CZ20013214A3

CZ20013214A3 - Způsob přípravy cyklo(Asp-DPhe-NMeVal-Arg-Gly)

Info

Publication number: CZ20013214A3
Application number: CZ20013214A
Authority: CZ
Inventors: Alfred Jonczyk; Markus Arnold
Original assignee: Merck Patent Gmbh
Priority date: 1999-03-11
Filing date: 2000-03-01
Publication date: 2001-12-12
Also published as: MY120083A; CN1343220A; PL202996B1; SK12552001A3; AR022905A1; CA2366694C; UA71608C2; TWI269798B; CN1200947C; ATE267839T1; NO330030B1; AU762540B2; HUP0200369A3; SE1159296T3; DE50006598D1; PT1159296E; EP1159296A1; KR100645002B1; CZ299879B6; AU4103400A

Description

Způsob přípravy cykloíAsp-DPhe-NMeVal-Arg-Gly)

Oblast techniky

Vynález se týká nového způsobu přípravy cyklického pentapeptidu cykloíArg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal).

Dosavadní stav techniky

Cyklické pentapeptidy například také cykloíArg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal) a jejich fyziologicky přijatelné soli jsou popsány v patentovém spise číslo EP O 770 622. Tento vynález je výběrovým vynálezem se zřetelem na EP 0 770 622.

Obecně se cyklické peptidy získávají cyklizací lineární prekurzorové molekuly za obyklých podmínek syntézy peptidů. Aby mohla být zaručena selektivní vazba dvou aminokyselin nebo dvou segmentů sestávajících z několika aminokyselin, nebo alternativně cyklizace lineárního peptidu, je třeba blokovat vhodnými chránícími skupinami odpovídající funkční části aminokyselin, které se nemají na reakci podílet. Byly proto vyvinuty různé typy chránících skupin pro aminoskupiny, pro skupiny karboxylové, hydroxylové, thiolové nebo karboxamidoskupiny a také pro guanidinové skupiny nebo pro imidazolový dusík, které ve svých kombinacích umožňují velkou možnost obměn se zřetelem na optimalizaci shora uvedených reakcí. Syntéza lineárních prekurzorových molekul, lineárních peptidů se může nadto provádět dvěma způsoby, jednak syntézou peptidu v pevné fázi, jednak v roztoku. V tomto případě jsou možné postupné kopulace aminokyselin nebo fragmentové kondenzace segmentů aminokyselin. Příslušné kopulační stupně se mohou opět provádět za pomoci různých kondenzačních činidel, jako jsou karbodiimidy, karbodiimidazol, sloučeniny uroniového typu, jako TBTU, nebo způsoby používajícími směsné anhydridy nebo aktivní estery.

Vynález je založen na vyvinutí nového zlepšeného způsobu přípravy cyklo(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal) v porovnání s dosud známými způsoby.

S překvapením se zjistilo, že při syntéze cyklopeptidu cyklo(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal) cyklizací lineární prekurzorové molekuly, kombinace chránících skupin 2,2,4,6,7-pentamethyldihydrobenzofuran-5-sulfonylové (Pbf) pro guanidinoskupinu ve vedlejším řetězci argininu a benzylové (Bzl) pro karboxylovou skupinu ve vedlejším řetězci asparagové kyseliny vede k optimalizaci výtěžeku.

Podstata vynálezu

Podstatou vynálezu je způsob přípravy cyklického pentapeptidu cykloí Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal) cyklizací lineárního pentapeptidu voleného ze souboru zahrnující ho

H-Arg(Pbf)-Gly-ASp(OBzl)-DPhe-NMeVal-OH,

H-Gly-Asp(OBzl)-DPhe-NMeVal-Arg(Pbf)-OH, H-Asp(OBzl)-DPhe-NMeVal-Arg(Pbf)-Gly-OH, H-DPhe-NMeVal-Arg(Pbf)-G1y-Asp(OBz)-OH nebo H-NMeVal-Arg(Pbf)-Gly-Asp(OBzl)-DPhe-OH, následným odstraněním chránící skupiny a popřípadě další konverzí na fyziologicky přijatelné soli.

Vynález se dále týká způsobu přípravy cyklického pentapept i du cyklo(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal) • 9 který spočívá v tom, že lineární pentapeptid H-Asp(OBzl)-DPhe-NMeVal-Arg(Pbf)-Gly-OH se cyklízuje.

