DD280322A5

DD280322A5 - Verfahren zur herstellung urethangeschuetzter aminosaeure-n-carboxyanhydride oder n-thiocarboxyanhydride

Info

Publication number: DD280322A5
Application number: DD89326451A
Authority: DD
Inventors: William D Fuller; Michael Ph Cohen; Fred R Naider; Murray Goodman
Original assignee: Kkk
Priority date: 1988-03-11
Filing date: 1989-03-10
Publication date: 1990-07-04
Also published as: WO1989008643A1; CN1022412C; JPH02503923A; PT89961A; JP2875834B2; NZ228282A; EP0357750B1; CN1040793A; NO306304B1; ATE108438T1; FI102379B1; DE68916722T2; HK1007744A1; IL89541A0; NO894503D0; EP0357750A1; IE890778L; DE68916722D1; HUT52488A; NO894503L

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von urethangeschuetzten Aminosaeure-N-carboxyanhydriden oder -thiocarboxyanhydriden, bei dem bestimmte Aminosaeure-N-carboxyanhydride mit einem geeigneten Halogenformiat in einem inerten Verduennungsmittel unter wasserfreien Bedingungen und in Gegenwart einer tertiaeren Aminbase umgesetzt wird.

Description

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Verfahren zur Herstellung urethangeschützter Aminosäure-N-carboxyanhydride oder N-thiocarboxyanhydride

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von neuartigen urethangeschützten Aminosäure-N-carboxyanhydriden oder -thiocarboxyanhydriden, und zwar von N-urethangeschützten Aminosäure-N-carboxyanhydridon und N-urethangeschützten N-Thiocarboxyanhydriden.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Auf klassische Weise wurden bisher Polypeptide einer bestimmten Sequenz durch sehr arbeitsaufwendige Techniken hergestellt, wobei die Zwischenprodukte nach dem Zusatz jeder Aminosäurekomponente isoliert wurden. Dies hat die Synthese sehr schwierig gestaltet und die Herstellung von langtettigen Polypeptiden und Proteinen wegen der geringen Ausbeuten, Razemisierung und/oder

anderer Nebenreaktionen fast unmöglich gemacht. 1963 haben Merrifield (J. Am. Chem. Soc., 85, 214?) und Letsinger und Kornet (J. Am, Chem. Soc., 85, 2045) die Verwendung von unlöslichen polymeren Trägern für die wachsende Peptidkette vorgeschlagen. Dieses Verfahren, allgemein als Festphasen-Peptidsynthese bezeichnet, gestattete die "Reinigung" der wachsenden Peptidkette ohne Isolierung des Zwischenprodukts. Vordem hatten die we.i.th-in akzeptierten Methoden sowohl für die klassische (Flüssi nasen-) als auch für die Festphasen-Polypeptidsynthese die Verwendung eines Kuppelungs- oder Aktivierungsmittels zur Reaktion mit der Carboxylgruppe einer sor st N-geschützten Aminosäure zur Gewinnung einer carboxylaktiv ,erten N-geschützten Aminosäure erfordert. Diese aktivierten Spezies wurden dann auf verschiedene Weise zur Förderung der Peptidbindungsbildung verwendet. Beispielsweise kann die aktivierte geschützte Aminosäure direkt mit der freien Aminogruppe einer Aminosäure, eines Aminosäureesters oder Aminosäureamids reagieren und die Peptidbindung bilden. Dies ist viele Jahre lang das zur Verfügung stehende Verfahren zur Herstellung von Peptiden gewesen. Die Aktivierungsstufe kann von einer Reihe von möglichen Nebenreaktionen begleitet sein. Wenn beispielsweise Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) das Aktivierungsmittel ist, kann sich das aktive Molekül in einen inaktiven N-Acylharnstoff "umlagern".

Ein weiterer Nachteil des Carbodiimidverfahrens ist die Bildung von unlöslichen Harnstoffen. Dies ist besonders störend bei der Festphasensynthese und ist faktisch nicht akzeptierbar in Festphasen-FlieOsystemen. Diese Harnstoffe verursachen auch schwierige Probleme bei der Reinigung in Lesungsphasenreaktionen.

Wissenschaftler haben einige dieser nut der in-situ-Aktivierung verbundenen Probleme lösen können, indem zuerst die DCC-aktivierte N-geschützte Aminosäure mit einem Alkohol oder Phenol (wie p-Nitrophenol, Pentachlorophenol, N-Hydroxysuccinimid usw.) umgesetzt wird, um einen "aktiven Ester" zu bilden, der isoliert und gereinigt werden kanr und anschließend mit dem freien Amin der nächsten Aminosäure kuppeln kann. Dieser Weg ist jedoch auch

nicht ohne Mängel, da der freigesetzte Alkohol oder das Phenol an Nebenreaktionen beteiligt sein können oder diese fördern können, und aktive Esterkupplungen zu Trägheit neigen und lange Reaktionszeiten erfordern.

Ein weiteres bekanntes Verfahren besteht in der Bildung eines ''symmetrischen Anhydrids", indem man 2 Äquivalente der N-geschützten Aminosäure mit einem Äquivalent DCC reagieren läßt, den gebildeten DCU filtert und dann das "symmetrische Anhydrid" mit der freien Aminogruppe der nächsten Aminosäure kuppeln läßt. Bei diesem Verfahren ergibt sich das Harnstoffproblem und außerdem wird die doppelte Menge einer teuren N-geschützten Aminosäure benötigt.

Einige Wissenschaftler haben in jüngster Zeit damit begonnen, Carbodiimide zu verwenden, die nach der Kupplung lösliche Harnstoffe bilden, aber auch diese neigen zu einer Umlagerung zu M-Acylharnstoffen.

Verschiedene Typen von N-Schutzgruppen sind für die Verwendung in der Peptidsynthese vorgeschlagen worden, die am meisten anerkannte Klasse der N-Schutzgruppen sind aber die Urethane. Die Urethane bieten bekanntermaßen einen hohen Schutzgrad, minimieren die Razemisierung, lassen sich leicht herstellen und sind lagerbeständig. Es lassen sich Urethanschutzgruppen herstellen, die empfindlich gegenüber schwachen Säuren (z. B, t-Butyloxycarbonyl), starken Säuren (z. B. Benzyloxycarbonyl), sehr schwachen Säuren (z. B. 2(p-Biphenylyl)-isopropyloxycarbonyl), wasserfreien Basen (z. B. Fluorenyl-9-methyloxycarbonyl) usw. sind.

Urethangeschützte Aminosäuren werden im allgemeinen durch Umsetzung eines Alkyls, Aryls oder Aralkylchloroformiats (oder eines anderen in geeigneter Weise aktivierten Formiats oder Carbonats) mit der Aminosäure in Gegenwart eines Alkalimetallhydroxids oder -carbonats in einem gemischten wäßrigen/organischen Lösungsmittelsystem (d. h. Schi Hen-Baumann-Bedingungen) hergestellt. Nach der Säuerung des Reaktionsgemischs wird die urethangeschützte Aminosäure in ein organisches Lösungsmittel extrahiert, wobei

alle Nebenprodukte in der wäßrigen Phase verbleiben. Nach der Kristallisation werden diese Verbindungen wie oben beschrieben für die Peptidbindungsbildung verwendet.

Ein besonders interessanter Typ von reaktiven Derivaten der Aminosäuren zur Verwendung bei der Peptidbindungsbildung sind die sogenannten N-Carboxyanhydride oder N-Thicarboxyanhydride wie zum Seispiel:

H — N Z R-

worin R, R' in der Regel Wasserstoff oder die Seitenketten (oder geschützte Seitenketten) der üblichen Aminosäuren sind, und Z Sauerstoff oder Schwefel ist.

Die Aminosäure-N-carboxyanhydride (es wird davon ausgegangen, daß der Begriff N-Carboxyanhydric! in dieser Beschreibung und den anhängigen Patentansprüchen die N-Thio~arboxyanhydride mit einschließt) sind gut bekannt und reagieren leicht mit den meisten freien Aminen. Ein Hauptvorteil der N-Carboxyanhydride (NCA) und selbst der geschützten NCA zur Verwendung in der Peptidbindungsbildung besteht in der Tatssc·':^, daß sie sehr wirksame acylierende Mittel sind (siehe Peptides, Bd. 9, S. 83). Sie liefern im allgemeinen auch höhere Ausbeuten an Peptiden als die Verfahren mit DCC- oder N-Hydroxysuccinimid-(OSu)-Esterkupplung. Die NCA haben jedoch bei der Polypeptidsynthese keine weite Verwendung gefunden, da man die Kupplungsreaktion schwer steuern oder begrenzen kann. Sobald ein NCA mit dem freien Amin einer Aminosäure reagiert, wird sofort Kohlendioxid freigesetzt und ein Di-

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peptid gebildet, das ebenfalls ein freies Amin enthält.. Dieses Amin wird in der Folge mit einem v/eiteren NCA reagieren und ein Tripeptid bilden usw. Durch diese Reaktion haben die Aminosäure-N-carboxyanhydride eine breite Anwendung bei der Bj" q von Poly- oC-aminosäuren gefunden, sie wurden dadurch aber Vl ι der Verwendung bei der schrittweisen Bildung von Polypeptiden ausgeschlossen. Hirschmann u. a. (The Controlled Synthesis of Peptides in Aqueous Medium. VIII) (Die gesteuerte Synthese von Peptiden im wäßrigen Medium), The Preparation and Use of Novel«C-Aminc Acid N-Carboxyanhydrides (Herstellung und Verwendung von neuartigen oC-Aminosäure-N-carboxyanhydriden) J.A.C.S., 93:11, 1971, S. 2746-2774) haben bei der Verwendung von Aminosäure-N-carboxyanhydriden in der Herstellung von Di- und Tripeptiden in wäßrigorganischen Lösungsmittelsystemen durch sorgsame Steuerung von Temperatur, pH-Wert, Salzgehalt und organischem Lösungsmittel des Reaktionsgemischs Erfolg gehabt. Dieses Verfahren ist jedoch wegen der oben beschriebenen Chemie der NCA auf kleine Peptide begrenzt. Außerdem müssen die aus diesen Lösungsphasenreaktionen gewonnenen Produkte einer umfangreichen Reinigung unterzogen werden, bevor sie für die Herstellung längerer Peptide verwendet werden.

