JP2011503223A - ペルシリル化ペプチドを製造する方法 - Google Patents

Abstract

ペルシリル化ペプチドまたはペルシリル化ペプチド類似体を製造する方法であって、
（ａ）トリメチルシリルシアニド以外のシリル化剤との反応によって対応するペプチドをシリル化することによりペルシリル化ペプチドまたはペルシリル化ペプチド類似体を製造する工程と、
（ｂ）式（Ｉ）Ｘ−Ａ−ＣＯＯＨ（式中、Ｘはアミノ保護基であり、Ａは、アミノ酸残基、ペプチド残基またはペプチド類似体残基であり、−ＣＯＯＨは任意に活性化されたカルボキシル基を表す）の化合物を４〜１５個のアミノ酸を含有するペルシリル化ペプチドまたはペルシリル化ペプチド類似体と反応させる工程と
を含む方法。

Description

本特許出願は、米国仮特許出願第６１／０１４，９２３号明細書の利益を主張するものである。この仮特許出願の全内容は参照により本願に援用される。
本発明は、ペルシリル化技術を利用するペプチドまたはペプチド類似体を製造する方法に関する。

ペプチドまたはペプチド類似体は、例えば医薬品として有用である。こうしたペプチドの一例は、女性における子宮内膜症および子宮類線維腫ならびに男性における良性前立腺肥大症の治療のために使用できるＣｅｔｒｏｒｅｌｉｘである。Ｃｅｔｒｏｒｅｌｉｘは、配列Ａｃ−Ｄ−Ｎａｌ−Ｄ−Ｃｌ−Ｐｈｅ−Ｄ−Ｐａｌ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｃｉｔ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｄ−ＡｌａＮＨ２（配列番号１）を有するゴナドトロピン放出ホルモン拮抗薬（ＧｎＲＨ拮抗薬）である。

ペルシリル化技術は、カレンズ（Ｃａｌｌｅｎｓ）のＥＰ第−Ａ−１８４２４３号明細書、ＩＢＣのペプチド技術に関する第二回国際会議（ＩＢＣ’ｓ ２^nd Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ロゴジン（Ｒｏｇｏｚｈｉｎ）ら、Ｉｓｖｅｓｔｉｊａ Ａｋａｄｅｍｉａ Ｎａｕｋ ＳＳＳＲ、セリヤ キメチェスカヤ（Ｓｅｒｉｙａ Ｋｈｉｍｅｃｈｅｓｋａｙａ）、Ｎｏ．３、６５７−６６０頁（１９７８年）およびクリチェルドルフ（Ｋｒｉｃｈｅｌｄｏｒｆ）、Ｌｉｅｂｉｇｓ Ａｎｎ．Ｃｈｅｍ．７６３、１７〜３８頁（１９７２年）において論じられている。

生産性および製造されたペプチドまたはペプチド類似体の純度の点で良好な結果を見込んでいるペルシリル化技術を用いる効率的で迅速なペプチド合成のための方法が今見出された。

従って、本発明は、ペプチドまたはペプチド類似体を製造する方法であって、
式（Ｉ）Ｘ−Ａ−ＣＯＯＨ（式中、Ｘはアミノ保護基であり、Ａは、アミノ酸残基、ペプチド残基またはペプチド類似体残基であり、−ＣＯＯＨは任意に活性化されたカルボキシル基を表す）の化合物を４〜１５個のアミノ酸を含有するペルシリル化ペプチドまたはペルシリル化ペプチド類似体と反応させる工程を含む方法に関する。

大規模な調製ペルシリル化が、テトラペプチド、ペンタペプチドなどのより高級なペプチドのために可能であり、後者が、高い純度、特に光学的純度を有するより長い鎖のペプチドおよびペプチド類似体の高収率製造を見込むのに十分な反応性および溶解性を有することが見出された。トリメチルシアノシラン以外のシリル化試薬がより長い鎖のペプチドのために適することも見出された。

本発明における「ペプチド」は、特に、アミド結合により互いに結合されたアミノ酸から本質的になる化合物を表すと理解される。
本発明における「ペプチド類似体」は、特に、アミノ酸から本質的になる化合物であって、ヘテロ置換カルボン酸、例えばヒドロキシカルボン酸またはメルカプトカルボン酸などのペプチドに導入され得る他の化合物を任意に含む化合物を表すと理解される。ペプチド類似体は、通常、ウレタン結合、ウレア結合、エステル結合またはチオエステル結合などのアミド結合とは異なる、ペプチド配列中に少なくとも１つの結合を含む。本発明におけるペプチドまたはペプチド類似体は、線状、環式または分岐であることが可能であり、好ましくは線状である。

