KR970002229B1 - 우레탄-보호된 아미노산-n-카르복시무수물 - Google Patents

우레탄-보호된 아미노산-n-카르복시무수물 Download PDF

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Abstract

내용없음.

Description

[발명의 명칭]
우레탄-보호된 아미노산-N-카르복시무수물
[발명의 상세한 설명]
[발명의 배경]
[발명의 분야]
본 발명은 신규한 부류의 N-보호된 아미노산-N-카르복시무수물 및 티오카르복시무수물, 말하자면 N-우레탄 보호된 아미노산-N-카르복시무수물 및 N-우레탄 보호된 N-티오카르복시무수물, 이들의 제조방법 및 펩타이드, 폴리펩타이드 및 단백질 합성에서 이들의 용도에 관한 것이다.
[종래기술]
대표적으로, 한정된 배열의 폴리펩타이드는 각각의 아미노산 부분의 부가후에 중간체들이 단리되는 아주 힘든 기법들에 의해서 제조되어 왔다. 이것은 합성을 복잡하게 했고 낮은 수율, 라세미화, 및/또는 다른 부반응들때문에 긴 사슬 폴리펩타이드 및 단백질들의 제조를 거의 불가능하게 만들었다. 1963년에, Merrifield 씨(J. Am. Chem. Soc., 85, 2149) 및 Letsinger 씨 및 Kornet 씨 (J. Am. Chem. Soc., 85, 2149)는 단백질 사슬을 성장시키기 위한 불용성 종합체 지지체의 사용을 제의했다. 고체상 펩타이드 합성으로 보통 표현되는 이러한 방법은 중간체의 단리없이 성장 펩타이드 사슬의 정제를 가능하게 했다.
여태까지, 고전적인 (액체상) 및 고체상 폴리펩타이드 합성양쪽을 위해 폭넓게 수용된 방법은 카르복실-활성화 N-보호된 아미노산이 얻어지도록 다른 상태의 N-보호된 아미노산의 카르복시기와 반응하기 위한 커플링제 또는 활성화제의 사용을 필요로했다. 이어서 이렇게 활성화된 종들은 펩타이드 결합형성을 증진하기 위해 몇 가지 방식으로 사용될 수 있었다. 예를 들어, 활성화된 보호된 아미노산은 아미노산, 아미노산 에스테르, 또는 아미노산 아미드의 유리아미노 그룹과 직접 반응하여 펩타이드 결합을 형성한다. 이것은 오랜동안 펩타이드를 제조하기 위한 선택과정이었다. 활성화단계는 다수의 가능한 부반응들에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어, 디시클로헥실 카보디아미드(DCC)가 활성화제인 경우, 활성분자는 불활성 N-아실우레아로 재배열될 수 있다.
카보디이미드 과정의 또다른 단점은 불용성 우레아들의 형성이다. 이것은 고체상 합성에서 특히 문제거리가 되며 고체상 흐름시스템에서 실제적으로 허용될 수 없다. 또한 이들 우레아들은 고체상 반응에서 곤란한 정제문제를 일으킨다.
연구원들은 DDC 활성화된 N-보호된 아미노산을 P-니트로페놀, 펜타클로로페놀, N-히드록시-숙신아미드 등과 같은 알콜 또는 페놀과 우선 반응시켜서 단리될 수 있는 활성 에스테르를 형성한 후 다음의 아미노산의 유리아민과 커플링시킴에 의해서 현장활성화와 관련된 문제들중의 일부를 완화했다. 그렇지만, 이 방법은 유리된 알콜 또는 페놀이 포함될 수 있거나 또는 그것들이 다른 부반응을 촉진할 수 있고 활성 에스테르 커플링이 완만해지기 쉬워서 오랜반응시간을 필요로 한다는 결점들이 있다.
또다른 보편적인 과정은 2당량은 N-보호된 아미노산을 1당량의 DCC와 반응시키고 형성된 DCU를 여과한 후비대칭적 무수물을 다음의 아미노산의 유리아민 그룹과 커플링시킴에 의해서 비대칭적 무수물을 형성하는 것이다. 이 과정은 2배의 값비싼 N-보호된 아미노산을 사용할 필요가 있다는 것 외에도 우레아 문제를 갖고 있다.
최근에, 일부의 연구원들은 커플링 후 가용성 우레아들을 형성하지만 N-아실우레아로 여전히 재배열되려는 경향이 있는 카보디이미드를 사용하기 시작했다.
여러 유형의 N-보호그룹들이 펩타이드 합성에서의 사용을 위해 제의되어 왔지만, 가장 폭넓게 수용된 부류의 N-보호그룹은 우레탄이다. 우레탄은 고도의 보호를 제공하고, 라세미화를 최소화시키고 저장시에 안정한 것으로 폭넓게 인정된다. 순한 산(즉, t-부틸옥시카르보닐), 강한 산(즉, 벤질옥시카르보닐), 아주 순한 산(즉, 2-(p-비페닐일)-이소프로필옥시카르보닐), 무수염기(즉, 9-플루오르에닐메틸옥시카르보닐) 등에 대하여 불안정한 우레탄-보호그룹들이 제조될 수 있다.
보통, 우레탄-보호된 아미노산들은 혼합된 수성/유기용매계(즉, Schotten-Baumann 조건)중에서 알칼리 금속 수산화물 또는 탄화물의 존재하에 아릴, 알킬 또는 아르알킬클로로포롬에이트(또는 다른 적당히 활성화된 포름에이트 또는 카본에이트)를 아미노산과 반응시킴에 의해서 제조된다. 반응혼합물의 산성화 후, 우레탄-보호된 아미노산은 모든 부산물들을 수성상에 남겨높은채 유기용매로 추출된다. 결정화 후, 이들 화합물들은 상기에 기재된 바와 같이 펩타이드 결합 형성에 사용된다.
펩타이드 결합형성에 사용하기 위한 아미노산들의 반응성 유도체의 특히 관심을 끄는 유형은 아래와 같은 N-카르복시무수물 또는 N-티오카르복시무수물이다.
Figure kpo00001
상기식에서 R, R'은 대표적으로 보통 아미노산의 곁사슬(또는 보호된 곁사슬) 또는 수소이고 Z는 산소 또는 항이다.
아미노산-N-카르복시무수물(명세서 및 특허청구의 범위에서 용어 N-카르복시무수물은 N-티오카르복시무수물을 포함함)은 잘 알려진 것으로서 대부분의 유리아민과 쉽게 반응한다. 펩타이드 결합형성에서 사용하기 위한 N-카르복시무수물(NCA's) 및 보호된 NCA's의 주된 이점은 이들이 잠재적인 아실화제라는 사실이다(Peptideg, Vol. 9, 83페이지, 참조). 또한 일반적으로 이들은 DCC 또는 N-히드록시숙신이미드(OSU)에스테르 커플링 과정들에 비해 더 높은 수율의 펩타이드를 산출한다. 그러나 NCA's는 커플링반응을 제어 또는 제한하기 위한 능력의 부족 때문에 풀리펩타이드 합성에서 폭넓은 사용을 발견하지 못했다. NCA가 아미노산의 유리아민과 반응하면, 이산화탄소가 즉시 유리되고, 디펩타이드가 유리아민을 함유한 채로 형성된다. 이어서, 이러한 아민은 또다른 NCA와 반응하여 트리펩타이드 등을 형성할 수 있다. 이 반응은 아미노산 N-카르복시무수물이 폴리 α-아미노산의 형성에서 광대한 사용을 찾아내게 하였지만 차후의 폴리펩타이드 형성에서 이들의 사용을 실제적으로 배제되었다. Hirschmann 등 (The Controlled Synthesis of peptides in Aqueons Medium. Ⅷ.; The Preparation and use of Novel α-Amimo Acid N-Carboxyanhydrides; J.A.C.S.,93:11, 1971년, 2746-2774페이지)은 반응혼합물의 온도, pH, 염, 유기용매의 조심스런 조절에 의하여 수성-유기용매계에서 디- 및 트리펩타이드의 제조를 위해 아미노산 N-카르복시무수물의 사용에 성공했다. 그렇지만, 이 과정은 상기에 기재된 NCA's의 화학반응 때문에 작은 펩타이드들로 제한된다. 또한, 이들 용액 상반응으로부터 얻어진 생성물들은 더 큰 펩타이드들의 제조에 사용하기에 앞서 광범위하게 정제되어야 한다.
N-메틸, N-벤질, N-아세틸, N-니트로페닐술펜일, N-크산티닐, 4,4'-디메틸벤즈히드릴, 트리틸 등과같은 여러 가지의 N-치환된 아미노산 N-카르복시무수물들이 문헌에 보고되어왔다. 이들중 몇몇의 치환된-NCA's는 배열 펩타이드합성 및 특히 고체상 펩타이드합성을 위한 것으로 제의되어왔지만, 펩타이드화학에 의한 일반적인 사용에 대한 승인을 전혀 받지 못했다.
Kricheldorf씨 (Angew. Chem. Acta
Figure kpo00002
, 86-87, (1978년))는 배열 폴리펩타이드 합성시에 사용하기 위한 0-니트로페닐설펜일(NPS) 치환된NCA's의 사용을 제안했다. 이들은 트리에틸아민의 존재하에 o-니트로페닐설펜일클로라이드와 N-카르복시무수물의 반응에 의해서 제조된다. 이어서, 트리에틸아민은 NPS-NCA's의 라세미화를 촉진한다고 밝혀졌다. 그밖에, NCA에 관한 트리에틸아민의 작용 때문에 소중함은 NPS-NCA합성동안에 매우 엄격한 반응조건 (즉, 0℃ 이상의 온도, 및 반응혼합물에 대하여 트리에틸아민의 매우 느린부가)들이 이용되어야 한다는 것을 필요로한다. 결과적으로, Halstrom씨등 (Z. Physiol. Chem.355 , 82-84,(1974)은 NPS-아미노산과 포스겐의 반응에 의해 NPS-NCA's의 합성을 제안하였지만 그 수율은 매우 낮았다(약20%). 제조되면 NPS-NCA's는 저장하기 어렵고, 축합 동안 보호그룹을 새어나오게 하기 쉽기 때문에, 다중 커플링 및 다른 부반응들이 일어난다. 또한 결과의 NPS 보호된 펩타이드의 질소는 실제적인 친핵성도를 갖기 때문에 추가의 축합반응을 치룰수 있다.