In der Literatur ist über eins Art von N-substituierten Aminosäure-N-carboxyanhydriden berichtet worden, wie beispielsweise über N-Methyl, N-Benzyi, N-Acetyl, N-Nitrophenylsulfeny1, N-Xanthyl, 4,4'-Dimethylbenzylhydryl, Trityl und dergleichen. Einige dieser substituierten NCA wurden für die Verwendung in der schrittweisen Synthese von Peptiden und besonders in der Festphasen-Peptidsynthese vorgeschlagen, aber von den Peptid-Chemikern sind noch keine für die allgemeine Verwendung anerkannt worden .

Kricheldorf (Angew. Chem. Acca 8_5, 86-87, (1978)) schlug die Verwendung von o-Nitrophenylsulfenyl-(NPS)-substituierten NCA in der schrittweisen Synthese von Polypeptiden vor. Diese wurden durch die Umsetzung von o-Nitrophe.iylsulfenylchlorid mit einem N-Carboxyanhydrid in Gegenwart von Trietylamin hergestellt. Es hat

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sich dann erwiesen, daß Trietylamin dia Razemisierung von NPS-NCA fördert. Außerdem verlangt die Ol'.gomerisierung infolge der Wirkung des Trietylamins auf die NCA die Anwendung sehr strenger Reaktionsbedingungen (d. h. Temperatur 0 ⁰C und sehr langsame Zugabe von Trietylamin zum Reaktionsgemisch) während der NPS-NCA-Synthese. Haistrom u. a. (Z. Physiol Chem. 3J3J3» 82-84, (1974)) schlug da'-uf die Synthese von NPS-NCA durch Reaktion von Phosgen mit der NPS-Aminosäure vor, aber die Ausbeuten waren sehr gering (etwa 20 %). Nach ihrei Herstellung sind die NPS-NCA schwierig aufzubewahren, sie neigen dazu, aie Schulzgruape während der Kondensation "auszubluten", geben Anlaß zu vielfältigen Kupplungen und anderen Nebenreaktionen. Der Stickstoff des gebildeten NPS-geschützten Peptids ist noch dazu sehr nukleophil und kann zusätzliche Kondensationsreaktionen verursachen.

Block und Cox ("Peptides, Proc. of the 5 tr. Europ. Symp. , (Peptide, Protokolle des 5. Europäischen Symposiums) Oxford, September 1962, Pergamon Press 1963, Hrg. Ü.T. Young, S. 84-87) schlugen die Verwendung von N-Trityl-aminosäure-N-carboxyanhydriden in der Peptidsynthese vor, obwohl sie nur die einfachsten N-Tritylaminosäure-NCA (d. h. Glycin und Alanin) herstellen konnten. Diese Verbindungen wurden durch die Umsetzung einer N-Trityl-aminosäure mit Phosgen hergestellt. Mit diesem Verfahren waren sie auch in der Lage, N-Acetyl-fjlycin-NCA herzustellen. Die Wissenschaf tier erkannten die potentielle Nützlichkeit des t-Butyloxycarbonylglycin-N-carboxyanhydrids und Benzyloxycarbonylglycin-N-carboxyanhydrids , hatten sber keinen Erfolg bei ihren Versuchen, diese herzustellen und schlußfolgerten, daß urethangeschützte Aminosäure-N-carboxyanhydride nicht hergestellt werden konnten. Selbst wenn sich alle N-Trityl-NCA herstellen ließen, so ist bekannt, daß sich bei Anwendung des Tritylschutzes von Aminosäuren in verschiedenen Kondensationsmethoden wegen der beträchtlichen sterischen Hinderung durch die Tritylgruppe niedrige Ausbeuten ergeben. Die Tritylgruppe ist auch gegenüber Säure extrem empfindlich, wodurch die Herstellung des Trityl-MCA erschwert wird, und neigt während normaler Festphasenuperationen zum "Ausbluten" .

9 8 O 3 2 2

Halstroem & Kovacs (Acta Chemica Scandinavica, Ser. B. 1986, BY= (6), 462-465 und US-PS 4, 267,344) erkannten ebenfalls die Verteile und die potentielle Nützlichkeit von N-geschützten Aminosäure-N-carboxyanhydriuen und waren in der Lage, mehrere N-substituierte NCA herzustellen, von denen sie glaubten, daß sie die bei der Peptidsynthese notwendigen Anforderungen erfüllten. Sie konnten eine Reihe von 9-Xanthyl- (und verwandten )-substitierten Aminosäure-N-carboxyanhydriden herstellen. Von diesen Verbindungen wurde behauptet, daß sie durch die direkte Kondensation von Xanthydrol mit dem geeigneten NCA in Benzen, Toluen, Xylen oder einem anderen geeigneten Alkylbenzen unter Rückflußkochen hergestellt werden konnten. Das während der Kondensation gebildete Wasser wurde azeotrop entfernt. Dieses Verfahren leidet unter der Instabilität der NCA gegenüber Wärme und Wasser und führt daher zu niedrigen Ausbeuten und möglicherweise unreinen Produkten Diese Verbindungen lassen sich auch durch die Reaktion von Phosgen (oder einem Phosgenäquivalent) mit d?r entsprechenden 9-Xanthylaminosäure herstellen, und in der Tat sind die meisten der substituierten NCA in dieser Klasse durch dieses Verfahren hergestellt worden.

Bei der Verwendung in der Peptidsynthese haben sich die 9-Xan-· thyl-NCA als reaktionsträge erwiesen. Sie benötigen bis zu 5 Stunden bei 50 ⁰C in der Lösungssynthese und 24 Stunden bei 25 C in der Festphasensynthese. Dies ist wahrscheinlich auf die sterische Hinderung der 9-Xanthyl-Gruppe und/oder die desaktivierende Wirkung zurückzuführen. Ein weiteres Problem, das beim 9-Xanthy1-Schutz von Aminogruppen auftritt, besteht darin, daß das Stickstoffator. der nach der Kupplungsreaktion gebildeten 9-Xanthyl-Aminosäure immer'noch nukleophil ist und anschließende Kondensationsreaktionen durchführen kann. Diese Gruppen neigen auch dazu, während der Bearbeitung auszubluten. Die substituierten Aminosäure-N-carboxyanhydride dieses oder eines anderen Typs haben deshalb heutzutage keine weitverbreitete Verwendung in der Peptidsynthese, und insbesondere in der Festphasen-Peptidsynthese gefunden.

Kricheldorf, (Makromol, Chem. Bd. 178, S. 905-939, 1977) hat ein Verfahren für die Herstellung von Methoxycarbonylglycin-NCA und Ethoxycarbonylglycin-NCA beschrieben. Kricheldorf berichtet aber auch, daß bei diesem Verfahren wegen der sterischen Hinderung keine urethangeschützten NCA von Aminosäuren mit anderen Seitenketten als Wasserstoff hergestellt v/erden konnten.

Ziel der Erfindung:

Es ist deshalb ein Ziel der Erfindung, bisher nicht gewinnbare urethangeschützte N-Carboxyanhydride und N-Thiocarboxyanhydride der höheren Aminosäuren zur Verfügung zu stellen.

Ein weiteres Ziel der Erfindung Desteht darin, Verfahren für die Herstellung reiner, kristalliner, stabiler urethangeschützter Aminosäure-N-carboxyanhydride und urethangeschützter N-thiocarboxyanhydride bereitzustellen.

Ein weiteres Ziel der Erfindung besteht, darin, eine Methode für die Polypeptidsynthese unter Verwendung von reinen, kristallinen, urethangeschützten Aminosäure-N-carboxyanhydriden zur Verfügung zu stellen, wobei die Synthese die folgenden Hauptvorteile gegenüber den herkömmlichen Methoden der Polypeptidsynthese aufweist:

1) Voraktivierung der zu kuppelnden Carboxylgruppe ist nicht notwendig, so daß Nebenprodukte, die durch herkömmliche aktivierte Moleküle erzeugt werden, nicht auftreten.

2) Es werden keine Zusätze wie N-Hydroxybenzotriazol zur Hemmung der Racemisierung benötigt.

3) Das einzige Beiprodukt aus der Kupplungsreaktion ist Kohlendioxid .

4) Diese N-geschützten carboxylaktivierten Aminosäuren sind stabile, lagerfähige, kristalline Materialien und ermöglichen und vereinfachen deshalb sowohl die Festphasen- als auch die Flüssigphasen-Peptidsynthese , insbesondere in Peptid-Syntheseautomaten,

da sie die Notwendigkeit von Aktivierungen, Filtrationen und Kupplungen vor der Peptidbindungsbildungsreaktion beseitigen. Die Reinigung der in Lösung hergestellten Peptide wird durch die Verwendung dieser neuartigen Verbindungen stark erleichtert, da durch Kupplungsmittel keine Nebenprodukte gebildet werden.

5) Das Verfahren stellt nach der Kupplung die allgemein anerkannten Urethanschutzgruppen für die Aminofunktion der wachsenden Peptidkette, die dann durch herkömmliche Techniken weiter bearbeitet werden kann, zur Verfügung. ,,

Darlegung des Wesens der Erfindung:

Diese Ziele werden durch ein urethangeschütztes Aminosäure-N-carboxyanhydrid oder N-Thiocarboxyanhydrid mit folgender Strukturformel :

erreicht, worin R und R¹ Wasserstoff, Alkyl, Cycloalkyl, substituiertes Alkyl, substituiertes Cycloalkyl, Aryl oder substituier tes Aryl sind und mindestens eines von R und R' etwas anderes als V/asserstoff ist; R" Alkyl, Aryl, substituiertes Alkyl oder substituiertes Aryl ist; Z Sauerstoff oder Schwefel ist, und N 0, 1 oder 2 ist.

Die bevorzugten Gruppen von R, R¹ und R" sind Alkylgruppen, einschließlich Cycloa.lky !gruppen, mit 1 bis 12 oder mehr Kohlen-

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stoffatomen, Arylgruppen mit 6 bis 20 oder mehr Kohlenstoffatomen einschließlich Aralkyl- und Aikarylgruppen mit 7 bis 20 oder mehr Kohlenstoffatomen. Beispiele für geeignete Alkylgruppen sind Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, Isobutyl, Butyl, t-Butyl, h'exyl, Cyclopentyl, Cyclohexyl, Heptyl, Octyl und dergleichen. Beispiele für geeignete Arylgruppen sind Phenyl, Methylphenyl, Ethylphenyl, Naphthyl, Methylnaphthyl, Anthracyl und dergleichen Beispiele für geeignete Aralkylgruppen sind Benzyl, p-Methoxybenzyl, 9-Fluorenylmethyl, Phenylethyl und dergleichen. Geeignete Aikarylgruppen sind Tolyl, Ethylphenyl, Isopropylphenyl und dergleichen. Gie Gruppen von R, R¹ und R" können ebenfalls durch nichtinterferierende Gruppen v/ie Fluoro, Methoxy, t-Butoxy, Carboxyl, Amido, Benzyloxy, Hydroxy (' substituiertes Amino, substituiertes Hydroxy, Schwefel, substituiertes Schwefel, Chloro, Bromo und dergleichen substituiert sein. R und R' sind in der Regel die geschützten oder ungeschützten Gruppen, die an das οό-Kohlenstoffatom (Sei+enketten) der Aminosäuren oder deren Analoga geknüpft sind.