本発明におけるペプチドまたはペプチド類似体および残基「Ａ」の成分として有用であるアミノ酸は、天然アミノ酸および非天然アミノ酸を含む。アミノ酸は、例えば、天然アミノ酸：アラニン、バリン、ノルバリン、レウシン、ノルレウシン、イソレウシン、セリン、イソセリン、ホモセリン、スレオニン、アロスレオニン、メチオニン、エチオニン、グルタミン酸、アスパラギン酸、アスパラギン、システイン、シスチン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、リシン、アルギニン、ヒスチジン、オルニチン、グルタミンおよびシトルリンから選択することが可能である。

特に、セリン、イソセリン、ホモセリンおよび／またはチロシン、より特にセリンおよび／またはチロシンを含有するペルシリル化部分は好ましい。
それらの非天然鏡像異性体を用いることも可能である。

アミノ酸は、例えば、合成由来のアミノ酸：（１−ナフチル）アラニン、（２−ナフチル）アラニン、ホモフェニルアラニン、（４−クロロフェニル）アラニン、（４−フルオロフェニル）アラニン、（３−ピリジル）アラニン、フェニルグリシン、ジアミノピメリン酸（２，６−ジアミノヘプタン−１，７−二酸）、２アミノ酪酸、２アミノテトラリン−２−カルボン酸、エリトロ−β−メチルフェニルアラニン、トレオ−β−メチルフェニルアラニン、（２−メトキシフェニル）アラニン、１アミノ−５−ヒドロキシインダン−２−カルボン酸、２−アミノヘプタン−１，７−二酸、（２，６−ジメチル−４−ヒドロキシフェニル）アラニン、エリトロ−β−メチルチロシンまたはトレオ−β−メチルチロシンから選択することが可能である。

本発明による方法のプロセス工程は、一般に液相中で行われる。
本発明による方法において、ペルシリル化ペプチドは、４、５、６、７または８個のアミノ酸、より好ましくは、４、５または６個のアミノ酸を含有する。これらの数が、ペプチド類似体における連結単位の数に同様に当てはまることは言うまでもない。

本発明による方法においてペルシリル化形態を取って適切に反応され得るペプチド配列の特定の例には、Ｈ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｈ（配列番号２）、
Ｈ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−（Ｄ）ＡｌａＮＨ２（配列番号３）、
Ｈ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−（Ｄ）Ｃｉｔ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−（Ｄ）ＡｌａＮＨ２（配列番号４）、
Ｈ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＯＨ（配列番号５）
Ｈ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−（Ｄ）Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−ＮＨＮＨＣＯＮＨ２（配列番号６）
が挙げられる。

本発明による方法の工程（ａ）において、ペルシリル化ペプチドまたはペルシリル化ペプチド類似体は、好ましくは有機溶媒中でのシリル化剤との反応によって対応するペプチド（類似体）をシリル化することにより得られる。ペルシリル化ペプチドまたはペルシリル化ペプチド類似体は、必要ならば、単離し精製することが可能である。しかし、例えば、ペルシリル化ペプチドまたはペルシリル化ペプチド類似体を含有する溶液と式（Ｉ）の任意に活性化された化合物を含有する溶液とを組み合わせることにより、現場（ｉｎ ｓｉｔｕ）でペルシリル化ペプチドまたはペルシリル化ペプチド類似体を用いることが好ましい。

本発明において、Ｎ−トリアルキルシリルアミンまたはＮ−トリアルキルシリルアミドなどのシアノ基を含有しないシリル化剤を用いることが好ましい。こうしたシリル化試薬の例には、Ｎ，Ｏ−ビス（トリメチルシリル）アセトアミド、Ｎ，Ｏ−ビス（トリメチルシリル）トリフルオロアセトアミド、ヘキサメチルジシラザン、Ｎ−メチル−Ｎ−トリメチルシリルアセトアミド（ＭＳＡ）、Ｎ−メチル−Ｎ−トリメチルシリルトリフルオロアセトアミド、Ｎ−（トリメチルシリル）アセトアミド、Ｎ−（トリメチルシリル）ジエチルアミン、Ｎ−（トリメチルシリル）ジメチルアミン、１−（トリメチルシリル）イミダゾール、３−（トリメチルシリル）−２−オキサゾリドンが挙げられる。Ｎ−メチル−Ｎ−トリメチルシリルアセトアミド（ＭＳＡ）が好ましい。

