₁₈H₁₇NO₅ összegképlet alapján: számított: C 68,13% H5,40% N4,42% talált: C 68,11% H5,38% N4,20%.

10. példa

Fenil-oxi-karbonil-L-alanin-N-tiokarboxianhidrid A) O-etil-S-metil-xantát.

16,0 g (100 mmól) kálium-etil-xantát 50 ml vízben felvett oldatához cseppenként 12,6 g (100 mmól) dimetil-szulfátot adagolunk 4±1 °C hőmérsékleten. Az

HU 205 091 Β adagolás befejezése után a reakcióelegyet kétszer 40 ml diklórmetánnal mossuk és az egyesített szerves fázisokat vízmentes magnézium-szulfáton szárítjuk, majd bepároljuk. Az olajos maradékot metanolban oldjuk, majd bepárlás után további felhasználáshoz elegendő tisztaságú O-etil-S-metil-xantátot kapunk.

B) Etoxi-tio-karbonil-L-alanin.

A fent előállított O-etil-S-metil-xantáthoz 8,9 g (100 mmól) L-alanin és 4,0 g (100 mmól) nátriumhidroxid 100 ml vízben felvett oldatát adjuk. A reakcióelegyet 2,3 órán keresztül 45 °C hőmérsékleten melegítjük, miközben nitrogéngázt fúvatunk át rajta. Ezután 50 ml metanolt adunk hozzá és további 0,7 órán keresztül 45 °C hőmérsékleten keverjük. A reakcióelegyet hagyjuk szobahőmérsékletre hűlni, háromszor 25 ml diklórmetánnal mossuk, koncentrált sósavval pH=2,5 értékre állítjuk és kétszer 50 ml etil-acetáttal extraháljuk. Az egyesített szerves oldatokat vízmentes magnézium-szulfáton szántjuk és bepároljuk. A kapott olajból hexán hozzáadásával 9,5 g (54%) etil-oxi-tiokarbonil-L-alanint kapunk színtelen szilárd anyag formájában, olvadáspont 74-78 °C. A kapott nyers terméket éter/hexán elegyből átkristályosítva tisztítjuk. Olvadáspont 74-79 ’C,

IR(CCI₄) 3397,1716 cm¹·

C) L-alanin-N-tiokarboxianhidrid.

3,0 g (17 mmól) etil-oxi-tiokarbonil-L-alanin és 1,2 g (17 mmől) imidazol 20 ml tetrahidrofuránban felvett oldatához cseppenként 20 ’C hőmérsékleten 5,4 g (20 mmól) PBr₃-at adagolunk. A reakcióelegyet addig keverjük, míg a szilárd anyag finom szuszpenzióvá alakul. Ezután 200 ml telített nátrium-hídrogén-karbonát oldat és 150 ml etil-acetát elegyére öntjük, a szerves fázist elválasztjuk, kétszer 100 ml 1 mól/1 sósavval, 100 ml telített nátrium-hidrogén-karbonát oldattal és 100 ml sóoldattal mossuk, vízmentes magnézium-szulfáton szárítjuk és bepároljuk. A kapott olaj állás közben megszilárdul. Átkristályosítás után 0,75 g (34%) L-alanin-N-tiokarboxianhidridet kapunk, olvadáspont 9192 °C,

IR(CC1₄) 1750,1695 cm-'·

D) Fenil-oxi-karbonil-L-alanin-N-tiokarboxianhidrid. 0,49 g (3,8 mól) L-alanin-N-tiokarboxianhidrid 50 ml etil-acetátban felvett oldatához 0,95 g (6,1 mmól) fenil-kloroformiátot adunk 0 ’C hőmérsékleten, majd 0,57 g (5,6 mmől) N-metil-morfolin 10 ml etil-acetátban felvett oldatát csepegtetjük hozzá. A kapott reakcióelegyet 3 órán keresztül 0 ’C hőmérsékleten keverjük, szűrjük és bepároljuk, A kapott félig szilárd, fehér anyagot 20 ml etil-acetátban oldjuk, hozzáadunk 150 ml hexánt és az elegyet-20 °C hőmérsékletre hűtjük. így 0,55 g (62%) fenil-oxi-karbonil-L-alanin-N-tiokarboxianhidridet kapunk, olvadáspont 110— 111 ’C.

NMR (CDC1₃) δ 7,18 (m, 5H), 4,83 (q, IH, J = 7

Hz), 1,71 (d, 3H, J=7 Hz),

IR (CH₂C1₂) 1810,1740 (dublett), 1715 (váll),

Elemanalízis a C_UH₉NO₄S összegképlet alapján: számított: C 52,58% H3,61% N5,58% S 12,76% talált: C52,75% H3,72% N5,36% S 12,98%.

11. példa

N-(9-Fluorenil-metil-oxi-karbonil)-0-t-butÍl-L-treonin-N-karboxianhidrid

A) A 4A) példában leírt trimetil-szililes eljárással O-t-butil-L-treoninból 57%-os kitermeléssel O-t-butilL-treonin-N-karboxianhidridet állítunk elő.

B) 0,80 g (4,0 mmól) O-t-butil-L-treonin-N-karboxianhidrid és 1,0 g (4,0 mmól) 9-fluorenil-metiI-oxikarbonil-klorid 50 ml toluolban felvett oldatához cseppenként 0,49 g (4,8 mmól) N-metil-morfolin 8 ml toluolban felvett oldatát adagoljuk 0 °C hőmérsékleten. A reakcióelegyet 3 órán keresztül 0 ’C hőmérsékleten keverjük, szűrjük és az illékony réteget csökkentett nyomáson eltávolítjuk. A maradékot éter/hexán elegyből átkristályosítva 1,0 g (60%) N-(9-fluorenil-metiloxi-karbonil)-O-t-butil-L-treonint kapunk, olvadáspont 124-127 ’C.

