PT89961B - Processo para a preparacao de n-carboxianidridos de aminoacidos protegidos por uretano - Google Patents

Description

A presente invenção diz respeito a uma nova classe de N-carboxianidridos de aminoácidos e tiocarboxianidridos de aminoácidos N-protegidos, nomeadamente N-carboxianidridos de aminoácidos e N-tiocarboxianidridos de aminoácidos protegidos com uretano, à sua preparação e utilização em síntese de péptidos, polipeptidos e proteínas .

II). Técnica anterior

De um modo clássico, os polipeptidos de uma sequência definida têm sido preparados por técnicas extremamente trabalhosas em que os compostos intermédios têm que ser isolados após adição de cada radical de aminoácido. A síntese torna-se portanto complicada e torna a preparação de polipeptidos de cadeia longa e proteínas quase impossível devido θ baixos rendimentos, racemização e/ou outras reacções secundárias. Em 1963, MERRIFIELD /

(J. Am. Chem. Soc., 85, 2149) e LETSINGER e KORNET (J. Am. Chem. Soc. 85, 2045) sugeriram o uso de suportes poliméricos insolúveis para o desenvolvimento da cadeia peptídica. Este processo, correntemente referido como uma síntese peptídica de fase sólida, permitiu a purificação da cadeia peptídica em desenvolvimento, sem isolamento dos compostos intermédios.

Até então, os métodos largamente aceites para ambas as sínteses clássica (de fase líquida) e po1ipeptídica de fase sólida, requeriam o uso de um agente de ligação ou activação para reagir com o grupo carboxílico de um outro aminoâcido N-protegido para dar origem a um aminoâcido N-protegido activado no grupo carboxílico. Estas espécies activadas poderiam depois ser utilizadas de diversos modos para promover a formação da ligação peptídica. Por exemplo, o aminoâcido protegido activado, pode reagir lentamente com o grupo amino livre de um aminoâcido, de um éster de aminoâcido ou de uma amida de aminoâcido, para formar a ligação peptídica. Este foi o processo de escolha para a preparação de péptidos durante muitos anos. A fase de activação pode ser acompanhada por um grande número de reacções secundárias possíveis. Por exemplo, quando o reagente de activação é a dicic1ohexi1 carbodiimida (DCC) a molécula activa pode reordenar para se formar uma N-acil-ureia inactiva.

Outra desvantagem do processo de carbodiimida é a formação de ureias insolúveis. Este facto é particularmente inconveniente na síntese de fase sólida e é praticamente inaceitável nos sistemas de fluxo de fase sólida. Estas ureias também ori3

ginam problemasde purificações difíceis nas reacções de fase em solução.

Investigadores conseguiram ultrapassar alguns destes problemas associados com a activação in situ mediante reacção inicial de aminoácido N-protegido activado com DCC, com um álcool ou um fenol, tais como p-nitrofeηo 1, pentaclorofenol, N-hid r o x i-succ i n i m i d a , etc., para formar um éster activo que pode ser isolado e purificado e em seguida permitir a ligação com a amina livre do aminoácido seguinte. Esta via não é isenta de inconvenientes, contudo, porque o álcool ou o fenol libertados, podem ser envolvidos em ou promover outras reacções secundárias e as ligações éster activas tendem a ser demoradas e a requerer longos tempos de reacção.

Outro processo corrente é a formação de um anidrido simétrico mediante a reacção de dois equivalentes do aminoácido N-protegido com um equivalente de DCC, filtração de DCU formado e, em seguida, deixando o anidro simétrico ligar-se com o grupo amina livre do aminoácido seguinte. Este processo tem o problema da ureia além de requerer a utilização de uma quantidade duas vezes maior de um aminoácido N-protegido dispendioso.

Alguns investigadores iniciaram recentemente a utilização de carboiimidas que formam ureias solúveis após ligação, mas estas são contudo sujeitas a rearranjo para originarem N-aci1-ureias.

Vários tipos de grupos protectores do átomo de azoto têm /

/ sido propostos para a utilização na síntese peptídica, mas a classe mais correntemente aceite de grupos de N-protecção é a dos uretanos. Os uretanos são largamente conhecidos como proporcionando um grau elevado de protecção, minimizando a racemização, de fácil preparação, e estáveis durante a armazenagem. Podem ser preparados grupos de protecção uretano que são lábeis em meio ácido moderado, isto é, t-buti1oxicarboni1 o, ácido forte, p. ex., benziloxicarbonilo, ácido extremamente fraco 2-(p-bifeni1il)-isopropi1 oxicarboni 1 o , base anidra, p. ex., 9-f1uoreni 1 -metiioxicarbonilo, etc.

Os aminoácidos protegidos com uretano são preparados por um modo usual mediante reacção de um grupo alquilo, arilo ou ara 1qui1c1 oroformato (ou outro formato ou carbonato, activado de maneira apropriada), com o aminoácido na presença de hidróxido ou de carbonato de metal alcalino numa mistura de água com sistema de dissolventes orgânicos (isto é, condições Schotten-Baumann). Após acidificaçao da mistura reaccional o aminoácido protegido com uretano é extraído com um dissolvente orgânico, abandonando todos os produtos secundários na fase aquosa. Após cristalização, estes compostos são utilizados para a formação da ligação peptídica, como se referiu anteriormente.

Um tipo de particular interesse de derivado reactivo de aminoácidos para utilizar na formação da ligação peptídica é o dos designados N-carboxianidridos ou N-tiocarboxianidridos, tal como os de fórmula geral na qual

R e R' representam habitua 1mente um átomo de hidró génio ou as cadeias laterais (ou cadeias laterais protegidas) de aminoácidos comuns;

Z representa um átomo de oxigénio ou de enxofre

Os N-carboxianidridos de aminoácidos (entende-se que a designação N - c a r b o x i a n i d r i d o na presente memória descritiva e nas reivindicações anexas, inclui os N-1iocarboxianidridos ) são muito bem conhecidos e reagem facilmente com a maior parte das aminas livres. Uma vantagem principal dos N-carboxianidridos (NCA's) e também NCA ' s protegidos para a utilização na formação da ligação peptídica reside no facto de estes serem agentes de acilação potentes (ver Peptides vol. 9, pag. 83). Geralmente também originam rendimentos mais elevados do que os processos de ligação com DCC ou éster de N-hidroxissuccinimida (OSu). Porém, os NCA's não encontraram grande aceitação na síntese de polipeptidos devido à falta de capacidade para controlar ou limitar a reacção de ligação.

Uma vez que o NCA reage com a amina livre de um aminoácido, liber6 /

ta-se imediatamente dióxido de carbono e forna-se um dipeptido que ainda contém amina livre. Esta amina reagirá em seguida com outro MCA para formar um tripeptido e assim por diante. Esta reacção tem permitido que os N-carboxianidrid os de aminoácidos encontrem grande aplicação na formação de po1i-aminoácidos, mas tem, praticamente, impedido a sua utilização na formação sequencial de polipéptidos. HIRSCHMANN et al., (The Controlled Synthesis of Peptides in Aqueous Médium. UIII.). The Preparation and Use of Novel C\L-Amino Acid N-Ca rbo x i a nh y d r i de s . J.A.C.S., 93: 11, 1971, pg. 2746-2774) foram bem sucedidos na utilização de

N-carboxianidridos de aminoácidos para a preparação de di- e tripeptidos em sistemas aquosos-disso 1vente orgânico, mediante controlo cuidadoso da temperatura, do pH, do sal e do dissolvente orgânico da mistura reaccional. Contudo, este processo está limitado aos pequenos péptidos devido à química dos NCA's, anteriormente referida. Além disso, os produtos obtidos através destas reacções de fase em solução, têm que ser extensivamente purificados antes de se utilizarem na preparação de péptidos maiores.

Tem sido referido na literatura uma variedade de N-carboxianidridos de aminoácidos N-substituidos, tais como N-metilo,

N-benzilo, N-acetilo, N-nitrofenilsulfenilo, N-xautilo, 4,4'-dimetilbenzidrilo, tritilo e outros. Vários destes NCA's-substituídos têm sido propostos para a utilização da síntese peptídica sequencial e especialmente para a síntese peptídica de fase sólida, mas nenhum obteve a aceitação para uso geral pelos químicos dos péptidos.

KRICHELDORF J_ Angew. Chem. Acta 8 3 , 86-87, ( 1 9 7 8 ) _7 propôs a utilização de O-nitrofenilsulfenil (NPS) substituídos NC A ' s para utilização na síntese po1ipeptídica sequencial. Estes foram preparados mediante reacção de cloreto de 0-n i t ro f en i 1 su 1 f en i 1 o com um N-carboxianidrido na presença de trietilamina.

Subsequentemente, demonstrou-se que a trietilamina promove a racemização dos NPS-NCA's. Além disso, a o 1igomerização devida à acção da trietilamina sobre NCA, requer que sejam utilizadas condições reaccionais muitíssimo restritas, isto é, temperatura menores do que 0° C e adição muito lenta de trietilamina à mistura reaccional, durante a síntese de NPS-NCA. HALSTROM, et al., ZfZ, Physiol. Chem. .355 , 82-84, (1974)_7 propôs, consequentemente, a síntese deNPS-NCA's mediante reacção de fosgénio com o NPS-amiηoácido , mas os rendimentos foram muito baixos (cerca de 20%). Uma vez preparados, os NPS-NCA's são de difícil conservação e tendem a expulsar o grupo de protecção durante a condensação, originando a ligação múltipla e outras reacções secundárias. Também o átomo de azoto do péptido NPS protegido resultante possui considerável nuc1eofi1icidade e pode sofrer reacções de condensação adicionais.