工程（ａ）の反応は、一般には０℃〜１００℃、好ましくは２５℃〜５０℃の温度で行われる。
工程（ａ）の反応において、シリル化されるべき官能基のモル量を基準として一般には０．５〜５当量、好ましくは０．７〜２当量、より好ましくは約１または１〜１．５当量のシリル化剤が用いられる。シリル化されるべき官能基のモル量を基準として２〜４当量のシリル化剤の使用も可能である。「シリル化されるべき官能基」は、特に、アミノ基、ヒドロキシル基、メルカプト基またはカルボキシル基などのシリル化剤と反応する活性水素原子を有する基を表すと理解される。

「ペルシリル化」は、特に、シリル化剤と反応できる活性水素原子を有する基がカップリング工程（ｂ）のための均質反応媒体を確実に得るのに十分にシリル化されているペプチドまたはペプチド類似体を表すことを意図していることは言うまでもない。
シリル化を溶媒の存在下で行うとき、前記溶媒は、好ましくは極性有機溶媒、より好ましくは極性非プロトン性有機溶媒である。Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドまたは特にＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡＣ）などのアミド型溶媒は、より特に好ましい。
別の実施形態において、シリル化は、シリル化剤およびペプチドまたはペプチド類似体から本質的になる液体シリル化媒体中で行われる。

本発明のペプチドまたはペプチド類似体において、残基Ａは、特に、２〜２０個のアミノ酸、より好ましくは２、３、４、５、６、７、８または９個のアミノ酸を含むアミノ保護Ａのカルボキシル基に、ペプチドのＮ末端としてまたはペプチド類似体における任意に対応する位置として結合されるペプチドまたはペプチド類似体を表すと理解される。

本発明による方法において適切に反応され得る式Ａの化合物の配列の特定の例には、
Ｚ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ａｌａ−ＯＨ
Ｚ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−（Ｄ）Ｃｉｔ−ＯＨ
Ａｃ−（Ｄ）Ｎａｌ−（Ｄ）Ｃｐｈ−（Ｄ）Ｐａｌ−ＯＨ
Ｂｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−ＯＨ（配列番号７）
Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ
が挙げられる。

本発明による方法は、特に、以下の反応に適用することが可能である。

「アミノ保護基Ｘ」という用語は、アミノ基の酸性陽子を取り替えて、その求核性を減少させるために用いられ得る保護基を意味する。典型的には、アミノ保護基Ｘは、成長ペプチド鎖に付加されるべき次のアミノ酸の付加の前に脱保護反応において除去される。アミノ保護基Ｘは、好ましくは立体的に妨害している。「立体的に妨害している」という用語は、特に、少なくとも１個の第二炭素原子、第三炭素原子または第四炭素原子を含む少なくとも３個の炭素原子、特に少なくとも４個の炭素原子を含む置換基を表すべく意図されている。立体的に妨害している基は、しばしば、多くとも１００個、好ましくは多くとも５０個の炭素原子を含む。