NMR (CDC1₃) δ 7,08-7,78 (m, 8H), 4,05-4,61 (m, 4H), 1,18 (s, 9H), 1,16 (d, 3Ή, J=7 Hz), Elemanalízis a C₂₄H₂₅NO₆ összegképlet alapján:

számított: C 68,07% H5,95% N3,31% talált: C 67,89% H5,96% N3,28%.

12. példa

Etil-oxi-karbonil-a-amino-izobutánsav-N-karboxianhidrid

A) A 2A) példában leírt módon 67%-os kitermeléssel a-amino-izobutánsav-N-karboxianhidridet állítunk elő.

Β) A 8B) példában leírt módon járunk el, azzal a különbséggel, hogy L-alanin-N-karboxianhidrid helyett α-amino-izobutánsav-N-karboxianhidridet alkalmazunk. így 16%-os kitermeléssel etil-oxi-karbonil-aamino-izobutánsav-N-karboxianhidridet kapunk, olvadáspont 68-70 °C (kloroform/hexán elegyből).

NMR (CC1₄) δ 4,59 (q, 2H, J = 7 Hz), 2,00 (s, 6H),

1,65 (t, 3H, J=7 Hz).

Elemanalízis a C_gHuNO₅ összegképlet alapján: számított: C 47,76% H5,51% N6,96% talált: C 47,67% H5,51% N7,14%.

13. példa

N-t-Butil-oxi-karbonil-L-alanin-N-karboxianhidrid

1,25 g (16,9 mmól) t-butil-alkohol és 3,4 ml 5 mól/1 koncentrációjú, dioxános foszgén oldat 80 ml etil-acetátban felvett elegyéhez cseppenként 3,4 g (34 mmól) Ν-metil-morfolint adagolunk -50 °C hőmérsékleten. A reakcióelegyet 0,5 órán keresztül keverjük, majd 0,23 g (2,0 mmól) L-alanin-N-karboxianhidrid 10 ml etil-acetátban felvett oldatával elegyítjük és további 0,75 órán keresztül -50 °C hőmérsékleten keverjük. Hozzáadunk 1,0 g (10 mmól) N-metil-morfolint és további 0,75 órán keresztül -50 ’C hőmérsékleten keverjük. A szilárd anyagot szűrjük, az oldatot bepároljuk, majd a maradékot hexánnal eldörzsöljük. Toluolból átkristályosítva 0,28 g (65%) N-t-butil-oxi-karbonil-Lalanin-N-karboxianhidridet kapunk, olvadáspont 103— 104,5 ’C.

NMR (CDClj) δ 4,71 (q, IH, J=7 Hz), 1,80 (d,

3H,J = 7Hz), 1,70 (s,9H)

HU 205 091 Β

Elemanalízis a CgH^NC^ összegképlet alapján: számított: C 50,23% H6,09% N6,51% talált: C 50,66% H6,36% N6,38%.

14. példa

N-(t-Butil-oxi-karbonil)-O-benzil-L-szerin-N-karboxianhidrid

A) A 2A) példában leírt módon 68%-os kitermeléssel O-benzil-L-szerin-N-karboxianhidridet állítunk elő.

B) A 13. példában leírt módon járunk el, azzal a különbséggel, hogy L-alanin-N-karboxianhidrid helyett O-benzil-L-szerin-N-karboxianhidridet alkalmazunk és így 52%-os kitermeléssel N-(t-butil-oxi-karbonil)-0-benzil-L-szerín-N-karboxianhidridet kapunk, olvadáspont 98-99,5 °C.

NMR (CC1₄) δ 7,30 (m, 5H), 4,64 (m, 3H, benzil

CH2 és NCA gyűrű proton), 4,09 (dd, IH, J= 15,5

Hz), 3,88 (dd, IH, J= 15,5 Hz), 1,65 (s, 9H),

Elemanalízis a C^HigNOg összegképlet alapján: számított: C 59,80% H5,96% N4,36% talált: C 59,71% H6,25% N 4,05%.

15. példa

-Amino-1 -ciklohexán-karbonsav-N-karboxianhidrid-fenil-oxi-karboxil-származéka

A) A 2A) példában leírt módon 1-amino-l-ciklohexán-karbonsavból 50%-os kitermeléssel 1-amino-lciklohexán-karbonsav-N-karboxianhidridet állítunk elő.

B) 0,85 g (5,0 mmól) A) pont szerinti N-karboxianhidrid és 1,2 g (7,5 mmól) fenil-kloroformiát 30 ml etil-acetátban felvett oldatához 0 °C hőmérsékleten 0,76 g (7,5 mmól) N-metil-morfolin 8 ml etil-acetátban felvett oldatát adjuk. A reakcióelegyet 2 órán keresztül 0 °C hőmérsékleten keverjük, szűrjük és bepároljuk. A fehér, félig szilárd maradékot etil-éter/metilén-kloríd/hexán elegyből átkristályosítva 0,92 g (66%) Nkarboxianhidridet kapunk. Olvadáspont 156,5-158 °C.

NMR (CDC1₃) δ 7,28 (m, 5H), 1,20-3,10 (m, 10H), Elemanalízis a C_I5H₁₅NO₅ összegképlet alapján:

számított: C 62,27% H5,23% N4,84% talált: C 62,03% H5,22% N4,77%.

16. példa

N-(9-Fluorenil-metil-oxi-karboml)-L-leucin-N-karboxianhidrid

A) A 2A) példában leírt módon L-leucinból 78 %-os kitermeléssel L-leucin-N-karboxianhidridet állítunk elő.

B) 9,2 g (58,4 mmól) L-leucin-N-karboxianhidrid 150 ml száraz, desztillált etil-acetátban felvett elegyét 10 °C hőmérsékletre hűtjük és cseppenként 5 perc alatt 9 ml (64 mmól) trietilamin 20 ml etil-acetátban felvett oldatát adjuk hozzá. Megszüntetjük a reakcióelegy hűtését, és az elegyet 15 percen keresztül keverjük. A maradék trietilamin semlegesítésére 5 ml 4,4 mól/l koncentrációjú, dioxános vízmentes sósavat adunk hozzá. A reakcióelegyet szűrjük és az oldószert vákuumban eltávolítjuk. A kapott nyers terméket etil-éterben felvesszük, szűrjük és hexánból átkristályosítjuk.