BLOCK e COX (Peptides, Proc. of the 5tn Europ. Symp., Oxford, Setembro de 1962. Pergamon Press 1963, Ed. G.T- Young, pp. 84-87 ) propuseram a utilização de N-carboxianidrid os de N-tritil-aminoácidos para a síntese peptídica, ainda que estes sejam apenas aptosà preparação dos NCA's de N-triti1aminoácidos mais simples,

isto é, a glicina e a alanina. Estes compostos foram preparados mediante reacção de um N-triti1-amiη oácid o com fosgénio. Mediante aplicação deste processo também foi possível preparar N-acetil-g 1 icina-MCA. Estes investigadores reconheceram a utilidade potencial do N-carboxianidrido da t-butiloxicarboni1-g1icina e do N-carboxianidrido de benzi1 oxicarboηi1-g1icina , mas foram mal sucedidos nas suas tentativas para a sua preparação e concluíram que os N-carboxianidridos de aminoácidos protegidos com uretano não podiam ser preparados. Mesmo que todos, estes NCA's de N-tritilo pudessem ser preparados, é bem conhecido que a utilização da protecção com tritilo dos aminoácidos em diversos processos de condensação origina baixos rendimentos devido ao considerável impedimento estérico imposto pelo grupo tritilo. 0 grupo tritilo é, também, extremamente sensível ao meio ácido, o que torna a preparação de tritil-NCA difícil e tende à expulsão durante as manipulações de fase sólida normais.

HALSTROEM e KOVACS ( Acta Chemica Scandinavica, Ser. Β.1 986 , BYO (6), 462-465 e a patente de invenção norte-americana n? 4.267.344) também reconheceram as vantagens e a utilidade potencial dos N-carboxianidridos de aminoácidos N-protegidos e foram capazes de preparar vários NCA's N-substituídos que consideraram preencher todos os requesitos necessários para utilizar na síntese peptídica. Estes foram capazes de preparar vários N-carboxianidridos de 9-xantil (e afins), substituídos-aminoácidos. Estes compostos foram reivindicados como sendo preparáveis mediante condensação directa de xantidrol com o NCA apropriado em benzeno tolueno, xileno

ou outros alquil benzenos sob refluxo. A água formada durante a condensação foi removida azeotropicamente. Este processo é afectado pela instabilidade dos NCA's ao calor e à água, conduzindo consequentemente a baixos rendimentos e a produtos ρotencia 1mente impuros. Estes compostos podem também ser preparados mediante reacção de fosgénio (ou de um equivalente do fosgénio) com o 9- xanti 1 -amiη oácido correspondente e, de facto, a maior parte dos NCA's substituídos nesta classe, têm sido preparados por meio deste processo.

Quando se usa a síntese peptídica com 9 - x an tilo-NC A ' s tem-se verificado que a reacção lenta requer cerca de cinco horas, à temperatura de 50° C em solução, e vinte e quatro horas, à temperatura de 25° C, quando em síntese de fase sólida.

Este facto é provavelmente devido ao impedimento estérico do grupo 9-xantilo e/ou a efeito de desactivação. Outros problemas associados com a protecção com 9-xantilo dos grupos amina, é que o átomo de azoto do 9-xan tilo-am inoác i do formado após a reacção de ligação é porém, nucleofílico e capaz de originar reacções de condensação subsequentes. Estes grupos tenderão ainda para a expulsão durante a manipulação. Consequentemente, até ao presente momento, os N-carboxianidridos de aminoácidos substituídos deste ou de outro tipo qualquer, ainda não encontraram grande utilização na síntese peptídica, particularmente na síntese peptídica de fase sólida. KRICHELDORF, (Mak romo1. Chem. vol. 178, pp. 905-939,

97 7 ) descreveu um método para a preparação de metoxicarboni 1 1 ο

-giicina-NCA e etoxicarboni1-g1icina-NCA. Contudo, Kricheldorf também refere que este processo foi incapaz de produzir NCA's protegidos com uretano de aminoácidos que possuem uma cadeia lateral e não hidrogénio devido a impedimento estérico. Constitui um objectivo da presente invenção, portanto, proporcionar N-carboxianidridos e N-tiocarboxianidridos protegidos com uretano de aminoácidos superiores. Ainda não obteníveis até ao presente momento. Outro objectivo da presente invenção é proporcionar processos para a preparação de N-carboxianidridos e N -1 i o c a r b o x i a n i dridos de aminoácidos protegidos com uretano sob forma pura, cristalina e estável.

Ainda um outro objectivo da presente invenção é proporcionar um método para a síntese de polipeptidos utilizando-se N-carboxianidridos de aminoácidos protegidos com uretano, síntese esta que oferece as vantagens principais, relativamente aos métodos convencionais da síntese polipeptídica, seguintes:

1) Não é necessária a pré-activação do grupo carboxilo que se lhes deixa ligar, eliminando-se portanto os produtos secundários gerados pelas moléculas activadoras convencionais.

2) Não são necessários aditivos, tais como N-hidroxibenzotriazol para inibir a racemização.

3) 0 único co-produto proveniente da reacção de ligação é o dióxido de carbono.

1

A )	Estes	grupos	carboxílicos	N-protegidos	d e	aminoàcidos
activados	são	materiais estáveis,	armazenáveis e	c r	istalinos e,
portanto,	f a c i	1i t am e	simpli f icam	quer a síntese	de	fase sólida

quer a síntese de fase líquida peptídicas, especia 1 mente nos sintetizadores de péptidos automáticos, pela eliminação da necessidade de activações, filtrações e ligações antes da reacção de formação da ligação peptídica. A purificação dos péptidos preparados em solução, é muito facilitada pela utilizção destes novos compostos devido à ausência de produtos secundários produzidos pelos agentes de ligação.

5) 0 processo proporcionará, após ligação, os grupos de protecção uretano vulgarmente aceites na função amina da cadeia peptídica de desenvolvimento que pode ser depois manipulada por meio de técnicas convencionais.

Sumário da invenção

Estes objectivos são atingidos por meio de N-carboxianidrido ou de N-tiocarboxianidrido de aminoàcidos protegidos com uretano de fórmula geral

II

R”- o - c

R

{ CH.

R'

2

na qual

R e R' representam, cada um, um átomo de hidrogénio ou um grupo alquilo, cicloalquilo ou cicloalquilo substituído ou arilo facultativamente substituído e, pelo menos,Lmde entre R e R' não representa um átomo de hidrogénio;

R'' representa um grupo alquilo ou arilo facultativamente substituído;

Z representa um átomo de oxigénio ou de enxofre; e n representa um número 0, 1 ou 2.

Os grupos preferidos, representados por R, R' e R* * , são grupos alquilo, incluindo grupos cicloalquilo, comportando 1 a 12 átomos de carbono ou mais, grupos arilo com 6 a 20 átomos de carbono ou mais, incluindo grupos aralquilo e alcarilo, com 7 a 20 átomos de carbono ou mais.

São exemplos adequados de grupos alquilo os grupos metilo, etilo, propilo, isopropilo, isobutilo, butilo, t-butilo, hexilo, ciclopentilo, ciclohexilo, peptilo, octilo, e outros. São grupos representativos apropriados de grupos arilo, os grupos fenilo, metilfenilo, etilfenilo, naftilo, metiInafti1 o, antracilo e outros. Exemplos de grupos aralquilo apropriados incluem os grupos benzilo, p-metoxibenzilo, 9 - f 1 u o r enilme t i 1 o , feniletilo e outros. Grupos alcarilo apropriados incluem os grupos tolilo, etilfenilo, isopropilfenilo e outros. Grupos ou átomos representados por R, R' e R'' podem também ser eventualmente substituídos com grupos que

não interferem, tais como flúor, metoxi, t-butoxi, carboxilo, amido, benziloxi, hidroxi, amina substituída, hidroxi substituído, enxofre facultativamente substituído, cloro, bromo e outros. R e R' representam tipicamente grupos protegidos ou não protegidos ligados ao átomo de carbono em posição (cadeias laterais) dos aminoácidos ou dos seus análogos.

Em muitos casos, um dos símbolos R ou R representa o átomo de hidrogénio, enquanto o outro representa uma cadeia lateral no átomo de carbono Ύ de um aminoácido, tal como, a lisina, leucina, arginina, serina, ácido aspártico, alanina, asparagina, cisteína, cistina, ácido glutâmico, histidina, giutamina, isoleucina, metionina, norleucina, ornitina, fenila 1anina, treonina, triptofano, tirosina, valina, ^-alanina, homossrina e outros.

Exemplos destas cadeias laterais são:

<CH₂ >4~NH₂

-<CH₂>₂-COOH ch₂-ch-ch₃ ch₃

<CH₂)₃-NH-C

nh₂

-<CH₂>₂-CONH₂

-ch-ch₂-ch₃ ch₃ ch₂-cooh

ch₃ ο

Η ch₂-c-nh₂

-ch₂-ch₂-s-ch₃

-<CH₂>₃-CH₃

-cch₂>₃-nh₂ ch₂-sh nh₂

I ch₂-s-s-ch₂-ch-cooh ch₂-oh ch₂-ch₂-oh ch-ch₂ch₃ ch₃

OH

Estas cadeias laterais podem, se necessário, ser protegidas, utilizando técnicas comuns e grupos de protecção correntes bem conhecidos dos entendidos na matéria, tais como os grupos amina frequentemente utilizados, hidroxi, tiol e grupos de protecção carboxi .

Os compostos da presente invenção também incluem aqueles em que R e R' representam cadeias laterais ligadas ao átomo de carbono Ct de um aminoácido como, p. ex., no caso da isovalina onde

5

Ζ

-S um dos símbolos R ou R' representa um grupo -Ch^CH^ e o outro representa um grupo metilo.

Os compostos da presente invenção também incluem aqueles em que R e R' fazem parte de uma estrutura cílica como, p. ex., no caso do ácido 1 -amiηo-1-cic1 ohexaηo-carbοχί1ico.

Os compostos da presente invenção também incluem exemplos tais como o ácido orto-amíno-benζóico ou 1-ammo-2-carboxi-ciclo-hexano em que os átomos de carbono dos grupos representados por R ou R' fazem parte de um núcleo cíclico.