Ｘによって本明細書において表されたアミノ保護基の非限定的なとして、ホルミル、アクリリル（Ａｃｒ）、ベンゾイル（Ｂｚ）、アセチル（Ａｃ）、トリフルオロアセチルなどのアシル型の置換基または非置換基；ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）、ｐクロロベンジルオキシカルボニル、ｐブロモベンジルオキシカルボニル、ｐニトロベンジルオキシカルボニル、ｐメトキシベンジルオキシカルボニル、ベンズヒドリルオキシカルボニル、２（ｐビフェニルイル）イソプロピルオキシカルボニル、２（３，５ジメトキシフェニル）イソプロピルオキシカルボニル、ｐフェニルアゾベンジルオキシカルボニル、トリフェニルホスホノエチルオキシカルボニル、または９フルオレニルメチルオキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ）などのアラルキルオキシカルボニル型の置換基または非置換基；ｔ−ブチルオキシカルボニル（ＢＯＣ）、ｔ−アミルオキシカルボニル、ジイソプロピルメチルオキシカルボニル、イソプロピルオキシカルボニル、エチルオキシカルボニル、アリルオキシカルボニル、２メチルスルホニルエチルオキシカルボニルまたは２，２，２トリクロロエチルオキシカルボニル基などのアルキルオキシカルボニル型の置換基または非置換基；シクロペンチルオキシカルボニル、シクロヘキシルオキシカルボニル、アダマンチルオキシカルボニルまたはイソボルニルオキシカルボニル基などのシクロアルキルオキシカルボニル型の基；およびベンゼンスルホニル、ｐトルエンスルホニル、メシチレンスルホニル、メトキシトリメチルフェニルスルホニル、２−ニトロベンゼンスルホニル、２−ニトロベンゼンスルフェニル、４−ニトロベンゼンスルホニルまたは４−ニトロベンゼンスルフェニル基などのヘテロ原子を含有する基について特に言及してもよい。これらのＸ基の中で、カルボニル、スルフェニルまたはスルホニル基を含む基が好ましい。アミノ保護基Ｘは、好ましくは、アリルオキシカルボニル基、ｔ−ブチルオキシカルボニル基（ＢＯＣ）、ベンジルオキシカルボニル基（Ｚ）、９フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、４−ニトロベンゼンスルホニル（Ｎｏｓｙｌ）、２−ニトロベンゼンスルフェニル（Ｎｐｓ）および置換誘導体から選択される。より好ましくは、アミノ保護基Ｘはｔ−ブチルオキシカルボニル基（ＢＯＣ）である。

アミノ保護基Ｘは、種々の方法、例えば、カルボベンズオキシクロリドなどの適する酸ハロゲン化物または無水酢酸などの酸無水物およびジ−ｔ−ブチルジカーボネート（ＢＯＣ₂Ｏ）との反応によって導入してもよい。他方、アミノ保護基Ｘは、酸分解、水添分解、希水酸化アンモニウムによる処理、ナトリウムによる処理、ナトリウムアミドによる処理、ヒドラジンによる処理、または酵素加水分解によって除去してもよい。本発明による方法は、しばしば、式（Ｉ）の化合物とペルシリル化ペプチドの反応によって生成する化合物から基Ｘを除去する工程を更に含む。

本発明による方法において、式（Ｉ）の化合物とペルシリル化ペプチドとの間の反応は、しばしば、カルボキシル基活性化剤の存在下で行われる。こうした場合、カルボン酸活性化剤は、カルボジイミド、ハロゲン化アシル、ホスホニウム塩およびウロニウム塩またはグアニジニウム塩から適切に選択される。より好ましくは、カルボン酸活性化剤はハロゲン化アシルである。なおより好ましくは、カルボン酸活性化剤は、イソブチルクロロホルメートおよび塩化ピバロイルから選択される。

良好な結果は、しばしば、副反応を減少させるおよび／または反応効率を向上させる追加のカルボン酸活性化剤を用いるときに得られる。例えば、ホスホニウム塩およびウロニウム塩は、第三塩基、例えば、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）およびトリエチルアミン（ＴＥＡ）の存在下で、保護アミノ酸を活性化化学種（例えば、ＢＯＰ、ＰｙＢＯＰ、ＨＢＴＵおよびＴＢＴＵ、すべてはＨＯＢｔエステルを発生させる）に転化させることが可能である。他の試薬は、保護試薬を提供することによりラセミ化を妨げるのを助ける。これらの試薬には、補助求核性試薬（例えば、１−ヒドロキシ−ベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、１−ヒドロキシ−アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）またはＨＯＳｕ）またはその誘導体が添加されたカルボジイミド（例えば、ＤＣＣまたはＷＳＣＤＩ）が挙げられる。用いることができる別の試薬はＴＢＴＵである。アジド法がそうである通り、補助求核性試薬が添加されたイソブチルクロロホルメートまたは補助求核性試薬が添加されていないイソブチルクロロホルメートを用いる混合無水物法も用いられる。その理由は、それに附随した低いラセミ化のゆえである。これらのタイプの化合物は、Ａｓｎ残留物およびＧｌｎ残留物の脱水を妨げるばかりでなく、カルボジイミド介在カップリングの速度を増加させることも可能である。典型的な追加の試薬は、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）、トリエチルアミン（ＴＥＡ）またはＮ−メチルモルホリン（ＮＭＭ）などの塩基も含む。