Három további óvatos kristályosítás után 3,6 g (16%) N-(9-fluorenil-metil-oxi-karbonil)-L-leucin-Nkarboxianhidridet kapunk. A tennék analitikai adatai azonosak a 3. példában előállított termék adataival.

17. példa

L-Leucil-L-valin

Szilárd fázisú peptidszintézishez alkalmazható edénybe 0,25 g p-alkoxi-benzll-alkohollal észterezett és 2% keresztbe kapcsolt polisztirolon felvett 9-fluorenil-metil-oxi-karbonil-L-valint mérünk (valintartalom 0,13 mmól). Hozzáadunk 5 ml dimetil-formamidot és 30 percen keresztül rázzuk. A dimetil-formamidot eltávolítjuk és a megduzzadt gyantát kétszer 5 ml dimetil-formamidos 10 tömeg%-os piperidin oldattal kezeljük, az első lépésben 5 percen keresztül, a második lépésben 15 percen keresztül. így eltávolítjuk a 9-fluorenil-metil-oxi-karbonil védőcsoportot. A gyantát négyszer 5 ml dimetil-formamiddal mossuk és 145 mg (0,38 mmól) 9-fluorenil-metil-oxi-karbonil-L-leucin-N-karboxianhidrid 6 ml dimetil-formamidban felvett elegyével reagáltatjuk 45 percen keresztül. A fluorenil-metil-oxi-karbonil védőcsoportot a fent leírt módon eltávolítjuk és a gyantát háromszor 5 ml dimetil-formamiddal és háromszor 5 ml metilén-kloriddal mossuk. A kapott dipeptidet a gyantáról 6 ml metilén-klorid/trifluor-ecetsav 1:1 eleggyel 45 percen keresztül eltávolítjuk. Az oldatot elválasztjuk és a gyantát háromszor 5 ml metilén-kloriddal és kétszer 5 ml metanollal mossuk. Az egyesített oldatokat és mosóoldatokat vákuumban bepároljuk és a félig szilárd maradékot desztillált vízben felvesszük, majd szűrjük. A vizes oldatot fagyasztva szárítjuk, a szilárd maradékot háromszor éterrel eldörzsöljük és így eltávolítjuk a gyantáról származó szennyező anyagokat, majd csökkentett nyomáson szárítjuk. így 90% feletti kitermeléssel L-leucil-L-valint kapunk. A dipeptid azonosságát HPLC-analízissel (áramlási sebesség 1,5 ml/perc, érzékelés 215 nmen, 30 tömeg%-os metanol 0,5 mól/l perklórsavban), amelynek során az elúciót ismert standardhoz (retenciós idő 8,49 perc) hasonlítjuk. A kapott termék tisztasága 97% felett van, D-leucil-L-valint nem tartalmaz (retenciós idő 32 perc, kimutatási határ 0,1% alatt),

18. példa

L-Leucil-L-valin

A 16. példában leírt módon járunk el, azzal a különbséggel, hogy a gyantán a 9-fiuorenil-metil-oxi-karbonil-L-leucin-N-karboxianhidridet szabad aminocsoportot tartalmazó L-valinnal reagáltatjuk 5 ml metilénklorid felhasználásával. A kapott eredmények összehasonlíthatók a 16. példa eredményeivel.

/ 9. példa

L-Leucil-L-alanil-L-vaUn (FMOC-eljárás)

A 16. példában leírt módon L-leucil-L-alanil-L-valint állítunk elő. A gyantáról történő lehasítás és éteres mosás után a tripeptidet 88% feletti kitermeléssel kap9

HU 205 091 Β juk fehér szilárd anyag formájában. A 16. példában ismertetett HPLC-analízis során idegen standardhoz hasonlítva igazoljuk a termék azonosságát (retenciós idő 16,28 perc). Eltérő szekvencia, így L-leucil-L-valin és L-alanil-L-valin nem mutatható ki (kimutatási határ 0,1% alatt).

20. példa

L-Leucil-L-alanil-L-valm(Boc-eljárás)

0,50 g, metilezett 2% keresztbe kapcsolt polisztirollal (Menyfield gyanta) észterezett t-butil-oxi-karbonilL-valint (valintartalom 0,23 mmól) mérünk szilárd fázisú peptidszintézishez alkalmazható edénybe. Hozzáadunk 5 ml metilén-kloridot és 30 percen keresztül rázzuk. Az oldószert eltávolítjuk és a gyantát 30 percen keresztül 6 ml metilén-klorid/trifluor-ecetsav 1:1 eleggyel kezelve eltávolítjuk a t-butil-oxi-karbonil védőcsoportot. A gyantát háromszor 5 ml metilén-kloriddal mossuk, 5 ml metilén-kloridos 10 tömeg%-os trietilaminnal semlegesítjük, háromszor 5 ml metilénkloriddal mossuk és 200 mg (1,0 mmól) t-butil-oxikarbonil-L-alanil-N-karboxianhidrid 5 ml metilén-kloridban felvett oldatával reagáltatjuk 45 percen keresztül. A kapott védett dipeptid gyantát háromszor 5 ml metilén-kloriddal mossuk, a védőcsoportot eltávolítjuk, a gyantát mossuk, semlegesítjük majd ismételt mosás után 240 mg (1,0 mmól) t-butil-oxi-karbonil-L-leucinN-karboxianhidrid 6 ml metilén-kloridban felvett elegyét adjuk hozzá és az elegyet 45 percen keresztül rázzuk. Az oldatot eltávolítjuk és a gyantát háromszor 5 ml metilén-kloriddal, háromszor 5 ml metanollal és háromszor 5 ml metilén-kloriddal mossuk, majd nagyvákuumban szárítjuk. A t-butil-oxi-karbonil-csoporttal védett tripeptidet tartalmazó gyantát 30 percen keresztül 0 °C hőmérsékleten folyékony hidrogén-fluoriddal reagáltatjuk. A hidrogén-fluoridot eltávolítjuk és a gyantát nagyvákuumban szárítjuk. A peptidet vízben felvesszük és a gyantát szűréssel eltávolítjuk. Az oldatot fagyasztva szárítva közel kvantitatív kitermeléssel L-leucil-L-alanil-L-valint kapunk. A termék HPLCanalíziseredményei összehasonlíthatóak a 18. példában kapott eredményekkel.