Reakční podmínky této cyklizace lineárních pentapeptidů volených ze souboru zahrnujícího

H-Arg(Pbf)-GIy-ASp(OBzl)-DPhe-NMeVal-OH,

H-Gly-Asp(OBzl)-DPhe-NMeVal-Arg(Pbf)-OH,

H-Asp(OBzl)-DPhe-NMeVal-Arg(Pbf)-Gly-OH,

Η-DPhe-NMeVal-Arg(Pbf)-Gly-Asp(OBz)-OH nebo

H-NMeVal-Arg(Pbf)-Gly-Asp(OBzl)-DPhe-OH, s ohledem na volbu dehydratačního činidla, inertního rozpouštědla a rekační teploty a další převádění na jejich fyziologicky přijatelné soli jsou poppsány v EP 0770 622.

Benzylová chránící skupina na vedlejším řetězci asparagové kyseliny může být odstraněna za obvyklých podmínek (například T.W. Greene, P.G.M. Wuts, Protéct i ve Groups in Organic Chemístry, 2. vydání, vydavatel Wiley, New York 1991; nebo P.J. Kocienski, Protecting Groups 1. vydánmí, nakladatel George Thieme Verlag, Stuttgart-New York, 1994; H. Kunz, H. Waldmann, Comprehensive Organic Synthesis, sv. 6, (vydavatel B.M. Trošt, I. Fleming, E. Winterfeldt), Pergamon, Oxford str. 631 až 701, 1991) například zpracováním vodíkem v přítomnosti katalyzátoru (například vzácného kovu, jako je palladium na uhlí). Vhodnými rozpouštědly jsou například ethanoi nebo methanol nebo amidy jako dimethyl formámid nebo směsi s dalšími inertními rozpouštědly, jako jsou například směsi s vodou. Hydrolýza se provádí o

zpravidla při teplotách přibližně O až 100 C a tlacích přibližně 0,1 až 20 MPa, s výhodou 20 až 30 °C a 0, 1 až 1 MPa.

Chrániči skupina Pbf, kterou zavedl do chemie peptidu

L. A.

Carpino a kol. (Tet.

Let. 34, str. 7829-7832,

1993), se odstraňuje například 95% trifluoroctovou kyselinou (TFA).

Chrániči skupina Pbf vykazuje v tomto případě větší labilitu se zřetelem na TFA než strukturálně podobné chránící skupiny

• · · · • ·

4-methoxy-2,3,6-tri methylfenylsulfonylová ( Mtr) a 2,2,5,7,8-pentamethylchroman-6-sulfonylová (Pmc), které jsou také možnými chránícími skupinami vedlejšího řetězce při přípravě cyk1o( Arg-G1y-Asp-DPhe-NMeVal) .

Trifluoroctové kyseliny se s výhodou používá v nadbytku bez přísady dalšího rozpouštědla. Trifluoroctová kyselina se může také použít jako směs s inertním rozpouštědlem, jako je například kombinace TFA/dichlormethan v poměru 6:4. TFA se může kromě toho použít také s přísadou 1 až 10 %, s výhodou 2 % vody. Reakční teplota pro odštěpení je výhodně přibližně O až

O o

C a reakce se s výhodou provádí při teplotě 15 až 30 C (při teplotě místnosti).

Shora a dále uvedené zkratky aminokyselin mají následujívýzanm:

Asp asparagová kyselina

Arg arginin

Gly g1yc i n

Phe fenylalanin

Val valin

Kromě toho se ještě uvádějí zkratky, které mají následující význam:

BOC terč.-butoxykarbonyl

Bzl benzyl

CHA cyk1ohexylamin charakter i zace D-am i nokyse1 i ny

DCC1 dicyklohexylkarbodi imid

DMAP d i methylam i nopyri d i n

DMF

EDC1 d i methylformam i d

N-ethyl -N,N -(3-dimethylaminopropyl)karbodi imid, hydroch1or i d

Et ethyl

Fmoc

9-fluorenylmethoxykarbonyl

HOBt 1 -hydroxybenzotri aso1

Me methyl

MTBE methylterc-butylether

Mtr 4-methoxy-2,3,6-trimethylfenylsulfonyl

NMe N-methyl ováná a-aminoskupina

NMP N-methylpyrrolidon

OtBu terc-butylester

OMe methylester

OEt ethylester

Pbf 2,2,4,6,7-pentamethyldihydrobenzofuran-5-sulfo nyl

Pmc 2,2,5,7,8-pentamethylchroman-6-sulfonyl

POA fenoxyacetyl

Pr propyl

Su sukcinimid

TBTU 2-(ΙΗ-bensotriazol-1-yl)- 1,1,3,3-tetramethy1uroňiumtetraf1uorborát

TFA tr i f1uoroctovou kyše1 i nu

Z benzyloxykarbonyl

Také se s překvapením zjistilo, že specifická volba chránících skupin vedlejších řetězců Pbf na Arg a Bzl na Asp i při syntéze lineárních peptidů, které, jak bylo dříve zmíněno, jsou meziprodukty v syntéze cyklo( Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal), vede ke zlepšeným výtěžkům v příslušných stupních syntézy. Výsledkem je, že výtěžek cyklo(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal) je obecně zvýšen a z toho plyne snížení nákladů na syntézy.

Zlepšení výtěžku se dosahuje v tomto případě jak při syntéze peptidu v pevné fázi tak v roztoku lineárních peptidů

H-Arg(Pbf)-G1y-ASpíOBzl)-DPhe-NMeVal-OH, H-Gly-Asp(OBzl)-DPhe-NMeVal-Arg(Pbf)-OH, H-Asp(OBzl)-DPhe-NMeVal-Arg(Pbf)-Gly-OH, H-DPhe-NMeVal-Arg(Pbf)-Gly-AspCOBz)-OH nebo

Η-NMeVal-Arg(Pbf)-Gly-Asp(OBzl)-DPhe-OH, zvláště H-Asp(OBzl)-DPhe-NMeVal-Arg(Pbf)-Gly-OH.

Chráněné aminokyseliny nebo fragmenty aminokyselin, používané v obou způsobech syntézy, se připravují obvykle způsoby syntézy aminokyselin a peptidů popsánými ve standardních publikacích (Principles of Peptide Synthesis, vydavatel M.Bodansky, Springer Verlag Berlin 1984; Houben Weyl, Methoden der organischen Chemie [Methods of Organic Chemistry], sv. 15/11, str.1 až 806 1974, Georg Thieme Verlag, Stuttgart; Calbiochem/ Novabiochem Catalogue and Synthesis Handbook 1999; Synthesis Notes or Peptide Synthesis Protocols, vydavatel M.W. Pennington a B.M. Dunn, Methods in Molecular Biology, sv 35, Humana Press Totowa N.J. 1994), a to sa reakčních podmínek, které jsou pro jmenované reakce známy a vhodné. Přitom se může také používat o sobě známých, zde blíže nepopisovaných variant.

Základní principy syntézy peptidů v pevné fázi vypracovali B.F Gysin a R.B. Merrifield (J. Am. Chem. Soc. 94, od str. 3102, 1972). Shora popsaná syntéza lineárních peptidů v pevné fázi, jejich izolace a čištění se provádí způsobem, který popsal A. Jonczyk a J. Meienhofer (Pepides, 8^th Am. Pept. Symp., vydavatel V. Hrubý a G.H. Rich, Pierce Comp. III, str. 73 až 77, 1983) nebo obdobně způsoby popsanými v Angew. Chem. 104, str. 375 až 391, 1992.

Obzvlášť výhodně se lineární peptidy syntetizují, jak je shora popsáno, konvergentně fragmentovou kondenzací.

Vynález se proto dále týká způsobu přípravy cyklického pentapeptidu cyklo(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal) , který spočívá v tom, že syntéza lineárního peptidů H-Asp(OBzl)-DPhe-NMeVal-Arg(Pbf)-Gly-OH se provádí konvergentně fragmentovou kondenzací tripeptidu R¹-Asp(OBzl)-DPhe-NMeVal-OH, kde znamená R¹ skupinu chránící aminoskupinu s dipeptidem H-Arg(Pbf)-G1y-R², kde znamená R² skupinu chránící karboxylovou skupinu a chrání7 cl skupiny R¹ a R² se pak odstraní.