本発明による方法において、工程（ｂ）の反応は、一般に、−５０℃〜５０℃、好ましくは−４０℃〜１０℃の温度で行われる。

別の態様において、本発明は、式（Ｉ）Ｘ−Ａ−ＣＯＯＨ（式中、Ｘはアミノ保護基であり、Ａは、アミノ酸残基、ペプチド残基またはペプチド類似体残基であり、−ＣＯＯＨは任意に活性化されたカルボキシル基を表す）の化合物をペルシリル化ペプチドまたはペルシリル化ペプチド類似体と反応させることによって得られる部分シリル化ペプチドまたは部分シリル化ペプチド類似体の溶液を提供するための極性有機溶媒の使用に関する。

処理および精製または脱保護および後続のカップリング工程などの任意の更なる反応工程のために特に適する均質溶液を提供するために反応全体を通して少なくとも５個のアミノ酸（または任意に類似体単位）を特に有する部分シリル化カップリング製品を極性有機溶媒中の溶液において維持できることが見出された。驚くべきことに、これは、反応を低温で行うときにも可能である。

極性有機溶媒は、例えば、エーテル、特に水混和性エーテル、例えば、テトラヒドロフラン、ジオキサンまたは１，２−ジメトキシエタンから、ニトロアルカン、特に水混和性ニトロアルカン、例えば、ニトロメタンから、またはアミド型溶媒、特に水混和性アミドから選択することが可能である。
本発明による使用において、極性有機溶媒は、好ましくは、Ｎ，Ｎ，ジメチルホルムアミドおよびＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミドならびにＮ−メチルピロリドンから選択される好ましくはアミド型溶媒である。より好ましくは、溶媒はＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミドである。この溶媒は、副生物の実質的な生成なしで生成したペプチドまたはペプチド類似体の特に効率的な処理および回収を見込んでいる。

本発明による使用において、溶液中の部分シリル化ペプチドまたは部分シリル化ペプチド類似体の濃度は、一般に、溶液の全質量を基準として約１質量％以上、好ましくは約５質量％以上である。本発明による使用において、溶液中の部分シリル化ペプチドまたは部分シリル化ペプチド類似体の濃度は、一般に、溶液の全質量を基準として約２０質量％以下、好ましくは約１５質量％以下である。

本発明による使用の特定の態様において、Ａにおけるアミノ酸単位および任意の類似体単位の数対ペルシリル化ペプチドまたはペルシリル化ペプチド類似体におけるアミノ酸単位および任意の類似体単位の数の比は、一般に、１：５以上、好ましくは１：４以上である。この態様において、前記比は、３：２以下、好ましくは１：１以下である。

本発明による使用において、溶液は、一般に、溶液の全質量を基準として１０質量％〜９５質量％の極性有機溶媒を含有する。
本発明による使用において、部分シリル化ペプチドまたは部分シリル化ペプチド類似体は、好ましくは、前に本明細書に記載された本発明による方法によって得られる。
本発明による使用の特に好ましい実施形態において、溶液は−４０℃〜＋１０℃の温度で均質である。

本発明は、本発明による使用を含む、ペプチドまたはペプチド類似体を製造する方法にも関する。

以後の実施例は本発明を例示するべく意図されているが、しかし、本発明を限定するものではない。
これらの実施例において且つ本明細書全体を通して、用いられた略号を次の通り定義する。
ＡｃＯＨは酢酸であり、ＡｃＯＥｔは酢酸エチルであり、Ｂｏｃはｔ−ブトキシカルボニルであり、ｎ−ＢｕＯＨはｎ−ブタノールであり、ｉ−ＢｕＯＨはイソブタノールであり、Ｃｂｚはベンジルオキシカルボニルであり、ＤＣＣは１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミドであり、ＤＣＭはジクロロメタンであり、ＤＩＣは１，３−ジイソプロピルカルボジイミドであり、ＤＩＰＥＡはＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンであり、ＤＭＦはＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドであり、ＤＭＡはＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミドであり、ＥＤＣは１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミドであり、Ｆｍｏｃはフルオレニルメチルオキシカルボニルであり、ＨＢＴＵはＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−Ｏ−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）ウロニウム−ヘキサフルオロルホスフェート）であり、ＨＯＢＴは１−ヒドロキシベンゾトリアゾールであり、ＨＯＯＢＴは３，４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−４−オキソ−１，２，３−ベンゾトリアジンであり、ＩＢＣＦはイソブチルクロロホルメートであり、ｉ−ＢｕＯＨはイソブタノールであり、ＩＰＥはジイソプロピルエーテルであり、ＭｅＣＮはアセトニトリルであり、ＭｅＯＨはメタノールであり、ＭＳＡはＮ−メチル−Ｎ−トリメチルシリルアセトアミドであり、ＮＭＭはＮ−メチルモルホリンであり、ＮＭＰは１−メチル−２−ピロリドンであり、ｔＢｕはｔ−ブチルであり、ＴＥＡはトリエチルアミンであり、ＴＨＦはテトラヒドロフランであり、Ｔｏｓはトシルであり、Ｔｒｔはトリチルである。