Block 및 Cox 씨 (Peptides, Proc. of the 5th Europ. Symp., Oxford, September 1962, Pergmon Press 1963, Ed. G. T. Young, pp 84-87)는 펩타이드 합성시에 사용하기 위한 N-트리틸 아미노산-N-카르복시무수물의 사용을 제안하였지만, 이들은 가장 간단한 N-트리틸아미노산 NCA's(즉, 글리신 및 알라닌) 밖에는 제조할 수가 없었다. 이들 화합물들은 N-트리틸-아미노산과 포스겐의 반응에 의해서 제조되었다. 이런 과정에 의하여, 또한, 이들은 N-아세틸-글리신-NCA를 제조할 수 있었다. 이들 연구원들은 t-부틸옥시카르보닐글리신 N-카르복시무수물 및 벤질옥시카르보닐글리신 N-카르복시무수물의 잠재적인 유용성을 인정했지만 이들을 제조하기 위한 그들의 시도는 성공적이지 못했고 우레탄-보호된 아미노산 N-카르복시무수물은 제조될 수 없는 것으로 판단했다. N-트리틸-NCA's가 제조될 수 있다손 치더라도 여러 축합방법들에서 아미노산들의 트리틸보호의 사용은 트리틸그룹에 의해 부과된 상당한 입체 장애 때문에 낮은 수율을 산출한다. 또한, 트리틸그룹은 산에 대하여 아주 민감하기 때문에 트리틸-NCA의 제조를 어렵게 만들고 또한, Halstroem Kovacs씨 (Acta Chemica Scandinavica, Ser. B 1986 BYO (6), 462-465 및 미국특제 4,267,344 호)는 N-보호된 아미노산 N-카르복시무수물의 이점 및 잠재적인 유용성을 인정했으며 펩타이드합성에 사용하기 위해 필요한 모든 요건들을 만족시킨다고 느껴지는 몇몇의 N-치환된 NCA's를 제조할 수 있었다. 이들의 다수의 9-크산틸 및 관련된 치환된 아미노산 N-카르복시무수물들을 제조할 수 있었다. 이들 화합물들은 환류벤젠, 톨루엔, 크실렌 또는 다른 알킬벤젠 중에서 적절한 NCA와 크산티드롤의 직접 축합에 의해서 제조될 수 있는 것으로 청구되었다. 축합동안에 형성된 물은 공비적으로 제거되었다. 이 과정은 열 및 물에 대한 NCA's의 불안정성 때문에 수율이 낮아지고 생성물이 불순수해진다는 단점이 있다. 또한, 이들 화합물들은 포스겐(또는 포스겐등가물)과 대응하는 9-크산틸-아미노산의 반응에 의해서도 제조될 수 있고 실제로 이런 부류에서 대다수의 N-치환된 NCA's는 이런 과정에 의해 제조되어왔다.
펩타이드 합성에 사용된때 9-크산틸-NCA's는 용액중에서는 50℃에서 5시간 그리고 고체상 합성에서는 25℃에서 24시간과 같이 긴시간을 필요로하여 완만하게 반응한다고 밝혀 졌다. 마찬가지로 이것은 9-크산틸그룹의 입체장애 또는 불활성화 효과 때문이다. 아민그룹의 9-크산틸보호와 관련된 또다른 문제는 커플링반응후에 형성된 9-크산틸아미노산의 질소원자가 여전히 친핵성이고 차후의 축합반응을 치룰 수 있다는 것이다. 또한, 이들 그룹들은 조작동안 새어나오기 쉽다. 따라서, 오늘날까지도, 이런 유형 또는 다른 어떤 유형의 치환된 아미노산 N-카르복시무수물은 펩타이드 합성, 특히 고체상 펩타이드 합성에서의 폭넓은 사용을 찾지못했다.
Kricheldorf씨 (Makromol. Chem. Vol. 178, pp905-909, 1977)는 메톡시카르보닐 글리신 NCA 및 에톡시카르보닐 글리신 NCA의 제조 방법을 제안했다. 그렇지만, 또한 Kricheldorf씨는 이 과정은 입체 장애 때문에 수소이외의 곁사슬을 갖는 아미노산의 우레탄-보호된 NCA's을 생산할 수 없었다고 보고 했다.
그러므로, 본 발명의 목적은 여태까지는 얻을 수 없었던 더 높은 아미노산들의 우레탄-보호된 아미노산 N-카르복시무수물 및 N-티오카르복시무수물을 제공하는데 있다.
본 발명의 또다른 목적은 순수하고, 결정형이고 안정한 우레탄-보호된 N-카르복시무수물 및 우레탄 보호된 N-티오카르복시무수물의 제조과정을 제공하는데 있다.
또한, 본 발명의 목적은 순수하고, 결정형인 우레탄-보호된 아미노산-N-카르복시무수물의 합성반법을 제공하는데 있으며, 이러한 방법은 통상의 폴리펩타이드 합성 이상으로 이래와 같은 주된 이점들을 제공한다:
1) 커플링될 카르복실그룹의 예비활성화가 불필요하기 때문에, 통상의 활성화 분자들에 의해 발생된 부생성물들이 배제된다.
2) N-라세미화를 억제하는데에 N-히드록시벤조트리아졸과 같은 첨가물들이 필요없다.
3) 커플링반응으로부터 공동생성물은 이산화탄소뿐이다.
4) 이들 N-보호된 카르복실 활성화된 아미노산들은 안정하고, 저장할 수 있고 결정형인 물질이기 때문에, 펩타이드 결합 형성반응이전에 활성화, 여과, 및 커플링에 대한 필요성을 배제함에 의해서 자동화된 펩타이드합성장치에서 고체상 및 액체상 펩타이드 합성양자를 촉진하고 단순화시킨다. 용액을 제조된 펩타이드들의 정제는 커플링제에 의해 제조된 부생성물들의 결핍 때문에 이들 신규 화합물들의 사용에 의해 크게 촉진된다.
5) 이 과정은, 커플링 후, 통상의 기법들에 의해 조작될 수 있는 성장 펩타이드사슬의 아미노 관능기상에 폭넓게 수용된 우레탄-보호그룹들을 제공할 수 있다.
[발명의 요약]
이들 목적들은 다음 구조식을 갖는 우레탄-보호된 아미노산-N-카르복시무수물 또는 N-티오카르복시무수물을 의해 달성된다:
Figure kpo00003
상기 식에서 R 및 R'은 수소, 알킬, 시클로알킬, 치환된 알킬, 치환된 시클로알킬, 아릴, 또는 치환된 아릴이고 R 및 R'중 최소한 하나는 수소이외의 것이고 ; R는 알킬, 아릴, 치환된 알킬 또는 치환된 아릴이고 ; Z는 산소 또는 황이고 ; 그리고 n은 0, 1또는 2이다.
바람직한 R, R'및 R그룹들은 C1-C12또는 그이상 탄소수의 알킬그룹(시클로알킬 그룹 포함), C6-C20또는 그 이상 탄소수의 아릴그룹(아르알킬 포함) 및 C7-C20또는 그 이상 탄소수의 알카릴그룹이다. 적당한 알킬그룹의 예로는 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 이소부틸, 부틸, t-부틸, 핵실, 시클로펜틸, 시클로핵실, 헵틸, 옥틸 등이 있다. 적당한 아릴그룹의 예로는 페닐, 메틸페닐, 에틸페닐, 나프틸, 메틸 나프틸, 안트라실 등이 있다. 적당한 아르알킬그룹의 예로는 벤질, p-메톡시벤질, p-플루오르에닐메틸, 페닐에틸 등이 있다. 적당한 알카릴그룹들로는 토릴, 에틸페닐, 이소프로필페닐 등이 있다. 또한, R, R'및 R그룹들은 플루오로, 메톡시, t-부톡시, 카르복실, 아미도, 벤질옥시, 히드록시, 치환된 아미노, 치환된 히드록시, 황, 치환된 황, 클로로, 브로모등과 같은 비간섭그룹들로 치환될 수 있다. 대표적으로 R 및 R'은 아미노산 또는 그 유사체들의 α-탄소원자(곁사슬)에 부착된 보호 또는 비보호된 그룹들이다.
대부분의 경우에 있어서 보통 R 또는 R'중의 하나는 H이면서 다른 것은 리신, 루신, 아르기닌, 세린, 아스파르트산, 알라닌, 아스파라긴, 시스테인, 시스틴, 글루탐산, 히스티딘, 글루타민, 이소루신, 메티오닌, 노르루신, 오르니틴, 페닐알라닌, 트레오닌, 트립토판, 티로신, 발린, β-알라닌, 호모세린 등과 같은 아미노산의 α-탄소원자 상의 곁사슬이다. 이와 같은 곁사슬의 예로는 아래와 같은 것들이있다.
Figure kpo00004
Figure kpo00005
이들 곁사슬들은 보통 이용된 아미노, 히드록시, 티올 및 카르복시 보호그룹과 같은, 당업자에게 잘 알려져있는 보호그룹 및 공통기법들을 사용하여, 불필요한대로 보호될 수 있다. 또한, 본 발명의 화합물들은 예컨대 R 또는 R'중 하나가 -CH2CH3이고 다른 것이 메틸인 경우의 이소발린의 경우에서와 같이 R 및 R'양자가 아미노산의 α-탄소상에 부착된 곁사슬인 경우를 포함한다.
또한, 본 발명의 화합물들은, 예컨대 1-아미노-1-시클로핵산 카르복실산의 경우에서와 같이, R 및 R'가 고리형구조의 부분인 경우를 포함한다.
또한, 본 발명의 화합물들은 R 또는 R'그룹으로부터의 탄소 원자들이 시클릭링(cyolic ring)의 부분인 경우의 오르토-아미노벤조산 또는 1-아미노-2-카르복시 시클로헥산과 같은 예를 포함한다.
본 발명의 또다른 측면은 N-보호된 아미노산 성분이 보호기 제거되고 보호기 제거된 아미노산 성분이 제2의 유사 또는 비유사한 활성화된 N-보호된 아미노산 성분과 반응하고 원하는 펩타이드가 얻어질때까지 이러한 과정이 반복되는 폴리펩타이드의 합성에 있어서의 개량을 포함하는데, 이러한 개량은 다음 구조식을 갖는 화합물을 상기의 반응들중의 최소한 한 반응에 활성화된 N-보호된 아미노산 성분으로 사용하는 것으로 이루어진다.
Figure kpo00006
상기식에서 R, R1',R, Z 및 n은 상기에 정의된 바와 같다.
여전히 본 발명의 또다른 측면은 N-보호된 아미노산 성분이 상기의 아미노산 성분의 카르복실말단과 반응성있는 치환기들을 함유하는 불용성 고체지지체에 축합반응에 의해 커플링되고, 커플링된 N-보호된 아미노산성분이 보호기 제거되고, 제2의 유사 또는 비유사한 활성화된 N-보호된 아미노산 성분이 상기의 보호기 제거된 아미노산 화합물에 커플링되고, 원하는 폴리펩타이드가 얻어질때까지 공정이 반복되는 경우의 불용성 고체지지체상에서 폴리펩타이드 사슬의 고체상 합성에 있어서의 개량을 포함하는데, 상기의 개량은 다음 구조식을 갖는 화합물을 상기 반응들중의 한 반응에서, 활성화된 N-보호된 아미노산 성분으로 사용하는 것으로 이루어진다:
Figure kpo00007
상기식에서, R, R',Z 및 n은 상기에 정의된 바와 같다.
