JPH04502908A - アミノ酸のトリアルキルシリルエステルおよびペプチド合成におけるその使用 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 アミノ酸のトリアルキルシリルエステルおよびペプチド合成におけるその使用 本発明はペプチド合成の新規な方法およびこれらの方法に使用する新規な試剤に 関する０本発明はまた本発明の方法を実施するのに使用する試剤箱をも提供する 。

近年、合成ペプチドワクチンの開発、抗原−抗体相互作用の詳細な研究、バオオ 活性ペプチド同族体の製造、臨床診断利用のペプチド抗原の最適化、特定遺伝子 の蛋白生成物のマツピング、右よび適合性パラメータの研究を包含する広範囲な 種類の用途における合成ペプチドの必要が飛躍的に増大した。これらの研究の大 部分において、限定因子は所望のペプチドの入手とコストであった。ペプチド合 成を迅速に且つコスト的に有効な方法で行なうことを可能にする方法が入手しつ るならば、これらの研究は非常に促進されるであろう、同様に商業的利用にとっ て、大規模操作に好適なプロトコールが必要である。

ペプチドはアミノ酸から誘導される線状ポリマーであり、一般に次式（Ｉ）をも つ。

ＨＪ、Ａ’、ＣＯ，ＮＨ，Ａ”、ＣＯ，Ｎ１１１．＾’、ＣＯ，ＮＨ，Ａ’、Ｃ Ｏ，Ａ’−’、ＣＧ、ＮＨ，Ａ、Ｃ００Ｈ（Ｉ） 式中、Ａ’　、Ａ”　、Ａ’−−−Ａ”はペプチドを形成するアミノ酸の残基で ある。

このようなアミノ酸は次式（ＩＩ）によって表わされる。

Ｈ，Ｎ、Ａ’　、Ｃ０ＯＨ，Ｈｔ　Ｎ、Ａ”　、Ｃ０ＯＨ、、、など（■夏） ペプチドはたとえばプロリンのようなイミノ酸（いわゆる複素環アミノ酸と呼ば れる）から誘導されるサブ・ユニットを付加的に含むことができる。このような サブ・ユニットは次式（ＩＩＩ　）によって表わされる。

、Ｎ＜Ａ、Ｃｏ、　（ＩＩＩ　） 式中、Ｎ＜Ａは複素環基を表わす。

対応すルアミノ酸は式ＨＮ＜Ａ、Ｃ０ＯＨ（ＩＶ）をもつ。

重要な種類のアミノ酸は蛋白のサブ・ユニットを形成するα−アミノ酸である。

これらのアミノ酸はＬ−形態のものであり、「天然産アミノ酸」と記述された。

天然産の実質的にすべての蛋白は均一細胞の原核微生物からのものであれ、ある いは高級な生命形体のものすなわち真核からのものであれ、同一セットの２０個 のα−アミノ酸から構成される。これらのアミノ酸のうちの１９個は構造Ｈｓ　 ＮＣＨＲＣＯＯＨ（Ｖ）をもつものとして記述することができる０式中ＣＨＲは アミノ酸残基と呼ぶことができ、Ｒは側鎖と呼ぶことができる。グリシンに右い て、この系列の単一アミノ酸は光学的に活性ではなく、Ｒは水素である。プロリ ンは式（’Ｖ）によって表わすことはできなくて、それは式（ｒｖ）のイミノ酸 であり、その残基はピロリジン環の一部を形成する。

一般に、側鎖Ｒはハイドロカルビル基であり、たとえばアラニン、バリン、ロイ シン、イソロイシン、メチオニン右よびフェニルアラニンにおけるようなアルキ ルまたはアリール基である。残基Ｒは極性であるが非イオン性の基を含むことが できる。たとえばアスバルチン酸、グルタミン酸、リジン、アルジニン、ヒスチ ジン、チロシン、トリプトファンおよびヒスティンに右けるようなＲ基である。

ペプチドは２つの異なったルートすなわち生物学的ルートおよび化学ルートによ って合成することができる０本発明は第２のルートに関するものである。

多くの天然産の薬理学的に活性なペプチドもしくは蛋白ホルモンは、インシュリ ン、ガストリン、オキシトシン、バンブレジンおよびプラデイキニンを含めて、 化学的手段によって合成された。

然しながら、ペプチドの化学合成における基本的な問題は、反応して所望のペプ チド形成する基が他の官能基と望まない副反応に入りやすいという事実である。

これらの他の官能基は所望のペプチド結合を形成するもの以外のアミノ酸試剤中 の基であることができ、あるいはそれらは試剤の官能性であることができる。

その結果として、ペプチド合成の最もよく知られている方法は保護基を使用して このような官能性の基がペプチド形成性試剤と反応しないようにすることを必要 としている。すなわち、ペプチド鎖の合成における各アミノ酸の付加は、ペプチ ド結合の形成に実際に関与する工程の他に、保護基（ブロッキング基）を取付け て次にこれを除去するい（つかの工程を必要とする。

ブロッキング基を利用する便利な方法は始めにエミール・フィッシャーによって 試みられ、そして構造のわかったペプチドの合成についての古典的試みはパーク マンおよび共同研究者によって発展された。バークマンの方法において、Ｎ−末 端のアミノ酸前駆体のアミノ基は、代表的にはアルカリ存在下でのペンゾイル力 −ボニルクロライドとの反応（ショツテン−バウマン反応）によってブロックま たは保護される。

Ｃ＠Ｈ＠ＣＨ＊０ＣＯＣ１＋　Ｈ，ＮＣＨＲＣＯＯＨ（ＶＩ）　（Ｖ　） ＝　Ｃａ　Ｈｓ　ＣＨｓ　ＯＣＯＮ　ＨＣＨＲＣＯＯＨ（１）（ＶＩＩ　） このＮ−末端ベンゾイルカーボニル保護アミノ酸前駆体に次のアミノ酸前駆体を 加えてカップリングさせる。

Ｃ＠Ｈ，ＣＨ，０ＣＯＮＨＣＨＲＣＯＮＨＣＨＲ’　Ｃ００Ｈ（ＶＩＩＩ） この系列の諸工程を繰り返してトリーまたは高級ペプチドを製造する。この方法 は溶液中で行なうので、中間のペプチド前駆体は副生物、未反応試剤などから分 離することが必要である。最後の工程において、末端Ｃｓ　Ｈｗ　ＣＨｓ　ＯＣ Ｏブロッキング基は。

接触水浴によって（トルエンとＣＯ怠が副生成物として生成する）またはＨＢｒ ／酢酸の使用によって開裂して所望のペプチド生成する。

このような化学的なペプチド合成法は３つの重要な因子を考慮に入れる必要があ る。第１に、所望のペプチドを合成するために、始めのペプチド鎖に所望のアミ ノ酸残基を結合させ、ひきつづいて所望の順序でこの操作を行なうという段階的 な方法で合成を続けなければならない。

第２に、−Ａ　’　ＣＯＯＨヲＮ　Ｈｔ　Ａ　”　（Ｘ　）　！：結合サすルこ とによってペプチド結合−Ａ’　、ＣＯ，ＮＨ，Ａ”　−（ＩＸ）を作るために 、カルボキシル基、Ｃ０ＯＨは活性種、ＣＯＯε″Ｃは離脱性基である）に転化 させる必要がある。この活性種において、カーボニル基は活性化され、モしてＮ Ｈ＊Ａ’−の遊離アミノ基によって核攻撃を受ける。

第３に、望ましくない副反応に入りつるすべての反応性基（−ＮＨ，基および一 〇〇ε基以外）は他の活性種による攻撃から保護される必要がある。

これらの因子を考慮に入れた技術が確立された。最も重要なのはマリフィールド とシェパードによって考案された固体状態の方法である。この点に関して、固相 ペプチド合成はマリフィールド（１９６９，１９７３）によって、メイエンホー フエン（１９７３）によって、およびエリックソンとマリフィールド（１９７６ ンによって詳細に検討された。それ以来１強調点を変えてこの方法を述べたもの としてアサ−トン（１９７９）の方法、シェパード（１９７７）の方法およびマ ルネットら（１９７９）の方法があげられる。

固相法の重要なアイディアと特徴は次の４項目である。

１）　ポリマー支持体に共有結合させながらペプチドを合成する。これは副生物 からの生成物の容易な分離を可能にする。

２）　ポリマー支持のペプチド鎖の反応は過剰試剤の使用により完了に向って駆 動されつる。

３）　合成の全期間中、単一の反応器中にペプチド・ポリマービーズを保持する ことによって機械的損失が避けられる。

４）　物理的操作は自動化を受けやすい。

マリフィールドの戦術はＮ−保護アミノ酸ＨＯＯＣ０Ａ、ＮＨＰｒｏｔ　（ＸＩ ）を使用してこれを活性化形体　ε、Ｃｏ、Ａ。

ＮＨＰｒｏｔ　（ＸＩＩ）に転化させる。

伝統的に第３級ブトキシカーボニル（ｔＢｏｃ）はえらばれた保護基であった。

マリフィールドの方法において、始めの（Ｃ−末ｊｌｉ）アミノ酸ＮＨ，Ａ’　 Ｃ０ＯＨをそのカルボキシル基を介して樹脂に共有結合させる。これは遊離−Ｃ Ｈ，ｃｌ基をもつ樹脂を保護アミノ酸セシウム塩ＣｓＯ，ＣＯ，Ａ’″、ＮＨＰ ｒｏｔ（ＸＩＩ　）と反応させてｎ番目の保護アミノ酸を結合させた樹脂すなわ ちＲｅ５ｉｎ、ＣＨｔＯＣＯ，Ａ”ＮＨＰｒｏｔ　（ＸＩＩＩ）を作ることによ って達成される０次の工程（またはサイクル）に右いて、保護基Ｐｒｏｔを除去 し、遊離アミノ基Ｒｅ５ｉｎ。

ＣＨ，Ｏ，Ｃｏ、Ａ”　、ＮＨｓ　（ＸＩＶ　）を残し、ｎ番目ノアミノ酸を結 合させた樹脂粒子を次の（ｎ−１）番目の活性化保護アミノ酸ｇ、　ｃｏ、Ａ” 　、ＮＨＰｒｏｔ　（ＸＩＩ　’　）と反応させる。この活性化保護アミノ酸は 所望のペプチドの（ｎ−１）番目のアミノ酸を形成する。すなわち Ｒｅ５ｉｎ、ＣＨＩ　ＯＣＯ，Ａ’　、ＮＨｍ（ＸＩＶ　） −Ｉ　Ｒａｇｉｎ、ＣＨｍＯＣＯ，Ａ”、ＮＨＣＯＡ”−’ＮＨＰｒｏｔ。