実施例１：［２＋４］：Ｚ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−ＯＨ（配列番号８）
窒素雰囲気下で、Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ（配列番号２）（１．０当量）をＤＣＭに分散させ、ＭＳＡにより室温で溶解した。窒素雰囲気下で、Ｚ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ａｌａ（１．０５当量）およびＴＥＡ（１．０当量）を２５℃±５でＣＨ₂Ｃｌ₂／ＤＭＦの混合物に溶解し、その後−１５℃に冷却した。カルボキシル官能基をピリジン（１．０当量）および塩化ピバロイル（１．０当量）の添加によって活性化させた。１０分後、シリル化ペプチドを活性化ペプチド上に移送した。均質であったカップリング反応媒体を水で希釈し、２相系に導いた。ＣＨ₂Ｃｌ₂を真空下で除去し、それによってペプチドは沈殿し、濾過によってＺ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕｔ）−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕを単離し、水で洗浄し、その後、真空下で乾燥させた。本出願人らは少なくとも７０質量％の収率で白色固体を得た。

実施例２：［３＋４］：Ｚ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−（Ｄ）Ｃｉｔ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−（Ｄ）ＡｌａＮＨ２．ＨＣｌ（配列番号４）
窒素雰囲気下で、ＬｅｕＡｒｇＰｒｏ（Ｄ）ＡｌａＮＨ２（配列番号３）（１．０５当量）をＤＭＡに溶解し、最高４０℃でＭＳＡによりシリル化させ、その後、溶液を約５℃に冷却した。窒素雰囲気下で、ＺＳｅｒＴｙｒ（Ｄ）ＣｉｔＯＨ（１．０当量）およびＨＯＯＢｔ（１．０５当量）を最高４０℃でＭＳＡに溶解し、溶液を約−５℃に冷却した。その後、溶液Ａを溶液Ｂに移送し、ＥＤＣの添加によってカップリングを開始した。ＨＣｌ（１．１当量）および反応混合物を少なくとも１時間にわたり−５℃で、その後、少なくとも３時間の間約５℃で攪拌した。反応の終わりをＨＰＬＣによって調べた。溶媒を真空下で除去し、その後、濃縮物をＮａＣｌの１％水溶液中で希釈し、ｐＨを希ＨＣｌの制御された添加によって２．５〜３．３の間に調節した。ＨＯＯＢｔおよびＤＭＡを除去するために、水溶液をＤＣＭで洗浄し、その後、ペプチドをｎ−ＢｕＯＨで３回抽出した。含水率が１質量％以下になるまで減圧下での蒸発によって溶媒を除去した。約４５℃で温度を維持することによりスラリーをアセトンで漸次希釈して、ペプチドを白色固体として沈殿させた。約２０℃で少なくとも１時間の間攪拌後に白色固体を濾過した。固体をアセトンで、最後にアセトニトリルで洗浄した。アセトン含有率が２０質量％以下になるまで沈殿物を乾燥させた。本出願人らは少なくとも７０質量％の収率で白色固体を得た。