본 발명의 그밖의 구체예로는 다음 구조식(1)를 갖는 아미노산 N-카르복시무수물과 다음 구조식(2)를 갖는 할로포름에이트(또는 아지도 포름에이트와 같은 다른 적당한 반응성의 포름에이트)를 N-메틸모르폴린의 존재하에서 무수조건하에 불활성 희석제중에서 반응시키는 것으로 이루어진, 본 발명의 우레탄-보호된 아미노산-N-카르복시무수물을 제조하는 방법이다:
[구조식 1]
Figure kpo00008
[구조식 2]
Figure kpo00009
상기식에서, R, R',Z 및 n은 상기에 정의된 바와 같고, X는 염소, 브롬, 볼소 또는 이지드등이고, R'은 알킬, 아릴, 또는 아르알킬이다. 놀랍게도, 이러한 반응시에 불활성 희석제 및 무수조건을 이용하고 염기로서 메틸모르폴린을 선택하면 N-카르복시무수물의 중합이 회피되고 그렇지않으면 여태까지 얻어질 수 없었던 더높은 아미노산의 우레탄-보호된 NCA's 및 NTA's의 제조가 가능하다는 것이 발견되었다.
[발명의 상세한 설명]
본 발명의 N-우레탄 보호된 NCA's 및 NTA's의 제조를 위한 출발물질로서 이용되는 아미노산 N-카르복시무수물(NCA's) 및 N-티오카르복시무수물(NTA's)는 당업자에게 잘 알려져있는 다수의 과정들에 이해 제조될 수 있다. 예를들어, 다음 문헌 [Fuller 등, Bioplymers 15, No. 9. 1869-1871 (1976); Kricheldorf, Chem. Ber. 104, 87-91 (1971); 및 Halstrom 및 Kovacs, Acta Chemica Scandinavica, B40, 462-465 (1986) ]을 참조하자.
일반적으로 우레탄들은 친핵성 원자들을 위한 보호그룹으로 사용될 수 있지만, 예컨대 t-부틸옥시카르보닐(Boc); 벤질옥시카르보닐(cbz) ; 및 9-플루오로메틸옥시카르보닐과 같이 단지 소수만이 펩타이드 합성에서의 폭넓은 사용을 찾았다. 따라서, 이들 보호그룹들로 치환된 아미노산 N-카르복시무수물 또는 N-티오카르복시무수물은 특별한 중요성이 있다. 따라서, 펩타이드 합성을 위한 매우 중요한 분자들은 다음 구조식들을 갖는 것과 같이, 상기된 보호 그룹들중 한 그룹에 의해 보호된 L-α-아미노산의 NCA's이다.
Figure kpo00010
상기식에서 R은 α-아미노산의 곁사슬이고, Z는 0 또는 S이고, X는 메톡시, 클로로 등이다.
앞서 언급된 바와 같이, 본 발명의 N-우레탄 보호된 NCA's는 Block 및 Cox 씨 (Peptides, Proc. of the 5th Europ, Symp., Oxford, September 1962 , Pergamon Press 1963, Ed. G. T. Young. pp. 84-87)에 의해 발표된 바와 같은, 포스겐과 N-우레탄 보호된 아미노산의 반응에 의해서는 얻어질 수 없으며, 뿐만아니라 더 높은 아미노산의 N-우레탄 보호된 NCA's는 Kricheldorf씨 (Makromol. Chem. Vol. 178. pp 905-939, 1977)에 의해 발표된 합성에 의해서는 얻어질 수 없다. 우레탄-보호된 NCA's 및 NTA's는 염기로서 3차아민의 사용과 함께 무수물 비간섭용매 중에서, 적절한 할모포름에이트와 이미 합성된 NCA 또는 NTA의 반응에 의해서 제조될 수 있다는 것이 발견되었다. 바람직하게 이 반응은 실온아래에서 수행된다. 반응을 위해 유용한 용매로는 테트라히드로 푸란, 에틸 아세테이트, 메틸렌 클로라이드, 톨루엔, 벤젠, 디옥산 등이 있다.
따라서, 본 발명의 신규한 우레탄-보호된 아미노산 N-카르복시무수물 및 N-티오카르복시무수물은 톨루엔과 같은 비간섭 용매중에 NCA를 녹이고 이 용액을 교반과 함께 냉각함에 의해서 제조될 수 있다. 이어서 원하는 포롬에이트(예, 벤질클로로포름에이트)가 한꺼번에 부가된다. 이 혼합물에, 축합을 증진하고 반응동안에 형성된 염산을 포착하는 3차아민염기(예, 트리에틸아민, 디이소프로필에틸아민, N-메틸 모르폴린, 등)가 부가된다. 놀랍게도 본 발명자들은 N-메틸모르폴린 및 N-에틸모르폴린과 같은 특정한 3차아민염기는 NCA's의 중합을 증진하지 않는다는 것을 발견하였다. 이와 같은 바람직한 염기들은 NCA 중합을 증진하지 않기에 충분히 낮은 pK를 갖지만 NCA와 할로포름에이트의 반응에 촉매작용을 하기에 충분히 높은 pk를 갖는 것들이다. 따라서, 이들 바람직한 염기들중의 한 염기가 축합반응에 사용되는 경우, 중합은 개시되지 않는다. 중합의 걱정이 없기 때문에, 염기가 과량으로 사용될 수 있고 결과의 우레탄-보호된 NCA's가 결정화에 의해 쉽게 단리된다.
이와 같은 발견들의 결과로서, 수분배제에 대한 단지 최소의 주의로서 실제적으로 어떠한 우레탄-치환된 NCA (또는 NTA)가 고슈율로 쉽게 제조될 수 있다. 이 방법은 쉽게 늘어나며, 크게 결정형이고 간단하 기법(즉, 결정화)에 의해 쉽게 정제될 수 있고 저장에 대하여 안정한(최소한 6개월 및 임의로 더 오랜동안 25℃에서 안정함) 생상물들을 제공한다. 따라서, 이들 물질들은 칭량, 운송, 및 분해 없이 펩타이드 합성에 사용하기 위해 저정될 수 있다.
다른 N-치환된 NCA's에 대하여 우레탄-보호된 NCA's가 제공하는 주된 이점은 이들 우레탄-보호된 NCA's가 펩타이드 결합을 형성하기 위해 사용된 후에 결과의 펩타이드가 펩타이드 합성에서 보통 사용된 폭넓게 수용된 우레탄 보호 그룹들중의 한 그룹의 의해 N-말단상에서 보호된다는 것이다. 이들 보호그룹들은 성장 펩타이드 사슬의 아민그룹에 대하여 가장 유용한 보호를 제공하는 것으로 당업자들에게 잘 알려져있다.
따라서, 우레탄-보호된 N-카르복시무수물의 사용은 비치환된 NCA's의 모든 이점(고반응성, 원치않는 재배열 생성물들의 형성이 없음, 그리고 부산물로서 CO2만이 있음)을 제공하지만 조심스럽게 제어된 수성조건으로 이들의 사용을 제한하는 비치환된 NCA's의 단점 (즉, 불안정성, 중합, 그리고 다중축합)이 전혀 없다. 따라서, 본 발명은 안정하면서도 크게 반응성이 있는 예비활성화된 생성물을 제공하므로 펩타이드 결합 형성동안에 최소의 부산물들을 산출한다. 또한 본 발명은 축합반응 후에 펩타이드의 N-말단의 질소원자상에 폭넓게 수용되었으며 잘 이해된 보호를 제공한다.
본 발명의 우레탄-보호된 아미노산-N-카르복시무수물들은 일련의 보호기제거 및 커플링반응을 사용하는 고전적인 방법들에 의해 폴리펩타이드의 합성에 사용될 수 있지만, 의심할 여지없이 이들은 고체상 폴리펩타이드 합성에서 더 방대한 사용을 찾을 수 있다. 본 명세서 및 특허청구의 범위에 사용된 것으로 용어 폴리펩타이드 및 펩타이드 및 단백질을 포함하는 것으로 이해하여야 한다. 또한, 본 발명은 우레탄-보호된 아미노산-N-카르복시무수물 이외에 N-보호된 아미노산이 이용될 뿐만아니라 본 발명의 최소한 하나의 우레탄-보호된 NCA가 이용되는 배열 펩타이드 합성을 계획한 것임을 이해하여야 한다. 그렇지만 실제적으로, 각각의 배열에서 사용된 N-보호된 아미노산 성분은 본 발명의 우레탄-보호된 NCA's에 비해 더 많이 사용될 것이다.
고체상 펩타이드 합성에서, 유리하게 비이드의 형태인 불용성 고체상 지지체 또는 매트릭스가 사용된다. 이와 같은 고체 지지체들은 폴리펩타이드들의 합성을 위한 통상적으로 이용되어온 고체상 중합체 기질중의 어떤 것일 수 있다. 이와 같은 중합체 수지들중의 대표적인 것은 아미노산 성분들과의 커플링을 위해 반응성 부위들은 본래 함유하거나 또는 위와 같은 반응성 부위들이 제공될 수 있는 교차결합된 폴리스티렌 수지, 유리비이드, 점토, 니트로셀룰로오스, 교차결합된 덱스트란, 폴리아크릴아미드, 폴리아미드수지 및 유사한 불용성 고체 지지체이다.
필요하다면, 본 발명의 고체상 폴리펩타이드 합성은 초대기압을 사용할 필요없이, 참고문헌인 미국특허 제4,192,798호에 기재된 바와 같이 압력하에서 흐름반응기내에서 수행될 수 있다.
펩타이드의 고체상 합성을 출발하기전에 몇몇의 예비조작이 필요하다. 우선, 제의된 펩타이드 사슬의 C-말단 아미노산 성분을 함유하는 지지수지가 제조되어야 한다. 이것은 당업자에게 알려져있는 다수의 과정들중의 어떤 과정에 의해 달성될 수 있다. 다수의 고체 지지체들에 연결된 이들 N-보호된 아미노산들의 대부분은 상업적인 물품으로서 원한다면 구입할 수도 있다.