この系列の工程を、所望の樹脂結合ペプチドが生成するまで、（りかえず０次い でペプチドを樹脂から開裂し、脱保護する。ｖＩ記のように、固相合成ペプチド 化学において、第３級ブトキシ・オキシカーボニル（ｔ−Ｂｏｃ）がえらばれた 保護基であった。

然しながら、この保護基は脱保護および最終開裂の双方において強酸の使用を必 要とする。その上、このような酸性条件の使用はアミノ酸の側鎖たとえば基本ア ミノ酸（Ｌｙｓ、ＨｉｓＪ５よびＡｒｇ）を保護するために酸に安定な保護部分 （たとえばベンジル基）の使用を必要としていた。

更に詳しく、メリフィールドによって開発されたペプチド合成の固相法において 、ペプチド鎖はペプチド鎖のカルボキシルまたはＣ−末端残基であることを意図 するアミノ酸から出発してアミノ酸からアミノ酸へと連結して構成される。

このＣ−末端アミノ酸はその−ＣＯＯＨ基を介して不溶性樹脂支持体に共有結合 する。クロロメチル化ポリスチレンが最も多く使用される。Ｃ−末端アミノ酸に より生成したベンジルエステルは容易に開裂しつるからである。

−４ｔ−Ｂｏｃ−ＮＨＣＨＲＣＯＯ−ＣＨＩ−Ｒｅｓｉｎ（ＸＶＩＩＩ　） ｔ−ブチルオキシカーボニル（ｔ−Ｂｏｃ）基でアミノ基をブロックした後、生 成ペプチド鎖中に使用しようとする次のアミノ酸はカップリング活性化剤たとえ ばジシクロヘキシルジカルポジイミド（ＤＣＣ）で活性化し、樹脂に結合したア ミノ酸（Ｈｍ　ＮＣＨＲＣＯＯ−ＣＨｓ　−Ｒｅ　ｓ　ｉ　ｎ　ＸＶＩＩＩ　′ ）の脱保護アミノ基にカップリングする。

（ｔ−Ｂｕ−ＯＣＯ）＊　Ｏ＋　Ｈ＠　ＮＣＨＲ′　Ｃｏｏｌ（（ＸＩＸ　’） 　（ＸＸ） ｔ−Ｂｏｃ基は次いでトリフルオロ酢酸による処理によって除去され、そして中 和後に、樹脂に結合した成長しつつあるペプチド鎖が次のアミノ酸前駆体の添加 に供される。この系列は必要な構造をもつペプチド鎖が合成されるまで反復され る。樹脂粒子に結合した成長しつつあるペプチド鎖が濾過によって液相が分離さ れるほど十分に大きくなると、多くの反復工程における過剰試剤の除去と樹脂粒 子の洗浄が容易になり、この方法をより大きなペプチドおよび蛋白によってより 便利なものとする。ペプチド鎖が完成すると、それはペプチド結合に悪影響を及 ぼさない反応によって樹脂支持体から開裂される。代表的に弗化水素を使用して ペプチドを樹脂から開裂させる。

近年、活性化保護アミノ酸ａｃＯＡ＊　Ｐｒｏｔの保護基としてフルオレニルメ トキシカーボニル（Ｆｍｏｃ）の導入がみられた。このＦ　ｍ　ｏ　ｃの試みの 最も顕著な相違は保護基が塩基によって、代表的にはピペリジンを使用して除去 しつる点にある。

然しながう、原理的にいってＦｍｏｃ法とｔＢｏｃ法との間には大きな類似性が 存在する。合成の各サイクルは最後に結合させたアミノ残基の脱保護とそれにつ づ（次の活性化アミノ酸のカップリングを含む。Ｆ　ｍ　ｏ　ｃ法とｔＢｏｃ法 の双方において、保護されたアミノ酸の対称無水物が活性種として非常に有利で あった。アミノ酸のＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾール誘導体およびペンタフル オロフェニルエステルも使用することができる。対称無水物の有利な理由は主と して対応するアミノ酸活性エステルに比べてのその大きな反応性による。然しな がら、使用直前にＦｍｏｃ対称無水物を製造する必要性はこの活性化プロトコー ルを自動機器に設置することを妨げた。これはｔＢｏｃアミノ酸をもとにする自 動ペプチド合成についても真実である。

利用しつるペプチド合成法は多くの重要な欠点をもち、これらの欠点はその利用 とくに自動装置でのそれらの利用をひどく限定した。

第１に、ｔＢｏｃ法およびＦｍｏｃ法はそれぞれｔＢｏｃ基右よびＦｍｏｃ保厘 基の除去のためにそれぞれ厳重な酸性条件および塩基性条件の使用を必要として いる。すなわち、ｔＢｏｃ法ではトリフルオロ酢酸のような強酸を使用しなけれ ばならず、そしてＦｍｏｃ法ではＤＭＦ中のピペリジンのような塩基を使用しな ければならない、ｔＢｏｃ保護基を除去するためにトリフルオロ酢酸を使用する ことは特に煩維である。サイクル毎に樹脂粒子をトリフルオロ酢酸とくりかえし 接触させることは樹脂の劣化を生ぜしめるからである。

第２に、ｔＢｏｃ法とＦｍｏｃ法の双方において、使用する酸性試剤および塩基 性試剤の除去のためにくりかえしの洗浄サイクルが必要である。

第３に、ある種の活性化保護アミノ酸（対称無水物）の使用はｔＢｏｃ法および Ｆｍｏｃ法の自動装置への容易な利用を妨げる。このような系は比較的安定な試 剤の使用を必要とする。所望のペプチドを合成するに必要な試剤のすべてを供給 するには比較的長期間の貯蔵が必要になるからである。然しながら、活性化した 保護化アミノ酸は一般に不安定であり、痕跡量の水の存在下でさえ分解を受けや すい、そして多くの商業的に入手しつる活性化した保護化アミノ酸は非常に高価 である。

第４に、ｔＢｏｃ法およびＦｍｏｃ法は樹脂結合のペプチド鎖のＮ−末端アミノ 酸残基と活性化保護化アミノ酸試剤との反応完了を確保するためにサイクル毎に 過剰の活性化保護化アミノ酸試剤の使用を必要とする。すなわち、たとえば対称 無水物を活性化保護化アミノ酸試剤として使用するとき、該試剤はＮ−末端アミ ノ残基のモル当り該試剤少なくとも４モルの比で存在させる必要がある。試剤モ ル毎に２モルのアミノ酸が生成するので、これは８倍過剰のアミノ酸出発物質の 必要性を表わす。

本発明は従来技術の固相ペプチド合成に伴う問題を次の方法によって解決しよう とするものである。その方法は所望のペプチドの第１アミノ酸をそのアミノ基を 介して樹脂に結合させ、このようにして結合させたアミノ酸のカルボキシル基を 活性化し、そしてカルボキシ保護アミノ酸試剤を使用してペプチド結合を結合ア ミノ酸の活性化カルボキシ基への核的攻撃によって生成させることから成る。爾 後のアミノ酸も同様にして結合させる。

上記の方法において、カルボキシ保護アミノ酸に反応性側鎖がある場合、該側鎖 は周知の方法によって保護することができる。

本発明により使用するカルボキシ保護基はＯ−シリルエステル基である。下記に 述べる偶然の例外は別として、０−シリルエステル保護基をもつアミノ酸は新規 であり、本発明のもう１つの面をなす。

下記に示すように、若干のシリル化アミノ酸は近年になって特にガスクロマトグ ラフ用のＮ−アセチルアミノ酸のカルボキシ部分の誘導化について記載された（ アーリイら、１９７８）。

また、１９６０年代のパークオファ−らの＾ｎｇｅｖ、　Ｃｈｅｗ、　７７゜４ １４　（１９６５）　ｉクリッベルトルフらのＬｉｅｂｉｇｓ　Ａｎｎ、　Ｃｈ ｅｗ、、　７６３゜１７−３８　（１９７２１、リューマンらのＬｉｅｂｉｇｓ 　Ａｎｎ、　Ｃｈｅｗ、　６δ３．２１１ｆ１９６５）　；にはアミノ酸および ペプチドのトリメチルクロロシランが記載されている０代表的な実験（たとえば 、パークオファ−１９６０）において、アミノ酸は溶液がえられるまで数滴の濃 ＨＩＳＯイを含む過剰のへキサメチルジシラン中で１３０〜１４０℃に加熱され た０次いでこれを冷却してベンゼンを加え、その後にトリエチルアミンとトリメ チルシリルクロライドを加え、そして混合物を１２〜１６時間室厘に保った。

えられた固体を濾過して除き、濾液を蒸発させ真空下で蒸留して所望のＮ−トリ メチルシリルアミノ酸トリメチルシリルエステルを得た。

更に、バーロスらはＪ、　Ｏｒｇ、　Ｃｈｅｗ、　４７．１３２４　（１９８２ １に右し）てＮ−１−リチルアミノ酸合成の中間体としてアミノ酸のトリメチル シリルエステルの生成を仮定している。黙しながらこのような構造上の中間体の 実在、製造または単離の決定的な証拠は示されなかった。

上記のように、本発明はその方法の面において、所望のペプチドのＮ−末端を形 成する始めのアミノ酸が段階的合成ルートの出発点を形成し、このアミノ酸のカ ルボキシル基が活性化され、そして活性化カルボキシ基がカルボキシ保護アミノ 酸の遊離アミノ基と反応するという方法によって明白な利点がこのペプチド合成 かうえられるという理解にもとづいている。

本発明の一面によれば、本発明は のペプチドを製造する方法であって、次の諸工程すなわち（Ａ）固体支持体に結 合したアミノ酸または固体支持体に結合したペプチドから成る の固相試剤をカルボキシル基活性化剤と反応させての活性化固相試剤を製造し、 （Ｂ）工程（Ａ）からの活性化固相試剤を式　Ｈ，ＮＨ，Ａ、Ｃｏ、Ｏ，Ｐｒｏ 　ｔ　（ＸＸＶＨ）のカルボキシ保護アミノ酸と反応させて（ＸＸＶＩＩＩ） の鎖延長生成物を製造し、 （Ｃ）該保護基Ｐｒｏｔを除去し、 （Ｄ）任意に工程（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）をＸ回くりかえし、そして の生成ペプチドを支持体から開裂させる；〔ただしわは０または正の整数であり ；Ｃは離脱基であり；Ｐｒｏｔはシリル基であり；それぞれのＡは同一でも異な っていてもよくアミノ酸の残基を表わすか、あるいは構造ＮＨ，Ａ、Ｃｏはイミ ノ酸ＮＨ＜ＡＣＯＯＴ（のＮ＜Ａである；そして残基Ａの反応性側鎖は保護され そして次に脱保護される；そして工程（Ａ）と（Ｂ）は順次にまたは単一操作で 行なわれるｊ諸工程から成ることを特徴とする上記式（ＸＸＩＶ）のペプチドの 製造方法、を提供するものである。