In den meisten Fällen ist eines von R oder R¹ gewöhnlich H, während das andere die Seitenkette am „^-Kohlenstoffatom einer Aminosäure wie Lysin, Leucin, Arginin, Serin, Asparaginsäure, Alanin, Asparagin, Cystein, Cystin, Glutaminsäure, Histidin, Glutamin, Isoleucin, Methionin, Norleucin, Ornithin, Phenylalanin, Threonin, Tryptophan, Tyrosin, Valin, /^-Alanin, Homoserin und dergleichen ist. Beispiele für diese Seitenketten sind:

-(CH₂J₂-COOH

-CH₂-CH-CH₃ CH₃

^, NH

(CH₂J₃-NH-C ^

-CH-CH₂-CH₃

CH₃ -CH₂-COOH

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-CH₃

-CH₂-C-NH₂-CH₂-SH

I -CH₂-S-S-CH₂-CH-COOH -CH₂-OH -CH₂-CH₂-OH

-CH-CH₂CH₃ CH₃

-CH₂-CH₂-S-CH₃ -(CH₂J₃-CH₃

-(CH₂J₃-NH₂-CH₂

-CH-CH₃ OH

OH

Diese Seitenketten können nach Bedarf mittels bekannter Techniken und Schutzgruppen, die dem Fachmann auf diesem Gebiet gut bekannt sind, geschützt werden, wie zum Beispiel durch die allgemein angewandten Amino-, Hydroxy-, Thiol- und Carboxyschutzgruppen.

Die erfindungsgemäOen Verbindungen schließen auch die Fälle ein, bei denen sowohl R als auch R¹ an das .^-Kohlenstoff atom einer Aminosäure geknüpfte Seitenketten sind, wie zum Beispiel bei Isovalin, wo eines von R oder R¹ -CH₇CH, ist und das andere Methyl ist.

Die erfindungsgemäOen Verbindungen schlieOen auch die Fälle ein, in denen R und R' Teil einer cyclischen Struktur sind, wie zum Beispiel bei 1-Amino-1-cyclohexan-carbonsäure.

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Die erfindungsgemäOen Verbindungen schließen euch solche Beispiele ein wie ortho-Aminobenzoesäure oder l-Amino-2-carboxy-cyclohexan, worin die Kohlenstoffatome aus den R- oder R'-Gruppen Teil eines cyclischen Rings sind.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung umfaßt eine Verbesserung in der Synthese einer Polypeptidkette, worin eine N-geschützte Aminosäurekomponente schutzblockiert wird und die nicht mehr geschützte Aminosäurekomporiente mit einer zweiten ähnlichen oder nicht ähnlichen aktivierten N-geschützten Aminosäurekomponente reagieren kann und der Prozeß solange wiederholt wird, bis das gewünschte Polypeptid gewonnen wurde, wobei die Verbesserung darin besteht, daß als die aktivierte N-geschützte Aminosäurekomponente in mindestens einer der Reaktionen eine Verbindung mit folgender Strukturformel

verwendet wird, fcorin R, R¹, R", Z und η die oben erläuterten Bedeutungen haben.

Ein weiterer erfindungsgemäßer Aspekt besteht in der Verbesserung der Festphasensynthese einer Polypeptidkette auf einem unlöslichen festen Träger, wobei eine N-geschützte Aminosäurekomponente durch Kondensatinnsreaktion an einen unlöslichen festen Träger gekuppelt wird, der Substituentengruppen enthält, die gegenüber dem Carboxylterminusende der Aminosäurekomponente reaktiv sind und der gekuppelten N-geschützten Aminosäurekomponente schutzblockiert

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(deprotected) wird, eine zweite ähnliche oder nicht ähnliche aktivierte N-geschützte Aminosäurekomponente an die besagte nicht mehr geschützte Aminosäureverbindung, gekuppelt und der Prozeß solange wiederholt wird, bis das gewünschte Polypeptid gewonnen ist, wobei die Verbesserung darin besteht, daß als die aktivierte N-geschützte Aminosäurekomponente in mindestens einer der Reaktionen eine Verbindung der folgenden Strukturformel

verwendet wird, worin R, R¹, Z und π die oben erläuterte Bedeutung haben.

Als eine weitere erfindungsgemäße Ausführungsform wird die Herstellungsmethode für die urethangeschützten Aminosäure-N-carboxyanhydride eingeschlossen, die die Reaktion eines Aminosäure-N-carboxyanhydrids mit folgender Strukturformel

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umfaßt, worin R, R¹, Z und η die oben erläuterten Bedeutungen haben, mit einem Halogenformiat (oder einem anderen geeigneten reaktiven Formiat, wie Azidoformiat) mit folgender Strukturformel :

Il

R"- 0 — C — X

worin X Chlor, Brom, Fluor, Azid oder dergleichen ist, und R" Alkyl, Aryl oder Aralkyl ist, in einem inerten Verdünnungsmittel unter wasserfreien Bedingungen und in Gegenwart von N-Methylmorpholin. Es hat sich überraschenderweise herausgestellt, daß bei der Verwendung eines inerten Verdunnungsmitteis, wasserfreier Bedingungen und der Wahl von N-Methylmorpholin als Base in diener Reaktion die Polymerisierung von N-Carboxyanhydriden vermieden wird und andererseits die Herstellung von bisher nicht gewinnbaren urethangeschützten NCA und MTA der höherer Aminosäuren ermöglicht wird.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Die Aminosäure-N-carboxyanhydride (NCA) und N-Thiocarboxyanhydride (NTA), die als Ausgangsmaterialien für die Herstellung der erfindungsgeiiiäßen N-urethangeschützten NCA und NTA dienen, können durch eine Reihe von den Fachleuten auf diesem Gebiet bekannten Verfahren hergestellt werden. Siehe beispielsweise: Fuller und Mitarbeiter, Biopolymers J_9, Nr. 9, 1869-1871 (1976); Kricheldorf, ehem. Ber. 104, 87-91 (1971); und ilalstrom und Kovacs, Acta Chemica Scandinavica, B40, 462-465 (1986).

Während Urethane im allgemeinen als Schutzgruppen für nukleophile Atome verwendet werden können, haben nur einige wenige verbrei-

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te te Verwendung in der Peptidsynthese gefunden, wie beispielsweise t-Butyloxycarbonyl (Boc( ; Benzyloxycarbonvl (Cbz) und 9~Fluorenmethyloxycarbonyl (FMC¹C). Infolgedessen sind Aminosä'ire-N-carboxyanhydride oder M-Thiocarboxyanhydride, die mit diesen Schutzgruppen substituiert sind, von besonderem Interesse. Demzufolge sind die NCA der L-c/.'-Aminosäuren, die durch eine der oben erwähnten Schutzgruppen geschützt sind, wie beispielsweise

CH- C- O-C— H L „

i^-O-C— H Z

worin R die Seitenkette einer -Aminosäure ist, Z 0 oder S ist, und X Methoxy, Chloro oder dergleichen ist, sehr nützliche Moleküle für die Peptidsynthese.

Wie zuvor bereits erwähnt, sind weder diu erfindungsgemäßen N-urethangeschützten MCA durch die Reaktion des Phosgens mit der N-urethangeschützten Aminosäure nach der Beschreibung von Block und Cox ("Peptides, Proc. of the 5th Europ. Symp. (Peptide, Protokolle des 5. Europ. Symposiums, Oxford, September 1962". Pergamon Press 1963, Hrg. G.T. Young, S. B4-87) zu gewinnen, noch sind es

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die N-urethangeschützten NCA der höheren Aminosäuren durch die Synthese nach der Beschreibung von Kricheldorf (Makromol. Chem., Bd. 176, S. 905-939, 1977). Es wurde gefunden, daO sich die urethangeschützten NCA und NTA durch die Reaktion eines zuvor synthetisierten NCA oder NTA mit dem geeigneten Halogenformiat in einem wasser freien, nichtinterferierenden Lösungsmittel unter Verwendung eines tertiären Amins als Base herstellen lassen. Die Reaktion wird vorzugsweise unterhalb der Raumtemperatur durchgeführt. Geeignete Lösungsmittel für die Reaktion sind Tetrahydrofuran, Ethylacetat, Methylenchlorid, Toluen, Benzen, Dioxan und dergleichen.

Die neuartigen erfindungsgemäßen urethangeschützten Aminobciure-N-carboxyanhydride und N-Thiocarboxyanhydride können somit hergestellt werden, indem ein NCA in einem nichtinterferierenden Lösungsmittel (wie Toluen) gelöst und die entstandene Lösung unter Rühren gekühlt wird. Das gewünschte Halogenformiat (z. B. Benzylchloroformiat) wird danach alles auf einmal zugefügt. Zu diesem Gemisch wird eine tertiäre Aminbase (wie Triethylamin, Diisopropylethylamin, N-Methylfiiorpholin usw.) gegeben, die die Kondensation fördert und die die während der Reaktion gebildete Chlorwasserstoffsäure wegspült. Überraschenderweise wurde gefunden, daß bestimmte tertiäre Aminbasen wie N-Methylmorpholin und N-Ethylmorpholin die Polymerisierung der NCA nicht fördern. Die bevorzugten Basen sind diejenigen, deren pK-Werte niedrig genug sind, daß sie die NCA-Polymerisierung nicht fördern, jedoch hoch genug sind, um als Katalysator für die Reaktion des NCA mit einem Halogenformiat zu dienen. Wenn demzufolge eine dieser bevorzugten Basen in der Kondensationsreaktion verwendet wird, wird keine Polymerisierung ausgelöst. Da somit keine Gefahr einer Polyrnersierung besteht, kann die Base im Überschuß eingesetzt werden, und die entstandenen urethangeschützten NCA lassen sich leicht durch Kristallisation isolieren.