21. példa

L-Alanil-L-fenil-alanin (teljesen védett eljárás)

A) 1,07 g (2,5 mmól) L-fenil-alanin-benzil-észter-ptoluol-szulfonát 20 ml tetrahidrofuránban felvett elegyéhez 0 °C hőmérsékleten 0,25 g (2,5 mmól) N-metilmorfolint adagolunk. A reakcióelegyet 0,5 órán keresztül 0 °C hőmérsékleten keverjük, majd hozzáadunk 0,50 g (2,0 mmól) N-benzil-oxi-karbonil-L-alanin-Nkarboxianhidridet. További 2 órán keresztül 0 °C hőmérsékleten keverjük, majd hozzáadunk 20 ml vizet és 50 ml diklórmetánt. A szerves réteget elválasztjuk és a vizes fázist 25 ml diklórmetánnal mossuk. Az egyesített szerves fázisokat kétszer 50 ml 0,5 mól/1 sósavval, 50 ml 10 tömeg%-os nátrium-hidrogén-karbonáttal és kétszer 50 ml vízzel mossuk, vízmentes magnéziumszulfáton szárítjuk és bepároljuk. Hexánnal kristályosítva 0,66 g (72%) N-benzil-oxi-karbonil-L-alanil-L-fenil-alanin-benzil-észtert kapunk, olvadáspont 118,5-119 °C.

NMR (CDCI₃) δ 7,64 (s, IH), 6,82-7,39 (m, 6H),

5,04 (s, 2H), 5,00 (s, 2H), 4,58-4,92 (m, 2H), 3,07 (d, J=6 Hz, 2H), 1,29 (d, J=7 Hz, 3H).

B) 0,50 g (1,1 mmól) N-benzil-oxi-karbonil-L-alanil-L-fenil-alanin-benzil-észter és 0,1 g 10% Pd/C 150 ml etil-alkoholban felvett elegyét Parr-féle hidrogénező berendezésen 6,5 órán keresztül 20 °C hőmérsékleten rázzuk. A reakcióelegyet szűrjük, a szűrletet 100 ml vízzel hígítjuk. Az oldatot bepárolva 0,26 g (100%) L-alanil-L-fenil-alanint kapunk. HPLC-analízis szerint a tennék tisztasága 99% felett van, racemizáció nem észlelhető.

22. példa

L-Alanil-L-feníl-alanin (részlegesen védett eljárás)

A) 0,33 g (2,0 mmól) L-fenil-alanin 20 ml 0,20 mól/1 kálium-karbonátban és 30 ml acetonitrilben felvett oldatához cseppenként 0,45 g (1,8 mmól) Nbenzil-oxi-karbonil-L-alanin-N-karboxianhidrid 5 ml acetonnítrilben felvett oldatát adagoljuk 0 °C hőmérsékleten. A reakcióelegyet 40 percen keresztül 0 °C hőmérsékleten keverjük, majd 50 ml etil-acetáttal és 10 ml 1 mól/1 sósavval hígítjuk. A fázisokat szétválasztjuk és a vizes fázist kétszer 35 ml etil-acetáttal extraháljuk. Az egyesített szerves fázisokat 30 ml sóoldattal, kétszer 50 ml 0,5 mól/1 sósavval és kétszer 50 ml vízzel mossuk, vízmentes magnézium-szulfáton szárítjuk és bepároljuk. Kloroform/hexán elegyből átkristályosítva 0,26 g (39%) N-benzil-oxi-karbonil-Lalanil-L-fenil-alanínt kapunk, olvadáspont 121122 ’C.

NMR (DMSO-d₆) δ 12,71 (s, IH), 8,06 (m, IH), 7,30 (m, 5H), 5,01 (s, 2H), 4,43 (m, IH), 4,06 (m, IH), 2,99 (m, 2H), 1,19 (d, 2H, J=7 Hz).

B) 0,208 g (0,562 mmól) N-benzil-oxi-karbonil-Lalanil-L-fenil-alanin és 0,1 g 10% Pd/C 50 ml 95 tömeg%-os etil-alkoholban felvett elegyét Parr-hidrogénező berendezésen 16 órán keresztül 20 °C hőmérsékleten rázzuk. A reakcióelegyet szűrjük és a szűrletet 100 ml vízzel hígítjuk. Az egyesített oldatokat bepárolva 0,122 g (92%) L-alanil-L-fenil-alanint kapunk fehér szilárd anyag formájában. HPLC-analízis szerint a termék tisztasága 99,5% felett van, racemizáció nem észlelhető.

23. példa

Acil-hordozós pétid (65-74, VQAAIDYING)

Acil-hordozós peptidet (65-74, VQAAIDYING) állítunk elő egyáramlásos reaktorban. Az oszlopot 0,8 g (0,36 mekvivalens/g) FMOC-glicin gyantával töltjük meg és száraz DMF-fel 11 ml/perc áramlással kiegyenlítjük. Az oszlopon 4A molekulárszűrőt átvezetve az oldószereket szárítjuk. A gyantát egymás után 3-szoros feleslegben alkalmazott FMOC-aminosav-NCA-val [FMOC-Val-NCA, FMOC-(tritiI)-GIn-NCA, FMOCAla-NCA, FMOC-Ala-NCA, FMOC-Ile-NCA, FMOC-(t-butil)-Asp-NCA, FMOC-(O-t-butiI)-Tyr10

HU 205 091 Β

NCA, FMOC-Ile-NCA, FMOC-(tritil)-Asn-NCA] reagáltatjuk az alábbi eljárás szerint:

1. védőcsoport-eltávolítás, 10 tömeg% piperidin DMF-ben, 10 perc, 11 ml/perc;

2. mosás, DMF, 5 perc, 11 ml/perc;

3. kondenzálás, 0,15 mól/l UNCA DMF-ben, 45 perc, 11 ml/perc;

4. mosás, DMF, 5 perc, 11 ml/perc;

5. 1-4. lépések ismétlése.