単一の操作で行なわれるとき、本発明の方法は次の諸工程から成る。

（ａ）固体支持体に結合したアミノ酸または固体支持体に結合したペプチドから 成る をもつ固相試剤をカルボキシ基活性化剤および式　Ｈ，ＮＨ，Ａ、Ｃｏ、Ｐｒｏ ｔ　（ＸＸＶＩＩ　）のカルボキシ保護アミノ酸と同時に反応させて（ｘｘｖｎ ｇ の鎖延長生成物を製造し、 （ｂ）該保護基Ｐｒｏｔを除去し。

（ｃ）任意に工程（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）をＸ回くりかえの生成ペプチドを 支持体から開裂させる。

〔ただしｎ、ｘ、ｔ、ＰｒｏｔおよびＡは前記定義のとありであり、そして残基 Ａの反応性側鎖は保護され、そしてその後に脱保護される。

好ましくは式 （ｎはｌである）の固相試剤はＨ，ＮＨ，Ａ、Ｇｏ、０Ｐｒｏｔのカルボキシ保 護アミノ酸を該カルボキシ保護アミノ酸のアミノ基もしくは基と共有結合を形成 しつる基をもつ支持体と反応させ、そして該保護基Ｐｒｏｔを除去することによ って製造される。

上記の反応式において、アミノ酸残基Ａは天然蛋白のアミノ酸に制限されない広 範囲のアミノ酸から誘導することができる。

すことができる、０は基、ＮＨＢを表わすが、あるいは０はＮ、ＣＪ３よびＯか らえらばれた４〜７個の環原子を含む複素環を表わす、なお上記、ＮＨＢに右い てＢは飽和または不飽和のＣ＋−＋。ハイドロカルビル基を表わし、該ハイドロ カルビル基はヒドロキシ、オキシ、チオ、ｃＩ−ａアルキルチオ、Ｃｌ−４アル コキシ、カルボキシ、アセトアミドまたは、ＮＲａ　Ｒ１（Ｒ４とＲ１は同一で も興なっていてもよく、Ｃｌ−４アルキル基を表わす）からえらばれた１個以上 の置換基によって任意に置換されていてもよい。

従って本発明は次の種類の１種以上のアミノ酸から誘導されたペプチドの製造を 包含する・ （ｉｌ　２０種のα−アミノ酸すなわち、グリシン、アラニン、バリン、ロイシ ン、イソロイシン、セリン、スレオニン、アスバルチン酸、アスパラギン、グル タミン酸、グルタミン、リジン、ヒスチチジン、アルジニン、フェニルアラニン 、チロシン、トリプトファン、システィン、メチオニンおよびプロリン；（Ｌｉ ）　上記（ｆ）のアミノ酸のＤ−類縁体；（ｉｉｉｌ上記（ｉｌのアミノ酸のデ ヒドロ誘導体；（ｉｖｌ　次の群からえらばれたアミノ酸：ヒドロキシリジン、 チロキシン、ヒドロキシプロリン、β−アラニン、γ−アミノ酪酸、ホモセリン 、およびサチン。

一般に、アミノ酸が式Ｈ，Ｎ、ＣＨＲ，Ｃ０ＯＨのα−アミノ酸である場合、Ｒ ＆ｉＣ，、。ハイドロカルビル基（任意に、ヒドロキシ、チオ、Ｃ＋＋ａアルキ ルチオ、ＣＩ−ａアルコキシ、カルボキシ、アセトアミド、グアニジル、３−イ ンドリルおよび２−イミダゾリルからえらばれた１種以上の置換基によって置換 されていてもよい）からえらばれたものと定義することができる。

上記のハイドロカルビル基として枝分かれ鎖の又は直鎖のアルキル基（好ましく は１〜６個の炭素原子を含む）およびアリール基とくにフェニル基があげられ、 これらはＣ１−４アルコキシ、ニトロおよびハロゲンからえらばれた１個以上の 置換分によって置換されていてもよく、または非置換のものでもよい。

カルボキシ保護アミノ酸の７ミノ基またはイミノ基と共有結合を形成しつる支持 体の基は好ましくは式−Ｃｏｔ（εは前記定義のとありである）の活性化カルボ キシ基または式−〇〇〇ε（ｇは前記定義のとおりである）の活性化オキシカー ボニル基である。

好適なシリル基の例は式Ｓ　ｉ（Ｒ，、Ｒｍ　、Ｒ−）　（ＸＸＸＩ）をもつ基 である０式中のＲ１，ＲｍＪよびＲ１は同一でも異なっていてもよく、１〜２０ 個の炭素原子を含む飽和または不飽和ハイドロカルビル基を表わすが、Ｃ４−１ ルコキシ、ニトロ、トリ（Ｃ，、アルキル）シリルおよびハロゲンからえらばれ た１種以上の基で置換されていてもよく、あるいは非置換でもよい。

上記のハイドロカルビル基として枝分かれ鎖または直鎖のアルキルおよびアルケ ニル基（好ましくは１〜６個の炭素原子を含む）およびアリール基とくにフェニ ル基があげられる。

好ましくはシリル基は式Ｓ　Ｌ　（Ｒｔ　、　Ｒｓ　、　ＲＭ　）　（ＸＸＨ） をもつ。式中のＲｔ、ＲｍおよびＲｍは同一でも又は異なっていてもよく、Ｃｌ −３０アルキル基を表わす、アルキル基は直鎖および枝分かれ鎖であることがで き（そして両者の組合せも存在しつる）。例としてメチル、エチル、ｎ−プロピ ル、ｎ−ブチル、第２級ブチル、第３級ブチルおよびドデシルがあげられる。

カルボキシ保護アミノ酸ＸＸＶＩＩは周知のシリル化剤を使用して遊離カルボキ シル基をシリルエステル基に転化させることによって対応するアミノ酸または保 護アミノ酸から製造することができる。このような試剤は一般に式Ｘ−Ｓ　Ｌ　 （Ｒｔ　Ｒｔ　Ｒｍ　）をもつ、Ｒ，、Ｒ，およびＲ１は前記定義のとありであ り、Ｘは離脱性の基である。

好適な離脱性基として次のものがあげられる。

ｆｉ）　Ｃ１，ＢｒＪ３よびＩ（トリメチルシリルクロライドにおけるように） （ｉｉ）　アルコキシたとえばエトキシ右よびメトキシ（トリメチルエトキシシ ランに右けるように） （ｊｉｉ）第２級アミノ、たとえばジＣ１−４アルキルアミノ、代表的な第２級 アミノ基はジメチルアミノである（Ｎ−トリメチルシリルジメチルアミンにおけ るように） （ｉｖｌ　ジシラザン（ヘキサメチルジシラザンにおけるように）離脱性基εは 、結合している炭素原子が十分に活性化されてカルボキシ保護アミノまたはイミ ノ酸の遊離アミノまたはイミノ基の孤立電子対によって核攻撃を受けつるような 周知の基準に従ってえらばれるべきである。好ましくは基εは“良好な離脱性基 ”と呼ばれるものであるべきである。

特に有効な離脱性基Ｃは強度に電子引抜き性である。

離脱性基εを導入する試剤はラセミ化を最少にすること、およびＣを含む活性化 中間体はラセミ化を受けてはならないこと、も望ましい。

基である。ただしＲｍとＲ“は同一でも異なりでいてもよく、Ｃ１−１゜ハイド ロカルビル基を表わす。このようなＲ５およびＲ６の好適な例は共にシクロヘキ シルである。

その他の離脱性基Ｃとしてペンタフルオロフェノキシ（ｂ）および下記（Ｃ）の 基があげられる。

離脱性基（ａ）をもつ化合物はカルボキシル官能基をもつ化合物を対応するカル ボジイミドと反応させることによって製造される。

離脱性基（ｂ）をもつ化合物および（Ｃ）をもつ化合物は離脱性基（ａ）を含む 化合物をペンタフルオロフェノールおよび１−ヒドロキシベンゾトリアゾールと 反応させることによってえられる。

換言すれば、基−Ｃｏｔは周知の方法によって、たとえばジシクロへキシルカル ボジイミドのようなジイミドとの反応によって、ヒドロキシベンゾトリアゾール エステルまたはペンタフルオロフェニルエステルの生成によって、またはベンゾ トリアゾール−２−イル−オキシ−トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキ サフルオロホスフェートを使用することによって、活性化されたカルボキシル基 を表わす。

上記のようなカルボキシ保護アミノ酸のカルボキシル活性化と付加は順次に又は 連続して行なうことができる。すなわち、（ｉｌ　カルボキシル基は保護アミノ 酸の付加前に活性化することができる。たとえばカルボキシルはヒドロキシベン ゾトリアゾールエステルまたはペンタフルオロフェニルエステルの形成によって 活性化される。「活性化」樹脂は洗浄され、次いで保護アミノ酸が付加される。

（ｉｔ）　活性化工程（Ａ）とアミノ酸付加工程（ｂ）は１工程で、たとえばベ ンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウム ヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰまたはカスドロ試剤として知られている） 、塩基および保護アミノ酸（化学量論比　１：２：１）を使用して、１工程で達 成させることができる。

本発明はまた液相でのペプチド合成に使用することもできる。

すなわち本発明の更にもう１つの面によれば、のペプチドの製造方法であって次 の諸工程すなわち（Ａ）ＮＨ＊保護アミノ酸またはＮ−末端ＮＨ諺−保護ペプチ ドを含み、式 ［Ｐ　ｒ　ｏ　ｔはＮ　Ｈｓ保護基を表わす］をもつカルボキシ活性化試剤をＨ ，ＮＨ，Ａ、ＣＯ，０Ｐｒｏｔ　［Ｐｒｏｔはシリル基である］のカルボキシ保 Ｉ２ミノ酸と反応させて式の鎖延長生成物を製造し、 （Ｂ）該保護基Ｐｒｏｔを除去し、 （Ｃ）任意に工程（Ａ）および（Ｂ）をＸ回くりかえし、そして （Ｄ）−ＮＨ，保護基Ｐｒｏｔを除去する〔ただし、ＸはＯまたは正の整数であ り；Ｃは離脱性の基であり；それぞれのＡは同一であるか又は異なっていてもよ く、アミノ酸の残基を表わすか、あるいは構造ＮＨ，Ａはアミノ酸ＮＨ＜ＡＣＯ ＯＨはイミノ酸ＮＨ＜ＡＣＯＯＨの残基Ｎ＜Ａである；そして残基Ａの反応性側 鎖は保護され、そして次に脱保護される〕諸工程から成ることを特徴とするペプ チドの製造方法が提供される。保護基Ｐｒｏｔ′は好ましくはｔ−ブトキシカー ボニル（ｔＢｏｃ）、フルオレニルメトキシカーボニル（Ｆｍｏｃ）またはトリ フェニルメチル（トリチルもしくはＴｒ’　）基である。