Im Ergebnis dieser Entdeckungen lassen sich nahezu alle urethangeschützten NCA (oder NTA) ohne Schwierigkeiten in hohen Ausbeuten herstellen, wobei nur darauf geachtet werden muß, daß Feuchtigkeit ausgeschlossen ist. Der Prozeß läßt sich leicht großtech-

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nisch durchführen und stellt Produkte zur Verfügung, die hochkris illin sind, sich durch einfache Techniken leicht reinigen lassen (z. D. Kristallisation) und die lagerbeständig sind (vollständig stabil bei 25 C über mindestens 6 Monöte und wahrscheinlich viel länger). Die>e Materialien für die Peptidsynthese lassen sich ohne die Gefahr einer Zersetzung abwiegen, versenden und lagern.

Der Hauptvorteil, den die urethangeschützten NCA gegenüber anderen N-substituierten NCA bieten, besteht darin, daß, nachdem sie zur Bildung der Peptidbindung verwendet wurden, das entstandene Peptid an seinem N-Terminus durch eine der allgemein anerkannten Urethanschutzgruppen, die üblicherweise in der Peptidsynthese eingesetzt werden, geschützt ist. Den Fachleuten auf diesem Gebiet ist gut bekannt, daß diese Schutzgruppen den besten verfügbaren Schutz für die Amingruppe einer wachsenden Peptidkette gewähren .

Der Einsatz der urethangeschützten N-Carboxyanhydride bietet somit alle Vorteile der nichtsubstituierten NCA (hohe Reaktivität, keine Bildung von unerwünschten Umlagerungsprodukten, C0„ als einziges Nebenprodukt.) ohne die Nachteile der nichtsubstituierten NCA (d. h. Instabilität, Polymerisation und Vielfachkondensation), die ihren Einsat, auf sorgfältig gesteuerte wäßrige Bedingungen begrenzt haben. Die Erfindung stellt damit ein lagerfähiges, hoch reaktives, voraktiviertes Reagens zur Verfügung, das während der Peptidbindungsbildung nur minimale Nebenprodukte erzeugt. Die Erfindung stellt auch den allgemein anerkannten, gut verständlichen Urethanschutz am Stickstoff des N-Terminus des Peptids. nach' der Kondensationsreaktion zur Verfügung.

Wenn auch die erfindungsgemäßen urethangeschützten Aminosäure-N-carboxyanhydride in der Polypeptidsynthese mit klassischen Methoden mittels einer Reihe von Schu tzblockierurigs- und Kupplungsreaktionen angewandt werden können, so werden sie zweifellos breitere Anwendung in der Festphasen-Polypeptidsynthese finden. Es versteht sich, daß der Begriff "Polypeptide" in der in der Be-

schreib¹ ig und den anhängigen Ansprüchen gehrauchten Bedeutung Peptide und Proteine einschließt. Es versteht sich ebenfalls, daß die vorliegende Erfindung die schrittweise Peptidsynthese mit einschließt, worin andere N-geschützte Aminosäuren al·.; die urethangeschützten Aminosäure-N-cs^boxyanhydride sowie mindesteis ein erfindungsgemäßes urethangeschütztes NCA angewandt werden. In der Praxis werden jedoch die in jeder Sequenz verwendeten N-geschützten Aminosäurekomponenten sehr wahrscheinlich die erfindungsgemäßen urethangeschützten NCA sein.

In der Festphasen-Polypeptidsynthese wird ein unlöslicher felter Träger oder eine Matrix, vortuilhafterweise als Kügelchen, verwendet. Derartige feste Träger können alle für die Polypeptidsynthese herkömmlicherweise af ""wandten polymeren Festphasensubstrt. te sein. Typisch für solche polymeren Harze sind vernetzte PoIystyrenharze, Glaskugeln, Tone, Celite, verletztes Dextran, Polyacrylamide, Polyamidharze und ähnliche unlösliche feste Träger, die entweder natürlicherweise reaktive Stellen zur Kupplung mit den Aminosäurekomponenten besitzen oder die mit solchen veaktiven Stellen ausgestattet werden können.

Auf Wunsch kann die erfindungsgemäße Fnstphasen-Polypeptidf.ynthese in einem Fließreaktor unter Druck, wie in US-PS 4,192,798, hierin durch Bezugnahme eingeschlossen, beschrieben wurde, durchgeführt werden, wobei aber die Anwendung von Überdruck nicht notwendig ist.

Vor Beginn der Festphasen-Peptidsynthese sind verschiedene vorbereitende Operationen notwendig. Zuerst muß das Trägerharz, das ' die C-terminale Aminosäure ... iiponent.e der gewünschten Peptidkette enthält, hergestellt werden, dies kann durch eine Reihe von den Fachleuten auf diesem Gebiet bekannten Verfahren geschehen. Viele dieser N-geschüczten Aminosäuren, die an unterschieuliche feste Träger geknüpft sind, sind im Handel erhältlich und können auf Wunsch gekauft werden.

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Die übrige Synthese zur Bildung der gewünschten- Polypeptidsequenz wird folgendermaßen ausgeführt. Bevor die Kupplung des zweiten Aminosäurerestes stattfinden kann, muß der Schutz des ersten Restes, der sich bereits auf den Träger befindet, beseitigt werden. Diese Schutzblockierung des ersten Aminosäurerestes auf dem Harz wie auch bei allen im folgenden gekuppelten Aminosäureresten kann durch Kontakt des geschützten Amimsä'urerestes mit einem geeigneten BlockierunLsmittel (deprotecting agent) erfolgen. Die für diesen Zweck angewandten BlocKierungsmittel sind den Fachleuten auf dem Gebiet der Peptidsynthese gut bekannt, und das in einem speziellen Fall angewandte Blockierungsmittel hängt natürlich von der Schutzgruppe an der Aminosäure/Harz ab. Wenn die Schutzgruppe zum Beispiel t-Butyloxycarbonyl ist, können Trifluoressigsäure in üichlormethan oder Chlorwasserstcffsäure in einem geeigneten Lösungsmittel wie Dioxan verwendet werden. Wenn die Schutzgruppe jedoch 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl ist, sind basische Bedingungen wie Piperidin in DMF die bevorzugte Methode. Die Konzentrationen des entsprechenden Blokkierungsmittels im Lösungsmittel sind wiederum je nach dem entsprechenden angewandten Schutzmittel unterschiedlich, liegen aber in der Regel im Bereich von 5 bis 50 Vol.%.

Nach der Blockierungsstufe wird das Harz mit einem geeigneten Lösungsmittel gewaschen, um die überschüssigen Blockierungsmittel zu entfernen. Wenn das Blockierungsmittel eine Säure ist, muß das Peptid auf dem Harz durch Waschen mit einer geeigneten Base wie Triethylamin in einem Lösungsmittel wie Dichlormethan neutralisiert werden. Überschüssiges Triethylamin und Triethylammoniumchlorid oder dabei entstandenes Trifluoracetat können durch wiederholtes Waschen mit einem Lösungsmittel wie Dichlormethan oder Dimethylformamid entfernt werden. Das so hergestellte freie Amin ist jetzt für die Kupplung mit der nächsten N-geschützten Aminosäure bereit.

Wenn die nächste N-geschützte Aminosäure ein erfindungsgemäßes urethangeschutztes Aminosäure-N-carboxyanhydrid ist, muß dieses

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nicht aktiviert werden und kann direkt mit dem Träger, der jetzt eine ungeschätzte harzgebundene Aminosäure enthält, reagieren. Wenn jedoch die N-geschützte Aminosaurekomponente durch herkömmliche Verfahren gekuppelt werden soll, ist zuerst eine Aktivierungsstufe notwendig, d. h. die Umwandlung in eine reaktive Form, zum Beispiel durch Umwandlung der Aminosäure in ein Anhydrid oder durch Aktivierung mit Dicyclohexylcarbodiimid, Carbonyldiimidazol oder andere Aktivierungsmittel. Im allgemeinen wird mit einem Überschuß an N-geschützter Aminosäurekomponente in der Reaktion gearbeitet.

Nach der Kupplung der zweiten geschützten Aminosäurekomponente an die erste Aminosaurekomponente wird der Schutz des angeknüpften geschützten Dipeptids entfernt, das Dipeptid wird, falls erforderlich, neutralisiert und gewaschen, wie im vorangegangenen beschrieben wurde, bevor die Kupplung des nächsten Aminosäurederivats durchgeführt wird. Dieses Verfahren wird solange wiederholt, bis die gewünschte Sequenz von Aminosäuren auf dem unlöslichen Träger zusammengestellt ist.

Da es bei der Kupplungsreaktion mit urethangeschützten NCA nicht zu unerwünschten Nebenreaktionen und Nebenprodukten kommt (CO₇ ist das einzige Nebenprodukt) und wegen ihrer Stabilität, können die in den Kupplungsreaktionen verwendeten überschüssigen urethangeschützten NCA leicht wiedergewonnen, rekristallisiert und wiederverwendet werden, wodurch sich die Kosteneffektivität dieser Materialien merklich erhöht.

Das fertige Peptid kann von dem unlöslichen Träger durch eine der Standardmethoden entfernt werden, wie zum Beispiel durch Abspaltung mit wasserfreiem Hydrogenfluorid, Umesterung, Aminolyse usw.

Nach der Abspaltung ist. festzustellen, daß das gewonnene Peptid bemerkenswert homogen ist und keine oder nur minimale Reinigung erfordert. Wegen der sehr geringen Verunreinigung durch Nebenprodukte ergeben sich insgesamt überraschend hohe Ausbeuten und eventuell notwendige Reinigungsvorgänge lassen sich relativ ein-

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fach ausführen. Solche Reinigungen erfolgen vorzugsweise durch Verteilungschromatoc aphie, Ionenaustauschchromatographie oder eine Kombination von beidem. Diese Verfahren sind den Fachleuten auf dem Gebiet der Peptidsynthese gut bekannt.

Ausführungsbeispiele: Beispiel I Zersetzung des N-Carboxyanhydrids in Abhängigkeit von einer Base

A. Valin-N-carboxyanhydrid (72 mg) wurde in trockenem, destilliertem Tetrahydrofuran (2 ml) gelöst, und Triethylamin (30μ1) wurde zugefügt.

Das Verschwinden des NCA wurde durch Infrarotspektroskopie verfolgt.

B. Valin-N-carboxyanhydrid (72 mg) wurde in Tetrahydrofuran

(2 ml) gelöst, und N-Methylmorpholin (25 μΐ) wurde zugefügt. Das Verschwinden des NCA wurde durch Infrarotspektroskopie verfolgt. Die Ergebnisse von A und B sind in der Figur 1 graphisch dargestellt.