A terminális védőcsoport eltávolítása után a gyantát kiürítjük az oszlopból, száraz CH₂Cl₂-vel mossuk, és nagyvákuumban szárítjuk. A pepiidet 1 órán keresztül 2,5 tömeg% anizolt és 2,5 tömeg% pentametil-benzolt tartalmazó 50 tömeg%, száraz CH₂Cl₂-ben felvett TFA-val kezelve lehasítjuk a gyantáról. Az oldószert csökkentett nyomáson eltávolítjuk, és a maradékot liofilizáljuk. így nyers acilhordozós pepiidet (65-74) kapunk 73%-os kitermeléssel.

Aminosav analízis (VQAAIDYING) alapján: számolt V = 1,00, Q=1,00, A =200, I =2,00, D +

N=2,00, Y= 1,00, G=1,00, talált V=l,00, Q=l,02, A=2,08, 1=2,05, D+N =2,20, Y =1,05, G =1,00,

FAB MS (M+H)^+: számolt 1064, talált 1064.

24. példa

N-t-butiloxikarboml-L-alanil-L-alanil-L-fenilalanin

0,236 g (1,0 mmól) L-alanil-L-fenilalanin 20 ml 0,20 mól/l kálium-karbonát és 30 ml acetonitril elegyében felvett oldatához cseppenként 0,194 g (0,9 mmól) N-t-butiloxikarbonil-L-alanin-NCA 5 ml acetonitrilben felvett oldatát adagoljuk 0 °C hőmérsékleten. Az elegyet 1 órán keresztül 0 °C hőmérsékleten kevertetjük, majd 50 ml etil-acetáttal és 10 ml 1 mól/l sósavval hígítjuk. A fázisokat szétválasztjuk és a vizes fázist 2x35 ml etil-acetáttal extraháljuk. Az egyesített szerves frakciókat 30 ml sóoldattal, 2x50 ml 0,5 mól/l sósavval és 2x50 ml vízzel mossuk, MGSO₄-en szárítjuk és vákuumban bepároljuk. A maradékot kloroformban felvesszük és lassan hideg, gyorsan kevertetett hexánba öntve kicsapjuk. A terméket szűrjük és nagyvákuumban szárítjuk, így 0,2 g (49%) Boc-L-alanil-L-alanil-Lfenilalanint kapunk. Az aminosav-analízis 1 fenilalanint és 2 alanint mutat ki. A termék vékonyréteg-kromatográfiás vizsgálat szerint (szilikagél, CHC1₃/CH₃OH 80:20) homogén.

25. példa

L~szeril-L-alaml-L-alaml-L-fenilalamn

A) 0,2 g (0,5 mmól) Boc-L-alanil-L-alanil-L-fenilalanint 45 percen keresztül 10 ml 4 mól/l koncentrációjú, dioxános sósavban kevertetünk. A sósavfelesleget vákuumban eltávolítjuk. A kapott L-alanil-L-alanil-Lfenilalanin-hidrokloridot liofilizálással izoláljuk és további tisztítás nélkül felhasználjuk.

B) A kapott L-alanil-L-alanil-L-fenilaíanin-hidrokloridot (teljes mennyiségben) 20 ml 0,20 mól/l káliumkarbonátban és 30 ml acetonitrilben oldjuk, majd 0,194 g (0,7 mmól) N-t-butiloxikarbonil-(O-benzil)-Lszerin-NCA 5 ml acetonitrilben felvett oldatát csepegtetjük hozzá 0 °C hőmérsékleten. Az elegyet 1 órán keresztül 0 °C hőmérsékleten kevertetjük, majd 50 ml etil-acetáttal és 10 ml 1 mól/l sósavval hígítjuk. A rétegeket elválasztjuk és a vizes fázist 2x35 ml etil-acetáttal extraháljuk. Az egyesített szerves fázisokat 30 ml sóoldattal, 2x50 ml 0,5 mól/l sósavval és 2x50 ml vízzel mossuk, MgSO₄-en szárítjuk és vákuumban bepároljuk. A maradékot kloroformban felvesszük és lassan hideg, gyorsan kevertetett hexánba öntve kicsapjuk. A terméket szűrjük és nagyvákuumban szárítjuk. így 0,202 g (63%) Boc-(O-benzil)-L-szeril-L-alanil-L-alanil-L-fenilalanint kapunk.

C) 0,2 g (0,31 mmól) Boc-(O-benzil)-L-szeril-L-alanil-L-alanil-L-fenilalanin és 50 ml ecetsav elegyét Parr-hidrogénező készülékben 17 órán keresztül 20 °C hőmérsékleten rázzuk. A reakcióelegyet ezután szűrjük és a terméket az ecetesav liofilizálásával izoláljuk.

D) A C) pontban kapott teljes Boc-L-szeril-L-alanilL-alanil-L-fenilalanint további tisztítás nélkül 45 percen keresztül 10 ml 4 mól/l koncentrációjú, dioxános sósavval kevertetjük. A sósavfelesleget vákuumban eltávolítjuk és a maradékot preparatív HPLC segítségével tisztítjuk (RP-18, 0,1 tömeg% IFA, H₂0/acetonitril 95 : 5-50: 50 lineáris grádiens„l óra). így 0,102 g (85%) L-szeril-L-alanil-L-alanil-L-fenilalanint kapunk.

Aminosav-analízis (SAAF): számolt S = l, A = 2, F=l, talált S = 0,98, A = 2,03, F=l,0,

FAB MS (M+H)^+: számolt: 395, talált: 395.