上記の方法に右いて、シリル基は好ましくは前記の式すなわちＲｒ　（Ｒｒ　、 　Ｒｍ　、　Ｒｓ　）　（ＸＸＸＩＩＩ）　［Ｒｒ　、　ＲｍおよびＲ８は同一 でも又は異なっていてもよく、１〜１０個の炭素原子を含むハイドロカルビル基 を表わす］の基であり、好ましくは５ｌ（Ｒｒ　、Ｒ１、Ｒｓ　）　（ＸＸＸＩ ＩＩ）　［Ｒｒ　、　Ｒｔ　Ｊ５よびＲ８は同一でも異なっていてもよ＜Ｃ，、 アルキル基を表わす］。

本発明の方法の面に従って使用するのに好適なシリルエステルの若干は新規であ る。これらの新規なシリルエステルとして次のものがあげられる。

（Ａ）Ｌ−バリン、Ｌ−インロイシン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−アス パルチン酸、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−リジン、およびＬ−メチオニンからえらば れたし一アミノ酸のシリルエステル；ただし該エステルは対応する異性体を実質 的に含まないものである； （Ｂ）下記の保護アミノ酸のシリルエステル、すなわち（ａ）〇−保護セリン、 〇−保護スレオニン右よび〇−保護チロジンからえらばれた〇−保護アミノ酸、 （ｂ）γ−カルボキシ保護グルタミン＃およびβ−カルボキシ保護アスバルチン 酸からえらばれたβ−およびγ−カルボキシ保護アミノ酸。

（Ｃ）ε−アミノ保護リジンおよびグアニジノ保護アルギニ（ｄ）（インド）− 保護トリブトファン；ただし「（インド）−保護」とはインドールの窒素の保護 を示す、（ｅ）チオ保護システィン、および （ｆ）イミダゾール保護ヒスチジン； 〔上記（ｄ）、（ｅ）および（ｆ）の例としてＮ−ホルミルトリプトファン、４ −メトキシベンジルシスティン、およびジニトロフェニルヒスチジンがあげられ る１　；の保護アミノ酸のシリルエステル； （Ｃ）α−アミノ保護グリシン、α−アミノ保護アラニン、α−アミノ保護バリ ン、α−アミノ保護ロイシン、α−アミノ保護イソロイシン、α−アミノ保護セ リン、α−アミノ保護スレオニン、α−７ミノ保厘アスバルチン酸、α−アミノ 保保護ススパルギンα−７ミノ保厘グルタミン酸、α−７ミノ保護グルタミン、 α−アミノ保護リジン、ａ−７ミノ保護アルジニン、α−アミノ保護フェニルア ラニン、ａ−アミノ保護フェニルアラニン、α−７ミノ保護チロシン、α−アミ ノ保護トリプトファン、ａ−アミノ保護システィン、α−アミノ保護メチオニン およびα−アミノ保護プロリンからえらばれたα−ＮＨ，保護アミノ酸のシリル エステル（ただし該α−ＮＨ論保護基はシリル基以外の基である）；右よび （Ｄ）　式Ｈ，ＮＨ，Ａ、Ｃｏ、Ｏ，Ｓ　ｉ　（Ｒｒ　Ｒ寓　Ｒ畠　）（ＸＸＸ ＩＶ　）のアミノ酸のトリアルキルシリルエステル；［Ｒｒ　、ＲｍおよびＲ１ は同一でも興なっていてもよく、１〜２０個の炭素原子をもつアルキル基を表わ し、Ｎ、ＮＨ，Ａ。

ＣＯ，Ｏはグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、ス レオニン、アスパルチン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、リジ ン、ヒスチジン、アルジニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、 システィン、メチオンニンおよびプロリンからえらばれたα−アミノ酸の残基で ある；ただしアミノ酸がリジン、アスバルチン酸またはグルタミン酸以外である ときは、Ｒｒ　、Ｒｍ右よびＲ，の少なくとも１つはメチル以外である１゜ 本発明の新規なシリルエステルが７ミノ官能基の保護基を有する場合には、その ような基は好ましくはｔ−ブトキシカーボニル（ｔＢｏｃ）基、フルロレニルメ トキシカーボニル（Ｆｍｏｃ）基またはトリフェニルメチル（Ｔｒｔ）基である 。

上記の（Ｂ）および（Ｃ）において、アミノ保護基は好ましくはｔ−ブトキシカ ーボニル基、フルオレニルメトキシカーボニルまたはトリフェニルメチル基であ る。

本発明の更にもう１つの面は（ａ）ペプチド合成法におけるアミノ酸シリルエス テルの使用および（ｂ）このようなエステルを含む用具、特にアミノ酸シリルエ ステルの供給を含むペプチド合成に使用するための試剤の用具、およびカルボキ シル基を活性化してそれらをアミノ基と反応してペプチド結合を作りつる活性化 カルボキシル基に転化させるための試剤の供給、を包含する。

本発明の方法により予め定めた構造のペプチドを合成するための固相法は代表的 に次の諸工程を含む。

（ａ）α−アミノ酸トリアルキルシリルエステルを該アミノ酸の７ミノ基を介し て不溶性樹脂に共有結合させる工程、（ｂ）トリアルキルシリルエステルを開裂 させる工程、（ｃ）トリアルキルシリルエステルの開裂によって生成するカルボ ン酸基を活性化させる工程、 （ｄ）α−アミノ酸トリアルキルシリルエステルをそのアミノ基を介して活性化 カルボン酸基に結合させる工程、（ａ）予め定めた構造のペプチド鎖が生成する まで工程（ｂ）、（（りＪ３よび（ｄ）を順次にくりかえす工程、および（ｆ） ペプチド鎖を樹脂から開裂させ、そしてトリアルキルシリルエステルを開裂させ る工程。

上記の本発明の方法は支持体を含む固相試剤を使用する固相ペプチド合成に関す るものであるけれども、液相系で好ましいカルボキシル保護基（シリル基）を使 用することも可能である。

本発明の方法により予め定めた構造のペプチドを合成するための液相合成法は代 表的に次の諸工程を含む。

（ａ）Ｎ−保護ａ−アミノ酸のカルボン酸基を活性化する工程、 （ｂ）α−アミノ酸トリアルキルシリルエステルのアミノ基を上記のＮ−保護ア ミノ酸の活性化カルボン酸基に結合させる工程、 （Ｃ）上記のトリアルキルシリルエステルを開裂させる工程、（ｄ）上記のトリ アルキルシリルエステルの開裂から生じるカルボン酸基を活性化する工程、 （ｅ）α−アミノ酸トリアルキルシリルエステルのアミノ基を上記の活性化カル ボン酸基に結合させる工程、（ｆ）予め定めた構造のペプチド鎖が生成するまで 上記工程（ｃ）、（ｄ）Ｊ３よび（ｅ）を順次にくりかえす工程、および（ｇ） トリアルキルシリルエステル基およびＮ−保護基を開裂させる工程。

本発明のペプチド合成の液相法および固相法は従来技術の方法よりも便利である 。全合成は少ない時間ですみ、工程数が少なく、そして温和な反応条件下に少量 の温和な試剤を使用すればよい。

二上ｍ広 アミノ酸トリアルキルシリルエステルはトリアルキルシリルクロライドとＮ−保 護アミノ酸との反応によって本発明の方法により製造するのが最も便利である。

多くのＮ−保護アミノ酸は商業的にえられるけれども、一般にそれらは対応する アミノ酸から周知の方法で製造することができる。すなわち、たとえばｔ−Ｂ。

Ｃアミノ酸はアミノ酸とジ−ｔ−ブチルジカーボネートとを反応させることによ って製造することができる。

保護基は通常のアミン保護基のいづれであってもよく、たとえばｔ−ブトキシカ ーボニル、フルオレニルメトキシカーボニル、フェニルアセチル、アセトアセチ ル、Ｎ−ベンジリデン、ベンゾイル、ベンジル、ｔ−アミロキシカーボニル、ベ ンジルオキシカーボニル、ｐ−トルエンスルホニル、クロロアセチル、カーバミ ル、トリフェニルメチルなどである。これらは適当な時に＃または塩によって、 水素化によって、または酵素作用によって容易に開裂させることができる。

前述のように、本発明によるアミノ酸シリルエステルの製造において、アミノ基 をまず保護することが必要である。好ましくはこれはジ−ｔ−ブチルジカーボネ ートとの反応にょるｔ−ブトキシカーボニル基の導入によって達成される。

適当な方法は、アミノ酸を水性ジメチルホルムアミドまたはジオキサン（２：１ の容量比の溶媒：水）にとかし、これに当量のトリエチルアミン（１モル／カル ボキシル基）を加えることである。

次いで室温で１／２〜２時間攪拌しながら１当量以上のジｔ−ブチルジカーボネ ートを加える０等容量の水を加えて混合物をジエチルエーテルで抽出して未反応 試剤を除く。

次いでクエン酸またはＩＮ　ＨＣＩで反応混合物をｐＨ３に酸性化し、エチルア セテートで２回抽出する。次いで有機相を蒸発させてｔ−Ｂｏｃ保護アミノ酸を 分離する。

２個以上のアミノ基を有するアミノ酸については、ペプチド結合を形成させよう とするアミノ酸のみが次に脱保護されるように、個々のアミノ基は一般に異なっ た保護基を必要とする。

従ってたとえばリジンについては、ε−アミノ基はｔ−Ｂｏｃによるアミノ基の 保護以前にベンジルオキシカーボニル基で保護するのが好ましい、これはα−Ｎ Ｈ，基とＣ０ＯＨ基により銅錯体を製造し、ベンジルオキシカーボニルクロライ ド（Ｚ−クロライド）と反応させ、次いで脱錆体化して前述のようにｔ−ブチル ジカーボネートと反応させることによって達成される。