Beispiel II N-(9-Fluorenylmethyloxycarbonyl)-L-alanin-N-carboxyanhydrid

A. Ein Gemisch aus L-Alanin (40,3 g, 0,45 Mol) und Phosgen (275 ml einer 3,3 M Lösung in Tetrahydrofuran, 0,90 Mol) wurde 4 Stunden lang bei 62-64 C gerührt. Die entstandene Lösung ließ man auf Raumtemperatur abkühlen, dann wurde sie filtriert, und die flüchtigen Stoffe wurden unter reduziertem Druck entfernt. Das entstandene Öl wurde in 100 ml Tetrahydrofuran gelöst, und 300 ml Hexan wurden unter Rühren zugesetzt, anschließend wurde auf -20 ⁰C gekühlt. Die Ausbeute an L-Alanin-N-carboxyanhydrid betrug 35,79 g (69 H).

B. Eine Lösung von N-Methylmorpholin (8,15 g, 80,5 mMol) in Toluen (50 ml) wurde zu einem bei 0 C gehaltenen Gemisch aus L-Alanin-N-carboxyanhydrid (8,84 g, 76,8 mMol) und 9-FluorenyImethyloxycarbony!chlorid (19,9 g, 76,8 mMol) in Toluen (200 ml) gegeben.

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Das Reaktionsgemisch wurde 2 Stunden bei 0 ⁰C gerührt und filtriert. Das Lösungsmittelvolumen wurde auf 20 ml reduziert. Bei Zugabe von 100 ml Hexan kam es zur Kristallisation, und 21,4 g (82 %) des Rohproduktes 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl-L-alanin-N-carboxyanhydrid wurden gewonnen. Das Produkt wurde durch Zermahlen mit kaltem Diisopropylether gereinigt und anschließend aus Ethylacetat/Hexan rekristallisiert: Schmelzpunkt 106-107 ⁰C; IR (CH, Cl₂) 1870, 1801, 1740 cm"¹; NMR (CDCl₃) ef 6,90-7,80 (m, 8 H), 3,95-4,55 (m, 4 H), 1,35 (d, J = 7 Hz, 3 H).

Analytisch berechnet für C₁₉H₁₅NO₅: C 67,65; H 4,48; N 4,15. Gefunden: C 67,73; H 4,65; N 4,19.

Beispiel III N-(9-Fluorenylmethyloxycarbonyl)-L-leucin-N-carboxyanhydrid

A. L-Leucin-N-carboxyanhydrid wurde aus L-Leucin in einer 78%igen Ausbeute nach dem in Beispiel HA beschriebenen Verfahren hergestellt.

B. Ein Gemisch aus L-Leucin-N-carboxyanhydrid (9,2 g, 58,4 mMol) und 9-Fluorenylmethyloxycarbonylchlorid (15,1 g, 58,4 mMol) in Toluen (125 ml) wurde auf 0 C gekühlt, und eine Lösung aus N-MethyImorpholin (6,5 g, 64 mMol) in 20 ml Toluen wurde tropfenweise zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 2,5 Stunden lang bei 0 C gerührt, filtriert, und das i.ösungsmittelvolumen wurde auf 20 ml reduziert, Hexan (480 ml) wurde zugegeben, und die Lösung wurde über Nacht auf -20 ⁰C gekühlt. Es wurden 18,8 g (85 %) N-(9-Fluorenylmethyloxycarbonyl)-L-leucin-N-carboxyanhydrid gewonnen. Eine Analyseprobe wurde durch Rekristallisation aus Ether/ Methylen Chlorid/Hexan gewonnen: Schmelzpunkt 118-120 ⁰C; NMR

₄) eil, 35-7,91 (m, 8 H; 4,72 (t, J = 7 Hz, 2 H); 4,58 (m, 3 H); 4,37 (t, J = 7 Hz, 1 H); 2,05 (m, 2 H); 1,09 (t, J = 6 Hz, 6 H). Analytisch berechnet für C₂₂H₂₁NO₅: C 69,64; H 5,58; N 3,69. Gefunden: C 69,08; H 5,97; N 3,70.

Beispiel IV N-oC-(9-Fluorenylmethyloxycarbonyl)-N- -t-butyloxycarbonyl-L-

lysin-N-carboxyanhydrid

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A. Ein Gemisch aus N- 6-t-Butyloxycarbonyl-L-lysin (1,23 g, 5,0 mMol) und Chlortrimethylsilan (1,08 g, 10,0 mMol) in Tetrahydrofuran (50 ml) wurde auf 0 C gekühlt, und eine Lösung von Triethylamin (1,01 g, 10,0 mMol) in 5 ml Tetrahydrofuran wurde tropfenweise zugegeben. Das Gemisch wurde 2,5 Stunden lang bei 0 ⁰C gerührt, filtriert, und eine Lösung Phosgen (10 mMol) in 15 ml Tetrahydrofuran wurde zugefügt. Die Temperatur wurde auf 60 ⁰C erhöht, und die Lösung wurde 2,0 Stunden lang und dann über Nacht bei Umgebungstemperatur gerührt. Die flüchtigen Bestandteile wurden durch Rotationsverdampfung entfernt, und 0,79 g (50 %) N- £ -t-Butyloxycarbonyl-L-lysin-N-carboxyanhydrid wurden gewonnen:

IR (CH₂Cl₂) 1860, 1795, 1710 cm"¹.

B. Ein Gemisch aus N-£.-t-Butyloxycarbonyl-L-lysin-N-carboxyanhydrid (0,79 g, 2,90 mMol) und 9-Fluorenylmethyloxycarbonylchlorid (0,75 g, 2,90 mMol) in Toluen (25 ml) wurde auf 0 ⁰C gekühlt, und eine Lösung N-Methylmorpholin (0,32 g, 3,2 mMol) in Toluen (5 ml) wurde tropfenweise zugefügt. Das Reaktionsgemisch wurde wie in Beispiel 111B beschrieben aufgearbeitet und ergab 0,88 g (66 %) N-/·-(9-Fluorenylmethyloxycarbonyl(-N- i'-t-butyloxycarbonyl-L-lysin-N-carboxyanhydrid: Schmelzpunkt 81-85 C (Ethylacetat/Hexan); NMR (CDCl₃) cf7,3-3,7 (m, 8 H), 4,11-4,58 (m, 5 H), 2,95-3,20 (m, 2 H); 1,90-1,98 (m, 2 H); 0,9-1,4 (m, 13 H). Analytisch berechnet für ^c ₂7^H3o^N2°7^{: C 65}>⁵⁷! ^{H 6}J¹¹! ^N 5,67. Gefunden C 66,33; H 6,38; N 5,67.

Beispiel V N-Benzyloxycarbonyl L-Alanin-N-carboxyanhydrid

Eine Lösung aus N-Methylmorpholin (1,06 g, 10,5 mMol) in Ethylace'tat (20 ml) wurde bei 0 ⁰C tropfenweise zu einem Gemisch von L-Alanin-N-carboxyanhydrid (aus 11A) (0,81 q, 7,0 mMol) und Benzyloxycarbonylchlorid (1,89 g, 10,5 mMol) in Ethylacetat (80 ml) gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 1,5 Stunden lang bei 0 C gerührt, filtriert, und das Volumen der Lösung wurde auf 75 ml reduziert. Hexan (75 ml) wurde unter Rühren zugefügt, anschließend wurde auf -20 ⁰C gekühlt, und i,20 g (71 h) M-Benzyloxycsrbony1-L-alanin-N-carboxyanhydrid wurden gewonnen: Schmelzpunkt

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101-104 ⁰C; NMR (CDCl₃) cT 7,33 (s, 5 H); 5,27 (s, 2 H); 4,60 (q, J = 7 Hz), 1,61 (d, J = 7 Hz, 3 H).

Analytisch berechnet für C₁₂H_nNU₅; C 57,83; H 4,45; N 5,62. Gefunden: C 57,60; H 4, ¹^; N 5,63.

Beispiel VI N-Benzyloxycarbonyl-L-leucin-N-carboxyanJiydrid

Eine Lösung aus N-Methylmorpholin (0,76 g, 7,50 mMol) in Ethylacetat (10 ml) wurde bei 0 ⁰C tropfenweise zu einer Lösung aus L-Leucin-N-carboxyanhydrid (0,79 g, 5,0 mMol) (aus 11IA) und Benzyloxycarbonylchlorid (1,35 g, 7,5ü mMol) in Ethylacetat (50 ml) gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 1,25 Stunden lang bei 0 ⁰C gerührt, filtriert, und das Volumen der Lösung wurde auf 5 ml reduziert. Hexan (50 ml) wurde zugegeben, anschließend wurde auf -20 ⁰C gekühlt, und 0,89 g (61 %) N-Benzyloxycarbonyl-L-Leucin-N-carboxyanhydrid wurden gewonnen: Schmelzpunkt 72-73,5 ⁰C (Ether/Hexan); NMR (CDCl₃)J*7,40 (s, 5 H); 5,33 (s, 2 H); 4,71 (t, J = 6 Hz); 1,80-2,04 (m, 3 H), 0,91 (m, 6 H). Analytisch berechnet für C₁₅H₁₇NO₅: ^c 61,84; H 5,88; N 4,81. Gefunden: C 61,64; H 6,02; N 4,90.

Beispiel VII N-Phenyloxycarbonyl-L-valin-N-carboxyanhydrid

A. L-Valin-N-carboxyanhydrid wurde aus L-Valin in einer Ausbeute von 75 % nach dem in Beispiel HA beschriebenen Verfahren hergestellt .

B. Beispiel V wurde wiederholt, wobei Phenylchloroformiat für Benzylchloroformiat und Valin-N-carboxyanhydrid für Leucin-N-car-· boxyanhydrid eingesetzt wurde. Das Ergebnis war eine 78%ige Ausbeute an N-Phenyloxycarbonyl-L-valin-N-carboxyanhydrid: Schmelzpunkt 105-106 ⁰C (Chloroform/Hexan); NMR (CDCl₃) cf7,30 (m, 5 H(, 4,70 (d, 3 = 3,5 Hz, 1 H), 2,60 (m, 1 H), 1,22 Cd, J = 7 Hz, 3 H) 1,07 (d, J = 7 Hz, 3 H), 1,07 (d, J = 7 Hz, 3 H). Analytisch berechnet für C₁₂H₁₃NO₅: C 59,31 H 4,98; N 5,32. Gefunden: C 59,09; H 4,91; N 5,49.