원하는 폴리펩타이드 배열을 형성하기 위한 그 나머지 합성은 아래와 같이 수행된다. 제2아미노산 잔기의 커플링이 일어나기전에, 지지체상에 이미 존재하는 제1잔류물은 보호기 제거되어야 한다. 수지상의 제1아미노산 잔기의 보호기제거 뿐만아니라 나중에 커플링된 아미노산 잔기의 보호기제거는 보호된 아미노산 잔기를 적절한 보호기 제거제와 접촉시킴에 의해서 수행될 수 있다. 이런 목적에 이용된 보호기제거제는 펩타이드 합성의 당업자들에게 잘 알려져 있으며 어떤 소정의 경우에 이용된 특정한 보호기제거제는 물론 아미노산/수지상의 보호그룹에 의존할 것이다. 예를들어, 보호그룹이 t-부틸옥시카르보닐인 경우, 디클로로메탄중의 트리플루오로아세트산 또는 디옥산과 같은 적당한 용매중의 염산이 사용될 수 있다. 다른 한편으로, 보호그룹이 9-플루오로에닐메틸옥시카르보닐인 경우, DMF 중의 피페리딘과 같은 염기성조건이 바람직한 방법일 것이다. 용매중의 특정한 보호기제거제의 농도는 이용된 특정한 보호기제거제에 의존하여 다양할 수 있지만 보통은 약 5 내지 50부피%의 범위일 것이다.
보호기제거 단계후, 과량의 보호기제거제를 제거하기 위하여 수지는 적당한 용매로 세척된다. 보호기제거제가 산인 경우, 수지상의 펩타이드는 디클로로메탄과 같은 용매중에서 트리에틸아민과 같은 적절한 염기로 세척함에 의해서 중화되어야 한다. 어떤 과량의 트리에틸아민 및 형성된 트리에틸암모늄 클로라이드 또는 트리플루오로아세테이트는 디클로로메탄 또는 디메틸포롬아미드와 같은 적당한 용매로 반복 세척함에 의해서 제거될 수 있다. 이렇게 제조된 유리아민은 다음의 N-보호된 아미노산과의 커플링을 위해 사용될 수 있다.
다음의 N-보호된 아미노산이 본 발명의 우레탄-보호된 아미노산 N-카르복시무수물인 경우, 이것은 활성화될 필요는 없으며 비보호된 수지결합 아미노산을 함유하는 지지체와 직접 반응할 수 있다. 그렇지만 N-보호된 아미노산 성분이 더 통상적인 과정들에 의해 커플링되는 경우에는 우선 활성화시킬 필요가 있다. 즉, 예컨대 아미노산을 무수물로 전환하거나 또는 디시클로핵실카보디아미드, 카보닐디이미다졸 또는 다른 활성화제로 활성화시킴에 의해서 반응성 형태로 전화할 필요가 있다. 일반적으로, 과량의 활성화된 N-보호된 아미노산 성분이 반응에 이용된다.
제1아미노산 성분에 제2의 보호된 아미노산 성분을 커플링한 후, 부착되었으며 보호된 디펩타이드가 보호기 제거되고, 필요하다면 중화되고, 그리고 다음의 아미노산 유도체의 커플링이 실시되기이전에 상기에 기재된 바와 같이 세척된다. 이 과정은 아미노산들의 원하는 배열이 불용성 지지체상에서 모여졌을때까지 반복된다.
우레탄 보호된 NCA 커플링에서 원치않는 부반응 및 부산물(CO2만이 존재함)이 없기 때문에, 그리고 이들의 안정성 때문에, 커플링반응에 사용된 과량의 우레탄 보호된 NCA는 쉽게 회수되고, 재결정화되어 재사용될 수 있고, 그래서 이들 물질들의 코스트 유효성이 현저하게 증가된다.
완성된 펩타이드 예컨대 무수불화수소로서의 분열, 에스테르화 교환, 가아미노분해에 의한 것과 같은 표준방법들중의 어떤 방법에 의해 불용성 지지체로부터 제거될 수 있다.
분열후, 결과의 펩타이드 현저하게 균일한 뿐만아니라 정제를 필요로 하지 않거나 또는 최소의 정제를 필요로한다는 것이 밝혀졌다. 부산물들의 매우 낮은 오염 때문에 전체 수득률이 놀라울만큼 높다는 것이 밝혀지고 필요한 정제가 비교적 쉽게 수행될 수 있다. 바람직하게, 이와 같은 정제는 분배 크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피 또는 이들 양쪽 방법의 조합에 의해서 수행된다. 이와 같은 과정은 펩타이드 합성의 당업자에게 잘 알려져있다.
[실시예 1]
염기작용으로서 N-카르복시무수물 분해
A. 발린 N-카르복시무수물(72㎎)을 건조, 증류된 테트라히드로푸란(2㎖)에 녹이고 트리에틸아민(30㎕)을 가한다. NCA의 소멸을 적외선분광계로 추적한다.
B. 발린 N-카르복시무수물(72㎎)을 테트라히드로푸란(2㎖)에 녹이고 N-메틸몰폴린(25㎕)을 가한다. NCA의 소멸을 적외선분광계로 추적한다.
A와 B의 실험결과들을 제1도 그래프에 제시한다.
[실시예 2]
N-(9-플루오르엔일메틸옥시카르보닐)-L-알라닌-N-카르복시무수물
A. L-알라닌(40.3g, 0.45몰)과 포스겐(테트라히드로푸란에 녹인 3.3 용액의 275㎖, 0.90몰)으로 이루어진 혼합물을 4시간동안 62∼42℃의 온도에서 저어준다. 상기 결과로서 생기는 용액을 실온으로 내각시키고, 여과하며 감압하에서 휘발성분을 제거한다. 휘발성분을 제거하고 남게되는 오일을 100㎖의 테트라히드로푸란에 녹이고 저어주면서 300㎖의 핵산을 가한다음-20℃의 온도로 냉각시킨다. L-알라닌 N-카르복시무수물의 스득률은 35.7g (69%)이다.
B. 톨루엔(50㎖)에 녹인 N-메틸몰폴린(8.15g, 80.5밀리몰) 용액을 L-알라닌-N-카르복시무수물(8.84;G, 76.8밀리몰)과 톨루엔(200㎖)에 녹인 염화 9-플루오르엔일메틸옥시카르보닐(19.9;G,76.8 밀리몰)로 이루어진 혼합물(0℃)에 가한다. 그 반응혼합물을 2시간 동안 0℃의 온도에서 저어주고 여과한다. 용매의 부피를 20㎖로 감축하고 10㎖의 핵산을 부가하면 결정화가 일어나 21.4g(82%)의 조생성물 9-플루오르엔일메틸옥시카르보닐-L-알라닌-N-카르복시무수물이 얻어진다. 그 생성물을 찬 디이소프로필 에테르를 사용하여 분쇄하여 정제한 다음 아세트산 에틸/헥산으로 재결정화한다 : 융점 106∼107℃; IR (CH2Cl2) 1870, 1801, 1700cm-1; NMR (CDCl2) δ6.90∼7.80 (m, 8H), 3.95∼4.55 (m, 4H), 1.35 (d, J=7HZ, 3H), C19H15NO5의 원소분석 계산치 : C, 67.65; H, 4.48; N, 4.15, 실측치 : C, 67.73; H, 4.65; N, 4.19.
[실시예 3]
N-(9-플루오르엔일메틸옥시카르보닐)-L-로이신-N-카르복시무수물
A. L-로이신-N-카르복시무수물을 실시예 (ⅡA)에서 설명한 실험절차를 사용하여 78% 수득률로 L-로이신으로부터 제조한다.
B. L-로이신 N-카르복시무수물(9.2g, 58.4밀리몰)과 톨루엔(125㎖)에 녹인 9-플루오르옥실메틸옥시카르보닐(15.1g, 58.4밀리몰)로 이루어진 혼합물을 0℃의 온도로 냉각시키고 20㎖의 톨루엔에 녹인 N-메틸몰폴린(6.5g, 64밀리몰)용액을 적가한다. 그 반응혼합물을 2시간반동안 0℃의 온도에서 저어주고 여과하며 용매의 부피를 20㎖로 감축시킨다. 핵산(480㎖)을 가한다음 그 용액을 밤새도록 -20℃의 온도로 냉각시키면, 18.8g(85%)의 N-(9-플루오르엔일메틸옥시카르보닐)-L-로이신-N-카르복시무수물이 얻어진다. 분석용 샘플은 에테르/염화메틸렌/헥산으로 재결정하여 얻어진다 : 융점 118∼120℃; NMR (CCl4) δ7.35∼7.91 (m,8H), 4.72 (t, J=7HZ, 3H); 4.58(m,3H); 4.37(t, J=7HZ, 1H); 2.05 (m, 2H); 1,09 (t, J=6HZ, 6H).C22H21NO5의 원소분석 계산치 : C, 69.64; H, 5.58; N,3.69, 실측치: C, 69.08; H, 5.97; N, 3.70
[실시예 4]
N-α-(9-플로오르엔일메틸옥시카르보닐)-N-ε-t-부틸옥시카르보닐-L-리신-N-카르복시무수물
A. N-ε-t-부틸옥시카르보닐-L-리신(1.23g, 5.0밀리몰)과 테트라히드로푸란(50㎖)에 녹인 클로로트리메틸실란(1.08g, 10.0밀리몰)으로 이루어진 혼합물을 0℃의 온도로 냉각시키고 5㎖의 테트라히드로푸란에 녹인 트리에틸아민(1.01g, 10.0밀리몰)용액을 적가한다. 상기 혼합물을 2시간반동안 0℃의 온도에서 저어주고 여과하면 15㎖의 테트라히드로푸란에 녹인 포스겐(10밀리몰)용액에 가한다. 상기의 반응온도를 60℃의 온도로 올리고 그 용액을 2시간 동안 저어준다음 밤새도록 주변온도에서 저어준다. 회전식증발에 의해 휘발성분들을 제거하면 0.79g (58%)의 N-ε-t-부틸옥시카르보닐-L-리신-N-카르복시무수물이 얻어진다 : IR(CH2Cl2) 1860, 1795, 1710cm.
B. N-ε-t-부틸옥시카르보닐-L-리신-N-카르복시무수물(0.79g, 2.90밀리몰)과 톨루엔(25㎖)에 녹인 염화 9-플루오르엔일메틸옥시카르보닐(0.75g, 2.90밀리몰)로 이루어진 혼합물을 0℃의 온도로 냉각시키고 톨루엔 (5㎖)에 녹인 N-메틸몰폴린(0.32g, 3.2밀리몰)용액을 적가한다. 상기 반응을 실시예 (Ⅲ B)에서와 같이 조작하면 0.88g(66%)의 N-ε-(9-플푸오르엔일메틸옥사카로보닐)-N-ε-t-부틸옥시카르보닐-L-리신-N-카르복시무수물이 얻어진다 : 융점 81∼85℃. (아세트산 에틸/핵산) ; NMR (CDCl3) δ 7.3∼7.7 (m, 8H), 4. 11∼4.58 (m, 5H), 2.95∼3.20(m, 2H) ; 1.90~1.98(m, 2H) ; 1.90∼1.4 (m, 13H). C27H30N2O7의 원소분석 계산치 : C, 67.65; H, 6.11; N, 5.67, 실측치 : C, 66.33; H, 6.38; N, 5.67.