Outro aspecto da presente invenção envolve uma melhoria da síntese de uma cadeia polipeptídica em que o componente aminoácido N-protegido é desprotegido e este aminoácido desprotegido é submetido à reacção com um segundo componente de aminoácido N-protegido igual ou diferente e o processo repetido até à obtenção do polipeptido desejado, incluindo a referida melhoria a utilização, como aminoácido N-protegido activado, pelo menos em uma das reacções referidas antes, de um composto de fórmula geral

na qual

R , R ' , R¹', Z e n têm os significados definidos antes.

Ainda um outro aspecto da presente invenção envolve uma melhoria na síntese de fase sólida de uma cadeia po1ipeptídica num suporte sólido insolúvel em que o aminoacido N-protegido é ligado mediante uma reacção de condensação a um suporte sólido insolúvel que contém grupos substituintes reactivos com o terminal carboxilo do referido aminoacido, e em que o aminoacido N-protegido ligado é desprotegido, um segundo aminoacido N-protegido activado, igual ou diferente, é ligado ao referido composto de aminoacido desprotegido e o processo é repetido até à obtenção do polipeptido desejado, incluindo esta melhoria a utilização, como aminoacido N-protegido activado, pelo menos em uma das reacções referidas antes, de um composto de fórmula geral

na qual

R, R', Z e n têm os significados definidos antes.

Ainda um outro aspecto da presente invenção consiste num método para a preparação de N-carboxianidridos de aminoácidos protegidos com uretano de acordo com a invenção, que inclui a

7 /

reacção de um N-carboxianidrido de aminoácido de fórmula geral

( CH.

R’

na qual

R, R', Z e n têm os significados definidos antes, com um halogenoformato (ou outro formato reactivo apropriado, tal como o formato de azida) de fórmula geral

II

R ' ' - 0 — C-X na qual

X representa um átomo de cloro, bromo ou flúor ou um grupo azida ou equivalente, e

R' ' representa um grupo alquilo, arilo ou aralquilo, sob condições anidras no seio de um dissolvente inerte e na presença de N-meti1 morfo 1ina . Verificou-se, surpreendentemente, que a utilização de um dissolvente inerte, sob condições anidras e selecção da N-metilmorfoiina como a base desta reacção evita a polimerização de N-carboxianidridos e, por outro lado, permite a produção de NCA's e NTA's protegidos com uretano de aminoácidos superiores que até ao momento não era

8 possível obter.

Descrição detalhada da invenção

Os N-carboxianidridos de aminoácidos (NCA's) e N-tiocarboxianidridos (NTA's) de aminoácidos que servem como compostas iniciais para a preparação de NCA's ou NTA's protegidos com iN-uretano da presente invenção, podem ser preparados mediante aplicação de diversos processos bem conhecidos da técnica. Ver, por ex., FULLER et.al., Biopo1ymers 1 5 , NS. 9, 1 869-1 87 1 ( 1 976 ); KRICHELDORE, Chem. Ber. 104, 87-91 ( 1971); e HALSTROM e KOVACS, Acta Chemica Scandinavica , B40, 462-465 ( 1986).

Embora os uretanos, em geral, possam ser utilizados como grupos protectores dos átomos nucleofί1icos, apenas alguns encontraram aplicação alargada na síntese peptídica, p. ex., t-butoxicarbonilo (Boc); benzi1 oxicarboni1 o (Cbz); e 9-f1uorenorneti1 oxicarbonilo (FMOC). Consequentemente, os N-carboxianidridos ou N-tiocarboxianidridos substituídos de aminoácidos com estes grupos de protecção, têm um interesse especial. Assim, moléculas muito úteis para a síntese peptídica são os NCA's de L--amιη oácιdos protegidos por um dos grupos protectores anteriormente referidos, tais como,

9

em que

R representa uma cadeia lateral de um -aminoácido ,

Z representa um átomo de oxigénio ou de enxofre e X representa um átomo de cloro ou um grupo metoxi ou similares.

Tal como referido anteriormente, os NCA's protegidos com N-uretano da presente invenção, não são obteníveis mediante reacção de fosgénio com aminoácidos protegidos com N-uretano, tal como descrito por BLOCK e COX em Peptides, Proc. of the 5th Europ. Symp., Oxford, Setembro de 1 962'.' (Perganon Press 1 963, Ed. G.T. Young, pp.84-87.); nem os NCA's protegidos com N-uretano de aminoácidos superiores são obteníveis pela síntese descrita por

KRICHELDORF (Makromol. Chem.. Vol. 176, p.p. 905-939, 1977).

Verificou-se que os NCA's protegidos com N-uretano ou NTA's podem ser preparados mediante reacção de um NCA sintetizado previamente ou de um NTA com o halogenoforma to apropriado sob condições anidras,no seio de um dissolvente inerte, com uma amina terciária como base. A reacção realiza-se de preferência abaixo da temperatura ambiente. Dissolventes utilizáveis para a reacção são o tetrahidrofurano, acetato de etilo ou cloreto de metileno, cloreto, tolueno, benzeno, dioxano e outros.

Assim, os novos N-carboxianidridos e N-tiocarboxianidridos de aminoácidos protegidos com uretano de acordo com a invenção podem ser preparados mediante dissolução de um NCA no seio de um dissolvente inerte, tal como otolueno e arrefecimento da solução resultante, sob agitação. 0 halogenoformato desejado, p. ex. o benzi1c1 oroformato, foi em seguida adicionado imediatamente. A esta mistura adiciona-se uma base de amina terciária, tal como trietilamina, diisopropi1eti1amina, N-metiImorfo 1ina, etc., que promove a condensação e elimina o ácido clorídrico formado durante a reacção. Surpreendentemente verificou-se que certas bases de aminas terciárias, tais como a N-metiImorfo 1ina e a N-etilmorfolina não promovem a polimerização de NCA's. Estas bases preferidas são as que têm um pK suficientemente baixo para não promoverem a polimerização de NCA, mas suficientemente elevado para cataiizarem a reacção de um NCA com um ha 1ogeη oformato. Consequentemente, quando uma destas bases preferidas for utilizada para a reacção de condensação a polimerização não tem início.

1 /

receio de polimerização, a base pode ser o NCA protegido com uretano resultante cristalização.

Uma vez que não existe utilizada em excesso e facilmente isolado por

Como resultado destas descobertas, pode preparar-se virtualmente qualquer NCA (ou NTA) facilmente, com um rendimento elevado, apenas com a precaução mínima de eliminação da humidade. 0 processo é facilmente reprodutível e proporciona produtos que são altamente cristalinos e facilmente purificados mediante técnicas simples como, p. ex., a cristalização, são estáveis durante a armazenagem (completamente estáveis à temperatura de 25° C, pelo menos durante seis meses e provavelmente durante muito mais tempo). Portanto, estes materiais podem ser pesados, expedidos e armazenados para utilização na síntese peptídica sem receio de decomposição. A vantagem principal que os NCA's protegidos com uretano oferecem sobre todos os NCA's N-substituídos é que após a sua utilização para a formação da ligação peptídica, o péptido resultante é protegido no N-terminal por um dos grupos de protecção uretano correntemente aceite e correntemente utilizado na síntese peptídica. Estes grupos de protecção são bem conhecidos dos entendidos na matéria como proporcionando a melhor protecção disponível para o grupo amina de uma cadeia peptídica em crescimento.

Assim, a utilização de N-carboxianidridos protegidos com uretano, oferecerá todas as vantagens dos NCA ¹ s não substituídos (reactividade elevada, isenção de formação de produtos de rearranjo indesejáveis e de dióxido de carbono como único produto secun22

dário), mas sem nenhuma das desvantagens dos NCA's não substituídos, (isto é, instabilidade, po1imerização e condensações múltiplas) que têm limitado a sua utilização a condições aquosas controladas cuidadosamente. Consequentemente, a presente invenção proporciona um reagente pré-activado ainda altamente reactivo e armazenável com produção de produtos secundários mínimos, durante a formação da ligação peptídica. A presente invenção também proporciona a largamente aceite, bem entendida, protecção com uretano no átomo de azoto do N-terminal do péptido após a reacção de condensação .

Embora os N-carboxianidridos de aminoácidos protegidos com uretano da presente invenção só possam ser utilizados na síntese de polipeptidos pelos métodos clássicos, utilizando uma série de reacções de desprotecção e de ligação, eles encontrarão indubitavelmente uma utilização mais completa na síntese de polipeptidos de fase sólida. Deve entender-se que o termo polipeptidos tal como se utiliza na presente memória descritiva e nas reivindicações anexas, significa que inclui péptidose proteínas. Também se deve entender que a presente invenção contempla a síntese peptídica sequencial em que aminoácidos N-protegidos , além dos N-carboxianidridos de aminoácidos protegidos com uretano, são utilizados também com pelo menos, um NCA protegido com uretano da presente invenção. Contudo, na prática, o componente de aminoácido N-protegido utilizado em cada sequência, sê-lo-à mais provavelmente do que os NCA's protegidos com uretano da presente invenção.

/

Na síntese po1ipeptídica em fase sólida, um suporte sólido insolúvel ou matriz é utilizado com vantagem sob a forma de pérolas. Tais suportes sólidos podem ser constituídos por quaisquer substractos poliméricos de fase sólida utilizados convencionalmente para a síntese po1ipeptídica . í/píco destas resinas poliméricas são as resinas de poliestireno de ligação cruzada, pérolas de vidro, argilas, cerite, dextrano reticulado, po 1 iacri1amidas, resinas de poliamida e suportes sólidos insolúveis idênticos que contêm sítios reactivos naturais para a ligação com os componentes de aminoàcidos ou que podem ser providos com estes sítios reactivos.

Se apropriado, a síntese polipeptúdíca de fase sólida da presente invenção, pode realizar-se num reactor de fluxo sob pressão reduzida tal como o descrito na patente de invenção norte-americana n2. 4.192.798, aqui incorporada como referência, ainda que a utilização de pressões acima da pressão atmosférica não seja essencial.

São necessárias várias operações preliminares antes de se poder dar início à síntese de fase sólida de um péptido. Primeiro tem que preparar-se a resina de suporte que contém o componente de aminoácido C-terminal da cadeia peptídica proposta. Esta preparação pode realizar-se por qualquer dos processos conhecidos dos entendidos na matéria. Muitos destes aminoàcidos N-protegidos ligados a vários suportes sólidos constituem artigos do comércio e podem ser adquiridos se necessário.