Symbol R¹ znamená skupinu chránící aminoskupinu. Výraz skupina chránící aminoskupinu je obecně znám a jde o skupiny, které jsou vhodné k ochraně (k blokování) aminoskupiny před chemickými reakcemi, které jsou však snadno odstranitelné, když je žádoucí reakce na jiném místě molekuly provedena. Typické pro takové skupiny jsou zvláště nesubstituované nebo substituované skupiny acylové, arylové, aralkoxymethylové nebo aralkylové. Jelikož se skupiny, chránící aminoskupinu, po žádoucí reakci (nebo po sledu reakcí) odstraňují, nemá jejich druh a velikost rozhodující význam. Výhodnými jsou však skupiny s 1 až 20 atomy uhlíku. Výraz acylová skupina je zde vždy míněn v nejširším slova smyslu. Zahrnuje acylové skupiny odvozené od alifatických, aralifatických, aromatických nebo heterocykl i ckých karboxy1ových nebo sulfonových kyselin, jakož zvláště skupiny alkoxykarbonylové, alkenyloxykarbonylové; aryloxykarbonylové a především aralkoxykarbonylové. Jakožto příklady takových acylových skupin se uvádějí skupiny formylová nebo alkanoylové skupiny jako skupina acetylová, propionylová, butyrylová skupina; aralkanoylové jako fenylacetylová skupina; aroylové jako benzoylová nebo toluylová skupina; aryloxyalkanoylové jako fenoxyacetylová skupina; alkoxykarbonylové, jako skupina methoxykarbonylová, ethoxykarbony1ová, 2,2,2-trichlorethoxykarbonylová, terc-butoxykarbonylová (BOC), 2-jodethoxykarbonylová; alkenyloxykarbonylové jako aryloxykarbonylová (Aloe); aralkyloxykarbonylové jako skupina benzyloxykarbonylová (CBZ, synonymum Z), 4-methoxybenzyloxykarbonylová (MOZ), 4-nitrobenzyloxykarbonylová nebo 9-f1uorenylmethoxykarbonylová (FMOC), 2-( fenylsulfonyl)ethoxykarbonylová; trimethylsilylethoxykarbonylová skupina (Teoc); a arylsulfonylová skupina jako skupina 4-methopxy-2,3,6-trimethylfenylsulfonylová skupina (Mtr). Jakožto skupina chránící aminoskupinu je dále známa tritylová skupina (Trt). Výhodnými skupinami, chránícími aminoskupinu, jsou skupiny BOC a Fmoc a Aloe, dále Z, skupina Boc.

·· »« ·· ·· ·· ♦ · · · · · · ·· • · ·♦· · · · ♦ ·· • ·· · · ♦ ····«· · • · ♦ · · · · ·· ·· ·· ·· 99 99 benzylová a acetylová skupina.

Zviáště výhodnou

Symbol R² znamená skupinu chránící karboxylovou skupinu.

Výraz chránící karboxylovou skupinu je obecně znám a jde o skupiny.

které jsou vhodné k ochraně hydroxylové skupiny karboxylové kyseliny před chemickými reakcemi. Typickými skupinami tohoto typu jsou shora uvedené nesubstituované nebo substituované skupiny arylové, aralkylové, aroylové nebo acylové, dále také skupiny alkylové, arylové a aralkylsilylové.

Jelikož se skupiny, chránící karboxy1ovou skupinu, po žádoucí reakci (nebo po sledu reakcí) odstraňuj í, nemá jejich druh a ve1 i kost rozhodující význam.

Výhodnými jsou však skupiny s 1 až 20 a zvláště s 1 až 10 atomy uhlíku. Jakožto příklady skupin, chránících hydroxylovou skupinu, se uvádějí skupiny aralkylové jako benzylová, 4-methoxybenzylová nebo 2,

4-dimethoxybenzy1ová skupina; aroylové jako benzoylová nebo p-n i trobenzoylová skupina; acylové jako acetylová nebo pivaloylová skupina;, p-toluensulfonylová skupina; alkylové jako methylová nebo terc-butylová skupina; avšak také allylová skupina; alkylsilylové jako trimethylsilylová (TMS), tri isopropy1silylová (TIPS), terc-butyldimethylsilylová (TBS), triethylsilylová nebo trimethylsilylethylová skupina;

nebo aralkylsilylové jako terc-butyldi fenylsilylová (TBDPS) skupina. Výhodnými skupinami, chránícími karboxylovou skupinu, jsou skupina methylová, benzylová, acetylová, terc-butylová nebo TBS. Obzvláště výhodnou je skupina methylová a terc-butylová skupina.

Obecně výhodnými chránícími skupinami pro karboxylovou skupinu asparagové kyseliny jako vedlejšího řetězce jsou lineární nebo rozvětvené alkylové skupiny, jako skupina methylová, ethylová nebo terc-butylová, nebo aralalkylové skupiny, jako skupina benzylová. Při způsobu podle vynálezu je výhodnou skupina benzylová.

Obecně výhodnými chránícími skupinami pro guanidinoskupinu • 4 4φ 44 ·· 44 • · · 4 4 · · 4 44 • 4 4 44 4 4« 4 e4 • 4« 444 4 44444* • 444 44 444 ·· 44 44 Φ4 444 argininového vedlejšího řetěace jaou například skupina Z, Boa, Mtr nebo Pmc. Při způsobu podle vynálezu je výhodnou skupina Pbf.