同様の方法はアルジニンについても使用することができるが、この場合にはグア ニジノ基をｐ−トルエンスルホニル基で保護する。

追加のカルボキシル基をもつアミノ酸はベンジルエステルの形体にあるのが好ま しい。

セリンおよびスレオニンのヒドロキシ基は、必要ならば、ベンジルエステルの生 成によって保護することができ、そしてチロシンのヒドロキシ基は２−ブロモベ ンジルオキシカーボニル誘導体の生成によって保護することができる。

同様に、トリプトファンのインドリル窒業はホルミル化によって保護することが でき、システィンのチオ基は４−メチルベンジル化によって保護することができ る。ヒスチジンはジニトロフェニル誘導体として保護することができる。

α−アミノ基および反応性官能基のこれらの保護は標準的なものであり、保護ア ミノ酸のほとんどは商業的に入手しつる。

Ｎ−保護アミノ酸とトリアルキルシリルクロライド（好ましくはトリメチルシリ ルクロライドまたはｔ−ブチルジメチルシリルクロライド）との間の反応は、不 活性溶媒中で、好ましくはエーテルのような非プロトン性溶媒中で（たとえばジ エチルエーテルまたはテトラヒドロフラン中）またはジメチルホルムアミド中で 行なうことができる。溶媒は使用前に注意深く乾燥すべきである。

最も便利には、正味の又は溶媒にとかしたトリアルキルシリルクロライドを冷水 または氷水浴に急冷した反応器中のＮ−ｔ−ＢＯＣ保護アミノ基溶液に時間をか けて滴下状に加える０反応媒質は好ましくは第３級アミンたとえばトリエチルア ミン、ピリジンまたはイミダゾールを含んでいて、反応期間中に生成したＨＣＩ のスカベンジャーとして働く。

トリアルキルシリルクロライドを添加した後に、反応混合物を一般に約１時間放 置して反応を完成させる０反応器合物が冷却されていたならば、この段階で室温 に加温することもできる。

反応期間中に生成した固体第３ｆｆｌアミン塩酸塩を次いで最も好都合には濾過 によって分離することができる。減圧下での濾液からの溶媒の除去は殆ど理論収 率の高純度のＮ−保護アミノ酸トリアルキルシリルエステルを与える。

シリル化反応は１当量の塩基（トリエチルアミン、ピリジンまたはイミダゾール ）の存在下で非プロトン性溶媒中で行なうのが好ましい、トリメチルシリルエス テルの製造にとって、ジエチルエーテルは好ましい溶媒である。ジメチルホルム アミドはｔ−ブチルジメチルシリルエステルの製造にとって好ましい１反応はト リメチルシリルエステルについては室温で１時間、ｔ−ブチルジメチルシリルエ ステルについては２〜８時間で一般に完了する。

Ｎ−保護基がｔ−ブトキシカーボニルである場合、Ｎ−非保護トリアルキルシリ ルエステルを製造するために、中間体Ｎ−ｔ−Ｂｏｃ保護エステルを乾燥エーテ ルにとかし、乾燥Ｈｃｌをこの溶液（約Ｏ〜５℃に冷却したものが好ましい）に 約３０分間通す、生成物は、濾過によって又は溶媒の蒸発によって分離すること ができる。

上記の方法を使用して、下記のＮ−保護α−アミノ酸トリアルキルシリルエステ ルから下記のＬ−ａアミノ酸トリアルキルシリルエステルを製造した。

Ｎ−α−；ノ　Ｉ　ル　ルシＩルエステルｔ−Ｂｏｃ　−Ｔｙｒ（２−Ｂｒ−Ｚ ）　−）リメチルシリルエステルｔ−Ｂｏｃ　−Ａｌａ−トリメチルシリルエス テルｔ−Ｂｏｃ　−Ｐｈｅ−トリメチルシリルエステルｔ−Ｂｏｃ　−Ｌｅｕ− トリメチルシリルエステルｔ−Ｂｏｃ−Ｐｒｏ　−トリメチルシリルエステルｔ −Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（２−ＣＩ−Ｚｌ　−ｈリメチルシリルエステルｔ−Ｂｏｃ　 −Ｇｌｙ　−トリメチルシリルエステルｔ−Ｂｏａ　−Ｍｅｔ−トリメチルシリ ルエステルｔ−Ｂｏａ　−ＡｒｇｆＴｏｓｌ　−ｈリメチルシリルエステルｔ− Ｂｏａ　−ＧｌｕｆＯＢｚ）−トリメチルシリルエステルｔ−Ｂｏｃ　−１１ｅ 　−ｈリメチルシリルエステルｔ−Ｂｏｃ　−５ｅｒｆＢｚｌｌ　−トリメチル シリルエステルｔ−Ｂｏｃ　−Ｔｈｒ（Ｂｚｌｌ　−トリメチルシリルエステル ｔ−Ｂｏｃ　−Ｔｒｐ（Ｆｏｒｍｙｌ）　−）リメチルシリルエステルｔ−Ｂｏ ｃ−Ｇｌｎ−トリメチルシリルエステルｔ−Ｂｏｃ　−Ａｓｎ−トリメチルシリ ルエステルｔ−Ｂｏｃ　−Ｃｙｓ（４−Ｍｅｔｈｙｌ　Ｂｚｌｌ　−トリメチル シリルエステルｔ−Ｂｏｃ　−Ａｓｐ（ＯＢｚｌ）−トリメチルシリルエステル ｔ−Ｈｏｅ　−Ｖａｌ−トリメチルシリルエステルｔ−Ｈｏｅ　−Ｈｉｓ（ＤＮ Ｐ）　−トリメチルシリルエステルα−ミノ　−　ルキルシｉルエステル 丁ｙｒ　ｆ２−Ｂｒ−Ｚ）　−トリメチルシリルエステル＾１ａ−トリメチルシ リルエステル Ｐｈｅ　−トリメチルシリルエステル Ｌｅｕ　−トリメチルシリルエステル Ｐｒｏ−トリメチルシリルエステル Ｌｙｓ　（２−Ｃ１−Ｚｌ　−トリメチルシリルエステルＧｌｙ　−）リメチル シリルエステル Ｍｅｔ　−トリメチルシリルエステル Ａｒｇ（Ｔｏｉｌ　−）リメチルシリルエステルＧｌｕ　（ＯＢｚ）−トリメチ ルシリルエステル１１ｇ−トリメチルシリルエステル ５ｅｒ（Ｂｚｌ）　−１−リメチルシリルエステルＴｈｒ　（Ｂｚｌ）　−トリ メチルシリルエステルＴｒｐ　（Ｆｏｒ■ｙｌｌ−トリメチルシリルエステルＧ ｉｎ　−トリメチルシリルエステル ＾ｓｎ−トリメチルシリルエステル Ｃｙｓ（４−Ｍｅｔｈｙｌ　ＢｚＬｌ−トリメチルシリルエステル＾ｓｒｒ　（ ＯＢｚｌ）　−トリメチルシリルエステルＶａｌ−トリメチルシリルエステル Ｈｉｓ　ｆＤＮＰ）−トリメチルシリルエステルＴｒｐ（ホルミル）、Ｈｉｓ　 （ＤＮＰ）、Ａｒｇ　（Ｔｏｓ）およびＬｙｓ　（２−Ｃ１−Ｚ）のそれぞれの トリメチルシリルエステルはそれらの吸湿性のために室温での長期間貯蔵の際に 不安定であることがわかった。

然しこの問題はトリメチルシリル基の代りにより安定なｔ−ブチルジメチルシリ ル基に置き換えることによって回避された。α−アミノ酸のＮ−ｔ−ＢｏｃＪ５ よびＴｒｔ保護ｔ−ブチルジメチルシリルエステルは塩基としてイミダゾールを 使用してＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミド中で製造した。

この方法を使用して表３（下記）に示すエステル類を製造した。

本発明の液相法（反応式ｌ）によってペプチドを製造するために、Ｎ−保護アミ ノ酸のカルボン酸基をジシクロへキシルカルボジイミドのような活性化剤で処理 することによってカップリング用に活性化した。

生成されるペプチド鎖中の次のアミノ酸のトリアルキルシリルエステルを次いで 加えた。このトリアルキルシリルエステルのアミノ酸部分のアミノ基を次いでＮ −保護アミノ酸の活性化カルボン酸基と溶液中で結合させた。

中間体ペプチド前駆体のトリアルキルシリルエステルはメタノールまたはメタノ ール／酢酸で容易に開裂し、遊離状態になったカルボン酸基は通常の活性化剤た とえばＤＣＣ／ＨＯＢＴでカップリング用に活性化される。必要な構造のペプチ ド鎖が生成するまでこの系列を（つかえず。次いでペプチド鎖のＣ−末端のトリ アルキルシリルエステルを開裂して、Ｎ−保護基を塩酸／ジエチルエーテルで除 去してペプチドを遊離させる。純粋なペプチド生成物を製造するために、合成過 程の期間中に生成した１種以上の中間体ペプチド前駆体から未反応試剤を単離お よび／または分離することが一般に必要である。

上記の液相法を使用してＴｙｒ−Ａｌ　ａ−Ａｌ　ａ−Ｐｈｅ　−Ｌｅｕ−ＯＨ ＪよびＡｌａ−Ａｌａ−ＯＨを製造した。

Ｎ−ｔＢｏｃ保護アミノ酸がそのカルボン酸基を介して樹脂に結合するメリフィ ールド法とは異なり、本発明の固相法においては、生成させるべきペプチド鎖中 の最初のアミノ酸のトリアルキルシリルエステルはそのアミノ基を介して不溶性 樹脂に結合する。最も好都合には、樹脂は−ＣＨ５０ｃｏｃｘ置換分をもつポリ エチレン樹脂であり、たとえば次のとおりである。

（Ａ　ｌ　ｋ）−Ｓ　ｉ　ＯＯＣＣＨＲＮＨ＊　＋　Ｃ１０ＣＯＣＨ−−Ｉｆ脂 →　（Ａ　Ｉ　ｋ　）　ｔ　Ｓ　ｉ　ＯＯＣＣＨＲＮ　ＨＯＣＯＣＨｘ−樹脂カ ルボキシル基は次いで、トリアルキルシリルエステルをメタノールまたはメタノ ール／酢酸で開裂することによって脱保護し、このようにして生成したカルボキ シル基なり　ＣＣ／ＨＯＢ　Ｔで活性化する。第２のアミノ酸のトリアルキルシ リルエステルを加え、第２７ミノ皺のアミノ基を第１アミノ酸（樹脂に結合した ままでいる）の活性化カルボキシル基に結合させる。