A restante síntese para formar a sequência polipeptídica

4 / 'C

I desejada, é realizada como se segue. Antes de se realizar a ligação do resto do segundo aminoácido, o primeiro resíduo já no suporte, deve ser desprotegido. A desprotecçâo do primeiro resto do aminoácido da resina, assim como cada um dos restos de aminoácidos ligados subsequentemente, pode realizar-se mediante contacto do resto de aminoácido protegido com um agente de desprotecçâo apropriado. Os agentes de desprotecçâo utilizados para esta finalidade são bem conhecidos dos entendidos da química dos péptidos e o agente de desprotecçâo específico utilizado em um dado momento dependerá, evidentemente, do grupo protector do aminoácido/resina. Por exemplo, se o grupo protector for o t-buti1 oxicarboni 1 o , pode utilizar-se ácido trif1uoroacético em diclorometano ou ácido clorídrico num dissolvente apropriado, tal como o dioxano. Por outro lado, se o grupo protector for o 9-f1uoreniImeti1 oxicarboni1 o o método preferido será a utilização de piperidina em dimetilformamida (DMF) sob condições básicas. As concentrações do agente de desproteação particular no dissolvente variarão dependendo mais uma vez do agente protector apropriado mas, de um modo corrente variam entre cerca de cinco e cinquenta por cento em volume.

Após a fase de desprotecçâo a resina é lavada com um dissolvente apropriado a fim de eliminar o excesso de agentes de desprotecção . Se o agente de desprotecçâo for constituído por um ácido o péptido ligado à resina deve ser neutralizado mediante lavagem com uma base apropriada, tal como trietilamina num dissolvente tal como o diclorometano. Qualquer excesso de trietilamina e de cloreto de trieti1amónio ou de trifiuoracetato formados pode ser eliminado por lavagens repetidas com um dissolvente apropriado, tal como diclorometano ou dimeti1formamid a . A amina livre assim preparada está agora pronta para ligação com o aminoacido N-protegido seguinte.

Se o aminoacido N-protegido seguinte for um N-carboxianidrido de aminoácido N-protegido com uretano da presente invenção, não é necessário activar-se e pode fazer-se reagir directamente com o suporte, contendo agora um aminoácido não protegido ligado à resina. Se, contudo, o componente de aminoácido N-protegido deve ser ligado por meio de processos mais convencionais, será necessário primeiro activar, isto é, converter à forma reactiva, p. ex., mediante conversão do aminoácido num anidrido ou por activação com diciclohexilcarboiirnida , carbonildiimidazol ou outros agentes de activação. Em geral, utiliza-se um excesso do componente de aminoácido N-protegido activado nesta reacção.

Após a ligação do segundo aminoácido protegido ao primeiro aminoácido, o dipéptido protegido ligado é desprotegido, neutralizado se necessário e lavado como descrito anteriormente antes de se efectuar a ligação com o derivado de aminoácido seguinte. Este processo é repetido até que a sequência de aminoácidos desejada tenha sido reunida sobre um suporte insolúvel.

Devido à ausência de reacções secundárias indesejáveis, ou de produtos secundários, (o dióxido de carbono é o único destes) na ligação NCA protegido com uretano, e como consequência da sua estabilidade, o excesso de NCA protegido com uretano utilizado

Ζ (____X nas reacções de ligação pode ser facilmente recuperado, recristalizado e reutilizado, aumentando portanto acentua damente o custo efectivo destes materiais.

péptido completado pode ser retirado do suporte insolúvel por qualquer dos métodos convencionais, tal como, p. ex., por cisão com fluoreto de hidrogénio, anidro, transesterificação, aminó1i s e , etc.

Após cisão, verificou-se que o péptido resultante era acentuadamente homogéneo e não requeria ou requeria purificação mínima. Devido à contaminação muito baixa dos subprodutos os rendimentos globais verificaram-se ser surpreendentemente elevados e qualquer que seja a purificação necessária, ela pode ser realizada com relativa facilidade. Estas purificações são de preferência realizadas por cromatografia de partilha, cromatografia de permuta iónica ou por uma associação de ambas.

Estes processos são bem conhecidos dos entendidos na síntese peptí dica .

Exemplo 1

Decomposição de N-carboxianidrido como uma função de base

A. Dissolveram-se 72 mg de va1ina-N-carboxianidrido em tetrahidrofurano destilado anidro (2 ml) e adicionaram-se 30 /41 de trietilamina. 0 desaparecimento do NCA foi seguido por espectroscopia no infravermelho.

B. D i s s o 1 v e r am-s e 72 mg de va 1ina-N-carboxianidrido em 2 ml de tetrahidrofurano e a d i c i o n a r am - s e 25 ^/£l de N-metiimorfo 1ina .

desaparecimento do NCA foi seguido por espectroscopia de infravermelho .

Os resultados de A e 8 representam-se no gráfico da figura

Exemplo 2

N-(9-fluorenilmetiloxicarbonil)-L-Alanina-N-carboxianidrido

A. Agitou-se durante 4 horas, a uma temperatura compreendida entre 62° e 64° C uma mistura de 40,3 g (0,45 mole) de L-alanina e fosgénio (275 ml de uma solução 3,3 Mem tetrahidrofurano,

0,90 mole). Deixou-se arrefecer a solução resultante à temperatura ambiente, filtrou-se e retiraram-se os produtos voláteis sob pressão reduzida. 0 óleo resultante foi dissolvido em 100 ml de tetrahidrofurano e adicionado com 300 ml de hexano, sob agitação, seguida de arrefecimento para -20° C. 0 rendimento em L-alanina-N-carboxianidrido foi de 35,79 g (69%).

B. Adicionou-se uma solução de 8,15 g (80,5 mmoles) de N-metilmorfolina em 50 ml de tolueno à temperatura de 0° C a uma mistura de 8,84 g (76,8 mmoles) de L-a 1 anina-N-carboxianidrido e 19,9 g ( 76,80 mmoles) de cloreto de 9-f1uoreniimeti1oxicarboni1 o em 200 ml de tolueno. A mistura reaccional foi agitada à temperatura de 0° C durante duas horas e filtrada. 0 volume do dissolvente foi reduzido para 20 ml e a cristalização ocorreu após adição de 100 ml

de hexano, fornecendo 21,4 g (rendimento 8 2 ) de 9-fluorenilmeti1 oxicarboni1-L-a 1anina-N-carboxianidrido sob a forma impura. 0 produto foi purificado por trituração com éter diisopropί1ico arrefecido, seguida de recristalização com acetato de etilo/hexano: ponto de fusão 1 06-1 07° C; IV (CH^l ) 1 870, 1 801, 1 740 cm¹;

NMR (CDC1₃ ) 8 6,90-7,80 (m, 8H), 3,95-4,55 (m, 4H), 1,35 (d, J =

-7 Hz, 3H). Anal. Calcul. para C^H^NO^: C, 67,65; H, 4,48; N, 4,15. Determ: C, 67,73; H, 4,65; N, 4,19.

Exemplo III

N-(9-fluorenilmetiloxicarbonii)-L-Leucina-N-carboxianidrido

A. Preparou-se L-1eucina-N-carboxianidrido a partir de L-leucina com um rendimento de 78% pelo processo descrito no Exemplo

II A.

8. Uma mistura de 9,2 g (58,4 mmoles) de L-1eucina-N-carboxianidrido e de 15,1 g (58,4 mmoles) de cloreto de 9-fluorenilmeti1 oxicarboni1 o em 125 ml de tolueno, foi arrefecida até à temperatura de 0° C e adicionou-se gota a gota uma solução de 6,5 g (64 mmoles) de N-meti1morfo 1ina em 20 ml de tolueno. A mistura reaccional foi agitada à temperatura de 0°C durante 2 h e 30 minutos, filtrada e o volume do dissolvente reduzido para 20 ml.

Adicionaram-se 480 ml de hexano e arrefeceu-se a solução até-20°C durante a noite para fornecer 18,8 g (rendimento 8 5 ) de N - (9 -fluorenilmetiloxicarbonil)-L-leucina-N-carboxianidrido . Obteve-se uma amostra analítica por recristalização com éter dietílico/'cio29 /

reto de me t i 1 eno/he xano : ponto de fusão P.F.1 1 8-1 20°C ; RMN (CCl_Zi)

Ò 7,	35-7,91	(m , 8	H); 4,72 (t, J= 7 Hz, 2 H);	4,58 (m,	3 H) ;
4,37	(t, J =	7 Hz ,	1 H) ; 2,05 (m , 2H ) ;	1,09 (t ,	J: 6 Hz ,	6 H ) .
Anal.	Calcul	. para	C22H21N°5: C’ 69’ó45	Η, 5,58	; N, 3,69	. Determ
C , 69	,08; H,	5,97;	N, 3,70.

Exemplo IV

N-^Q^-(-9-fluorenilmetiloxicarbonilo)-N-ò-t-butiloxicarbonil-L-lisina-N-carboxianidrido

A. Arrefeceu-se uma mistura de 1,23 g de N-*&-t-buti1 oxicarbon i 1 - L -1 i s i n a (5,0 mmoles) e 1,08 g (10,0 mmoles) de clorotrimetilssilano em 50 ml de tetrahidrofurano até à temperatura de 0°C e adicionou-se gota a gota uma solução de 1,01 g (10,0 mmoles) de trietilamina e 5 ml de tetrahidrofurano. A mistura foi agitada 'a temperatura de 0°C durante 2 horas e 30 minutos, filtrada e adicionada a uma solução de 10 mmoles de fosgénio em 15 ml de tetrahidrofurano. Elevou-se a temperatura para 60°C e a solução foi agitada durante duas horas e, em seguida, durante a noite à temperatura ambiente. Os produtos voláteis foram eliminados por evaporação rotativa para se obter 0,79 g (rendimento de 58%) de N- - t-bu t i 1 ox i ca rboni 1-L-l i s ina-N-ca rbox i an i dr ido : IVCCH^Cl^,)

860, 1 795, 1 71 0 cm^-1 .