Uvolňování chránící skupiny použité v kterémkoliv případě je známé z literatury (například T.W. Greene, P.G.M. Wuts, Protéct i ve Groups in Organic Chemistry, druhé vydání, Wiley, New York, 1991; nebo P.J. Kocienski, Protective Groups, 1. vyd. Georg Thieme Verlag, Stuttgart - New York, 1994). Přitom se může také používat o sobě známých, zde blíže nepopisovaných variant.

Vynález se týká shora popsaného způsobu, který spočívá v tom, že tripeptid R¹-Asp(OBzl)-DPhe-NMeVal-OH, kde znamená R¹skupinu chránící aminoskupinu, se připraví lineární syntézou reakcí Z-DPhe-OH s H-NMeVal-OMe na H-DPhe-NMeVal-OMe a pak jeho reakcí s aktivovaným derivátem R¹-Asp(OBzl)-OH a štěpením methylesteru.

Výhodným derivátem R¹ -Asp(OBzl)-OH je sukei nim id R¹-Asp(OBzl)-OSu. Další aktivní estery, kterých je možno použít, jsou známy z obecné literatury o peptidech, uvedené shora.

Vynález se dále týká shora popsaného způsobu, při kterém dipeptid H-Arg(Pbf)-Gly-R², kde znamená R² supinu chránící karboxylovou skupinu, se připraví lineární syntézou reakcí Z-Arg(Pbf)-OH a chránící skupina Z se odstraní.

Podobně se vynález týká lineárních pentapeptidů, volených ze souboru zahrnujícího

H-Arg(Pbf)-G1y-ASp(OBzl)-DPhe-NMeVal-OH,

H-Gly-Asp(OBzl)-DPhe-NMeVal-Arg(Pbf)-OH,

H-Asp(OBzl)-DPhe-NMeVal-Arg(Pbf)-Gly-OH,

H-DPhe-NMeVal-Arg(Pbf)-Gly-Asp(OBz)-OH nebo

H-NMeVal-Arg(Pbf)-Gly-Asp(OBzl)-DPhe-OH, • » jako meziproduktů pro syntézu cykloíArg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal).

Vynález se týká způsobu přípravy cyklického pentapeptidu cyklo(Arg-G1y-Asp-DPhe-NMeVal) ,

a) reakcí dipeptidu H-Arg(Pbf)-Gly-R², připraveného lineární syntézou Z-Arg(Pbf)-OH s H-Gly-R² a následným odstraněním chránící skupiny Z,

b) s tripeptidem R¹-AspíOBzl)-DPhe-NMeVal-OH, připraveným lineární syntézou Z-DPhe-OH s H-NMeVal-OMe a odstraněním chránící skupiny Z za získání H-DPhe-NMeVal-OMe a následnou kopulací tohoto peptidu na aktivní ester R¹-Asp(OBzl)-OH a následným štěpením methylesteru, konvergentně za získání lineárního pentapeptidu R¹-Asp(OBzl)-DPhe-NMeVal-Arg(Pbf)-Gly-R³,

c) odstraněním chránících skupin R¹ a R²,

d) cykližací uvolněného pentapeptidu H-Asp(OBzl)-DPhe-NMeVal-Arg( Pbf)-Gly-OH, za získání cyklo(Arg(Pbf)-Gly-Asp(OBzl)-DPhe-NMeVal),

e) odstraněním benzylové chránící skupiny,

f) odstraněním chránící skupiny Pbf trif1uoroctovou kyselinou a popřípadě převedením trifluoroacetátu cykloíArg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal), připraveného ve stupních a) až f) na další fyziologicky přijatelné soli.