実施例３：［３＋７］：Ａｃ−（Ｄ）Ｎａｌ−（Ｄ）Ｃｐｈ−（Ｄ）Ｐａｌ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−（Ｄ）Ｃｉｔ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−（Ｄ）Ａｌａ−ＮＨ２．ＨＣｌ（配列番号１）
窒素雰囲気下で、ＳｅｒＴｙｒ（Ｄ）ＣｉｔＬｅｕＡｒｇＰｒｏ（Ｄ）ＡｌａＮＨ２（配列番号４）（１．０５当量）をＤＭＡに溶解し、少なくとも６０分にわたり最高４０℃でＭＳＡによりシリル化させ、その後、溶液を約−５℃に冷却した。窒素雰囲気下で、Ａｃ（Ｄ）Ｎａｌ（Ｄ）Ｃｐｈ（Ｄ）ＰａｌＯＨ（１．０当量）およびＨＯＯＢｔ（１．０５当量）を最高４０℃でＤＭＡに溶解し、溶液を約−５℃に冷却した。その後、溶液Ａを溶液Ｂに移送し、ＥＤＣの添加によってカップリングを開始した。ＨＣｌ（１．１当量）および反応混合物を少なくとも２時間にわたり−５℃で、その後、少なくとも８時間の間約５℃±５で攪拌した。反応の終わりをＨＰＬＣによって調べた。反応全体を通して均質なままであった反応混合物を水で希釈し、ＨＣｌの希釈水溶液によりｐＨを２．０±０．５で調節した。その後、溶液を±３５℃でＤＣＭで２回洗浄し、その後、ｎ−ＢｕＯＨでペプチドを３回抽出した。組み合わせた有機相を最後に水で洗浄した。含水率が２質量％以下になるまで減圧下での蒸発によって溶媒を除去した。スラリーをアセトンで希釈して、ペプチドを白色固体として沈殿させた。約１５℃で少なくとも１時間の間攪拌後に白色固体を濾過した。固体をアセトンで洗浄した。アセトン含有率が５質量％以下になるまで沈殿物を乾燥させた。その後、少なくとも１時間の間約２０℃でＭｅＯＨとアセトンの１／１混合物中で、乾燥させた固体を粉砕し、濾過し、アセトンで洗浄した。本出願人らは少なくとも７０質量％の収率で白色固体を得た。

実施例４：［４＋７］：Ｂｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｇｌｙ ＯＨ （配列番号９）
窒素雰囲気下で、Ｓｅｒ（ｔＢｕ）Ｔｈｒ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）Ｖａｌ Ｌｅｕ ＧｌｙＯＨ（配列番号５）（１．０当量）をＮＭＰに溶解し、少なくとも９０分にわたり最高５０℃でＭＳＡによりシリル化させ、その後、溶液を約５℃に冷却した。窒素雰囲気下で、Ｂｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ａｓｎ−Ｌｅｕ ＯＨ（配列番号７）（１．０２当量）およびＮＭＭ（１．０５当量）をＮＭＰに溶解し、その後、溶液を約−１５℃±５に冷却した。その後、カルボキシル部分をＩＢＣＦ（１．０５当量）の添加によって活性化した。その後、溶液Ａを溶液Ｂに移送し、反応混合物を少なくとも６０分にわたり０℃で攪拌した。反応全体を通して均質なままであった反応混合物をＫＨＳＯ₄の水溶液で希釈し、それはペプチドを沈殿させた。固体を濾過し、水、その後、アセトンと水の９／１混合物で洗浄した。乾燥後、本出願人らは少なくとも７５質量％の収率で白色固体を得た。

実施例５：［４＋７］：Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−（Ｄ）Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−ＮＨＮＨＣＯＮＨ２（配列番号１０）
窒素雰囲気下で、Ｈ−ＴｒｐＳｅｒＴｙｒ（Ｄ）Ｓｅｒ（ｔＢｕ）ＬｅｕＡｒｇＰｒｏＮＨＮＨＣＯＮＨ２（配列番号６）（１．０当量）をＤＭＡに溶解し、少なくとも６０分にわたり最高４０℃でＭＳＡによりシリル化させた。溶液を約±２５℃に冷却し、Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ（１．０当量）およびＨＢＴＵ（１．１当量）を添加し、完全に溶解するまで±２５℃で溶液を混合し、次に約−５℃まで冷却した。ＤＩＰＥＡ（１．１当量）の制御された添加によってカップリングを開始した。反応の終わりをＨＰＬＣによって調べた。カップリング中に均質なままであった反応混合物をＫＨＳＯ₄の水溶液で希釈し、それはペプチドを沈殿させた。固体を濾過し、水で洗浄した。乾燥後、本出願人らは少なくとも７０質量％の収率で白色固体を得た。

Claims (23)