26. példa

N-a-terc-Butil-oxi-karbonil-(gamma-benzil)-glutaminsav-N-karboxianhidrid

A) A szokásos módon 93%-os kitermeléssel gammabenzil-L-glutaminsav-N-karboxianhidridet állítunk elő.

B) 110 g (0,417 mól) (gamma-benzil)-L-glutaminsav-N-karboxianhidridet 21 g 4 A molekulaszűrőt tartalmazó 1,70 1 THF-ben oldunk, majd kevertetés közben 109 g (0,500 mól) dl-terc-butil-dikarbonátot és 66,0 g (0,834 mól) piridint adunk hozzá 0 °C hőmérsékleten. A reakcióelegyet 7 napon keresztül 20 °C hőmérsékleten állni hagyjuk, majd 218 ml 2,86 mól/l, dioxános sósavval semlegesítjük a piridin feleslegét. A szilárd anyagot szűrjük, a felülúszót vákuumban mintegy 500 ml térfogatra bepároljuk. 500 ml diizopropil-étert adunk hozzá, és a maradék szilárd anyagot kiszűrjük. Az illékony részeket vákuumban eltávolítva viszkózus olajat kapunk, amely THF/dietil-éter elegyből átkristályosítható. így

90,25 g (60%) N-a-terc-butil-oxi-karbonil-(gammabenzil)-L-glutaminsav-N-karboxianhidridet kapunk, olvadáspont 75-76,5 °C.

IR (CH₂C1₂, cm¹): 1875,1820, 1810, 1740;

[c$]+30,l° (THF, C-2);

Elemanalízis a C]gH₂₁NO₇ összegképlet alapján:

HU 205 091 Β számított: C59,50% H5,83% N3,85% talált: C 59,90% H5,90% N4,00%.

NMR (CDC1₃) 5=7,40 (s, 5H), 5,17 (s, 2H), 4,82 (dd, J = 3,5, 7,2 Hz, 2H), 2,57 (m, 2H), 2,46 (m,

2H).

27. példa

N-terc-Butil-oxí-karbonil-L-metionin-N-karboxianhidrid

A) A szokásos módszerrel 86%-os kitermeléssel Lmetionin-N-karboxianhidridet állítunk elő.

B) 44,4 g (0,253 mól) L-metionin-N-karboxianhidridet 9,00 g 4 A molekulaszűrőt tartalmazó 1,00 1THFben oldunk, majd kevertetés közben 0 °C hőmérsékleten 66,3 g (0,303 mól) di-terc-butil-dikarbonátot és 40,0 g (0,506 mól) piridint adunk hozzá. A reakcióelegyet 48 órán keresztül -20 °C hőmérsékleten állni hagyjuk, majd 80 ml 4,74 mól/1, dioxános sósavval semlegesítjük a piridinfelesleget, és a piridínium-hidrokloridot kiszűrjük. A kapott tiszta oldatot vákuumban sűrű olaj állapotig bepároljuk, majd az olajat THF/diizopropil-éter elegyből kristályosítjuk. így 39,2 g (56%) N-a-terc-butil-oxi-karbonil-L-metionin-N-karboxi-anhidridet kapunk, olvadáspont 97,5-98,5 °C.

IR (CH₂C1₂, cm-¹’: 1870, 1820, 1810, 1740; [cc]o+93,2⁰ (THF, C=2,3);

Elemanalízis aC_nH₁₇NO₅S összegképlet alapján:

számított C47,99% H6,22% N5,09% SÍI,65% talált C 47,86% H 6,33% N 5,09% S 12,03%.

NMR (CDC1₃) 5 = 4,76 (torzult t, J=4 Hz, IH),

2,65 (m, IH), 2,52 (m, IH), 2,44 (t, J=5H, 2H), 2,08 (s, 3H), 1,58 (s, 9H).

28. példa

N-&-terc-Butil-oxi-karbonildN™-2,4-dÍnitro-fenll)L-hisztidut-N-karboxianhidrid

A) 100,0 g (207,7 mmól) N-a-terc-butil-oxi-karbonil-(N’^m-2,4-dinitro-fenil)-L-hisztidín IPA 1,7 1 THFben felvett oldatához 167 ml 3,73 mól/1, THF-ben felvett foszgén oldatot (622,9 mmól) adunk, és 20 °C hőmérsékleten, sötétben 5 napon keresztül kevertetjük. A reakcióelegyet vákuumban mintegy egyharmad térfogatra bepároljuk, majd hexánnal kétszeres térfogatra hígítjuk. Az oldatot vákuumban mintegy fele térfogatra bepároljuk, és hexánnal ismét dupla térfogatra hígítjuk. Az oldatot vákuumban ismét fele térfogatra bepároljuk, és hexánnal ismét dupla térfogatra hígítjuk. A kapott sárga szilárd anyagot szűrjük, hexánnal mossuk, és vákuumban szántjuk. így 71,5 g (77,6%) (N^im-2,4-dinitro-fenil)-L-hisztidÍn-N-karboxianhidridet kapunk, amely további tisztítás nélkül közvetlenül felhasználható.