Dalšími fyziologicky přijatelnými solemi jsou například soli anorganických kyselin, jako je kyselina sírová, siřičitá, dithionová, dusičná, hydrohalogenidové kyseliny, jako kyselina chlorovodíková nebo bromovodíková, fosforečné kyseliny, jako je kyselina ortofosfosforečná, sulfamová kyselina, dále organických kyselin, jako jsou obzvláště alifatické, alicyklické, aralifatické, aromatické nebo heterocyklické jednosytné nebo několikasytné karboxylové, sulfonové nebo sírové kyseliny, například kyselina mravenčí, octová, propionová, hexanová, oktanová, dekanová, hexadekanová, oktadekanová, pivalová, di-

«0 8» *0 • · ♦ Λ · 0 · «♦ * 00 • ·000 • 0 00 • · ·· • 0 0· • 0 · 0 00

0 0 0 000 0 00

0 0 0 00

0* 0» «0 · ethyloctová, malonová, jantarová, pimelová, fumarová, maleinová, mléčná, vinná, jablečná, citrónová, glukonová, askorbová, nikotinová, isonikotinová, methansulfonová nebo ethansulfonová, benzensulfonová, terimethoxybenzoová, adamantankarboxylová, p-toluensulfonová, glykolová, embonová, chlorofenoxyoctová, asparagová, glutamová, prolin, glyoxylová, palmitová, parachlorofenoxyisomáselná, cyklohexankarboxylová, glukoso-1- fosfát, naftalenmonosulfonová a disulfonová a aury1s í rová kysel ina.

Obzvlášť výhodnými fyziologicky přijatelnými solemi jsou hydrochlorid nebo interní soli cykloíArg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal).

Jestliže znamená R¹ Boc a R² terc-butylová skupina, mohou být tyto terč.-butylu podobné koncové chránící skupiny štěpeny mravenčí kyselinou, bez napadení chránících skupin Pbf a Bzl vedlejšího řetězce.

Další příklady popisují specifická provedení jednotlivých syntesních stupňů. Všechny teploty jsou ve C.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Syntéza Boc-Asp(OBzl)-DPhe-NMeVal-OH

1. Do roztoku 26,5 g Z-NMeVal-OH ve 200 ml methanolu se přikape 25,3 ml trimethylchlorsilanu a směs se míchá přes noc. Reakční směs se zbaví rozpouštědla a zbytek se vyjme do methyl terc-butyl etheru (MTBE) a promyje se 5% roztokem uhličitanu sodného a vodou. Po odstranění rozpouštědla se zbytek vyjme do methanolu a IN kyseliny chlorovodíkové, smísí se s vodou navlhčeným 10% palladiem na uhlí a hydrogenuje se v mírném proudu vodíku. Po ukončení reakce se katalyzátor odfiltruje, fil12 • ·

trát se zbaví rozpouštědla a zbytek se překrystaluje z ethylacetátu. Získá se hydrochlorid H-NMeVal-OMe v 75% výtěžku.

2. Roztok 16,1 g Z-DPhe-OH, 10 g hydrochloridu H-NMeVal-OMe a 10,1 ml diisopropylethylaminu ve 100 ml dichlormethanu se o- o

chladí na teplotu O až 5 a přidá se 11,35 g EDCI. Směs se o napřed míchá jednu hodinu při teplotě 0 až 5 , pak přes noc při teplotě místnosti. Rozpouštědlo se odstraní a zbytek se vyjme do MTBE a promyje se uhličitanem sodným (5% roztok), IN kyselinou chlorovodíkovou a vodou a usuší se. Po odstranění rozpouštědla se získá Z-DPhe-NMeVal-OMe v 84,5% výtěžklu.

3. Rozpustí se 12 g Z-DPhe-NMeVal-OMe v 80 ml THF a 20 ml vody, smísí se s 10 mg thymolftaleinu a přikává se 10M roztok hydroxidu sodného až do modrého zbarvení indikátoru. Po odbarvení indikátoru se směs opakovaně zpracuje přikapáním 10 M roztoku hydroxidu sodného. Pokud se už odbarvování indikátoru nepozoruje, nastaví se roztok na hodnotu pH 2 10% roztokem hydrogensíránu draselního, methanol se odstraní a produkt se extrahuje MTBE. Po vysušení síranem sodným, se sůl CHA z filtrátu vysráží přidáním 2,9 ml CHA. Získá se Z-DPhe-NMeVal-OH x CHA v 90% výtěžku.

4. Míchá se 16,4 g Z-DPhe-NMeVal-OH x CHA (cyklohexylamoniové soli) ve 250 ml MTBE a 100 ml kyseliny fosforečné (10%) až do úplného rozpuštění. Po odstranění vodné fáze se organická fáze promyje vodou a nasyceným roztokem chloridu sodného a vysuší se. Rozpouštědlo se odstraní a zbytek se vyjme do 15,2 ml 2N roztoku hydroxidu sodného a 150 ml THF a po přidání většiny katalyzátoru (1 g 10% palladia na uhlí) se hydrogenuje v mírném proudu vodíku. Katalyzátor se odfiltruje a čirý roztok se zpracuje 12,1 g Boc-Asp(OBzl)-OSu a 4,5 ml triethylaminu a míchá se přes noc při teplotě místnosti. Po odstranění rozpouštědla se zbytek vyjme do MTBE a promyje se kyselinou fosforečnou (10%), vodou a nasyceným roztokem chloridu sod13 • · ného. Organická fáze se zpracuje 3,3 ml CHA. Výsledná sůl Boc-Asp(OBzl)-DPhe-NMeVal- OH x CHA se odfiltruje a vysuší se ve vakuu. Výtěžek je 93%.