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Beispiel VIII N-Ethyloxycarbonyl-L-alanin-N-carboxyanhydrid

Beispiel V wurde wiederholt, wobei Ethylchloroformiat für Benzylchloroformiat eingesetzt wurde. Das ilrgebnis war eine 62%iye Ausbeute an N-Ethyloxycarbonyl-L-alanin-N-carboxyanhydrid; Schmelzpunkt 72-73,5 ⁰C (Ethylacetat/Hexan); NMR (CDCl₃)cT4,73 (q, J = 7 Hz, 2 H), 4,33 (q, J = 7 Hz, 1 H), 1,70 (d, 3 = 7 Hz, 3 H), 1,33 (t, 3 = 7 Hz, 3 H). Analytisch berechnet für C₇H₉NO₃: C 44,92; H 4,85; N 7,49. Gefunden: C 45,08; H 5,03; N 7,33.

Beispiel IX Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanin-N-carboxyanhydrid

A. L-Phenylalanin-N-carboxyanhydrid wurde aus L-Phenylalanin in 53%iger Ausbeute nach dem in Beispiel HA beschriebenen Verfahren hergestellt.

B. Zu einer Lösung aus L-Phenylalanin-N-carboxyanhydrid (2,5 g, 13 mMol) und Benzylchloroformiat (3,4 g, 20 mMol) in Ethylacetat (i30 ml) wurde bei 0 C tropfenweise eine Lösung aus N-Methylmorpholin (2,0 g, 20 mMol) in Ethylacetat (10 ml) gegeben. Das entstandene Gemisch wurde 2,5 Stunden lang bei O⁰C gerührt und wie in Beispiel V beschrieben aufgearbeitet und ergab 2,0 g (48%) N-Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanin-N-carboxyanhydrid: Schmelzpunkt 108-109 ⁰C; NMR (CDCl₃)Cf 7,35 (s, 5 H), 7,00 (m, 5 H). 5,31 (s, 2 H), 4,83 (m, 1 H), 3,28 (m, 2 H). Analytisch berechnet für C₁₉H₁₇NO₅: C 68,13; H 5,40; N 4,42. Gefunden: C 68,11;

H 5,38; N 4,20.

Beispiel X Phenyloxycarbonyl-L-alanin-N-thiocarboxyanhydrid

A. O-Ethyl-S-methylxanthat. Zu einer Lösung von Kaliumethylxanthat (16,0 g, 100 mMol) in V/asser (50 ml) wurde bei 4 + 1 ⁰C tropfenweise Dimethylsulfat (12,6 g, 100 mMol) gegeben. Nach Beendigung der Zugabe wurde das Reaktionsgemisch mit Dichlormethan (2 χ 40 ml) gewaschen, und die zusammengenommenen organischen Fraktionen wurde

2 8 O 3 2 2

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getrocknet (MgSO.) und eingeengt. Der ölige Rückstand wurde in Methanol gelöst und eingeengt und ergab O-Ethyl-S-methylxanthat von ausreichender Reinheit für die Verwendung in der nächsten Stufe.

B. Ethoxythiocarbonyl-L-alanin. Zu dem wie oben angegebenen hergestellten O-Ethyl-S-methylxanthat wurde eine Lösung aus L-AIanin (8,9 g, 100 mMol) und NaOH (4,0 g, 100 mMol) in Wasser (100 ml) gegeben. Die Lösung wurde 2,3 Stunden lang auf 45 ⁰C erhitzt. Beim Spülen mit N₂ wurde Methanol (50 ml) zugesetzt, und das Gemisch wurde noch einmal 0,7 Stunden bei 45 ⁰C gerührt. Dann ließ man das Reaktionsgemisch auf Raumtemperatur abkühlen, es wurde mit Dichlormethan (3 χ 25 ml) gewaschen, mi⁺ konzentrierter HCl auf pH 2,5 gesäuert, und mit Ethylacetat (2 χ 50 ml) extrahiert. Die zusammengenommenen organischen Lösungen wurden getrocknet (MgSO.) und eingeengt. Der Zusatz von Hexan zu dem entstandenen Öl ergab 9,5 g (54 %) Ethyloxythiocarbonyl-L-alanin als einen farblosen Feststoff, der bei 74-78 C schmolz. Diese Substanz wurde durch Rekristallisation aus Ether/Hexan weiter gereinigt: Schmelzpunkt 77-79 ⁰C; IR (CCl₄) 3397, 1716 cm"¹.

C. L-Alanin-N-thiocarboxyanhydrid. Zu einer Lösung aus Ethyloxythiocarbonyl-L-alanin (3,0 g, 17 mMol) und Imidazol (1,2 g, 17 mMol) in THF (20 ml) wurde bei 20 ⁰C tropfenweise PBr₃ (5,4 g, 20 mMol) gegeben. Das Rühren wurde solange fortgesetzt, bis die feste Masse in eine feine Suspension aufgebrochen war.

Das Reaktionsgemisch wurde in ein Gemisch aus gesättigtem NaHCO-, (200 ml) und Ethylacetat (150 ml) gegossen. Die organische Schicht wurde abgetrennt, mit 1 M HCl (2 χ 100 ml) und gesättigtem NaHCO-, (100 ml) sowie Salzlösung (100 ml) gewaschen, getrocknet (MgSO₄) und eingeengt. Das entstandene Ül wurde beim Stehen fest. Die Rekristallisation des Feststoffs ergab 0,75 g (34 h) L-Alanin-N-thiocarboxyanhydrid: Schmelzpunkt 91-92 ⁰C; IR (CCl₄) 1750, 169 5 cm"".

D. Phenyloxycarbonyl-l-alanin-N-thiocarboxyanhydrid. Zu einer Lösung aus L-Alanin-N-thiocarbcxyanhydrid (0,40 g, 3,8 mMol) in 50 ml Ethylacetat wurde bei 0 ⁰C Phenylchloroformiat (0,95 g, 6,1 mMol) gegeben und anschließend wurde bei 0 C tropfenweise eine Lösung aus N-Methylmorpholin (0,57 g, 5,6 mMol) in Ethyl-

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acetat (10 ml) zugefügt. Das entstandene Gemisch wurde 3 Stunden lang bei O ⁰C gerührt, filtriert, und zu einem weißen halbfesten Stoff eingeengt. Die halbfeste Substanz wurde in 20 ml Ethylacetat gelöst, Hexan (150 ml) wurde zugefügt, und das Gemisch wurde auf -20 ⁰C gekühlt und ergab 0,55 g (62 %) Phenyloxycarbonyl-L-alanin-N-thiocarboxyanhydrid: Schmelzpunkt 110-111 ⁰C, NMR (CDCl₃)CT 7,18 (m, 5 H), 4,83 (q, 1 H, J = 7 Hz), 1,71 (d, 3 H, 3 = 7 Hz), IR (CH₂Cl₂) 1810, 1740 (Dublett), 1715 (Schulter), Analytisch berechnet für C₁₁H₉NO₄S: C 52,58; H 3,61; N 5,58; S 12,76. Gefunden: C 52_:75; H 3,72; N 3,36; S 12,98.

Beispiel XI

N-(9-Fluorenylmethyloxycarbonyl>0-t-butyl-L-threonin-N-carboxy anhydrid

A. 0-t--Butyl-L-threonin-N-carboxyanhydrid wurde aus 0-t--Butyl-L-threonin in einer Ausbeute von 57 H nach dem in Beispiel IVA beschriebenen Trimethylsilylverfahren hergestellt.

B. Zu einer Lösung aus O-t-Butyl-L-threonin-N-carboxyanhydrid (0,80 g, 4,0 mMol) und 9-Fluorenylmdthyloxycarbonylchlorid (1,0 g, 4,0 mMol) in Toluen (50 ml) wurde bei 0 C tropfenweise eine Lösung aus N-Methylmcrpholin (0,49 g, 4,8 mMol) in 8 ml Toluen gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 3 Stunden bei 0 C gerührt, filtriert, und die flüchtigen Bestandteile wurden unter reduziertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde aus Ether/Hexan auskristallisiert und ergab 1,0 g (60 H) N-(9-Fluorenylmethyloxycarbonyl)-0-t-butyl-L-threonin: Schmelzpunkt 324-127 ⁰C, NMR (CDCl₃) (/7,08-7,78 (m, 8 ii), 4,05-4,61 (m, 4 H), 1,18 (s, 9 H), 1,16 (d, 3 H), J = 7 Hz). Analytisch berechnet für C₀₇H₀₁-NO,: C 68,07; H 5,95; N 3,31. Gefunden: C 67,89; H 5,96; N 3,28.

Beispiel XII Ethyloxycarbonyl-oC -aminodimethylessigsäure-N-carboxyanhydrid

A.<£ -Aminodimethylessigsäure-N-carboxyanhydrid wurde in einer Ausbeute von 67 h nach dem in Beispiel ΙΙΛ beschriebenen Verfahren hergestellt,

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B. Beispiel VIIIB wurde wiederholt, wobeie£-Aminodimethylessigsäure-N-carboxyanhydrid für L-Alanin-N-carboxyanhydrid eingesetzt wurde, und es wurde eine 16%ige Ausbeute an Ethyloxycarbonyl-^-aminodimethylsssigsäure-N-carboxyanhydrid gewonnen. Schmelzpunkt 68-70 ⁰C (Chloroform/Hexan); NMR (CCl ^)(T H,59 (q, 2 H, J = 7 Hz), 2,00 (s, 6 H), 1,65 (t, 3 H, J = 7 Hz). Analytisch berechnet für CgH₁₁NO₅: C, 47,76; H 5,51; N 6,96. Gefunden: C 47,67; H 5,51; N 7,14.

Beispiel XIII N-t-Butyloxycarbonyl-L-alanin-N-carboxyanhydrid

Zu einer Lösung aus t-Butylalkohol (1,25 g, 16,9 mMol) und Phosgen (3,4 ml einer 5 M Lösung in Dioxan, 17 mMol) in 80 ml Ethylacetat wurde bei -50 ⁰C tropfenweise N-Methylmorpholin (3,4 g, 34 mMol) gegeben. Gas Reaktionsgemisch wurde 0,5 Stunden gerührt. L-Alanin-N-carboxyanhydrid (0,23 g, 2,0 mMol) in Ethylacetat (10 ml) wurde zugefügt, und das Gemisch wurde bei -50 ⁰C weitere 0,75 Stunden gerührt. N-Methylmorpholin (1,0 g, 10 mMol) wjrde zugegeben, und es wurde bei -50 C weiter für 0,75 Stunden gerührt. Die Feststoffe wurden durch Filtration entfernt, die Lösung wurde eingeengt, und das Produkt wurde nach Zermahlen mit Hexan gewonnen. Die Rekristallisation aus Toluen ergau 0,28 g (65 %) N-t-Butyloxycarbonyl-L-al^ lin-N-carboxyanhydrid . Schmelzpunkt 103-104,5 ⁰C; NMR (CDCl₃) (A, 71 (q, 1 H, J = 7 Hz), 1,80 (d, 3 H, J = 7 Hz), 1,70 (s, 9 H). Analytisch berechnet für C₀H₁₃NO₅: C 50,23; H 6,09; N 6,51. Gefunden C 50,66; H 6,36; N 6,38.