所望構造のペプチド鎖が生成するまで、この系列の反応をくりかえす、最後に、 最終のトリアルキルシリルエステルをメタノールまたはメタノール／酢酸で開裂 させ、そしてペプチドを酸性条件下で、たとえばＨＢｒ／酢酸、トリフルオロ酢 酸（ＴＦＡ）およびＨＦ中のトリフルオロメタンスルホン酸（ＴＦＭＳＡ）を用 いて、樹脂から遊離させる。

本発明の方法を使用してペプチドを製造するとき、アミノ酸残基をペプチド鎖に 加える各サイクルに必要な試剤の量は少なくなり、合成を完了するに必要な試剤 コストと全時間は減少する。

使用する試剤と反応条件は常用されるものよりも温和である。

［本発明においては保護基を開裂させるのにメタノールを使用することができる （トリフルオロ酢酸を使用してＮ−ｔ　＝　Ｂ　ｏ　ｃ保護基を除くメリフィー ルド法、および塩基ピペリジンを使用してＮ−末端保護基を除去するシェパード のｆ’　ｍ　ｏ　ｃ系を参照）］。

従って１本発明によれば固相法での樹脂マトリックスの損傷は小さく、生成され るペプチド中の構成アミノ酸との反応に悪影響を及ぼす危険は小さい、トリアル キルシリルクロライドとアミノ酸との反応はペプチド合成の中間体として使用す る便利な安定なＣ−保護アミノ酸を与え、そして保護基は所望のペプチド類を製 造したとき容易に除去することができる。

本発明の方法の更なる利点は、反応媒質の伝導度を測定することによって個々の 反応工程の完了を試験することが可能であることである。

以下の実施例により本発明を更に具体的に説明する。

！五■ユ ｔ−チルオキシカーボニル　ｔＢＯｃ　ア；ノ　寥メ　ルシ寞ルエスールの　゛ １．１　ｔ−ＢＯＣ−Ｌ−アラニン・トリメチルシリルエステルＬ−アラニンの トリメチルシリルエステルを次の方法によって製造した。

Ｎ−ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−アラニン（１０ミリモル）を無水ジエチルエーテル（４０ ｍｌ）にとかし、ピリジン（１０ミリモル）を加えた。この溶液を水浴上で０℃ に冷却して攪拌した。

次いでメリメチルシリルクロライド（１１ミリモル）を滴下状に加えた。直ちに 白色沈殿が生成し始めた（ピリジン−ＨＣＩ）、混合物を１時間攪拌してから室 温に加温した。白色固体を濾過によって除き、有機層を減圧下で蒸発さけてｒ’ Ｊ　−ｔ　−ＢＯＣ−アラニン・トリメチルシリルエステルを液体として９４％ の収率で久た。これを窒素下で貯蔵した。すべての操作は無水条件下で行なった 。

生成物を赤外（ＩＲ）スペクトル、　′Ｈ核磁気共鳴（ＮＭＲ）右よび薄層クロ マトグラフ（ｔ　ｌ　ｃ）分析によって確認した。

’ＨＮＭＲスペクトルは内部標準としてテトラメチルシラン（ＴＭＣ）を使用し てＲ−１５００日立（６０ＭＨｚ）機器で記録した。

赤外スペクトルは最大（薄いフィルム）において次の帯を示したニ ア６０　（ｓｔ、）、８４０　（ｓｔ、）、１６９５　（ｓｔ、）。

１７４０　（ｓｔ、）　ａｎｄ　３４００ｃｍ’　−（ｓｔ、は強い帯をいう、 ） ’ＨＮＭＲスペクトル（ＣＤＣ１，）は次の値を示した：δ　０．２５　（ｓ、 、９Ｈ）、　１．４５　（ｓ、９Ｈ）。

４．０−４．２５　（ｔ、、ＬＨ）　ａｎｄ　５．２　（ｂｒ、、ＬＨ）。

溶媒として７０％ジエチルエーテル−軽油（６０〜８０℃）を使用するシリカ根 土の薄層クロマトグラフは０．３１のＲｆ値を与えた。

４．２−２０下記のＮ−保護アミノ酸のトリメチルシリルエステル類：（２）ｔ −Ｂｏｃグリシン、（３）ｔ−ＢｏｃＬ−バリン、（４）ｔ−ＢｏｃＬ−フェニ ルアラニン、（５）　ｔ−Ｂ。

ｃＬ−イソロイシン、（６）ｔ−ＢｏｃＬ−ロイシン、（７）ｔ−Ｂｏａ　（２ −ＣＩ−Ｚ）−Ｌ−リジン、（８）ｔ−Ｂｏｃ　Ｌ−メチオニン、（９）ｔ−Ｂ ｏｃＬ−７スバルギン、（１０）ｔ−Ｂｏｃ　Ｌ−プロリン、　（１１）ｔ−Ｂ ＯＣ（４−ＭＢｚｌ）−Ｌ−システィン、（１２）　ｔ−Ｂｏｃ　（２−Ｂｒ　 −Ｚ）−Ｌ−チロシン、（１３）ｔ−Ｂｏｃ　（Ｂｚｌ）−Ｌ−スレニオン、（ １４）ｔ−Ｂｏｃ　（０−Ｂｚｌ）−Ｌ−グルタミン酸、（１５）ｔ−Ｂｏｃ　 （０−Ｂｚ　１）−Ｌ−アスバルチン酸、（１６）ｔ−Ｂｏｃ　Ｌ−グルタミン 、（１７）　ｔ−Ｂｏｃ　（Ｔｏｓ）−Ｌ−アルギニン、（１８）ｔ−Ｂｏｃ　 （Ｆｏｒｍｙｌ）−り一トリブトファン、（１９）ｔ−Ｂｏｃ　（ＤＮＰ）−Ｌ −ヒスチジン、（２０）ｔ−Ｂｏｃ　（Ｂｚｌ）−Ｌ−セリン上記のアミノ酸お よび保護アミノ酸のトリメチルシリルエステル類は実施例１．１に述べた方法に よって製造したが、ただしＮ−ｔ−Ｂｏｃ−″Ｌ−アラニンの代りに次のアミノ 酸および保護アミノ酸を使用した：ｔ−Ｂｏｃ−グリシン５Ｌ−バリン、Ｌ−フ ェニルアラニン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｎ−２−Ｃ１−Ｚ−Ｌ−リ ジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−プロリン、Ｓ−４−ＭＢｚｌ− Ｌ−システィン、０−２−Ｂｒ−Ｚ−Ｌ−チロシン、０−Ｂｚｌ−Ｌ−スレオニ ン、０−Ｂｚｌ−Ｌ−グルタミン酸、Ｑ−Ｂｚｌ−Ｌ−アスバルチン酸、Ｌ−グ ルタミン、Ｎ−Ｔｏｓ−Ｌ−アラニン、Ｎ−ホルミル−Ｌ−トリプトファン、Ｎ −ＤＮＰ−Ｌ−ヒスチジン、および０−Ｂｚｌ−Ｌ−セリン。

すべての場合にジエチルエーテルを使用した、ただしＭ　ｅ　ｔ　。

Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、およびＨｉｓについてはジクロロメタンを使用した。

えられたトリメチルシリルエステル類の収率を表１に示す。

表−−１ ｔ−ＢＯＣ−ζノ　−１メチルシ？ルエステル２−ＣＩ−Ｚ　−２−クロロベン ジルオキシカーボニル４−Ｍ−Ｂｚｌ−４−メチルベンジル ２−Ｂｒ−Ｚ−２−ブロモベンジルオキシカーボニルＢｚｌ　−ベンジル ０−Ｂｚｌ　−ベンジルエステル Ｔｏｓ−ｐ−トルエンスルホニル ＣＨＯ−ホルミル ＤＮＰ　−２，４−ジニトロフェニル ＤＥＥ　−ジエチルエーテル ＤＣＭ　−ジクロロメタン 実ＪＬｆｌλ ｔ−ブチルオキシカーボニル　ｔＢｏｃ　アミノ　トリメチルエステルの　に　 アミノ　ｌメチルシＩルエステルの遣 ２．１　Ｌ−アラニン・トリメチルシリルエステル塩酸塩実施例１．１で述べた ようにして製造したＮ−ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ　−アラニン・トリメチルエステル（１ ０ミリモル）を無水ジエチルエーテル（５０ｍｌ）にとかした。この溶液に乾燥 ＭＣＩを飽和になるまで吹き込んだ。生成した白色沈殿を濾過し、ジエチルエー テルで洗浄して痕跡量のＨＣＩを除去し、減圧下で乾燥した０次いでその固体を 不活性雰囲気（Ｎ、）下で貯蔵した。

生成したし一アラニン・トリメチルシリルエステル塩酸塩を赤外スペクトルおよ び融点測定によって確認した。

赤外スペクトル（Ｎｕｊｏｌ　ｍａｌｌ）は最大において次の帯を示した。７６ ０　（ｓｔ、）、８４５−８６０　（ｓｔ、）、１１７５　（ｓｔ、’）、１２ ００　（ｓｔ、）、１７５５　（ｓｔ、）。

２９８５　ａｎｄ　３４００ｃｍ’　。

２．２−２０下記のアミノ酸またはＮ−係属アミノ酸のトリメチルシリル塩酸塩 ＝　（２）グリシン、（３）Ｌ−バリン、（４）Ｌ−フェニルアラニン、（５） Ｌ−イソロイシン、（６）Ｌ−ロイシン、（７）　２−Ｃ１−ｚ−Ｌ−リジン、 （８）Ｌ−メチオニン、（９）Ｌ−アスパラギン、（１０）Ｌ−プロリン、（１ １）（４−ＭＢｚｌ）−Ｌ−システィン、（１２）（２−Ｂｒ、−Ｚ）−Ｌ−チ ロシン、（１３）（Ｂｚｌ）−Ｌ−スレオニン、（１４）（０−Ｂｚｌ）−Ｌ− グルタミン酸、（１５）（０−Ｂｚｌ）−Ｌ−アスバルチン酸、（１６）Ｌ−グ ルタミン、（１７）（Ｔｏｓ）−Ｌ−アルジニン、（Ｊ、８）（ホルミル）−Ｌ −トリプトファン、（１９）（ＤＮＰ）−Ｌ−ヒスチジン、（２０）（Ｂｚｌ） −Ｌ−セリン。

上記のアミノ酸および保護アミノ酸のトリメチルシリルエステルを実施例２．１ の方法によって製造した、ただしｔ−Ｂｏｃ−Ｌ＝アラニン・トリメチルシリル エステルの代りに対応するｔ−ＢＯＣアミノ酸およびｔ−ＢｏＣ保護アミノ酸の トリメチルシリルエステル（２）〜（２０）を用いた。