B. Uma mistura de 0,79 g (2,90 mmoles) de N- &-t-buti1 oxicarboni1-L-1isina-N-carboxianidrido e 0,75 g (2,90 mmoles) de cio30

reto de f 1 uorenilmeti1 oxicarboni1 o em 25 ml de tolueno, foi arre,o fecida até à temperatura de 0 C e adicionou-se gota a gota, uma solução de 0,32 g (3,2 mmoles) de N-meti1morfo 1ina em 5 ml de tolueno. A reacção foi conduzida tal como descrito no exemplo III B para fornecer 0,88 g (66?ó) de N-0<(-(9-fluorenilmetiloxicarbonil)-N - t, - t-bu t i 1 o x i ca rbon i 1 -L-1 i s ina-N-c a rbo x i an i d r i do : Ponto de fusão 81-85 °C (acetato de etilo/hexano; ; RMN (CDCl^) S7 , 3 - 7 , 7 (m, 8 H), 4,11-4,58 (m, 5 H), 2,95-3,20 (m, 2 H); 1,90-1,98 (m,

H); 0,9-1,4 (m, 13 H). Anál. Calcul. para ^27^30^2^7 ^: 5 , 5 7 ;

H, 6,11; N, 5,67. Determ. C, 66,33; H, 6,38; N, 5,67.

Exemplo V

N-benziloxicarbonil-L-alanina-N-carboxianidrido

Adicionou-se gota a gota uma solução de 1,06 g (10,5 mmoles) de N-metiImorfo 1ina em 20 ml de acetato de etilo a uma mistura de 0,81 g (7,0 mmoles) de L-alanina-N-carboxianidrido ( do Exemplo II A) e 1,89 g (10,5 mmoles) de cloreto de beηzi loxicarboni lo em 80 ml de acetato de etilo à temperatura de 0^u C. A mistura reaccional foi agitada durante uma hora e meia, à temperatura de ,o

C, filtrada e o volume da solução reduzido para 75 ml. Adicionaram-se 75 ml de hexano, sob agitação, após o que se submeteu a um arrefecimento até à temperatura de -20° C para se obter 1 ,20g ( 7 1 % de rendimento) de N-benziloxicarboni1-L-a 1anina-N-carboxia nidrido: Ponto de f usão P.E.101 -104 °C ; RMN (CDCl^) 7,33 (s, 5 H),

5,27 (s, 2 H), 4,60 (q, J = 7 Hz, 1 H), 1,61 (d, J χ 7 Hz, 3 H).

Anál. calcul. para 7 , 8 3 ; ^>^5; N, 5,62.

D e t e r m: C, 57,60; H, 4,50; N, 5,53.

Exemplo VI

N-benziloxicarbonil-L-leucina-N-carboxianidrido

Adicionou-se, gota a gota, uma solução de 0,76g (7,50 mmoles) de N-m e t i 1 m o r f o 1 i n a em 10 ml de acetato de etilo a uma solução de 0,79 g (5,0 mmoles) de L-leucina-N-carboxianidrido (do exemplo III A) e 1,35 g (7,50 mmoles) de cloreto de benzi1 oxicarbonilo em 50 ml de acetato de etilo à temperatura de 0° C. A mistura reaccional foi agitada à temperatura de 0° C durante 1 hora e 15 minutos, filtrada e o volume da solução reduzido para 5 ml. Adicionaram-se 50 ml de hexano, seguido de arrefecimento até à temperatura de -20° C, para se obterem 0,89 g (61% de rendimento) de N-benzi1 oxicarboni1-L-1eucina-N-carboxianidrido: Ponto de fusão P-f-7 2 - 7 3 , 5 ° C ( éter/hexano ) ; RMN (CDCl^) k 7,40 (s, 5 H), 5,33 (s, 2 H), 4,71 (t, J = 6 Hz, 1 H), 1,80-2,04 (m, 3 H), 0,91 (m,

H). Anál. Calcul. para C^H^NO^: C, 61,84; H, 5,88; N, 4,81. Determ: C, 61,64; H, 6,02; N, 4,90.

Exemplo VII

N-Feniloxicarbonil-L-valina-N-carboxianidrido

A. Preparou-se L-va 1ina-N-carboxianidrid o a partir de L-valina em um rendimento de 75% de acordo com o processo descrito no exem32 /

pio I ΙΑ .

B. Repetiu-se ο exemplo V mas substituindo o cloroformato do benzil por cloroformato de fenilo e a leucina-N-carboxianidrido por va 1ina-N-carboxianidrido . Obteve-se deste modo um rendimento de 7 8 % de N-feni1 oxicarboni1-L-va1ina-N-carboxianidrido.

Ponto de Fusão P.F.1 0 5 - 1 06°C ( c 1 o r o f ó rm i o/h e x a n o ) ; RMN (CDCl-j)

7,30 (m, 5 H), 4,70 (d, J= 3,5 Hz, 1 H), 2,60 (m, 1 H), 1,22 (d,

J _ 7 Hz, 3 H), 1,07 (d, J = 7 Hz, 3 H), 1,07 (d, J = 7 Hz, 3 H). Anál. Calcul. para C, 59,31 H, 4,98; N, 5,32.

Determ: C, 59,09; H, 4,91; N, 5,49.

Exemplo VIII

N-etiloxicarbonil-L-alanina-N-carboxianidrido

Repetiu-se o exemplo V mas substituindo o cloroformato de benzilo por cloroformato de etilo. Como resultado obteve-se com um rendimento de 62% N-eti1oxicarboni1-L-a 1 anina-N-carboxianidrido : Ponto de fusãoP.F.7 2-73,5 °C (acetato de etilo/hexano); RMN (CDCl^)

4,73 (q, J = 7 Hz, 2 H), 4,33 (q, J = 7 Hz, 1 H), 1,70 (d, J χ 7 Hz, 3 H), 1,33 (t, J = 7 Hz, 3 H). Anál. Calcul. para C^H^NO^:

C, 44,92; H, 4,85; N, 7,49. Determ: C, 45,08; H, 5,03; N, 7,33.

Exemplo IX

Benziloxicarbonil-L-fenilalanina-N-carboxianidrido

A .

Preparou-se L-feni1alanina-N-carboxianidrido a partir de

3

L-fenilalanina com um rendimento de 5 3% pelo processo descrito no exemplo II A.

B. A uma solução de 2,5 g (13 rnmoles) de L-fenilalanina-N-carboxianidrido e 3,4 g (20 rnmoles) de cloroformato de benzilo em 130 ml de acetato de etilo, adicionou-se, gota a gota, uma solução de 2,0 g (20 rnmoles) de N-metiImorfo 1ina em 10 ml de acetato de etilo à temperatura de 0° C. A mistura resultante foi agitada à temperatura de 0° 0 durante duas horas e meia e tratada como descrito no exemplo V para fornecer 2,0 g (rendimento de 48%) de

N-benzi1 oxicarboni1-L-fenilalanina-N-carboxianidrido: Ponto de fusão: 1 08-1 09°C; RMN (CDCl-j) &7,35 (s, 5 H), 7,00 (m, 5 H),

5,31 (s, 2 H), 4,83 (m, 1 H), 3,28 (m, 2 H). Anál. calcul. para C_iaH₁₇N0₅: C, 68,13; H, 5,40; N, 4,42. Determ: C, 68,11; H 5,38;

N , 4,20.

Exemplo X

Feniloxicarbonil-L-alanina-N-tiocarboxianidrido

A. O-Etil-S-metilxantato. A uma solução de 16,0 g (100 rnmoles) de etilxantato de potássio em 50 ml de água, a diciοηou-se , gota a gota, sulfato de dimetilo (12,6 g, 100 rnmoles) à temperatura de 4° - 1° C. Terminada a adição, a mistura reaccional foi lavada com duas vezes quarenta mililitros de diclorometano e as fases orgânicas reunidas, foram secas sobre sulfato de magnésio e concentradas. 0 resíduo oleoso foi dissolvido em metanol e concentrado para fornecer 0-eti1-S-meti1xantato de pureza suficiente para ser uti34 ff /

lizado na fase seguinte.

B. Etoxitiocarboni1-L-a 1anina. Ao 0-eti1-5-meti 1 xantato preparado anteriormente, adicionou-se uma solução de 8,9 g (100 mmoles) de L-alanina e 4,0 g (100 mmoles) de hidróxido de sódio em 100 ml de água. A solução foi aquecida até à temperatura de 45°C durante 2,3 horas com purga de azoto, a dicionaram-se 50 ml de metanol e agitou-se a mistura à temperatura de 45°C durante mais 0,7 horas. Deixou-se arrefecer esta mistura até à temperatura ambiente, lavou-se com diclorometano (3 x 25 ml), acidificou-se até pH 2,5 com ácido clorídrico concentrado e extraíu-se com 2 x 50 ml de acetato de etilo. As soluções orgânicas reunidas foram secas com sulfato de magnésio e concentradas. A adição de hexano ao óleo resultante forneceu 9,5 g (rendimento de 54%) de eti1oxitiocarboni1-L-a 1anina, sob a forma de um sólido incolor que fundiu à temperatura de 74°-78° C. Este material foi purificado ρosteriormente por recristalização com éter dietί1ico/hexano : ponto de fusão 77°-79° C; IV (CCl^) 3397. 1716 cm^-1.