Příklad 2

Syntéza H-Arg(Pbf)-Gly-OtBu

1. Míchá se 33,0 g Z-Arg(Pbf)-OH x CHA ve 300 ml octové kyseliny a 300 ml kyseliny fosforečné až do rozpuštění. Po odstranění vodné fáze se organická fáze promyje vodou a nasyceným roztokem chloridu sodného a vysuší se. Rozpouštědlo se odstraní a zbytek se rozpustí ve 250 ml dichlormethanu s 8,38 g Η-Gly-OtBu x HCI a ochladí se na teplotu 0 C. Přidá se 17,12 ml diisopropylethylaminu a 16,05 g TBTU a směs se míchá 60 mi-

O nut při teplotě 0 Ca přes noc při teplotě místnosti. Rozpouštědlo se odstraní a nahradí se 250 ml ethylacetátu: Po promytí roztokem uhličitanu sodného (5%), vodou a nasyceným roztokem chloridu sodného se rozpouštědlo odstraní. Získá se Z-Arg(Pbf)-Gly-OtBu v 86% výtěžku.

2. Roztok 30 g Z-Arg(Pbf)-Gly-OtBu ve 350 ml THF se smísí se 3 g vodou navlhčeného 10% palladia na uhlí a Z-skupina se odstraní hydrogenací mírným proudem vodíku. Katalyzátor se odfiltruje a rozpouštědlo se odstraní. Zbytek se vyjme do ethylacetátu a zpracuje se dále jako v příkladu 2.1. Získá se Z-Arg(Pbf)-Gly-OtBu v 86% výtěžku.

Příklad 3

Syntéza H-Asp(OBzl)-DPhe-NMeVal-Arg(Pbf)-Gly-OH

1. Převede se 1,23 g Boc-Asp(OBzl)-DPhe-NMeVal-OH x CHA obvyklým způsobem na volnou kyselinu, která se rozpustí ve 12,5 ml dichlormethanu s 0, 81 g H-Arg(Pbf)-Gly-OtBu a 0,22 g DMAP.

o

Roztok se ochladí na 0 až 5 Ca zpracuje se 0,345 g EDCI. Mío chá se dvě hodiny při teplotě 0.5 Ca přes noc při teplotě místnosti. Rozpouštědlo se odstraní, zbytek vyjme do MTBE a zpracuje se dále jako v příkladu 2.1. Získá se Boc-Asp(OBzl)-DPhe-NMeVal-Arg(Pbf)-G1y-OtBu v 82% výtěžku.

2.Rozpustí se 2,3 g Boc-Asp(OBzl)-DPhe-NMeVal-Arg(Pbf)-Gly-OtBu • ve 23 ml 95% mravenčí kyseliny k odstranění koncových chrání- cích skupin a zkoncentruje se ve vakuu v průběhu 30 minut.

Produkt se tri turuje s etherem, odfiltruje se a vysuší se ve vakuu. Získá se Boc-Asp(OBzl)-DPhe-NMeVal-Arg(Pbf)-Gly-OH x HCOOH v 95 % výtěžku.

Příklad 4

Syntéza cyklo(Arg(Pbf)-G1y-Asp(OBzl)-DPhe-NMeVal)

Roztok 11,9 g H-Asp(OBzl)-DPhe-NMeVal-Arg(Pbf)-Gly-OH x

HCOOH v 60 ml MNMP se přikape do míchaného roztoku 7,25 g TBTU a 7,45 ml N-methylmorfolinu ve 180 ml N-methylpyrrolidonu.

Reakční roztok se míchá 20 hodin, načež se přikape do roztoku

47,5 g hydrogenuhli či tanu sodného ve 1800 ml vody. Sraženina se odfiltruje a vysuší se ve vakuu. Získá se cyklo(ArgíPbf)-Gly-Asp(OBzl)-DPhe-NMeVal) v 73,4% výtěžku.