これらのトリメチルシリルエステル塩酸塩を表２に示す収率でえた。

表−−Ｚ アミノ　ｌメ　ルシＩルエステル （略号は表１に示すとおり） ！１１九旦 ｔ−ブチルオキシカーボニル　ｔ−Ｂｏｃ　アミノ　のｔ−ジチルシＩルエステ ルの ３．１　ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−アラニン−ｔ−ブチルジメチルシリルエステル ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−アラニン−ｔ−ブチルジメチルシリルエステルを次の方法によ って製造した。

Ｎ−ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−アラニン（１０ミリモル）をＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミ ド（２０■１）にとかし、イミダゾール（２０ミリモル）を加えて塩基および触 媒として働かせた。

溶液を室温で攪拌してからｔ−ブチルジメチルシリルクロライＦ（１１ミリモル 、ｉ、ｓｇ）を徐々に加えた２反応混合物を室温で更に２時間攪拌して、イミダ ゾール塩酸塩の白色沈殿を生成させた。

混合物をジエチルエーテル（６０社）で希釈し、１０％重炭醍ナトリウム（ｌＸ ２０ｍｌ）、水（ＩＸ２０ｍｌ）、Ｏ，１Ｍ塩酸（ＩＸ２０ｓ＋１）Ｊ３よび水 （２Ｘ２０社）で洗浄した０次いで有機層を無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、減 圧下で乾燥してＮ−ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−アラニン−ｔ−ブチルジメチルシリルニス デルを油状物としてえた。

Ｎ−ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−アラニン−ｔ−ブチルジメチルシリルエステルを赤外スペ クトル、　′Ｈ核磁気共鳴スペクトル、および薄層クロマトグラフ（ｔ　１　ｃ ）によって確信した。

赤外スペクトルは最大（ｌＩいフィルム）において次の帯を示した。７６０−７ ８０　（ｓｔ、＞、８４５　（正よ、）、１１８０（ｓｔ、ン　、　１２６０　 （旦、）、７．６９５（旦、）、１７２０　（１工。）、２９６０　ａｎｄ　３ ４００ｃｍ−’。

’Ｈｎ、ｍ、ｒ、（ＣＤＣ１婁）　δ　０．　２１　（ｓ、、６Ｈ）、０．９　 （ｓ、、９Ｈ）、１．４５　（ｓ、、９Ｈ）３．２−１１下記のＮ−保護アミノ 酸のｔ−ブチル−ジメチルシリルエステル：（２）ｔ−Ｂｏｃフェニルアラニン 、（３）ｔ−Ｂｏｃ　（０−Ｂｚｌ）−Ｌ−アスバルチン酸、（４）ｔ−Ｂｏｃ Ｌ−ロイシン、（５）ｔ−Ｂｏｃ　（２−Ｂｒ−Ｚ）−Ｌ−チロシン、（６）ｔ −Ｂｏｃｔ−プロリン、（７）　ｔ−Ｂｏａ　Ｌ　−バリン、（８）ｔ−Ｂｏａ 　（ＤＮＰ）−Ｌ−ヒスチジン、（９）ｔ−ＢｏｃＬ−イソロイシン、（１０） ｔ−Ｂｏｃ　Ｌ−グリシン、（１１）ｔ−Ｂｏｃ　（Ｔｏｓ）−Ｌ−アルジニン 。

上記ｔ−Ｂｏｃアミノ酸および保護アミノ酸のｔ−ブチル−ジメチルシリルエス テルを実施例３．１の方法によって製造した。ただしＮ−ｔ−Ｂｏｃ−アラニン の代りに次のｔ−Ｂｏｃアミノ酸および保護アミノ酸を使用した。

ｔ−Ｂｏｃフェニルアラニン、ｔ−Ｂｏｃ　０−Ｂｚｌ−Ｌ　−アスバルチン酸 、ｔ−ＢｏｃＬ−ロイシン、ｔ−Ｂｏａ２−Ｂｒ−ｚ−Ｌ−チロシン、ｔ−Ｂｏ ｃＬ−プロリン、を−Ｂｏｃ　Ｌ−バリン、ｔ−Ｂｏｃ　ＤＮＰ−Ｌ−ヒスチジ ン、ｔ−Ｂｏａ　Ｌ−イソロイシン、ｔ−ＢｏｃＬ−グリシン、を−Ｂｏａ　Ｔ ｏｓ−Ｌ−アルギニン。

すべての場合にジメチルホルムアミドを溶媒として使用した。

ｔ−ブチルジメチルシリルエステルを表３に示す収率でえた。

Ｃｙｓ　（４−メチルＢｚｌ）−ｔ−ブチルジメチルシリルエステルおよびＬｙ ｓ　（２−ＣＩ−Ｚ）−ｔ−ブチルジメチルシリルエステルも上記の方法によっ て製造した。

敷一旦 ｔ−ＢＯＣ−アミノ　ｔ−プチルジ　チルシ１ルエステル（略号は表１に示すと おり） 宜ＪＬｆ２Ｌま ｔ　−Ｂ　ｏ　ｃ　の　−アミノ　ｔ−プチルジメチルシｌル玉２ｆコヒ２設童 ４、ＩＬ−アラニンｔ−ブチルジメチルシリルエステルｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−アラニ ンｔ−ブチルジメチルシリルエステル（１０ミリモル）をジクロロメタン（２５ 耐）中の２５％トリフルオロ酢酸で室温において３０分間処理した。溶媒（すな わちジクロロメタン、トリフルオロ酸ａ）を次いで室温において減圧下に除去し て、油状物を高収率でえた。

生成Ｌ−アラニンｔ−ブチルジメチルシリルエステルを赤外スペクトル右よび’ Ｈｎ、ｍ、ｒ、スペクトルによって確認した。

赤外スペクトル（薄いフィルム）は最大において次の帯を示した。ｍａｘ、７０ ０　（ｓよ、）、８００−８６０　（ｓｔ、）。

１２００　（ｓｔ、）、１７４０−１７９０　（ｓｔ、）。

２９６０．３０５０　ａｎｄ　３２４０ｃｓ＋−’。

’Ｈｎ、ｍ、ｒ、（ＤＭＳＯ−ｄｓ　）　δ　Ｏ，Ｌ９　（ｓ、。

６Ｈ）、０．９　（ｓ、、９Ｈ）。

４．２ｔ−Ｂｏａ基の開裂　−下記のｔ−ブチルジメチルシリルエステルの製造 ＝　（２）フェニルアラニン、（３）（０−Ｂｚｌ）−Ｌ−アスバルチン酸、（ ４）Ｌ−ロイシン、（５）（２−Ｂｒ−Ｚ）−Ｌ−チロシン、（６）Ｌ−プロリ ン、〔７）Ｌ−バリン、（８）（ＤＮＰ）−Ｌ−ヒスチジン、（９）Ｌ−インロ イシン、（１０）Ｌ−グリシン、（１１）（ＴｏｓＪ　−Ｌ−アルギニン。

上記のｔ−Ｂｏｃｌ！！Ｊ３よび保護アミノ酸は前記の実施例４．１の方法によ って開裂することができる。

良五五五 直ｉ立１ｌ −ＣＨ，Ｏ，Ｃｏ、ＣＩａｌｔ含ｔｆ樹脂ｅ次（７）方法（ｒｊ！Ｉ２参照）に よって標準の商業的に入手しつる「メリフィールド」樹脂（−ＣＨＩＣＩ基を含 む）から製造した。

メリフィールド樹脂（２５ｇ）をジメトキシエタン中の酢酸ナトリウムと８０℃ で４８時間反応させてエステルな高収率でえた。エステルの生成を赤外スペクト ル（１７３０ｃｍ−’）によって検知しえない量の塩素と共に確認した。ジエチ ルエーテル中のＬ　ｉ　Ａ　］　ＮＨ４で還元して、通常の操作後にメチロール 樹脂をえた。このメチロール樹脂を次いでトルエン中のホスゲンで室温において 処理して所望のクロロホーメート樹脂を高収率でえた。塩素分析は０．９ミリモ ル／ｇのＣＩが樹脂上に存在することを示した。

良直五互 ベプｌ」危１１童 −ラペ　゛の　Ａ テトラペプチドＨ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−ＯＨを次の方法によって 製造した。すべてのアミノ酸はＬ−形態であった１反応式を後記の図３Ｊよび図 ４に示す。

実施例５で製造した樹脂を反応器に入れてジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）で洗 浄した（３　Ｘ　Ｉ　０ｗ１）　−Ｌｅｕ　ｔ−ブチルジメチルシリルエステル をＤＭＡ（１０ｍｌ）中に加え、次いでトリエチルアミンを加えて反応器を室温 で２時間振とうした。液相を流出させ、樹脂をＤＭＡで洗浄した（２　Ｘ　１０ ｍ１）。未反応Ｌｅｕ誘導体の推定は０．６１ミリモル／ｇが樹脂に結合したこ とを示した。樹脂に残る遊離クロロホーメートをＤＭＡ中のジエチルアミンで封 鎖した。

ｔ−ブチルジメチルシリルＬｅｕ樹脂を加温（４０℃）メタノール（１０ｍｌ） で３０分間処理してｔ−ブチルジメチル基を除いた。樹脂をＤＭＡ　（３ｘ　Ｉ 　０ｓｌ）で洗浄し、ＤＣＣ／ＨＯＢＴの存在下にＤＭＡ中のＨ−Ａ　１　ａ− ＯＳ　ｉ　（Ｍｅ）　ｓ　ｔ−Ｂ　ｕと共に４５分分間上うした。

溶媒を排出し、樹脂をＤＭＡ　（３Ｘ　１０＋ｗｌ）で洗浄した。

１００ｇの樹脂を反応機器から抜き出した０次いでこの樹脂を上記のようにして Ｈ−Ｇｌｙ−ＯＳｉ　（Ｍｅ）＊　ｔ−Ｂｕに結合させ、ｌｏｏｍｇの樹脂−（ Ｃ−Ｈｓ　）　−ＣＨ＊　Ｏ−ＣＯＮ　Ｈ−Ｌ　ｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−ＯＳｉ 　（Ｍｅ）ｓ　ｔＢｕを同様に抜き出した０次いでこれを同様にＨ−Ｖａｌ−Ｏ Ｓｉ　（Ｍｅ）　雪ｔＢｕに結合させ、所望のペプチドをえた。これらのペプチ ドＬａｕ−Ａｌａ、Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇ１ｙ＋　Ｊ３よびＬｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌ ｙ−Ｖａｌを標準ＨＦ開裂によって樹脂から放出させた。