[실시예 5]
N-벤질옥시카르보닐-알라닌-N-카르복시무수물
아세트산에틸(20㎖)에 녹인 N-메틸목폴린(1.06g, 10.5밀리몰) 용액을 L-알라닌-N-카르복시무수물((ⅡA)로부터 얻어짐) (0.81g, 7.0밀리몰)과 0℃의 온도에서 아세트산 에틸(80㎖)에 녹인 염화벤질옥시카르보닐(1.89g, 10.5밀리몰)로 이루어진 혼합물에 적가한다. 그 반응 혼합물을 0℃의 온도에서 1시간반동안 저어주고 여과하며 그 용액의 부피를 75㎖로 감축시킨다. 헥산(75㎖)을 저어주면서 가한다음 -20℃의 온도로 냉각시키면 1.20g (71%)의 N-벤질옥시카르보닐-N-알라닌-N-카르복시무수물이 얻어진다 : 융점 101∼104℃; NMR (CDCl3) δ 7.33(s, 5H), 5.27 (s, 2H), 4.60 (q, J=7Hz, 1H), 1.61 (d, J=7Hz, 3H). C12H11NO5의 원소분석 계산치 : C, 57.83; H, 4.45; N, 5.62, 실측치 : C, 57.60; H, 4.50; N,5.53.
[실시예 6]
N-벤질옥시카르보닐-L-로이신-N-카르복시무수물
아세트산에틸(10㎖)에 녹인 N-메틸몰폴린(0.76g, 7.50밀리몰) 용액을 L-로이신-N-카르복시무수물(0.79g, 5.0밀리몰) ((Ⅲ A)로부터 얻어짐)과 0℃의 온도에서 아세트산에틸(50㎖)에 녹인 염화벤질옥시카르보닐 (1.35g, 7.50밀리몰)에 적가한다. 그 반응혼합물을 0℃의 온도에서 1시간 15분동안 저어주고, 여과하며 그 용액의 부피를 50㎖로 감축시킨다. 헥산(50㎖)을 가한다음 -20℃의 온도로 냉각시키면 0.89g (61%)의 N-벤질옥시카르보닐-N-로이신-N-카르복시무수물이 얻어진다 : 융점 72∼73.5℃(에테르/헥산); NMR (CDCl3) δ 7.40 (s, 5H), 5.33 (s, 2H), 4.71 (t, J=6Hz, 1H), 1.80∼2.04 (m, 3H) 0.91 (m, 6H). C15H17NO5의 원소 분석 계산치 : C, 61.84; H, 5.58; N, 4.81, 실측치 : C, 61.64; H, 6.02; N, 4.90.
[실시예 7]
N-페닐옥시카르보닐-발린-N-카르복시무수물
A. L-발린-N-카르복시무수물을 실시예 (ⅡA)에서 설명한 실험절차에 따라 75% 수득률로 L-발린으로부터 제조한다.
B. 실시예 (Ⅴ)의 방법을 되풀이하고, 단 벤질클로로포롬산염 대신에 페닐클로로포름산염을 그리고 로이신 N-카르복시무수물 대신에 발린 N-카르복시무수물을 사용한다. 상기 반응의 결과 78% 수득률로 N-페닐옥시카르보닐-N-발린-N-카르복시무수물이 얻어진다 : 융점 105∼106℃(클로로포롬/헥산); NMR (CDCl3) δ7.30 (m, 5H), 4.70 (d, J=3.5Hz, 1H); 2.60 (m, 1H); 1.22 (d, J=7Hz, 3H); 1.07 (d, J=7Hz, 3H), 1.07 (d, J=7Hz, 3H). C12H13NO5의 원소분석 계산치 : C, 59.31; H, 4.98; N, 5.32, 실측치 : C, 59.09; H, 4.91; N, 5.49.
[실시예 8]
N-에틸옥시카르보닐-L-알라닌 N-카르복시무수물
실시예 (Ⅴ)의 실험절차를 되풀이하고, 단 클로로포롬산 벤질대신에 클로로포롬산 에틸을 사용한다. 그 결과 62% 수득률의 N-에틸옥시카르보닐-L-알라닌-N-카르복시무수물이 얻어진다 : 융점 72∼73.5℃(아세트산에틸/헥산); NMR (CDCl3) δ4.73 (q, J=7Hz, 2H), 4.33 (q, J=7Hz, 1H), 1.70 (d, J=7Hz,3H), 1.33 (t, J=7Hz, 3H). C7H9NO5의 원소분석 계산치 : C, 44.92; H, 4.85; N, 7.49, 실측치 : C, 45.08; H, 5.03; N, 7.33.
[실시예 9]
벤질옥시카르보닐-L-페닐알라닌-N-카르복시무수물
A. L-페닐알라닌-N-카르복시무수물을 실시예 (ⅡA)의 설명한 실험절차에 따라 53% 수득률로 L-페닐알라닌으로부터 제조한다.
B. 아세트산 에틸(30㎖)에 녹인 N-페닐알라닌-N-카르복시무수물(2.5g, 13밀리몰) 및 벤질클로로포롬산염 (3.4g, 20밀리몰) 용액에 0℃의 온도에서 아세트산에틸(10㎖)에 녹인 N-메틸몰폴린(2.0g, 20밀리몰)용액을 적가한다. 상기 반응결과로서 생기는 혼합물을 0℃의 온도에서 2시간반동안 저어주고 실시예 (Ⅴ)에서 설명한 바와 같이 처리하면 2.0g (4.8%)의 N-벤질옥시카르보닐-L-페닐알라닌-N-카르복시무수물이 얻어진다 : 융점 108∼109.5℃; NMR (CDCl3) δ7.35 (s, 5H), 7.00 (m, 5H), 5.31 (s, 2H) ; 4.83 (m, 1H) ; 3.28 (m, 2H). C18H17NO5의 원소분석 계산치 : C, 68.13; H, 5.40; N, 5.67, 실측치 : C, 68.11; H, 5.38; N, 4.20.
[실시예 10]
페닐옥시카르보닐-L-알라닌-N-티오카르복시무수물
A. o-에틸-s-메틸크산트산염물(50㎖)에 녹인 에틸크산트산칼륨(16.0g, 100밀리몰) 용액에 4±1℃의 온도에서 황산디메틸(12.6g, 100 밀리몰)을 적가한다. 적가를 완전히 끝내자마자 그 반응혼합물을 디클로로메탄(2×40㎖)으로 세척하며 합쳐진 유기성분들을 건조 (MgSO4) 및 농축시킨다. 유상잔류물들 메탄올에 녹여 농축시키면 다음단계에서 사용하기에 충분한 순도를 갖는 o-에틸-s-메틸크산트산염이 얻어진다.
B. 에톡시티오카르보닐-L-알라닌, 실시예 (XA)에서 제조한 o-에틸-s-메틸크산트산염에 L-알라닌(8.9g, 100밀리몰)용액 및 물 (100㎖)에 녹인 NaOH(4.0g,100밀리몰) 용액을 가한다. 그 용액을2시간 18분동안 45℃의 온도를 가열한다. N2을 사용하여 정제하면서, 메탄올(50㎖)을 45℃의 온도에서 42분동안 더 저어준다. 그 반응혼합물을 실온으로 냉각시키고 디클로로메탄(3×25㎖)으로 세척하고 진한 HCl을 사용하여 pH 2.5로 산성화하며 아세트산 에틸 (2×50㎖)로 추출한다. 합쳐진 유기용액을 건조 (MgSO4) 및 농출시킨다. 상기 결과로서 생기는 오일에 헥산을 부가하면 74∼78℃의 온도에서 용융하는 9.5g (54%)의 에틸옥시티오카르보닐-L-알라닌의 무색의 고체로서 얻어진다. 이 물질을 에테르/헥산으로 재결정하여 더 정제한다 : 융점 77-79℃; IR (CCl4) 3397, 1716cm-1.
C. L-알라닌-N-티오카르복시무수물 THF (20㎖)에 녹인 에틸옥시티오카르보닐-L-알라닌(3.0g,17밀리몰) 및 이미다졸(1.2g, 17밀리몰) 용액에 20℃의 온도에서 PBr(5.4g, 20밀리몰)을 적가한다. 고체덩어리가 미세한 현탁액으로 분쇄될 때까지 계속 저어준다. 그 반응혼합물을 포화된 NaHCO3(200㎖) 및 아세트산에틸(150㎖)로 이루어진 혼합물에 붓는다. 유기층을 분리하여 1M HCl (2×1000㎖)으로 세척하고 NaHCO3(100㎖)로 포화시키고 그리고 소금물(100㎖)에 담그고 건조하면 (MgSO4) 농축시킨다. 그 결과로서 생기는 오일을 방치하여 고형화한다. 그 고체를 재결정하면 0.75g (34%)의 L-알라닌-N-티오카르복시무수물이 얻어진다: 융점 91∼92℃; IR (CCl4) 1750, 1659cm-1.
D. 페닐옥시카르보닐-L-알라닌-N-티오카르복시무수술. 50㎖의 아세트산에틸에 녹인 L-알라닌-N-티오카르복시무수술 (0.49g, 3.8몰)용액에 0℃의 온도에서 클로로포롬산 페닐 (0.95g, 6.1밀리몰)을 가한다음 0℃의 온도에서 아세트산 에틸(10㎖)에 녹인 N-메틸몰폴린(0.57g, 5.6밀리몰)용액을 적가한다. 그 결과로서 생기는 혼합물을 0℃의 온도에서 3시간동안 저어주고 여과하며 흰색의 반고체로 농축시킨다. 그 반고체의 물질을 20㎖의 아세트산에틸에 녹이고, 헥산(150㎖)을 가하고, 그리고 그 혼합물을 -20℃의 온도로 냉각시키면 0.55g (62%)의 페닐옥시카르보닐-L-알라닌-N-티오카르복시무수물이 얻어진다: 융점 110-111℃; NMR(CDCl3)δ7.18 (m, 5H), 4.83 (q, 1 H J=7HZ), 1.71 (d, 3 H J=7HZ), IR (CH2Cl2) 1810, 1740(이중선). 1715(쇼울더). C11H9NO4의 원소분석 계산치 : C, 52.58; H, 3.61; N, 5.58; S,12.76 실측치: C, 52.75; H, 3.72; N, 5.36; S, 12.98.