C. L-a 1anina-N-1iocarboxianidrido. A uma solução de 3,0 g (17 mmoles) de eti1 oxitiocarboni1-L-a 1anina e 1,2 g (17 mmoles) de imidazol em 20 ml de tetrahidrofurano, adicionou-se , gota a gota, tribrometo de fósforo (5,4 g; 20 mmoles) à temperatura de 20° C. Manteve-se a agitação até que a massa sólida se transformasse numa suspensão fina. A mistura reaccional foi vertida numa mistura de 200 ml de carbonato de hidrogénio e sódio e 150 ml de acetato de etilo. A fase orgânica foi separada, lavada com 2 x 100 ml de ácido clorídrico 1M, carbonato de hidrogénio e sódio saturado

5

(100 ml) e solução concentrada de cloreto de sódio (100 ml), seca sobre sulfato de magnésio e concentrada. 0 óleo resultante solidificou por repouso. A recristalização do produto sólido forneceu 0,75 g (rendimento de 34?á) de L-alanina-N-tiocarboxianidrido:

ponto de fusão 91°- 92° C; IV (CCl^) 1750, 1695 cm \

D. Eeniloxicarboni1-L-alanina-N-1iocarboxianidrido . A uma solução de 0,49 g (3,8 mmoles) de L-alanina-N-tiocarboxianidrido, em 50 ml de acetato de etilo, adicionaram-se 0,95 g (6,1 mmoles)

da	a d i -
d e	N - m e -
d e	0° C .

tilmorfolina em 10 ml de acetato de etilo à temperatura de 0 C.

A mistura resultante foi agitada durante 3 horas à temperatura de 0°C , filtrada e concentrada para se obter um produto semi-sólido branco. Este material semi-sólido branco foi dissolvido em ml de acetato de etilo e adicionado com 150 ml de hexano, arrefecendo-se a mistura até -20° C para fornecer 0,55 g (rendimento de 62%) de feni1 oxicarboni1-L-alanina-N-1iocarboxianidrido: ponto de fusão 110-111° C; RMN (CDCl-j) ά 7,18 (m, 5 H), 4,83 (q, 1 H,

J = 7 Hz), 1,71 (d, 3 H, J = 7 Hz); IV (CH Cl ) 1 8 1 0, 1 740 (dubleto), 1715 (Inflexão). Anál. Calcul. para C^H^NO^S: C, 52,58; H, 3,61;

N, 5,58; S, 12,76. Determ: C, 52,75; H, 3,72; N, 5,36; 5, 12,98.

Exemplo XI

N-(9-Fluorenilmetiloxicarbonil)-Q-t-butil-L-treonina-N-carboxianidrido

A. Preparou-se 0 -1 - bu t i 1 - L - t r e o n i na-N-ca r b o x i a n i d r i d o a partir de 0-t-butil-treonina com um rendimento de 5 7°í utilizando-se tri36 /

metilssililo de acordo com o processo descrito no exemplo IV A.

Β. A uma solução de 0,80 g (4,0 mmoles) de O-t-butil-L-treonina-N-carboxianidrido e 1,0 g (4,0 mmoles) de cloreto de 9-fluorenilmeti1 oxicarboni 1 em 50 ml de tolueno, adicionou-se , gota a gota, uma solução de 0,49 g (4,8 mmoles) de N-metilmorfolina em 8 ml de tolueno à temperatura de 0° C. A mistura reaccional foi agitada durante três horas, à temperatura de 0°C, filtrada e os produtos voláteis eliminados sob pressão reduzida. 0 resíduo foi cristalizado com éter/hexano para fornecer 1,0 g (rendimento de 60%) de N - ( 9 - f 1 uo ren i lme t i lox ica rbon i 1)-0 -1-bu t i 1 -1 reon i na : ponto de fusão 124-127°C; RMN (CDCl^) S 7,08-7,78 (m, 8 H), 4,05-4,61 (m, 4 H), 1,18 (s, 9 H), 1,16 (d, 3 H, 0 = 7 Hz). Anal. Calcul.

para ^24^25'^θ6^: 68,07; H, 5,95; N, 3,31. Determ: C, 67,89; H,

5,96; Ν, 3,28.

Exemplo XII

N-carboxianidrido do ácido etiloxicarbonil-^-aminoisobutírico

A. Preparou-se o N-carboxianidrido do ácido 'V. -aminoisobutírico com um rendimento de 67%, de acordo com o processo descrito no

Exemplo II A.

B. Repetiu-se o exemplo VIII B substituindo o L-alanina-N-carboxianidrido pelo N-carboxianidrido do ácido -aminoisobutírico para se obter, com um rendimento de 16%, o N-carboxianidrido do ácido eti1 oxicarboni1-‘V-aminoisobutírico; ponto de fusão 68-70°C ( cloro fórmio/hexano) ; RMN (CCl^) b 4,59 (g, 2 H, J - 7 Hz), 2,00

(s, 6 Η), 1,65 (t, 3 H, J = 7 Hz). Anál. Calcul. para CgH^NO^:

C, 47,76; H, 5,51; N, 6,96. Determ: C, 47,67; H, 5,51; N, 7,14.

Exemplo XIII

N-t-butiloxicarbonil-L-alanina-N-carboxianidrido

A uma solução de 1,25 g (16,9 mmoles) de álcool t-butílico e fosgénio (3,4 ml de uma solução 5 M em dioxano 17 mmoles) em 80 ml de acetato de etilo, adicionou-se gota a gota, 3,4 g (34 mmoles) de N-meti1morfo 1ina, à temperatura de -50° C. A mistura reaccional foi agitada durante meia hora. Adicionou-se 0,23 g (2,0 mmoles) de L-anina-N-carboxianidrido em 10 ml de acetato de etilo e agitou-se a mistura à temperatura de -50° C durante mais 45 minutos. Adicionou-se 1,0 grama (10 mmoles) de N-metilmorfolina e continuou-se a agitação durante mais 45 minutos à temperatura de -50° C. Retiraram-se os produtos sólidos por filtração e concentrou-se a solução, obtendo-se o produto após trituração com hexano. A recristalização com tolueno forneceu 0,28 g (65% de rendimento) de N-1-butiloxicarboni1-L-a 1anina-N-carboxianidrido . Ponto de fusão 103-104,5° C; RMN (0001^)^4,71 (q, 1 H, J = 7 Hz),

1,80 (d, 3H, 0 = 7 Hz), 1,70 (s, 9 H). Anál. calcul. para C_oH.-.N0_c: C, 50,23; H, 6,09; N, 6,51. Determ: C, 50,66; H, 6,36; N, 6,38.

Exemplo XIV

N - (t-butiloxicarbonill-O-Benzil-L-serina-N-carboxianidrido

Preparou-se, com um rendimento de 68%, 0-benzi1-L-serina 38

-Ν-carboxianidrido pelo processo descrito no Exemplo II A.

8. Repetiu-se o exemplo XIII, mas substituindo o L-alanina-N-carboxianidrido por 0-benzi1-L-serina-N-carboxianidrido para se obter N-(t-butiioxicarbonil)-0-benzii-L-serina-N-carboxianidrido,

com 52% de	rendimento :	Ponto	de fusão	98-99,5°C; RMN	(CC1.) ·-+
7,30 (m, 5	H ) , 4,64 (m,	3 H,	benzilo CH	2 NCA protão	do núcleo),
4,09 (DD,	1Η , J = 15, 5	Hz ) ,	3,88 (dd,	1 Η , J - 1 5 , 5	Hz ) , 1,65
(s , 9 H ) ;	Anal. Ca 1c u1 .	para	C15H19N06:	C , 59,80; Η,	5,96; Ν, 4,36
Determ: C ,	59,71 ; Η , 6	,25; N	, 4,05.

Exemplo XV

Derivação de feni1 oxicarboni1 o do N-carboxianidrido do ácido

-am i no-1-ciclohexanocarboxílico.

A. Preparou-se o N-carboxianidrido do ácido 1-amino-1-ciclohexano c a rbo χ ί 1 i c o a partir do ácido 1-amino-1-cic1ohexanocarbo xílico com um rendimento de 50% pelo processo descrito no exemplo II A .

8. A uma solução do N-carboxianidrido preparada em A. (0,85 g 5,0 mmoles) e cloroformato de fenilo (1,2 g, 7,5 mmoles) em 30 ml de acetato de etilo à temperatura de 0° C, adicionou-se uma solução de 0,76 g (7,5 mmoles) de N-metilmorfo 1ina em 8 ml de acetato de etilo. A mistura reaccional foi agitada durante duas horas à temperatura de 0° C, filtrada e concentrada. 0 resíduo semi-sólido branco foi recristalizado com éter-dietílico/cloreto de metileno/ /hexano , para se obter 0,92 g (rendimento de 6 6 ?ó) do N-carboxia39 nidrido: ponto de fusão: 1 56,5 — 158° C; RMN (C D C1) O 7,28 ( m , 5 H),

1,20-3,10 (m, 10 H). Anál. Calcul. para C^H^NO^ C, 62,27; H,

5,23; Ν , 4,84. Determ: C, 62,03; H, 5,22; N, 4,77.

Exemplo XVI

N-(9-fluorenilmetiloxicarbonil)-L-leucina-N-carboxianidrido

A. Preparou-se L-leucina-N-carboxianidrido a partir de L-leucina com um rendimento de 78% pelo processo descrito no exemplo

II A .

B. Arrefeceu-se até à temperatura de -10°C uma mistura de L-leucina-N-carboxianidrido (9,2 g, 58,4 mmoles) (em 150 ml de acetato de etilo destilado anidro) e adicionou-se, gota a gota, no decurso de 5 minutos, uma solução de 9 ml (64 mmoles) de trietilamina em 20 ml de acetato de etilo. Suspendeu-se o arrefecimento e deixou-se a mistura reaccional sob agitação durante 15 minutos. Adicionou-se uma pequena quantidade de ácido clorídrico anidro em dioxano (4,4 M, 5 ml) a fim de se assegurar a neutralização de toda a trietilamina. A mistura reaccional foi filtrada e o dissolvente eliminado sob vazio. 0 produto impuro resultante, foi novamente suspenso em éter etílico, filtrado e o produto, obtido por cristalização, após adição a hexano. Após três outras cristalizações cuidadosas, obteve-se N - (9-f 1 uoreni1 meti1 oxicarbon i 1 ) - L -1 euc i na-N - c a rbo x i anid r i do com um rendimento de 1 6 ?ó (3,6 g). Os dados analíticos foram essencialmente idênticos aos obtidos no exemplo III.