B) 17,75 g (40,0 mmól) A) szerint előállított (N‘^m2,4-dmítro-fenil)-L-hisztidm-N-karboxianhidrid 1,77 g 4 A molekulaszűrőt tartalmazó 200 ml THFben felvett oldatához kevertetés közben -15 °C hőmérsékleten 19,0 g (240,0 mmól) piridint, majd 34,9 g (160,0 mmól) di-terc-butil-dikarbonátot adunk, és —15 °C hőmérsékleten állni hagyjuk. Négy nap elteltével további 8,7 g (40,0 mmól) di-terc-butildi-karbonátot adunk hozzá. További 7 nap elteltével a reakcióelegyet 300 ml THF-fel hígítjuk, 50,0 ml 4,35 mól/I dioxános sósavat adunk hozzá, és a kapott piridínium-hidrokloridot és a molekulaszűrőt kiszűrjük. Az oldatot vákuumban bepároljuk, az olajos maradékot kétszer 200 ml hexánnal és egyszer 200 ml metil-terc-butil-éterrel elkeverjük. Az olajos maradékot 500 ml THF-ben felvesszük, az oldhatatlan részeket dekantálással elválasztjuk, majd kevertetés közben lassan 500 ml hexánnal hígítjuk, és a kapott szilárd anyagot szűrjük, és eldobjuk. A felülúszót vákuumban bepároljuk, az olajos maradékot 1 liter metilterc-butil-éterben felvesszük, és az oldhatatlan részeket kiszűrjük. Az oldatot lassan, intenzíven kevert 3,5 liter hexánhoz adagoljuk, majd a kapott szilárd anyagot szűrjük, és vákuumban szárítjuk. így 8,9 g (41%) N-a-terc-butil-oxi-karbonil-(N^im-2,4-dinitro-fenÍl)-L-hi sztidin-N-karboxianhidridet kapunk, olvadáspont 90 °C (bomlik).

IR (THF, cm⁴) 1870,1820,1810,1735;

[c$] = +66,2 (THF, C= 1,88);

Elemanalízis a C_l8H₁₇N₅O₉ összegképlet alapján: számított: C 48,33% H3,83% N 15,65% talált: C 48,03% H4,07% N 15,10%.

NMR (CDC1₃) 5 = 8,85 (d, J=2,4 Hz, IH), 8,60 (dd, J=2,3, 8,6 Hz, IH), 7,73 (d, J=8,7 Hz, IH),

7,65 (s, IH), 6,89 (s, IH), 4,92 (dd, J = 5,5,1,8 Hz,

IH), 3,61 (dd, 15,4,5,7 Hz, IH), 3,38 (bd, J= 15,4

Hz, IH), 1,57 (s, 9H).

29. példa

N-a-9-Fluorenil-metil-oxi-karbonll-(N^s-4-metoxi2,3,6-trimetil-benzol-szulfonil)-L-arginin-N-karboxianhidrid

A) 50,0 g (80,7 mmól) N-a-benzil-oxi-karbonil(N^g-4-metoxi-2,3,6-trimetil-benzol-szulfonil)-L-argin in-ciklohexilamin-só 190 ml THF-ben felvett szuszpenziójához kevertetés közben -15 °C hőmérsékleten 190 ml (1,6 mól) tionil-kloridot adunk, és a reakcióelegyet 20 órán keresztül -15 °C hőmérsékleten állni hagyjuk. A szilárd anyagot kiszűrjük, és 50 ml THF-fel mossuk. Az egyesített oldatokat lassan 4 liter diizopropil-éterhez adagoljuk. A kapott csapadékot szűrjük, és háromszor 200 ml diizopropil-éterrel mossuk. Vákuumban végzett szárítás után 42,3 g nyers (N^g-4-metoxi-2,3,6-trimetiI-benzol-szulfonil)-L-arginin-N-karboxianhídridet kapunk, amely a sószennyezés eltávolítása után a további lépéshez felhasználható.

B) 40 g (89 mmól) A) pont szerint előállított (N^g-4metoxi-2,3,6-trimetil-benzol-szulfonil)-L-arginin-Nkarboxianhidrid 850 ml THF-ben felvett oldatát az oldhatatlan részek eltávolítása érdekében szikjük, és a szilárd anyagot 50 ml THF-fel mossuk. Az egyesített oldatokhoz 57,6 g (223 mmól) 9-fluorenÍl-metíl-oxikarbonil-kloridot adunk, és a kapott oldatot -25 °C hőmérsékletre hűtjük. Ezután 44 ml (400 mmól) N-metil-morfolint csepegtetünk hozzá, a reakcióelegyet hagyjuk szobahőmérsékletre melegedni, és 45 percen keresztül kevertetjük. 20 ml 4,45 mól/1 (90 mmól), díoxános sósavat adunk hozzá, és a kapott N-metil-mor12

HU 205 091 Β folin-hidrokloridot kiszűrjük. Az oldathoz intenzív kevertetés közben 2,7 liter hexánt adagolunk. A felülúszót leöntjük a kapott gumiszerű szilárd anyagról. Ezt 200 ml THF-ben oldjuk, és intenzív kevertetés közben lassan 400 ml hexánnal hígítjuk. Dekantálás után a gumiszerű szilárd anyagot 200 ml THF-ben oldjuk, és intenzív kevertetés közben 200 ml diizopropil-étert, majd lassan 200 ml hexánt adunk hozzá. Dekantálás után a maradékot 200 ml THF-ben felvesszük, és intenzív kevertetés közben lassan 1,35 liter hexán és 250 ml THF elegyét adjuk hozzá. A kapott csapadékot szűrjük, és vákuumban szárítjuk. így 32 g (53%) Ν-α-9-fluorenil-metil-oxi-karbonil(N^g-4-metoxi-2,3,6-trimetil-benzol-szulfonil)-L-arginin-N-karboxianhidridet kapunk, olvadáspont 102 °C (bomlik).

IR (THF, cm¹) 1875, 1812, 1807, 1745; [α)0 = +1Ο,21⁰ (THF, C = 2);

NMR (CDC1₃) δ = 9,42 (bs, 0,5H), 7,95 (bs, 0,5H), 7,78 (d, J = 7Hz, 2H), 7,70 (bs, 0,5H), 7,59 (m, 2H), 7,41 (t, J=7 Hz, 2H), 7,32 (t, J = 7 Hz, 2H), 6,56 (S, IH), 5,53 (bs, 0,5H), 4,15-4,76 (m, 5H), 3,84 (s, 3H), 3,81 (m, 2H), 2,71 (s, 3H), 2,61 (s, 3H), 2,53-2,78 (m, 2H), 2,14 (s, 3H), 1,88 (m, 2H)

30. példa

N-a-9-Fluoi'enil-metÍl-oxi-karbonil-(Nⁱⁿ-fonnil)-Ltriptofán-N-karboxianhidrid

A) 309 ml 3,61 mól/1 (1,12 mól) foszgén oldatot adagolunk 150 g (0,558 mól) Nⁱⁿ-formil-L-triptofán 1,00 1 THF-ben felvett szuszpenziójához kevertetés közben, majd lezárt reakcióedényben 24 órán keresztül 35-50 °C hőmérsékleten melegítjük. Az oldhatatlan részeket kiszűrjük, és az oldatot vákuumban bepároljuk. A viszkózus olajat 800 ml diklór-metán hozzáadásával kristályosítjuk. A szilárd anyagot szűrjük, diklór-metánnal mossuk, és vákuumban szárítjuk. így 212 g (74%) Nⁱⁿ-formil-L-triptofán-N-karboxianhidridet kapunk.