[실시예 11]
N-(9-플루오르엔일메틸옥시카르보닐)-O-t-부틸-L-트레오닌-N-카르복시무수물
A. O-t-부틸-L-트레오닌 N-카르복시무수물을 실시예 (ⅣA)에서 설명한 트리메티실릴 실험절차를 사용하여 57% 스득률로 O-t-부틸-L-트레오닌으로부터 제조한다.
B. 톨루엔(50㎖)에 녹인 O-t-부틸-L-트레오닌-N-카르복시무수물(0.80g, 4.0밀리몰) 및 염화 9-플루오르엔일메틸옥시카르보닐(1.0g, 4.0밀리몰)용액에 0℃의 온도에서 8㎖의 톨루엔에 녹인 N-메틸몰폴린(0.49g, 4.8밀리몰) 용액을 적가한다. 그 반응혼합물을 0℃의 온도에서 3시간동안 저어주고 요과하며 휘발성분을 감압하에서 제거한다. 그 잔류물을 에테르/헥산으로 결정화하면 1.0g (60%)의 N-(9-플로우르엔일메틸옥시카르보닐)-O-t-부틸-L-트레오닌이 얻어진다 : 융점 124∼127℃; NMR (CDCl3) δ7.08∼7.78 (m, 8H), 4.05∼4.61 (m, 4H), 1.18 (s, 9H) ; 1.16 (d, 3H, J=7Hz). C24H25NO6의 원소분석 계산치 : C, 68.07; H, 5.95; N, 3.31, 실측치; C, 67.89; H, 5.96; N, 3.28.
[실시예 12]
에틸옥시카르보닐-α-아미노이소부티르산-N-카르복시무수물
A. α-아미노이소부티르산 N-카르복시무수물을 실시예(ⅡA)에서 설명한 실험절차를 사용하여 67%의 수득률로 제조한다.
B. 실시예(ⅧB)의 실험절차를 되풀이하고, 단 L-알라닌-N-카르복시무수물 대신에 α-아미노이소부티르산 N-카르복시무수물을 사용하면 16% 수득률의 에틸옥시카르보닐-α-아미노이소부티르산 N-카르복시무수물이 얻어진다 : 융점 68∼70℃ (클로로포름/헥산); NMR(CCl4)δ 4.56(q, 2H, J=7Hz), 2.00(s, 6H), 1.6(t, 3H, J=7Hz), C8H11NO6의 원소분석 계산치 : C, 47.76; H, 5.51; N, 6.96, 실측치 : C, 47.67; H, 5.51; N, 7.14.
[실시예 13]
N-t-부틸옥시옥시카르보닐-L-알라닌 N-카르복시무수물
80ml의 아세트산 에틸에 녹인 t-부틸 알코올(1.25g, 16.9밀리몰)과 포그겐(디옥산에 녹인 5M 용액의 3.4ml, 17밀리몰) 용액에 -50℃의 온도에서 N-메틸몰폴린(3.4g, 34밀리몰)을 적가한다. 그 반응혼합물을 30분동안 저어준다. 아세트산 에틸(10ml)에 녹인 L-알라닌-N-카르복시무수물(0.23g, 2.0밀리몰)을 가하고 그 혼합물을 -50℃의 온도에서 45분동안 더 저어준다. N-메틸몰풀린(1.0g, 10밀리몰)을 가하고 -50℃의 온도에서 계속하여 45분동안 더 저어준다. 고체를 여과로 제거하고, 그리고 용액을 농축시키면 헥산으로 분쇄한 후에 생성물이 얻어진다. 톨루엔으로 재결정하면 0.28g(65%)의 N-t-부틸옥시카르보닐-L-알라닌-N-카르복시무수물이 얻어진다 : 융점 103∼104℃; NMR(CCl3)δ 4.71(q, 1H, J=7Hz), 1.80(d, 3H, J=7Hz), 1.70(s, 9H), C8H13NO5의 원소분석 계산치 : C, 50.23; H, 6.09; N, 6.51, 실측치 : C, 50.66; H, 6.36; N, 6.38.
[실시예 14]
N-(t-부틸옥시카르보닐)-O-벤질-세린-N-카르복시무수물
A. O-벤질-L-세린-N-카르복시무수물 실시예(ⅡA)의 실험절차에 따라 68% 수득률로 제조한다.
B. 실시예(ⅩⅢ)의 실험절차를 되풀이하고, 단 L-알라닌-N-카르복시무수물 대신에 O-벤질-L-세린-N-카르복시무수물이 사용하면 52%을 수득률의 N-(t-부틸옥시카르보닐)-O-벤질-L-세린-N-카르복시무수물이 얻어진다 : 융점 98∼99.5℃; NMR(CCl4)δ 7.30(m, sH), 4.64(m, 3H, 벤질 CH2and NCA 고리양성자). 4.09(dd, 1H, J=15,5Hz), 3.88(dd, 1H, J=15, 5Hz), 1.65(s, 9H), C15H19NO6의 원소분석 계산치 : C, 59.80; H, 5.96; N, 4.36, 실측치 : C, 59.71; H, 6.25; N, 4.05.
[실시예 15]
1-아미노-1-시클로헥산카르복실산 N-카르복시무수물의 페닐옥시카르복실 유도체
A. 실시예 11A에 기재된 과정에 따라 1-아미노-1-시클로헥산카르복실산으로부터 1-아미노-1-시클로헥산카르복실산-N-카르복시무수물 50% 수율로 제조했다.
B. 0℃에서 에틸 아세테이트 30ml에 녹아있는 단계 A에서 제조한 N-카르복시무수물(0.85g, 5.0mmol) 및 페닐 클로로포름에이트(1.2g, 7.5mmol)의 용액에, 8ml의 에틸아세테이트에 녹아 있는 N-메틸모르폴린(0.76g, 7.5mmol)의 용액을 부가했다. 그 반응 화합물을 0℃에서 2시간 동안 교반하고, 여과하고, 응축했다. 백색의 반고체 잔류물을 에틸 에테르/메틸렌 클로라이드/헥산으로부터 재결정화하여 0.92g(66%)의 N-카르복시무수물을 얻어진다 : 융점 156.5∼158℃; NMR(CCl3)δ 89.28(m, 5H), 1.20∼3.10(m, 10H); C15H15NO5의 원소에 대한 분석계산값 : C, 62.27; H, 5.23; N, 4.84, 실측값 : C, 62.03; H, 5.22; N, 4.77.
[실시예 16]
N-(9-플루오르에닐메틸옥시카르보닐)-L-루신-N-카르복시무수물
A. 실시예 11A에 기재된 과정에 따라 L-루신으로부터 L-루신-N-카르복시무수물을 70% 수율로 제조했다.
B. 건조증류된 에틸 아세테이트(150ml)에 녹아있는 L-루신 N-카르복시무수물(9.2g, 58.4mmol)의 혼합물을 -10℃까지 냉각하고 20ml의 에틸 아세테이트에 녹아있는 트리에틸아민(9ml, 64mmol)의 용액을 5분에 걸쳐 한방울씩 부가했다. 모든 트리에틸아민을 확실히 중화하기 위하여 디옥신(4.4M, 5ml)에 녹아있는 소량의 무수염산을 부가했다. 반응물을 여과하고 용매를 진공중에서 제거했다. 결과의 조생성물을 에틸에테르에 부가하여, 여과하고, 헥산에 부가한 후 결정화하여 생성물을 얻었다.
세 번의 추가의 조심스런 결정화후에, N-(9-플루오르에닐-메틸옥시카르보닐)-L-루신-N-카르복시무수물을 16% 수율(3.6g)로 얻었다. 분석데이타는 실시예 Ⅲ에서 얻은 것과 본질적으로 같았다.
[실시예 17]
L-루실-L-발린
p-알콕시벤질 알콜 유도체화 2% 교차결합된 폴리스티렌으로 에스테르화된 9-플루오르에닐메틸옥시카르보닐-L-발린(0.25g, 0.13mmol 발린)을 고체상 펩타이드 합성용기에 위치시켰다. 디메틸포름아미드(5ml)를 부가하고 그 슬러리를 30분동안 흔들었다. 디메틸포름 아미드를 제거하고 팽윤된 수지를 디메틸포름아미드 중에서 10% 피페리딘으로 두 번(5ml로 5분간, 그런 다음 5ml로 15분간)처리하여 9-플루오르에닐메틸옥시카르보닐 보호그룹을 제거했다. 그 수지를 디메틸포름아미드(4×5ml)로 씻고 디메틸포름아미드(6ml)중에서 9-플루오르에닐메틸옥시카르보닐-L-루신-N-카르복시무수물(145mg, 0.38mmol)과 45분간 반응시켰다. 플루오르에닐메틸옥시카르보닐 보호그룹을 상기와 같이 제거하고 그 수지를 디메틸포름아미드(3×5ml) 및 메틸렌 클로라이드(3×5ml)로 씻었다. 결과의 펩타이드를 메틸렌 클로라이드/트리플루오로아세트산(6ml, 1/1)으로 45분간 처리하여 수지로부터 분열했다. 용액을 제거하고 수지를 메틸렌 클로라이드(3×5ml) 및 메탄올(2×5ml)로 씻었다. 결합된 용액을 씻고 반고체상태로 진공증발시켜 이것을 증류수에 부가하여 여과했다. 그 수용액을 동결건조시키고, 결과의 고체를 에테르로 3번 부셔서 수지의 오염물을 제거하고 감압하에 건조시켜서 90% 이상 수율의 L-루실-L-발린을 얻는다. 공지의 스탠다드(귀환시간 8.49분)과 공동용리로서 HPLC 분석(유량=1.5ml/qns, 215nm에서 검출, 0.5M과 염소산)에 대해 디펩타이드의 정체를 확인했다. 그 순도는 97% 이상으로 측정되며, 수지에 대한 모든 요염물들은 미소했다. D-루실-L-발린 (회수시간 32분)이 검출될 수 없었다(검출한계 0.1% 이하).
[실시예 18]
L-레우실-L-발린
9-플루렌일메틸옥시카르보닐-L-레우신-N-카르복시무수물을, 용매로서 디메틸포름아미드대신 염화메틸렌(5ml)을 사용하는 수지상에서 L-발린의 유리아민과 반응시킨다는 것을 제외하고는, 실시예 ⅩⅩⅠ를 반복한다. 결과는 실시예 ⅩⅥ에 필적한다.
[실시예 19]
L-레우실-L-알라닐-L-발린(FMOC 공정)
실시예 ⅩⅥ의 공정을 사용하여 L-레우실-L-알라닐-L-발린을 제조한다. 수지로부터 분열하고 에테르로 세척한 다음 삼펩티드를 88% 이상의 수득률로 흰색 고체로서 얻는다. 실시예 ⅩⅥ에서 설명한 조건을 사용한 HPLC 분석은 공지된 표준물과 공동 용리된 생성물의 정체를 입증한다. (체류시간 16.28분) L-레우실-L-발린과 L-알라닐-L-발린 같은 삭제 순서는 검출(검출한계 : 0.1% 이하)되지 않는다.