Beispiel XIV N-(t-Butyloxycarbonyl)-0-benzyl-L-Sbrin-N-carboxyanhydrid

A. 0-Benzyl-L-serin-N-carboxyanhydrid wurde in einer Ausbeute von 68 % nach dem in Beispiel IIA beschriebenen Verfahren hergestellt

B. Beispiel XIII wurde wiederholt, wobei O-ßenzyl-L-serin-N-carboxyanhydrid für L-Alanin-N-carboxyanhydrid eingesetzt wurde. Es wurde N-(t-Butyloxycarbonyl)-0-benzyl-L-serin-N-carboxyanhydrid

2 fl O * 2 2

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in einer Ausbeute von 52 % gewonnen: Schmelzpunkt 98-99,5 ⁰C; NMR (CCl₄) ei 7,30 (m, 5 H), 4,64 (m, 3 H, Benzyl CH₂ und NCA Ringproton), 4,09 (dd, 1 H, J = 15, 5 Hz), 3,88 (dd, 1 H, J = 15, 5 Vi), 1,65 (s, 9 H); Analytisch berechnet für C₁₅H₁₉NO₆: C 59,80,; H 5,96; N 4,36. Gefunden: C 59,71; H 6,25; N 4,05.

Beispiel XV

Phenyloxycarboxy!derivat von l-Amino-l-cyclohexancarboiTsäure-N- carboxyanhydrici

A. l-Amino-l-cyclohexancarbonsäure-N-carbuxyanhydrid wurde in einer Ausbeute von 50% aus l-Amino-l-cyclohexancarbonsäure nach dem in Beispiel IIA beschriebenen Verfahren hergestellt.

B. Zu einer Lösung aus N-Carboxyanhydrid (0,85 g 5,0 mMol), die in A hergestellt w':rde, und Phenylchloroformiat (1,2 g, 7,5 mMol) in Ethylacetat (3C! ml) wurde bei 0 C eine Lösung aus N-Methylmorpholin (0,76 g, 7,5 mMol) in 8 ml Ethylacetat gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 2 Ständen lang bei 0 ⁰C gerührt, filtriert und eingeengt. Der weiße, halbfeste Rückstand wurde aus Ethylether/Methylen-Chloriri/Hexan rekristallisiert und ergab 0,92 g (66 H) N-Carboxyanhyund: Schmelzpunkt 156,5-158 ⁰C; NMR (CDCl₃) (/7,28 (m, 5 H), 1,23-3,lü (m, i0 H). Analytisch berechnet für C₁₅H₁₅NO₃: C 62,27; H 5,2:<; N 4,84. Gefunden: C 62,03; H 5,22; N 4,77.

Beispiel XVI N-(9-Fluorenylmethyloxycarbonyl)-L-leucin-N-carboxyanhydrid

A. L-Leucin-N-carboxyanhydrid wurde in einer Ausbeute von 78 % aus L-Leucin nach dem in Beispiel HA beschriebenen Verfahren hergestellt.

B. Ein Gemisch aus L-Leucin-N-carboxyanhydrid )9,2 g, 58,4 mMol) in trockenem, destilliertem Ethylacetat (150 ml) wurde auf -10 ⁰C gekühlt, und eine Lösung Triethylamin (9 ml, 64 mMol) in 20 ml Ethylacetat wurde im Verlauf" von 5 Minuten tropfenweise zugegeben. Die Kühlung wurde unterbrochen und das Reaktionsgemisch wurde 1 5 Minuten gerührt. Es wurde eine kleine Menge wasserfreie

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Chlorwasserstoffsäure in Dioxan (4,4 M, 5 ml) zugegeben, um zu sichern, daß das gesamte Triethylamin neutralisiert worden wird. Das Reaktionsgemisch wurde filtriert, und das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt. Das entstandene Rohprodukt wurde in Ethylether aufgenommen, filtriert, und das Produkt wurde nach Zugabe zu Hexan durch Kristallisation gewonnen.

Nach drei zusätzlichen, sorgfältig ausgeführten Kristallisationen wurde N-(9-Fluorenyl-methylGxycarbonyl)-L-leucin-N-carboxyanhydrid in einer Ausbeute von 16 % gewonnen (3,6 g). Die Analysewerte sind im wesentlichen mit den in Beispiel III gewonnenen i lentisch.

Beispiel XVII L-Leucin-L-valin

9-Fluorenylmethyloxycarbonyl-L-valin, verestert an p-Alkoxybenzylakohol 2 % derivatisiertem vernetztem Polystyren (0,25 g, 0,ii mMol Valin) wurde in einen Reaktionskessel für Festphasen-Pertidsynthese gegeben. Dimethylformamid (5 ml) wurde zugesetzt, und die Aufschlämmung wurde 30 Minuten geschüttelt. Das Dimethylformamid wurde entfernt, und das gequollene Harz wurde zweimal mit 10%igem Piperidin in Dimethylfcrmamid (5 ml 5 Minuten lang, anschließend 5 ml 15 Minuten lang) behandelt, um die 9-Fluorenylmethyloxycarbonylschutzgruppe ?u entfernen. Das Harz wurde mit Dimethylformamid (4x5 ml) gewaschen und mit 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl-L-leucin-N-udrboxyönhydrid (145 mg, 0,38 mMol) in Dimethylformamid (6 ml) 45 Minuten lang zur Reaktion gebracht. Die Fluorenylmethyloxycarbonylschutzgruppe wurde wie oben beschrieben entfernt, und das Harz wurde mit Dimethylformamid (3x5 ml) und Methylenchlorid (3x5 ml) gewaschen. !Das entstandene Dipeptid wurde durch Behandlung mit Methylenchlorid/Trifluoressigsäure (6 ml, 1:1) 45 Minuten lang abgespalten. Die Lösung wurde entfernt, und das Harz wurde mit Methylenchlorid (3x5 ml) und Methanol (2x5 ml) gewaschen. Die mit den Waschflüssigkeiten zusammengenommene Lösung wurde im Vakuum zu einem halbfesten Stoff verdampft, der in destilliertem V/asser aufgenommen und filtriert

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wurde. Die wäßrige Lösung wurde gefriergetrocknet, der entstandene Feststoff wurde mit Ether (3 x) zermahlen, um harzverwandte Verunreinigungen zu entfernen, und unter reduziertem Druck getrocknet, um L-Leucyl-L-valin in einer Ausbeute von>90 \ zu gewinnen. Die Identität des Dipeptids wurde durch HPLC-Analyse (Durchflußgeschwindigkeit = 1,5 ml/min, Nachweis bei 215 nm, 30%iges Methanol in 0,5 M Perchlorsäure) mittels Co-Elution mit einem bekannten Standard (Gesamtretentionszeit 8,49 min) bestätigt. Die Reinheit wurde mit > 97 % bestimmt, wobei alle Verunreinigungen auf das Harz zurückzuführen waren. Es konnte kein D-Leucyl-L-valin (Gesamtrettntionszeit 32 Minuten) nachgewiesen werden (Nachweisgrenze <0,1 %).

Beispiel XVIII L-Leucyl-L-valin

Beispiel XVI wurde wiederholt, mit der Ausnahme, daß 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl-L-leucin-N-carboxyanhydrid mit dem freien Amin von L-Valin am \'<.>κτ mittels Methylenchlorid (5 ml) anstelle von Dimethyl!ormamid als Lösungsmittel zur Reaktion gebracht wurde. Die Ergebnisse sinr' mit denen von Beispiel XVI vergleichbar.

Beispiel XIX

L-Leucyl-L-alanyl-L-valin (FMOC-Verfahren)

Das Verfahren aus Beispiel XVI wurde zur Herstellung von L-Leucyl-L-aalanyl-L-valin angewandt. Nach der Abspaltung vom Harz und Waschen mit Ether wurde aas Tripeptid in einer Ausbeute von>88 % als weißer Ftststoff gewonnen. Durch die HPLC-Analyse mit den in Beispiel XVI beschriebenen Bedingungen wurde die Identität des Produktes bestätigt, das zusammen mit einem bekannten Standard eluiert wurde, (nesa/ntretentinnszsit 16,28 Minuten). DeletionsseqMünzen wie .-Leucyl-L-valin und L-Alanyl-L-"alin wurden nicht nachgewiesen ^!-achweisgrenze < 0 ,1 h).

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Beispiel XX

L-Leucyl-L-Alanyl-L-valin (Roc-Verfahren)

An methyliertem 2%igem vernetzten! Polystyren verestertes t-Butyloxycarbonyl-L-valin (d. h. Merrifield-Harz) (0,50 g, 0,23 mMol Valin) wurde in ein ReaktionsgefäO für Festphasen-Peptidsynthese gegeben. Methylenchlorid (5 ml) wurde zugefügt, und die Aufschlämmung wurde 30 Minuten geschüttelt. Das Lösungsmittel wurde entfernt, und das Harz wurde mit Methylenchlorid/Trifluoressigsäure (6 ml im Verhältnis 1/1) 30 Minuten lang behandelt, um die t-Butyloxycarbonylschutzgruppe zu entfernen. Das Harz wurde mit Methylenchlorid (3x5 ml) gewaschen, mit 10%igem Triethylamin in Methylenchlorid (5 ml) neutralisiert, mit Methylenchlorid (3 χ 5 ml) gewaschen und anschließend 45 Minuten lang mit einer Lösung t-Butyloxycarbonyl-L-alanin-N-carboxyanhydrid (200 mg, 1,0 mMol) in Methylenchlorid (5 ml) zur Reaktion gebracht. Das entstandene geschützte Dipeptidharz wurde mit Methylenchlorid (3x5 mi)gewaschen. Das Harz wurde erneut schutzblockiert, gewaschen, neutralisiert und gewaschen wie pijen beschrieben wurde. t-Butyloxycarbonyi-L-leucin-N-carboxyanlwdrid (240 mg. 1,0 mMol) in Methylenchlorid (6 ml) wurde zu dem Harz gegeben, und das Gemisch wurde 45 Minuten lang geschüttelt. Die Lösung wurde entfernt und das Harz wurde mit Methylenchlorid (3x5 ml), Methanol (3x5 ml) und Methylenchlorid (3x5 ml) gewaschen und unter hohem Vakuum getrocknet. Das mit t-Butyloxycarbonyl geschützte Tripeptidharz wurde mit flüssigem Hydrogenfluorid bei 0 ⁰C 30 Minuten lang umgesetzt. Das Hydrogenfluorid wurde entfernt, und der Rückstand wurde unter hohem Vakuum getrocknet. Das Peptid wurde in Wasser aufgenommen und das Harz wurde durch Filtration entfernt. Die Lösung wurde gefriergetrocknet und ergab eine fast quantitative Ausbeute an L-Leucyl-L-alanyl-L-valin. Die Ergebnisse der HPLC-Analyse gleichen den Ergebnissen aus Beispiel XVIII.