1. ペプチドまたはペプチド類似体を製造する方法であって、
   （ａ）トリメチルシリルシアニド以外のシリル化剤との反応によって対応するペプチドをシリル化することによりペルシリル化ペプチドまたはペルシリル化ペプチド類似体を製造する工程と、
   （ｂ）式（Ｉ）Ｘ−Ａ−ＣＯＯＨ（式中、Ｘはアミノ保護基であり、Ａは、アミノ酸残基、ペプチド残基またはペプチド類似体残基であり、−ＣＯＯＨは任意に活性化されたカルボキシル基を表す）の化合物を４〜１５個のアミノ酸を含有するペルシリル化ペプチドまたはペルシリル化ペプチド類似体と反応させる工程と
   を含む方法。
2. 前記ペルシリル化ペプチドが、４、５、６、７または８個のアミノ酸を含有する請求項１に記載の方法。
3. 前記ペルシリル化ペプチドが、４、５または６個のアミノ酸を含有する請求項１に記載の方法。
4. 工程（ｂ）の反応が有機溶媒中で行われる請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
5. 前記シリル化剤が、Ｎ−トリアルキルシリルアミンおよびＮ−トリアルキルシリルアミドから選択され、好ましくは、Ｎ−メチル−Ｎ−トリメチルシリルアセトアミド（ＭＳＡ）である請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
6. 前記有機溶媒が、極性有機溶媒、好ましくはアミド型溶媒、より好ましくはＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡＣ）である請求項４または５のいずれか一項に記載の方法。
7. 工程（ａ）のシリル化反応が２５℃〜５０℃の温度で行われる請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
8. シリル化されるべき官能基のモル量を基準として、０．５〜５当量、好ましくは０．７〜１．５当量のシリル化剤が用いられる請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
9. Ａが、２、３、４、５、６、７、８または９個のアミノ酸を含む請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
10. Ｘが電子求引性アミノ保護基である請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
11. ＸがＢｏｃ基である請求項１０に記載の方法。
12. 工程（ｂ）の反応が、カルボキシル基活性化剤、好ましくはピバロイルクロリドまたはイソブチルクロロホルメートの存在下で行われる請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
13. 前記反応によって生成した化合物から基Ｘを除去する工程を更に含む請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
14. 式（Ｉ）Ｘ−Ａ−ＣＯＯＨ（式中、Ｘはアミノ保護基であり、Ａは、アミノ酸残基、ペプチド残基またはペプチド類似体残基であり、−ＣＯＯＨは任意に活性化されたカルボキシル基を表す）の化合物をペルシリル化ペプチドまたはペルシリル化ペプチド類似体と反応させることによって得られる部分シリル化ペプチドまたは部分シリル化ペプチド類似体の溶液を提供するための極性有機溶媒の使用。
15. 前記極性有機溶媒が、好ましくはＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドおよびＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミドから選択されるアミド型溶媒である請求項１４に記載の使用。
16. 前記溶媒がＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミドである請求項１５に記載の使用。
17. Ａにおけるアミノ酸単位および任意の類似体単位の数対ペルシリル化ペプチドまたはペルシリル化ペプチド類似体におけるアミノ酸単位および任意の類似体単位の数の比が、１：５〜３：２、好ましくは１：４〜１：１である請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の使用。
18. 前記溶液が１０質量％〜９５質量％の極性有機溶媒を含有する請求項１４〜１７のいずれか一項に記載の使用。
19. 部分シリル化ペプチドまたは部分シリル化ペプチド類似体が、請求項９または１０のいずれか一項に記載の式（Ｉ）の化合物を請求項１〜３のいずれか一項に記載のペルシリル化ペプチドまたはペルシリル化ペプチド類似体と反応させることにより得られる請求項１４〜１８のいずれか一項に記載の使用。
20. 前記溶液が−４０℃〜＋１０℃の温度で均質である請求項１４〜１９のいずれか一項に記載の使用。
21. 請求項１４〜２０のいずれか一項に記載の使用を含む、ペプチドまたはペプチド類似体を製造する方法。
22. Ｎ−メチル−Ｎ−トリメチルシリルアセトアミドおよびアミド型溶媒を含有する液媒体中に４〜１５個のアミノ酸を含有するペプチドまたはペプチド類似体を含む溶液。
23. 前記アミド型溶媒がＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミドである請求項２３に記載の溶液。