Příklad 5

Syntéza cyklo(Arg-G1y-Asp-DPhe-NMeVal)

1. Roztok 2 g cykloíArg(Pbf)-Gly-Asp(OBzl)-DPhe-NMeVal) ve 26 ml THF se smísí s 0,5 g 10% palladia na uhlí. Nechá se probublávat dvě hodiny vodík, směs se zbaví katalyzátoru a rozpouštědlo se odstraní ve vakuu. Produk vykrystaluje po přidání 32 ml acetonu, odfiltruje se vysuší. Získá se cyklo-(Arg(Pbf)-Gly-Asp-DPhe-NMeVal) v 83% výtěžku.

2. Rozpustí se 1,5 g cyklo(Arg(Pbf)-Gly-Asp-DPhe-NMeVal) v 15 ml 95% TFA. Po jedné hodině se roztok přikape do 150 ml isopropyletheru a pevná látka se odfiltruje a vysuší. Vysušený produkt se rozpustí ve 30 ml směsi isopropanol/voda 1=2 a zpracuje se iontoměničem III (acetátová forma; Měrek KGaA). Zfiltrovaný roztok se zkoncentruje a vysuší se vyhrazováním. Získá se cyk1o(Arg-G1y-Asp-DPhe-NMeVal) v podobě vnitřní soli v 96% výtěžku.

Průmyslová využitelnost

Způsob přípravy cyklického pentapeptidu cykloCArg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal) v daleko větším výtěžku než dosud známými způsoby.

Claims

1. Způsob přípravy cyklického pentapeptidu cyklo(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal) cyklizací lineárního pentapeptidu voleného ze souboru zahrnující ho

H-Arg(Pbf)-Gly-ASp(OBzl)-DPhe-NMeVal-OH,

H -Gly-Asp( OBzl)-DPhe-NMeVal-Arg(Pbf)-OH,

H-Asp(OBzl)-DPhe-NMeVa1-Arg(Pbf)-Gly-OH,

Η-DPhe-NMeVal-Arg(Pbf)-Gly-Asp(OBz)-OH a

H-NMeVal-Arg(Pbf)-Gly-Asp(OBzl)-DPhe-OH, následným odstraněním chránící skupiny a popřípadě další konverzí na fyziologicky přijatelné soli.

2. Způsob přípravy cyklického pentapeptidu cyklo(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal) podle nároku 1,vyznačující se tím, že se cyklizuje pentapetid H-Asp(OBzl)-DPhe-NMeVal-Arg( Pbf)-Gly-OH.

3. Způsob podle nároku 1 nebo 2, vyznačuj ící se tím, še se syntéza lineárního peptidu H-Asp(OBzl)-DPhe-NMeVal-Arg(Pbf)-Gly-OH provádí konvergentně fragmentovou kondenzací tripeptidu R¹-Asp(OBzl)-DPhe-NMeVal-OH, kde znamená R¹ skupinu chránící aminoskupinu, s dipeptidem H-Arg(Pbf)-Gly-R², kde znamená R² skupinu chránící karboxylovou skupinu a chránící skupiny R¹ a R² se odstraní. ⁴

4. Způsob podle nároku 1 až 3, vyznačující se t í m, že tripeptid R¹-Asp(OBzl)-DPhe-NMeVal-OH, kde znamená R¹ skupinu chránící aminoskupinu, se připraví lineární syntézou reagováním Z-DPhe-OH s H-NMeVal-OMe za získání H-DPhe-NMeVal-OMe, který se nechává reagovat s aktivovaným derivátem

R¹-Asp(OBzl)-OH a methylester se štěpí.

5. Způsob podle nároku 1 až 3, vyznačující se tím, že dipeptid H-Arg(Pbf)-Gly-R², kde znamená R² skupinu chránící karboxylovou skupinu, se připraví lineární syntézou reagováním Z-Arg(Pbf)-OH s H-Gly-R² a odstraněním chránící skupiny Z.

6. Lineární pentapeptidy volené ze souboru zahrnujícího H-Arg(Pbf)-Gly-ASp(OBzl)-DPhe-NMeVal-OH,

H-Gly-Asp(OBzl)-DPhe-NMeVal-Arg(Pbf)-OH, H-Asp(OBzl)-DPhe-NMeVal-Arg(Pbf)-Gly-OH,

H-DPhe-NMeVal-Arg(Pbf)-Gly-Asp(OBz)-OH a

H-NMeVal-Arg(Pbf)-Gly-Asp(OBzl)-DPhe-OH jako meziprodukty pro syntézu cyklo( Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal) .