[실시예 20]
L-레우실-L-알라닐-L-발린(DOC 공정)
메틸화된 2% 가교결합된 플리스티렌 (즉, 메리필드수지) (0.50mg, 0.23mmol 발린)으로 에스테르화된 t-부틸옥시카르보닐-L-발린을 고체상 펩티드 합성용기에 넣는다. 염화메틸렌(5ml)을 부가하고 슬러리를 30분 동안 흔든다. 용매를 제거하고, 수지를 염화메틸렌/트리플루오로아세트산(1/1 용액 6ml)으로 처리하여 t-부틸옥시카르보닐 보호그룹을 제거한다. 수지를 염화메틸렌(3×5ml)으로 세척하고, 염화메틸렌(5ml)에 녹인 10% 트리에틸아민으로 중화하고, 염화메틸렌(3×5ml)으로 세척한 다음 염화메틸렌(5ml)에 녹인 t-부틸옥시카르보닐-L-알라닌-N-카르복시무수물(200mg, 1.0mmol)의 용액과 45분동안 반응시킨다. 결과하는 보호된 이펩티드수지를 염화메틸렌(3×5ml)으로 세척한다. 수지를 다시 보호기제거하고, 세척하고, 중화하고 상기에 설명한 바와 같이 세척한다. 염화메틸렌(6ml)에 녹인 t-부틸옥시카르보닐-L-레우신-N-카르복시무수물(240mg, 1.0mmol)을 수지에 부가하고, 이 혼합물을 45분동안 교반한다. 용액을 제거하고 수지를 염화메틸렌(3×5ml), 메탄올(3×5ml) 및 염화메틸렌(3×5ml)으로 세척하고 감압하에서 건조한다. t-부틸옥시카르보닐로 보호된 삼펩티드수지를 0℃에서 30분동안 액체불화수소와 반응시킨다. 불화수소를 제거하고 그 잔류물을 감압하에서 건조한다. 펩티드를 물에 녹이고 수지를 여과법으로 제거한다. 용액을 동결건조하여 거의 정량의 수득률의 L-레우실-L-알라닐-L-발린을 얻는다. HPIC 분석결과를 실시예(ⅩⅧ)에 필적한다.
[실시예 21]
L-알라닐-L-페닐알라닐(완전보호공정 경우)
A. 0℃에서 테트라히드로퓨란(20ml)에 녹인 L-페닐아라닐 벤질 에스테르 p-톨루엔술폰산염(1.07g, 2.5mmol)에 N-메틸모르폴린(0.25g, 2.5mmol)을 부가한다. 0℃에서 0.5℃시간동안 혼합물을 교반하고 N-벤질옥시카르보닐-L-알라닐-N-카르복시무수물(0.50g, 2.0mmol)을 부가한다. 반응혼합물을 0℃에서 2시간동안 교반하고 물(20ml)과 디클로메탄(50ml)을 부가한다. 층을 분리하고 수용액 층을 디클로로메탄(25ml)으로 세척한다. 결합된 유기부분을 0.5M HCl (2×50ml), 10% 중탄산나트륨(50ml) 및 물(2×50ml)로 세척하고, 건조(MgSO4)하고 응축한다. 헥산의 부가에 근거하여 생긴 결정화(반응)으로 0.66g(72%)의 N-벤질옥시카르보닐-L-알라닐-L-페닐알라닐벤질 에스테르를 얻는다 : 융점 118.5∼119℃; NMR(CDCl3)δ 7.64(s, 1H), 6.82∼7.39(m, 6H), 5.04(s, 2H), 5.00(s, 2H), 4.58∼4.92(m, 2H), 3.07(d, J=6Hz, 2H), 1.29(d, J=7Hz, 3H).
B. N-벤질옥시카르보닐-L-알라닐-L-페닐알라닐 벤질 에스테르(0.50g, 1.1mmol) 및 에틸알코올(150ml) 녹인 10% 팔라듐/C이 혼합물을 20℃에서 6.5시간동안 Parr 수소화반응 장치상에서 교반한다. 반응 혼합물을 여과하고 그 거른액을 물(100ml)로 헹군다. 용액을 응축하여 0.26g(100%)의 L-알라닐-L-페닐알라닐을 얻는다. HPLL 분석은 99% 이상의 순도를 제시하나 라세미화(반응)증거를 전혀 제시하지 않는다.
[실시예 22]
L-알라닐-L-페닐알라닐(부분보호공정 경우)
A. 0.02M 탄산칼륨(20ml)과 아세토니트릴(30ml)에 녹인 L-페닐알라닐(0.33g, 2.0mmol)의 용액에 아세토니트릴(5ml)에 녹인 N-벤질옥시카르보닐-L-알라닐 N-카르복시무수물(0.45g, 1.8mmol)의 용액을 0℃에서 적하방울로 부가한다. 혼합물을 0℃에서 40분동안 교반하고 아세트산에틸(50ml) 및 1M 염산(10ml)으로 희석한다. 층을 분리하고 수용액층을 아세트산 에틸(2×35ml)로 추출한다. 결합된 유기부분을 브롬(30ml), 0.5M 염산 (2×50ml) 및 물(2×50ml)로 세척하고, 건조(MgSO4)하고 응축한다. 잔류물을 클로로포름/헥산으로부터 재결정화하여 0.26g (39%)의 N-벤질옥시카르보닐-L-알라닐-L-페닐알라닐을 얻는다 : 융점 121∼122℃; NMR(DMSO-d6)δ 12.71(s, 1H), 8.06(m, 1H), 7.30(m, 5H), 5.01(s, 2H), 4.43(m, 1H), 4.06(m, 1H), 2.99(m, 2H), 11.9(d, 2H, J=7Hz).
B. N-벤질옥시카르보닐-L-알라닐-L-페닐알라닐(0.208g, 0.562mmol)과 95% 에틸알코올(50ml)에 녹인 10% Pd/C(0.1g)의 혼합물을 20℃에서 16시간동안 Parr 수소화반응 장치상에서 교반한다. 반응 혼합물을 여과분리하고, 거른액을 물(100ml)로 헹군다. 결합된 용액을 응축하여 0.122g(92%)의 L-알라닐-L-페닐알라닐을 흰색 고체로 얻는다. HPLL 분석은 99.5% 이상의 순도를 제기하나 라세미화(반응)증거를 제시하지는 않는다.

Claims (73)

  1. 다음 구조식을 갖는 우레탄-보호된 아미노산-N-카르복시무수물 또는 N-티오카르복시무수물 :
    Figure kpo00011
    상기 식에서, R 및 R'은 수소, 알킬, 시클로알킬, 치환된 알킬, 치환된 시클로알킬, 아릴, 또는 치환된 아릴이고 R 및 R'중 최소한 하나는 수소 이외의 것이고 ; R는 알킬, 아릴, 치환된 알킬 또는 치환된 아릴이고 ; Z는 산소 또는 황이고 ; 그리고 n은 0, 1 또는 2이다.
  2. 제1항에 있어서, R이 C1-C20알킬인 것을 특징으로 하는 우레탄-보호된 아미노산-N-카르복시무수물 또는 N-티오카르복시무수물.
  3. 제2항에 있어서, R가 저급알킬 또는 치환된 저급알킬인 것을 특징으로 하는 우레탄-보호된 아미노산-N-카르복시무수물 또는 N-티오카르복시무수물.
  4. 제3항에 있어서, R이 t-부틸인 것을 특징으로 하는 우레탄-보호된 아미노산-N-카르복시무수물 또는 N-티오카르복시무수물.
  5. 제1항에 있어서, R가 아릴 또는 치환된 아릴인 것을 특징으로 하는 우레탄-보호된 아미노산-N-카르복시무수물 또는 N-티오카르복시무수물.
  6. 제5항에 있어서, R가 페닐 또는 치환된 페닐인 것을 특징으로 하는 우레탄-보호된 아미노산-N-카르복시무수물 또는 N-티오카르복시무수물.
  7. 제1항에 있어서, R가 아르알킬 또는 치환된 아르알킬인 것을 특징으로 하는 우레탄-보호된 아미노산-N-카르복시무수물 또는 N-티오카르복시무수물.
  8. 제7항에 있어서, R가 벤질 또는 치환된 벤질인 것을 특징으로 하는 우레탄-보호된 아미노산-N-카르복시무수물 또는 N-티오카르복시무수물.
  9. 제8항에 있어서, R가 p-메톡시벤질인 것을 특징으로 하는 우레탄-보호된 아미노산-N-카르복시무수물 또는 N-티오카르복시무수물.
  10. 제7항에 있어서, R가 9-플루오르에닐메틸 또는 치환된 9-플루오르에닐메틸인 것을 특징으로 하는 우레탄-보호된 아미노산- N-카르복시무수물 또는 N-티오카르복시무수물.
  11. 제1항 내지 10항 중 어느 한 항에 있어서, R 또는 R'중 최소한 하나가 보호 또는 비보호된 아미노산의 곁사슬인 것을 특징으로 하는 우레탄-보호된 아미노산-N-카르복시무수물 또는 N-티오카르복시무수물.
  12. 제11항에 있어서, R 또는 R'이 알라닌의 곁사슬인 것을 특징으로 하는 우레탄-보호된 아미노산-N-카르복시무수물 또는 N-티오카르복시무수물.
  13. 제11항에 있어서, R 또는 R'이 아르기닌 또는 적당히 보호된 아르기닌의 곁사슬인 것을 특징으로 하는 우레탄-보호된 아미노산-N-카르복시무수물 또는 N-티오카르복시무수물.
  14. 제11항에 있어서, R 또는 R'이 아스파르트산 또는 적당히 보호된 아스파르트산의 곁사슬인 것을 특징으로 하는 우레탄-보호된 아미노산-N-카르복시무수물 또는 N-티오카르복시무수물.
  15. 제11항에 있어서, R 또는 R'이 아스파라긴 또는 적당히 보호된 아스파라긴의 곁사슬인 것을 특징으로 하는 우레탄-보호된 아미노산-N-카르복시무수물 또는 N-티오카르복시무수물.
  16. 제11항에 있어서, R 또는 R'이 시스테인 또는 적당히 보호된 시스테인의 곁사슬인 것을 특징으로 하는 우레탄-보호된 아미노산-N-카르복시무수물 또는 N-티오카르복시무수물.
  17. 제11항에 있어서, R 또는 R'이 시스테인의 곁사을인 것을 특징으로 하는 우레탄-보호된 아미노산-N-카르복시무수물 또는 N-티오카르복시무수물.
  18. 제11항에 있어서, R 또는 R'이 클루탐산 또는 적당히 보호된 클루탐산의 곁사슬인 것을 특징으로 하는 우레탄-보호된 아미노산-N-카르복시무수물 또는 N-티오카르복시무수물.