Beispiel XXI L-Alanyl-L-phenylalanin (mittels Vollschutzverfahren)

A. Zu L-Phenylala! inbenzylester-p-toluensulfonat (1,07 g, 2,5 mMol)

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in Tetrahydrofuran (20 ml) wurde bei 0 ⁰C N-Methylmorpholin (0,25 g, 2,5 mMol) gegeben. Das Gemisch wurde 0,5 Stunden bei 0 ⁰C gerührt, und N-Benzyloxycarbonyl-L-alanin-N-carboxyanhydrid (0,50 g, 2,0 mMol) wurden zugegeben. Das (\eaktionsgemisch wurde 2 Stunden bei 0 C gerührt, und Wasser (20 ml) und Dichlormethan (50 m] ) wurden zugefügt. Die Schichten wurden getrennt, und die wäßrige Schicht wurde mit Dichlormethan (25 ml) gewaschen. Die zusammengenommenen organischen Fraktionen wurden mit 0,5 M HCL (2 χ 50 ml) 10%igem Natriumhydrogencarbonat (50 ml) und V/asser (2 χ 50 ml) gewaschen, getrocknet (MgSO.) und eingeengt. Bei Zugabe von Hexan kam es zur Kristallisation, und es wurden 0,66g (72 ⁵ό) N-Benzylnv^'carbonyl-L-alanyl-L-phenylalaninbenzylester gewonnen: Schmelzpunkt 118,5-119 ⁰C; NMR (CDCl₇) 7,64 (s, 1 H), 6,82-7,39 (m, 6 H), 5,04 (s, 2 H), 5,00 (s, 2 H), 4,58-4,92 (m, 2 H), 3,07 (d, J = 6 Hz, 2 H), 1,29 (d, J = 7 Hz, 3 H).

B. Ein Gemisch aus N-Benzyloxycarbonyl-L-alanyl-L-phenylalaninbenzylester (0,50 g, 1,1 mMol) und 10 % Palladium auf Kohlenstoff (0,1 g) in Ethylalkohol (150 ml) wurde 6,5 Stunden bei 20 ⁰C auf einrr Parr-Hydrierappaiatur geschüttelt. Das Reaktionsgemisch wurde filtriert, und das Filtrat wurde mit Wasser (100 ml) gespült. Dii; Lösung wurde eingeengt und ergab 0,26 g (100 %) L-AIanyl-L-phenylalanin. Die HPLC-Analyse zeigte eine Reinheit von > 99 % und kein Zeichen einer Razemisierung.

Beispiel XXII

L-Alanyl-L-phenylalanin (mittels Teilschutzverfahren)

Zu einer Lösung aus L-Phenylalanin (0,33 g, 2,0 mMol) in 0,20 M Kaliumcarbonat (20 ml) und Acetonitril (30 ml) wurde bei einer Temperatur von 0 ⁰C tropfenweise eine Lösung aus N-Benzy.loxycarbonyl-L-alanin-N-carboxyanhydrid (0,45 g, 1,8 mMol) in Acetonitril (5 ml) gegeben. Das Gemisch wurde 40 Minuten bei 0 C gerührt und mit Ethylncetat (50 ml) und 1 M Chlorwasserstoff (10 ml) verdünnt. Die Schichten wurden getrennt, und die wäßrige Schicht wurde Tiit Ethylacetat (2 χ 35 ml) extrahiert. Die zusammengenommenen organischen Fraktionen wurden mit Salzlösung (30 ml), 0,5 M

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Chlorwasserstoffsäure (2 χ 50 ml) und Wasser (2 χ 50 ml) gewaschen, getrocknet (MgSO.) und eingeengt. Der Rückstand wurde aus Chloroform/Hexan rekristallisiert und ergab 0,26 g (39 %) N-Benzyloxycarbonyl-L-alanyl-L-phenylalanin: Schmelzpunkt 121-122 ⁰C; NMR (DMS0-d₆) 12,71 (s, 1 H), 8,06 (m, 1 H), 7,30 (m, 5 H), 5,01 (s, 2 H), 4,43 (m, 1 H), 4,06 (m, 1 H), 2,99 (m, 2 H), 11,19 (d, 2 H, J = 7 Hz).

B. Ein Gemisch aus N-Benzyloxycarbonyl-L-alanyl-L-phenylalanin (0,208 g, 0,562 mMol) und 10 \ Palladium auf Kohlenstoff (0,1 g) in 95%igem Ethylalkohol (50 ml) wurde auf einer Parr-Hydrierapparatur 16 Stunden lang bei 20 C geschüttelt. Das Reaktionsgemisch wurde filtriert, und das Filtrat wurde mit Wasser gespült (100 ml). Die zusammengenommenen Lösungen wurden eingeengt und ergaben 0,122 g (92 %) L-Alanyl-L-phenylalanin als einen weißen Feststoff. Die HPLC-Analyse zeigte eine Reinheit von >99,5 % und kein Zeichen einer Razemisierung.

Claims

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Patentansprüche

1. Verfahren zur Herstellung urethangeschützter Aminosäure-N-carboxyanhydride oder -N-thiocarboxyanhydride mit folgender Strukturformel

R"·

-O C

worin R und R¹ Wasserstoff, Alkyl, Cycloalkyl, substituiertes Cycloalkyl, Aryl oder substituiertes Aryl sind; R" Aklyl, Aryl, substituiertes Alkyl oder substituiertes <\ryl ist; Z Sauerstoff oder Schwefel ist; und η 0, 1 oder 2 ist, dadurch gekennzeichnet, daß ein Aminosäure-N-carboxyanhydrid oder -N-thiocarboxyanhydrid mit folgender Strukturformel

H —N

R¹

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worin R und R¹ die oben definierte Bedeutung haben, mit einem Halogenformiat der folgenden Strukturformel

R»— ο -C-X

worin χ ein Halogen ist und R" die oben definierte Bedeutung hat, in einem inerten Verdünnungsmittel unter wasserfreien Bedingungen und in Gegenwart einer tertiären Aminbase umgesetzt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß R" ein Alkyl mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen ist.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß R" ein niederes Alkyl oder substituiertes niederes Alkyl ist.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß R" t-Bu-LyI ist.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß R" Aryl oder substituiertes Aryl ist.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß R" Phenyl oder substituiertes Phenyl ist.
7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß R" Aralkyl oder substituiertes Aralkyl ist.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß R" Benzyl oder substituiertes Benzyl ist.
9. Verfahren nach Anspruch Q, dadurch gekennzeichnet, daß R" p-Methoxybenzy1 ist.

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10. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß R" 9-Fluorenylmethyl oder substituiertes 9-Fluorenylmethyl ist.
11. Verfahren nach einem der im vorangegangenen genannten Ansprüche 1-10, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eines von R und R¹ die Seitenkette einer geschützten oder ungeschützten Aminosäure ist.
12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß R oder R¹ die Seitenkette von Alanin ist.
13. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß R oder R' die Seitenkette von Arginin oder geeigneterweise geschütztem Arginin ist.
14. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß R oder R¹ die Seitenkette von Asparaginsäure oder geeigneterweise geschützter Asparaginsäure ist.
15. Verfahren nach Anspruch .¹I, dadurch gekennzeichnet, daß R oder R' die Seitenkette von Asparagin oder geeigneterweise geschütztem Asparagin ist.
16. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, doß R oder R' die Seitenkette von Cystein oder geeigneterweise geschütztem Cystein ist.
17. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß R oder R' die Seitenkette von Cystein ist.
18. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß R oder R¹ die Seitenkette von Glutaminsäure oder geeignexerweise geschützter Glutaminsäure ist.
19. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß R oder R' die Seitenkette von Glutamin oder geeigneterweise geschütztem Glutamin ist.

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20. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß R oder R' die Seitenkette von Histidin oder geeigneterweise Geschütztem Histidin ist.
21. Verfahren na^h Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß R oder R¹ die Seitenkette von Isoleucin ist.
22. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß R oder R¹ die Seitenkette von geeigneterweise geschütztem Lysin ist
23. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß R oder R¹ die Seitenkette von Leucin ist.
24. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß R oder R' die Seitenkette von Methionin ist.
25. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß R oder R' dis Seitenkette von Norleucin ist.
26. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß R oder R¹ di-j Seitenkette eines geeigneterweise geschützten Ornithins ist.
27. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß R odpr R¹ die Seitenkette von Phenylalanin ist.
28. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß R oder R' die Seitenkette von Serin oder geeigneterweise geschütztem Serin ist.
29. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß R oder R¹ die Seitenkette von Threonin oder gecigneterweise geschütztem Threonin ist.
30. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß R oder R' die Seitenkette von Tryptophan oder geeigneterweise geschütztem Tryptophan ist.

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31e Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß R oder R¹ die Seitenkette von Tyrosin oder geeigneterweise geschütztem Tyrosin ist.
32. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß R oder R¹ die Seitenkette von Valin ist.
33. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß R oder R' die Seitenkette von Homoserin oder geeigneterweise geschütztem Homoserin ist.
34. Verfahren nach Anspruch 1 - 33, dadurch gekennzeichnet, daß die tertiäre Aminbase N-Methylmorpholin ist.
35. Verfahren nach Anspruch 1-33 und 34, dadurch gekennzeichnet, daß das urethangeschützte Amin:säure-N-carboxyanhydrid-Reaktionsprodukt durch Kristallisation wiedergewonnen wird.

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