Exemplo XVII

L-leucil-L-valina

9-f1uoreηi1meti1 oxicarboni1-1-va 1ina esterificada com álcool para alcoxibenzílico derivado de poliestireno a 2 0°í de r e ticulação (0,25 g., 0,13 mmole de valina) foi colocada num recipiente de síntese peptídica em fase sólida. Adicionaram-se 5 ml de dimeti1formamida e agitou-se a pasta durante trinta minutos.

Retirou-se a dimeti1formamida e a resina entumescida foi tratada duas vezes com piperidina a 10% em dimeti1formamida (5 ml durante cinco minutos, seguidos de mais 5 ml durante quinze minutos) para se eliminar o grupo protector de 9-f1uoreni1 meti1 oxicarboni1 . A resina foi lavada quatro vezes 5 ml de dimeti1formamida e submetida a reacção com 9-f luorenílmetiloxicarbonil -1 -1 euc ina-N-ca rbox i anidrido (145 mg, 0,38 mmole) em 6 ml de dimeti1formamid a durante quarenta e cinco minutos. 0 grupo protector de f1uoreni1meti1 oxi carbonilo foi removido tal como referido anteriormente e a resina foi lavada com 3 x 5 ml de dimeti1formamida e 3 x 5 ml de cloreto de metileno. 0 dipéptido resultante foi cindido da resina mediante tratamento com cloreto de meti1eno/ácido trif1uoro acético (6 ml 1/1) durante 45 minutos. A solução foi retirada e a resina lavada com 3 x 5 ml de cloreto de metileno e 2 x 5 ml de metanol. A solução e as fases de lavagem reunidas foram evaporadas sob vazio até uma consistência semi-sólida, após o que se retomou com água destilada e se filtrou. A solução aquosa foi liofilizada e o produto sólido resultante triturado três vezes com éter dietílico para se retirar contaminantes relacionados com a resina e seca sob

pressão reduzida para fornecer L-1euci1-L-va 1ina com um rendimento maior do que 9 0%. A identificação do dipéptido foi confirmada por análise de HPLC (débito = 1,5 ml/minuto, detecção a 215 nm, metanol a 30% em ácido perclórico 0,5 M) por co-eluição com um padrão conhecido (tempo de retenção, 8,49 minutos). A pureza foi determinada como sendo superior a 9 7%, com todos os produtos contaminantes, podendo ser seguidos na resina.

Não se pôde detectar qualquer D-1euci 1 -L-va 1 ina (tempo de retenção .· 32 minutos); limites de detecção 0,1%.

Exemplo XVIII

L -Leuci1-L-va 1ina

Repetiu-se o exemplo XVI, com a excepção de se fazer reagir

9-f1uoreniImeti1 oxicarboni1-L-leucina-N-carboxianidrido com a amina livre de L-valina na resina utilizando 5 ml de cloreto de metileno em substituição de dimetilformamida como dissolvente. Os resultados foram comparáveis aos do exemplo XVI.

Exemplo XIX

L-Leuci1-L-a 1ani1-L-va 1ina (processo EMOC) processo do exemplo XVI foi utilizado para preparar L-leuci 1 -L-a 1 ani1-L-va 1ina . Após cisão da resina e lavagens com éter dietílico obteve-se o tripeptido com o rendimento maior do que 88% sob a forma de um produto sólido branco. A análise de HPLC, utilizando as condições descritas no exemplo XVI, confirmou a identifi42

/ ' cação do produto que co-eluíu com retenção : 16,28 minutos). Não se cias, tais como L- 1 euci1-L-va 1ina de detecção: Ί. 0 , 1 ?ó) .

o padrão conhecido. (Tempo de detectaram delecções de sequên e L-a 1 a ηί1-L-va 1ina (limites

Exemplo XX

L- 1 euci1-L-a 1 aηi1-L-va 1ina (Processo Boc)

T-butiloxicarbonil-L-valina esterificado com poliestireno reticulado metilado a 2% (isto é, resina Merryfield) (0,50 g, 0,23 mmole de valina) foi colocado num recipiente de síntese peptídica de fase sólida. Adicionaram-se 5 ml de cloreto de metileno e agitou-se a pasta durante trinta minutos. 0 dissolvente foi eliminado e a resina tratada com cloreto de metileno/ácido trif1uoroacético (6 ml de 1/1) durante trinta minutos para eliminar o grupo protector de t-buti1 oxicarboni1 o. A resina foi lavada com 3 x 5 ml de cloreto de metileno, neutralizada com trietilamina a 10?ó em 5 ml de cloreto de metileno e lavada com 3 x 5 ml de cloreto de metileno e em seguida submetida a reacção com uma solução de t-buti1 oxicarboni1-L-alanina-N-carboxianidrido ( 200 mg, 1,0 mmole) em 5 ml de cloreto de metileno durante 45 minutos. A resina dipeptídica protegida resultante, foi lavada com três vezes 5 ml de cloreto de metileno. A resina foi novamente desbloqueada, lavada, neutralizada e lavada como descrito anteriormente. Adicionaram-se 240 mg (1,0 mmole) de t-butiloxicarbonil-L-leucina-N-carboxianidrido em 6 ml de cloreto dimetileno à resina e a mistura foi agitada durante 45 minutos. Foi retirada a solução e a

3

resina lavada com 3 x 5 ml de cloreto de metileno, 3 x 5 ml de metanol e 3 x 5 ml de cloreto de metileno e seca sob alto vazio.

A resina tripeptídica protegida de t-buti1 oxicarboni 1 o foi feita reagir com fluoreto de hidrogénio líquido à temperatura de 0° C durante 30 minutos. 0 fluoreto de hidrogénio foi eliminado e o resíduo seco sob alto vazio. 0 péptido foi retomado com água e a resina foi removida mediante filtração. A solução foi liofilizada para fornecer um rendimento quase quantitativo de L-leucil-L-alani1-L-va 1 ina. Os resultados analíticos de HPLC foram comparáveis com os do exemplo XVIII.

Exemplο XXI

L-a 1 ani1-L-feni1 a 1anina (via processo de protecção total).

A. Ao éster L-fenilalaninabenzílico de paratoluenosulfonato (1,07 g, 2,25 mmoles) em 20 ml de tetrahidrofurano, à temperatura de 0° 0, adicionou-se 0,25 g (2,5 mmoles) de metiImorfo 1ina. A mistura foi agitada durante meia hora à temperatura de 0° C e adicionada com 0,50 g (2,0 mmoles) de N-benzilox.icarbonil-L-ala1ina-N-carboxianid ri do. A mistura reaccional foi agitada durante duas horas à temperatura de 0° C e adicionada com 20 ml de água e 50 ml de diclorometano. As camadas foram separadas e a fase aquosa lavada com 25 ml de diclorometano. Os extractos orgânicos reunidos foram lavados com 2 x 50 ml de ácido clorídrico 0,5 M, ml de solução de carbonato de hidrogénio e sódio a 10?ó e 2x50 ml de água, secos sobre sulfato de magnésio e concentrados. A cristalização verificou-se após a adição de hexano, para se obter

0,66 g (rendimento de 12%} do éster benzílico de N-benziloxicarbonil-L-alanil-L-fenilalanina: ponto de fusão 118,5-119°C; RMN

(CDC13) C	>7,64 (s , 1	Η), 6,82-7 , 39	( m , 6 H ) ,	5,04	( s ,	2 Η) ,	5,00
(s, 2 H ) ,	4,58-4,92	(m, 2 Η), 3,07	(d, J = 6	Hz , 2	H)	1 ,29	(d ,
J=7 Hz, 3	H) .
B . Uma	mistura do	éster benzílico de N-beηzi 1 oxicarboni 1	-L-
-alanil-L	-feni1 a 1 anina (0,50 g, 1,1	mmole) e	0,1 g	de	palád	i 0

sobre carvão a 10% em 150 ml de álcool etílico foi agitada num aparelho de hidrogenação de PARR, durante 6 horas e meia, à temperatura de 20° C. A mistura reaccional foi filtrada e o filtrado lavado com 100 ml de água. A solução foi concentrada para fornecer 0,26 g (rendimento de 1 0 0 ?ó) de L-a 1 an i 1-L - f en i 1 a 1 an ina . A análise de HPLC evidenciou uma pureza superior a 99% e ausência de racemização.

Exemplo XXII

L-a I aηi1-L-feni1 a 1anina (processo de protecção parcial).

A. A uma solução de 0,33 g (2,0 mmoles) de L-feni1 a 1anina em 20 ml de carbonato de potássio 0,20 M e 30 mi de acetonitrilo, adicionou-se gota a gota, 0,45 g (1,8 mmoles) de N-benziloxicarbonil-L-alanina-N-carboxianidrido em 5 ml de acetonitrilo à temperatura de 0° C. A mistura foi agitada durante 40 minutos a essa temperatura e diluída com 50 ml de acetato de etilo e 10 ml de ácido clorídrico 1M. As fases foram separadas e a fase aquosa extraída com 2 x 35 ml de acetato de etilo. As fraeções orgânicas

- 65 reunidas foram lavadas com 30 ml de uma solução concentrada de cloreto de sódio, duas vezes 50 ml de ácido clorídrico 0,5 M e duas vezes 50 ml de água, secas sobre sulfato de magnésio e concentradas. 0 resíduo foi recrista 1izado em c1 orofórmio/hexano , para se obter 0,26 g, rendimento de 39% de N-benziloxicarbonil-L-alanil-L-fenilalanina: ponto de fusão 121-122° C ; RMN (DMSO-d ) S 12 , 71 (s, 1 H), 8,06 (m, 1H), 7,30 (m, 5 H), 5,01 (s, 2 H),

4,43 (m, 1 H), 4,06 (m, 1 H), 2,99 (m, 2 H), 11,19 (d, 2 H, J = •7 Hz ) .