  19. 제11항에 있어서, R 또는 R'이 글루타민 또는 적당히 보호된 글루타민의 곁사슬인 것을 특징으로 하는 우레탄-보호된 아미노산-N-카르복시무수물 또는 N-티오카르복시무수물.
  20. 제11항에 있어서, R 또는 R'이 히스티딘 또는 적당히 보호된 히스티딘의 곁사슬인 것을 특징으로 하는 우레탄-보호된 아미노산-N-카르복시무수물 또는 N-티오카르복시무수물.
  21. 제11항에 있어서, R 또는 R'이 이소루신의 곁사슬인 것을 특징으로 하는 우레탄-보호된 아미노산-N-카르복시무수물 또는 N-티오카르복시무수물.
  22. 제11항에 있어서, R 또는 R'이 적당히 보호된 리신의 곁사슬인 것을 특징으로 하는 우레탄-보호된 아미노산-N-카르복시무수물 또는 N-티오카르복시무수물.
  23. 제11항에 있어서, R 또는 R'이 루신의 곁사슬인 것을 특징으로 하는 우레탄-보호된 아미노산-N-카르복시무수물 또는 N-티오카르복시무수물.
  24. 제11항에 있어서, R 또는 R'이 메티오니의 곁사슬인 것을 특징으로 하는 우레탄-보호된 아미노산-N-카르복시무수물 또는 N-티오카르복시무수물.
  25. 제11항에 있어서, R 또는 R'이 노르루신의 곁사슬인 것을 특징으로 하는 우레탄-보호된 아미노산-N-카르복시무수물 또는 N-티오카르복시무수물.
  26. 제11항에 있어서, R 또는 R'이 적당히 보호된 오르니틴의 곁사슬인 것을 특징으로 하는 우레탄-보호된 아미노산-N-카르복시무수물 또는 N-티오카르복시무수물.
  27. 제11항에 있어서, R 또는 R'이 페닐알라닌의 곁사슬인 것을 특징으로 하는 우레탄-보호된 아미노산-N-카르복시무수물 또는 N-티오카르복시무수물.
  28. 제11항에 있어서, R 또는 R'이 세린 또는 적당히 보호된 세린의 곁사슬인 것을 특징으로 하는 우레탄-보호된 아미노산-N-카르복시무수물 또는 N-티오카르복시무수물.
  29. 제11항에 있어서, R 또는 R'이 트레오닌 또는 적당히 보호된 트레오닌의 곁사슬인 것을 특징으로 하는 우레탄-보호된 아미노산-N-카르복시무수물 또는 N-티오카르복시무수물.
  30. 제11항에 있어서, R 또는 R'이 트립토판 또는 적당히 보호된 트립토판의 곁사슬인 것을 특징으로 하는 우레탄-보호된 아미노산-N-카르복시무수물 또는 N-티오카르복시무수물.
  31. 제11항에 있어서, R 또는 R'이 티로신 또는 적당히 보호된 티로신의 곁사슬인 것을 특징으로 하는 우레탄-보호된 아미노산-N-카르복시무수물 또는 N-티오카르복시무수물.
  32. 제11항에 있어서, R 또는 R'이 발린의 곁사슬인 것을 특징으로 하는 우레탄-보호된 아미노산-N-카르복시무수물 또는 N-티오카르복시무수물.
  33. 제11항에 있어서, R 또는 R'이 호모세린 또는 적당히 보호된 호모세린의 곁사슬인 것을 특징으로 하는 우레탄-보호된 아미노산-N-카르복시무수물 또는 N-티오카르복시무수물.
  34. N-9-플루오르에닐메틸옥시카르보닐-L-루신-N-카르복시무수물.
  35. N-9-플루오르에닐메틸옥시카르보닐-L-알라닌-N-카르복시무수물.
  36. N-α-(9-플루오르에닐메틸옥시카르보닐)-N-ε-t-부틸옥시카르보닐-L-리신-N-카르복시무수물.
  37. N-벤질옥시카르보닐-L-알라닌-N-카르복시무수물.
  38. N-벤질옥시카르보닐-L-루신-N-카르복시무수물.
  39. N-페닐옥시카르보닐-L-발린-N-카르복시무수물.
  40. N-에틸옥시카르보닐-L-알라닌-N-카르복시무수물.
  41. N-벤질옥시카르보닐-L-페닐알라닌-N-카르복시무수물.
  42. N-페닐옥시카르보닐-L-알라닌-N-티오카르복시무수물.
  43. N-(9-플루오르에닐메틸옥시카르보닐)-O-t-부틸-L-트레오닌-N-카르복시무수물.
  44. N-9-플루오르에닐메틸옥시카르보닐-β-알라닌-N-카르복시무수물.
  45. N-t-부틸옥시카르보닐-L-알라닌-N-카르복시무수물.
  46. N-(t-부틸옥시카르보닐)-O-벤질-N-세린-N-카르복시무수물.
  47. N-페닐옥시카르보닐-1-아미노-1-카르복시시클로헥산-N-카르복시무수물.
  48. N-에틸옥시카르보닐-α-아미노이소부티르산-N-카르복시무수물.
  49. 아미노산 성분을 제2의 유사 또는 비유사한 아미노산 성분과 반응시키고 원하는 폴리펩타이드가 얻어질 때까지 과정을 반복하는 폴리펩타이드 사슬의 합성방법에 있어서, 다음 구조식을 갖는 화합물을 상기 반응들 중의 최소한 한 반응시에, 보호된 아미노산 성분으로 사용하는 것을 특징으로 하는, 폴리펩타이드 사슬의 합성 방법 :
    Figure kpo00012
    상기 식에서, R 및 R'은 수소, 알킬, 아릴, 치환된 알킬, 또는 치환된 알릴이고 ; R은 알킬, 아릴, 치환된 알킬 또는 치환된 아릴이고 ; Z는 산소 또는 황이고 ; 그리고 n은 0, 1 또는 2이다.
  50. 제49항에 있어서, 보호된 아미노산 성분인 R이 C1-C20알킬 또는 치환된 알킬인 제1항에 따른 우레탄-보호된 아미노산-N-카르복시무수물 또는 N-티오카르복시무수물인 것을 특징으로 하는 방법.
  51. 제50항에 있어서, R가 저급알킬 또는 치환된 저급알킬인 것을 특징으로 하는 방법.
  52. 제50항에 있어서, R이 t-부틸인 것을 특징으로 하는 방법.
  53. 제49항에 있어서, R이 아릴 또는 치환된 아릴인 것을 특징으로 하는 방법.
  54. 제53항에 있어서, R이 페닐 또는 치환된 페닐인 것을 특징으로 하는 방법.
  55. 제49항에 있어서, R이 아르알킬 또는 치환된 아르알킬인 것을 특징으로 하는 방법.
  56. 제55항에 있어서, R이 벤질 또는 치환된 벤질인 것을 특징으로 하는 방법.
  57. 제55항에 있어서, R이 p-메톡시벤질인 것을 특징으로 하는 방법.
  58. 제55항에 있어서, R이 p-플루오르에닐메틸 또는 치환된 p-플루오에닐메틸인 것을 특징으로 하는 방법.
  59. 제59항 내지 57항 중 어느 한 항에 있어서, R 또는 R 중의 최소한 하나는 보호 또는 비보호된 아미노산의 곁사슬인 것을 특징으로 하는 방법.
  60. 아미노산 성분의 카르복실 말단과 반응성이 있는 치환체 그룹들을 함유하는 지지체에 보호된 아미노산 성분을 축합반응으로 커플링시키고, 커플링된 보호된 아미노산 성분을 보호기제거하고, 필요하다면 중화하고, 그리고 상기의 보호기제거된 아미노산 성분에 제2의 유사 또는 비유사한 보호된 아미노산 성분을 커플링시키고, 그리고 원하는 폴리펩타이드가 얻어질 때까지 과정을 반복하는, 불용성 또는 가용성 지지체상에서 폴리펩타이드 사슬의 고체상 합성방법에 있어서 다음 구조식을 갖는 화합물을 상기의 반응들 중의 최소한 한 반응시에, 보호된 아미노산 성분으로 사용한 것을 특징으로 하는 방법.
    Figure kpo00013
    상기 식에서, R 및 R'은 수소, 알킬, 시클로알킬, 치환된 알킬, 치환된 시클로알킬, 알릴, 또는 치환된 아릴이고 ; R은 알킬, 아릴, 치환된 알킬 또는 치환된 아릴이고 ; Z는 산소 또는 황이고 ; 그리고 n은 0, 1 또는 2이다.
  61. 제60항에 있어서, R가 C1-C20알킬 또는 치환알킬인 방법.
  62. 제61항에 있어서, R가 저급알킬 또는 치환저급알킬인 방법.
  63. 제62항에 있어서, R가 t-부틸인 방법.
  64. 제60항에 있어서, R가 아릴 또는 치환아릴인 방법.
  65. 제64항에 있어서, R가 페닐 또는 치환페닐인 방법.
  66. 제60항에 있어서, R가 아르알킬 또는 치환아르알킬인 방법.
  67. 제66항에 있어서, R가 벤질 또는 치환벤질인 방법.
  68. 제66항에 있어서, R가 p-메톡시벤질인 방법.
  69. 제66항에 있어서, R가 9-플루오르에닐메틸 또는 치환9-플루오르에닐메틸인 방법.
  70. 제60 내지 69항 중 어느 한 항에 있어서, R 또는 R' 중 적어도 하나가 보호 또는 비보호된 아미노산의 측쇄인 방법.
  71. 하기 일반식(2)의 아미노산 N-카르복시무수물 또는 N-티오카르복시무수물을 하기 일반식(3)의 할로포르메이트와, 무수조건 및 3차 아민염기 존재하의 불활성 희석액중에서 반응시킴을 특징으로 하는, 하기 일반식(1)의 우레탄-보호된 아미노산 N-카르복시무수물 또는 N-티오카르복시무수물의 제조방법.
    [일반식 1]
    Figure kpo00014
    [일반식 2]
    Figure kpo00015
    [일반식 3]
    Figure kpo00016
    식 중, R 및 R'은 수소, 알킬, 시클로알킬, 치환알킬, 치환시클로알킬, 아릴 또는 치환아릴이고, R는 알킬, 아릴, 치환알킬 또는 치환아릴이며, Z는 산소 또는 황이고, n은 0, 1 또는 2이며, X는 할로겐이다.
  72. 제71항에 있어서, 3차아민염기가 N-메틸모르폴린인 방법.
  73. 제71항에 있어서, 우레탄-보호된 아미노산 N-카르복시무수물 반응생성물을 결정화에 의해 회수하는 방법.
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