B) 100 g (0,387 mól) Nin-formil-L-triptofán-Nkarboxi-anhidrid és 110,2 g (0,426 mól) 9-fluorenil-metil-oxi-karbonil-klorid 1,50 1 THF-ben felvett oldatához 0 ÉC hőmérsékleten kevertetés közben 43,1 g (0,426 mól) N-metil-morfolint adagolunk 30 perc alatt. Az elegyet 70 percen keresztül 0 °C hőmérsékleten tartjuk, majd 10 ml 4 mól/1 (40 mmól), dioxános sósavval semlegesítjük az Nmetil-morfolin feleslegét. Az elegyet hagyjuk szobahőmérsékletre melegedni, az N-metil-morfolin-hidrokloridot kiszűrjük, és az oldatot vákuumban bepároljuk. A kapott olajat 350 ml THF-ben oldjuk, és az oldatot intenzív kevertetés közben 3 liter hexánhoz csepegtetjük. Az elegyet 30 percen keresztül kevertetjük, majd a szilárd anyagot szűrjük, hexánnal mossuk, és vákuumban szárítjuk. így 209 g nyers N-a-9fluorenil-metíloxi-karbonil(Nⁱⁿ-formil)-L-triptofánN-karboxianhidridet kapunk, amely jelentős mennyiségű oldószert tartalmaz.

g nyers N-a-9-fluorenil-metil-oxi-karbonil-(N'ⁿformil)-L-triptofán-N-karboxianhidridet 400 ml THFben oldunk, intenzív kevertetés közben 200 ml diizopropil-étert csepegtetünk hozzá, és az elegyet további 30 percen keresztül kevertetjük. Az oldószert dekantálással eltávolítjuk az olajos termékről, majd az olajos maradékot THF-ből és diizopropil-éterből az alábbi oldószermennyiségek alkalmazásával hat alkalommal kicsapjuk, és a felülúszót minden kicsapás után félretesszük: 1. 333 ml THF és 167 ml diizopropil-éter, 2. 267 ml THF és diizopropil-éter, 3. 200 ml THF és 100 ml diizopropil-éter, 4.133 ml THF és 67 ml diizopropil-éter, 5. 67 ml THF és 33 ml diizopropil-éter, 6. 33 ml THF és 16 níl diizopropil-éter. A kicsapásoknál félretett felülúszókat egyesítjük, és lassan, intenzív kevertetés közben 2,15 liter hexánhoz adagoljuk. A szilárd anyagot szűréssel elválasztjuk, hexánnal mossuk, és vákuumban szárítjuk. így 23,2 g (58%) Ν-α-9-fluorenil-metil-oxi-karbonil-(N^u,-formil)-L-triptofán-N-karboxianhidrid X 0,25 THF-et kapunk, olvadáspont 108 °C (bomlik).

IR (THF, cm'¹) 1871, 1809, 1738, 1715 cm-’; [a]g = +87,9° (C =1,6, THF).

NMR (CDCI3) δ = 9, 34 (bs, 0,3H), 8,96 (bs, 0,7 H), 8,37 (bs, 0, 7H), 7,56-7,52 (m, 4,3H), 7,187,52 (m, 7,3H), 6,77 (bs, 0,7H), 4,83*(bs, IH), 4,76 (m, 2H), 4,29 (t, J = 7 Hz, IH), 3,77 (m, IH, THF), 3,23 (m, 2H), 1,85 (m, IH, ΤΗ?).

Elemanalízis a C₂₉H₂₂N₂O₆ 25 összegképlet alapján: számított: C 69, 87%H 4, 45% N 5,62% talált: C 70,12% H 4,46% N5,53%.'

Claims (3)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Eljárás (I) általános képletű, metánnal védett aminosav-N-karboxianhidridek vagy N-tiokarboxianhidridek előállítására, a képletben

   R és R’ jelentése azonos vagy különböző 1-4 szénatomos alkilcsoport,'vagy

   R és R’ együtt 2-5 szénatomos alkilénláncot képeznek vagy

   R jelentése hidrogénatom és

   R’ jelentése alanin, valin, norvalin, leucin, norleucin, izoleucin, metionin, fenilalanin, triptofán, szerin, treonin, aszparaginsav, glutaminsav, arginin vagy hisztidin adott esetben védett oldallánca,

   R” jelentése 1-6 szénatomos alkilcsoport, amely adott esetben fenilcsoporttal vagy fluorétól csoporttal szubsztituálva lehet, valamint fenilcsoport,

   Z jelentése oxigénatom vagy kénatom, n értéke 0, azzal jellemezve, hogy egy (II) általános képletű aminosav-N-karboxianhidridet vagy N-tiokarboxianhidridet, a képletben

   R, R’, Z és n jelentése a tárgyi körben megadott, R”-O-CO-X általános képletű halogén-formiáttal reagáltatunk, a képletben

   X jelentése halogénatom,

   R” jelentése a tárgyi körben megadott, inért oldószerben vízmentes körülmények között tercieramin bázis jelenlétében.

   HU 205 091 Β
2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy tercieramin bázisként N-metil-morfolint alkalmazunk.
3. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az üretánnal védett aminosav-N-karboxianhidrid végterméket kristályosítással izoláljuk.