B. Uma mistura de 0,208 g (0,562 mmole) de N-benziloxicarbonil-L-alanil-L-fenilalanina e 0,1 g de paládio a 10% sobre carvão, em 50 ml de álcool etílico a 95%, foi agitada num aparelho de hidrogenação de PARR durante dezasseis horas, à temperatura de 20° C. A mistura reaccional foi filtrada e o filtrado foi lavado com 100 ml de água. As soluções reunidas foram concentradas para fornecerem 0,122 g (92% de rendimento) de L-a 1 a ηi1-L-feni1 a lanina sob a forma de um produto sólido branco. A análise de HPLC evidenciou uma pureza superior a 99,5% e a ausência de racemização

Claims (38)

1.- Processo para a preparaçao de N-carboxianidridos ou N-tiocarboxianidridos de aminoácidos protegidos com uretano de fórmula geral

R' na qual

R e R' representam, cada um, um átomo de hidrogénio ou um grupo alquilo, cicloalquilo ou cicloalquilo substituído ou arilo facultativamente substituido;

R representa um grupo alquilo ou arilo, facultativamente substituídos;

-47ζ

Ζ representa um átomo de oxigénio ou de enxofre; e n representa o numero 0,1 ou 2, caracterizado pelo facto de se fazer reagir um N-carboxianidrido ou um N-tiocarboxianidrido de aminoãcido de fórmula geral na qual

R e R' têm os significados com um halogenoformato de fórmula definidos antes geral

R— 0 — C —X na qual

X representa um átomo de halogéneo e R tem o significado definido antes, no seio de um dissolvente inerte, sob condições anidras e na presença de uma base de amina terciária.

2.- Processo de acordo com a reivindicação 1, por a preparação de compostos de fórmula geral I na qual R representa um grupo alquilo comportando 1 a 20 átomos de carbono, caracterizado pelo facto de utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituídos.

3. - Processo de acordo com a reivindicação 2, para a preparação de compostos de fórmula geral I na qual R representa um grupo alquilo inferior facultativamente substituído, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituídos.

4. - Processo de acordo com a reivindicação 3, para a preparação de compostos de fórmula geral I, na qual R representa um grupo t-butilo, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituídos.

5. - Processo de acordo com a reivindicação 1, para a preparação de compostos de fórmula geral I na qual R representa um grupo arilo facultativamente substituído, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituídos.

6. - Processo de acordo com a reivindicação 5, para a preparação de compostos de fórmula geral I, na qual R representa um grupo fenilo facultativamente substituído, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais corresponcentemen te substituídos.

7. - Processo de acordo com a reivindicação 1, para a preparação de compostos de fórmula geral I na qual R repre-49ρ senta um grupo aralquilo facultativamente substituído, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituídos.

8.- Processo de acordo com a reivindicação 7, para a preparação de compostos de fórmula geral I, na qual R representa um grupo benzilo facultativamente substituído, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituídos.

9.- Processo de acordo com a reivindicação 8, para a preparação de compostos de fórmula geral I na qual R representa um grupo p-metoxibenzilo caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituídos.

10.- Processo de acordo com a reivindicação 7, para a preparação de compostos de fórmula geral I na qual R representa um grupo 9-fluorenilmetilo facultativamente substituído , caracte rizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituídos.

11.- Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 10, para a preparação de compostos de fórmula geral I na qual pelo menos um dos símbolos R e R' representa a cadeia lateral de um aminoácido facultativamente protegido, caracteri-50zado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituídos.

12. - Processo de acordo com a reivindicação 11, para a preparação de compostos de fórmula geral I na qual R ou R¹ representa a cadeia lateral de alanina, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituídos.

13. - Processo de acordo com a reivindicação 11, para a preparação de compostos de fórmula geral I na qual R ou R' representa a cadeia lateral da arginina ou da arginina apropriadamente protegida, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituídos.

14. - Processo de acordo com a reivindicação 11, para a preparação de compostos de fórmula geral I, na qual R ou R' representa a cadeia lateral do ãcido aspártico ou do ãcido aspãrtico apropriadamente protegido, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituídos.

15.- Processo de acordo com a reivindicação 11, para a preparação de compostos de fórmula geral I na qual R ou R' representa a cadeia lateral da asparagina ou da asparagina apropriadamente protegida, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituídos.

16.- Processo de acordo com a reivindicação 11, para a preparação de compostos de fórmula geral I na qual R ou R' representa a cadeia lateral da cisteina ou da cisteina apropriadamente substituída, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituídos.

17.- Processo de acordo com a reivindicação 11, para a preparação de compostos de fórmula geral I, na qual R ou R' representa a cadeia lateral da cistina, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituídos .

11, para a

R ou R' reácido glutãfacto de se substituidos.

18.- Processo de acordo com a reivindicação preparação de compostos de fórmula geral I na qual presenta a cadeia lateral do ãcido glutâmico ou do mico apropriadamente protegido, caracterizado pelo utilizarem compostos iniciais correspondentemente

19.- Processo de acordo com a reivindicação 11, para a preparação de compostos de fórmula geral I na qual R ou R' representa a cadeia lateral da glutamina facultativamente protegida de um modo apropriado, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituídos.

20.- Processo de acordo com a reivindicação 11, para a

-52preparação de compostos de fórmula geral I na qual R ou R' representa a cadeia lateral da histidina facultativamente protegida de um modo apropriado, caracterizado pelo facto de se utilizarem comoostos iniciais correspondentemente substituídos.

21,- Processo de acordo com a reivindicação 11, para a preparação de compostos de fórmula geral I na qual R ou R' representa a cadeia lateral da isoleucina, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais corresponentemente substituídos.

22. - Processo de acordo com reivindicação 11, para a pre paração de compostos de fórmula geral I na qual R ou R' represen ta a cadeia lateral de uma lisina protegida de um modo apropriado, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituídos.

23. - Processo de acordo com a reivindicação 11, para a preparação de compostos de fórmula geral I na qual R ou R' repre senta a cadeia lateral de leucina, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituídos .

24. - Processo de acordo com a reivindicação 11 para a pre paração de compostos de fórmula geral I na qual R ou R' represen ta a cadeia lateral de metionina, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituídos.

25. - Processo de acordo com a reivindicação 11, para a preparação de compostos de fórmula geral I na qual R ouR' representa a cadeia lateral de norleucina, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituídos .

26. - Processo de acordo com a reivindicação 11, para a preparação de compostos de fórmula geral I na qual R ou R' representa a cadeia lateral de ornitina protegida de um modo apropriado, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituídos.

27. - Processo de acordo com a reivindicação 11, para a preparação de compostos de fórmula geral I, na qual R ou R' repre senta a cadeia lateral da fenilalanina, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituí dos.

28. - Processo de acordo com a reivindicação 11, para a preparação de compostos de fórmula geral I na qual R ou R¹ representa a cadeia lateral de serina, facultativamente protegida de um modo apropriado, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais corresDondentemente substituídos.

29.- Processo de acordo com a reivindicação 11, para a preparação de compostos de fórmula geral I na qual R ou R’ representa a cadeia lateral de treonina facultativamente protegida de um modo apropriado, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituídos.

30. - Processo de acordo com a reivindicação 11, para a preparação de compostos de fórmula geral I na qual R ou R' representa a cadeia lateral de triptofano facultativamente protegido de um modo apropriado, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituídos.

31. - Processo de acordo com a reivindicação 11, para a preparação de compostos de fórmula geral I, na qual R ou R' representa a cadeia lateral de tirosina facultativamente protegida de um modo apropriado, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituídos.

32. - Processo de acordo com a reivindicação 11, para a preparação de compostos de fórmula geral I na qual R ou R' representa a cadeia lateral da valina, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituídos .

33. - Processo de acordo com as reivindicação 11,

-55ι para a preparação de compostos de fórmula geral I na qual R ou R' representa a cadeia lateral da homoserina facultativamente protegida de um modo apropriado, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituídos.

34.- Processo para a síntese de uma cadeia polipeptídica na qual um componente de aminoâcido protegido se faz reagir com um segundo componente de aminoâcido similar ou diferente em que o processo se repete até se obter o polipeptido desejado, caracterizado pelo facto de se utilizar, como componente de aminoâcido pro tegido, pelo menos em uma das reacções referidas, um composto de fórmula geral

R’ na qual R e R' representam, cada um, um átomo de hidrogénio ou um grupo alquilo ou arilo facultativamente substituídos; R representa um grupo alquilo ou arilo facultativamente substituídos; Z representa um ãtomo de oxiaénio ou um átomo de enxofre; e n representa o número 0,1 ou 2.

35.- Processo para síntese de fase sólida de uma cadeia polipeptídica num suporte solúvel ou insolúvel, em cue um ,componente aminoácido protegido é ligado mediante uma reacção de condensação a um suporte que contém grupos substituintes reactivos com o terminal carboxilo do componente de aminoácido referido, o componente de aminoácido protegido ligado é desprotegido e neutralizado, se necessário, um segundo componente de aminoácido similar ou diferente é ligado ao referido composto aminoácido desprotegido e o processo se repete até ã obtenção do polipéptido desejado, caracterizado por se utilizar, como componente de aminoácido protegido, pelo menos em uma das reacções referidas, um composto de fórmula geral

R' na qual R e R' representam, cada um, um átomo de hidrogénio ou um grupo alquilo ou cicloalquilo facultativamente substituídos ou arilo facultativamente substituído; R representa um grupo alquilo ou arilo facultativamente substituídos; Z representa um átomo de oxigénio ou de enxofre; e n representa um número 0, 1 ou 2.

36.- Processo para a síntese de uma cadeia polipeptídica em que um componente de aminoácido protegido se faz reagir com um segundo componente de aminoácido igual ou diferente e o processo é repetido até à obtenção do polipéptido desejado, caracterizado por se utilizar, como componente de aminoacido protegido, pelo menos em uma das referidas reacções, um composto preparado pelo processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 33.

37. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 33, caracterizado pelo facto de se utilizar como base de amina terciária N-metilmorfolina.

38. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 33 e 37, caracterizado pelo facto de se recuperar mediante cristalização o produto da reacção N-carboxianidrido de aminoãcido protegido com uretano,