これらのペプチドはメリフィールド面相法によっても製造した。比較ＴＬＣおよ びＨＰＬＣは両方の方法によって合成したジー、トリー、およびテトラペプチド が同じであることを示した。

これらのペプチド合成に８ける固相シリル化中にラセミ化の徴候はなかった。

浄書（内容に変更なし） ｔ　、Ｂｏｃ　、ＮＨ、Ａ　、Ｃ００Ｅ　＋　ＮＨ２、Ａ　、Ｃｏｏ　Ｓ　１１ ｙ１ｔ、８０ｃ、ＮＨ，Ａ、ｃｏ、ＮＨ，Ａ　、ＣＯＯ５１１ｙｌ已　２ 凹　４ 手続補正書（方式） ％式％ １、事件の表示 ２、発明の名称 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 名称　パブリック　ヘルス　ラボラトリ−サービス　ポード（外１名） ６、補正の対象 図面の翻訳文 ７、補正の内容 国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．式▲数式、化学式、表等があります▼（ＸＸＩＶ）のペプチドを製造する方 法であって、次の諸工程すなわち（Ａ）固体支持体に結合したアミノ酸または固 体支持体に結合したペプチドから成る 式▲数式、化学式、表等があります▼（ＸＸＶ）の固相試剤をカルボキシル基活 性化剤と反応させて式▲数式、化学式、表等があります▼（ＸＸＶＩ）の活性化 固相試剤を製造し、 （Ｂ）工程（Ａ）からの活性化固相試剤を式　Ｈ．ＮＨ．Ａ．ＣＯ．Ｏ．Ｐｒｏ ｔ（ＸＸＶＩＩ）のカルボキシ保護アミノ酸と反応させて式▲数式、化学式、表 等があります▼（ＸＸＶＩＩＩ）の鎖延長生成物を製造し、 （Ｃ）該保護基Ｐｒｏｔを除去し、 （Ｄ）任意に工程（Ａ），（Ｂ）および（Ｃ）をｘ回くりかえし、そして （Ｅ）式▲数式、化学式、表等があります▼（ＸＸＩＸ）の生成ペプチドを支持 体から開裂させる；〔ただしｎは０または正の整数であり；εは離脱基であり； Ｐｒｏｔはシリル基であり；それぞれのＡは同一でも異なっていてもよくアミノ 酸の残基を表わすか、あるいは構造ＮＨ．Ａ．ＣＯはイミノ酸ＮＨ＜ＡＣＯＯＨ のＮ＜Ａである；そして残基Ａの反応性側鎖は保護されそして次に脱保護される ；そして工程（Ａ）と（Ｂ）は順次にまたは単一操作で行なわれる］諸工程から 成ることを特徴とする上記式（ＸＸＩＶ）のペプチドの製造方法。 ２．次の諸工程すなわち （ａ）固体支持体に結合したアミノ酸または固体支持体に結合したペプチドから 成る 式▲数式、化学式、表等があります▼（ＸＸＶ）をもつ固相試剤をカルボキシ基 活性化剤および式　Ｈ．ＮＨ．Ａ．ＣＯ．Ｐｒｏｔ　（ＸＸＶＩＩ）のカルボキ シ保護アミノ酸と同時に反応させて式▲数式、化学式、表等があります▼（ＸＸ ＶＩＩＩ）の鎖延長生成物を製造し、 （ｂ）該保護基Ｐｒｏｔを除去し、 （ｃ）任意に工程（Ａ），（Ｂ）および（Ｃ）をｘ回くりかえし、そして （ｄ）式▲数式、化学式、表等があります▼（ＸＸＩＸ）の生成ペプチドを支持 体から開裂させる。 ［ただしｎ，ｘ，ε，ＰｒｏｔおよびＡは請求項１に定義のとおりである］ 諸工程から成る請求項１の方法。 ３．式 ▲数式、化学式、表等があります▼（ＸＸＶ）（ｎは１である）の固相試剤を、 Ｈ．ＮＨ．Ａ．ＣＯ．ＯＰｒｏｔ［Ｐｒｏｔはシリル基である｝のアミノ酸シリ ルエステルを該アミノ酸シリルエステルのアミノ基またはイミノ基と共有結合を 生成しうる基をもつ支持体材料と反応させる、そして該Ｐｒｏｔ基を除去するこ とによって製造する請求項１の方法。 ４．共有結合を生成しうる基が−ＣＨ２ＯＣＯＣ１基である請求項３の方法。 ５．シリル基が式Ｓｉ（Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３）（ＸＸＸＩ）［Ｒ１，Ｒ２およびＲ ３は同一の又は異なった１〜２０個の炭素原子を含むハイドロカルビル基である ］をもつ請求項１〜４のいづれか１項の方法。 ６．シリル基が式Ｓｉ（Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３）（ＸＸＸＩＩ）［Ｒ１，Ｒ２および Ｒ３は同一の又は異なったＣ１−４アルキル基である］をもつ請求項５の方法。 ７．シリル基がトリメチルシリル基またはｔ−ブヂルジメチルシリル基である請 求項６の方法。 ９．基εが電子引き抜き性基を表わす請求項１〜７のいづれか１項の方法。 １０．離脱性基がＣｌ，Ｂｒ，Ｉ，Ｃ１−４アルコキシ、第２級アミノおよびジ シラザノ基からえらばれる請求項１〜９のいづれか１項の方法。 １１．離脱性基εが式▲数式、化学式、表等があります▼（ａ）［ただしＲ５お よびＲ６は同一でも又は異なっていてもよく、Ｃ１−１０ハイドロカルビル基を 表わす］をもつ基；ペンタフルオロフェノキシ基すなわち ▲数式、化学式、表等があります▼（ｂ）および基▲数式、化学式、表等があり ます▼（ｃ）；からえらばれる請求項１〜９のいづれか１項の方法。 １２．式▲数式、化学式、表等があります▼（ＸＸＩＸ）のペプチドの製造方法 であって次の諸工程すなわち（Ａ）ＮＨ２保護アミノ酸またはＮ−末端ＮＨ２− 保護ペプチドを含み、式 ▲数式、化学式、表等があります▼（ＸＸＸＩＩ）［Ｐｒｏｔ′はＮＨ２保護基 を表わす〕をもつカルボキシ活性化試剤を式　Ｈ．ＮＨ．Ａ．ＣＯ．ＯＰｒｏｔ ［Ｐｒｏｔはシリル基である〕のカルボキシ保護アミノ酸と反応させて式▲数式 、化学式、表等があります▼ ［Ｐｒｏｔはシリル基である］ の鎖延長生成物を製造し、 （Ｂ）該保護基Ｐｒｏｔを除去し、 （Ｃ）任意に工程（Ａ）および（Ｂ）をＸ回くりかえし、そして （Ｄ）−ＮＨ２保護基Ｐｒｏｔ′を除去する［ただし、ｘは０または正の整数で あり；εは離脱性の基であり；Ｐｒｏｔはシリル基であり；それぞれのＡは同一 であるか又は異なっていてもよく、アミノ酸の残基を表わすか、あるいは構造Ｎ Ｈ．Ａはアミノ酸ＮＨ＜ＡＣＯＯＨはイミノ酸ＮＨ＜ＡＣＯＯＨの残基Ｎ＜Ａで ある；そして残基Ａの反応性側鎖は保護され、そして次に脱保護される］ 諸工程から成ることを特徴とするペプチドの製造方法。 １３．Ｐｒｏｔおよびεが請求項５〜１１のいづれか１項に定義されたものであ る請求項１２の方法。 １４．Ｌ−バリン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−アス バルチン酸、Ｌ−アスバラギン、Ｌ−リジン、およびＬ−メチオニンからえらば れたＬ−アミノ酸のシリルエステル［ただし該エステルは対応する異性体を実質 的に含まないものである］ １５．下記の保護アミノ酸のシリルエステル、すなわち（ａ）０−保護セリン、 ０−保護スレオニンおよび０−保護チロシンからえらばれた０−保護アミノ酸、 （ｂ）カルボキシ保護グルタミン酸およびカルボキシ保護アスバルチン酸からえ らばれたβ−およびγ−カルボキシ保護アミノ酸、 （ｃ）グアニジノ保護アルギニン、 （ｄ）インド−保護トリブトファン （ｅ）チオ保護システイン、および （ｆ）イミダゾール保護ヒスチジン； の保護アミノ酸のシリルエステル。 １６．α−アミノ保護グリシン、α−アミノ保護アラニン、α−アミノ保護バリ ン、α−アミノ保護ロイシン、α−アミノ保護イソロイシン、α−アミノ保護セ リン、α−アミノ保護スレオニン、α−アミノ保護アスバルチン酸、α−アミノ 保護アスバルギン、α−アミノ保護グルタミン酸、α−アミノ保護グルタミン、 α−アミノ保護ヒスチジン、α−アミノ保護アルジユン、α−アミノ保護フェニ ルアラニン、α−アミノ保護チロシン、α−アミノ保護トリブトファン、α−ア ミノ保護システイン、α−アミノ保護メチオニンおよびα−アミノ保護プロリン からえらばれたα−ＮＨ２保護アミノ酸のシリルエステル［ただし該α−ＮＨ２ 保護基はシリル基以外の基である］。 １７．α−ＮＨ２保護基がｔ−ブトキシカーボニル基、フルオレニルメトキシカ ーボニル基、またはトリフェニルメチル基である請求項１６のエステル。 １８．式Ｈ−ＮＨ．Ａ．ＣＯ．Ｏ．Ｓｉ（Ｒ１Ｒ１Ｒ３）のアミノ酸のトリアル キルシリルエステル［Ｒ１，Ｒ２およびＲ３は同一でも異なっていてもよく、１ 〜２０個の炭素原子をもつアルキル基を表わし；Ｎ．ＮＨ．Ａ．ＣＯ．Ｏはクリ シン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、アス バルチン酸、アスバラギン、グルタミン酸、グルタミン、ヒスチジン、アルジユ ン、フェニルアラニン、チロシン、トリブトファン、メチオニンおよびプロリン からえらばれたα−アミノ酸の残基である；ただしアミノ酸がアスバルチン酸以 外であるときは、Ｒ１，Ｒ２およびＲ３の少なくとも１つはメチル以外である］ 。 １９．Ｌ形態にある請求項１５〜１８のいづれか１項のα−アミノ酸のシリルエ ステル。 ２０．アミノ酸のシリルエステルの供給およびカルボキシル基を活性化してそれ らをアミノ基と反応させてペプチド結合を作りうる活性化カルボキシル基に転化 させるための試剤の供給、を含むペプチド合成に使用するための試剤類用具。