CN107337717A - 一种片段法合成西曲瑞克的方法 - Google Patents

一种片段法合成西曲瑞克的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN107337717A
CN107337717A CN201710530244.4A CN201710530244A CN107337717A CN 107337717 A CN107337717 A CN 107337717A CN 201710530244 A CN201710530244 A CN 201710530244A CN 107337717 A CN107337717 A CN 107337717A
Authority
CN
China
Prior art keywords
fmoc
fragment
resins
tbu
cetrorelix
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201710530244.4A
Other languages
English (en)
Inventor
张冬梅
张颖
冷佳蔚
冯金辉
王仁友
李同金
石鑫磊
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
JINAN KANGHE MEDICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Original Assignee
JINAN KANGHE MEDICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by JINAN KANGHE MEDICAL TECHNOLOGY Co Ltd filed Critical JINAN KANGHE MEDICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Priority to CN201710530244.4A priority Critical patent/CN107337717A/zh
Publication of CN107337717A publication Critical patent/CN107337717A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/23—Luteinising hormone-releasing hormone [LHRH]; Related peptides

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明涉及多肽合成领域，特别涉及一种片段法合成西曲瑞克的方法。本发明采用片段法5+5合成西曲瑞克，其中两个片段可以同时合成，缩短了合成周期；有效的避免了[D‑Cit(Ac)]‑西曲瑞克毒性杂质的产生；西曲瑞克粗肽纯度超过96％，产率在90％以上；纯化后精肽收率在71％以上，纯度在99.80％以上；降低了纯化难度，操作简便，有利于工业大规模生产。

Description

一种片段法合成西曲瑞克的方法
技术领域
本发明涉及多肽合成领域，特别涉及一种片段法合成西曲瑞克的方法。
背景研究
西曲瑞克，英文商品名又为Cetrorelix，是一种直链线性十肽，其分子结构式如下：
氨基酸序列如下：
Ac-D-2Nal-D-Phe(4Cl)-D-3Pal-Ser-Tyr-D-Cit-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2
分子式：C70H92N17O14Cl
分子量：1431.04
CAS：120287-85-6
西曲瑞克(Cetrorelix)，又名醋酸西曲瑞克，早在1999年8月瑞士Ares-Serono公司便完成了西曲瑞克在德国的首次上市。其作为是一种黄体酮释放激素抑制素(LH-RH)受体阻断剂，其能够有效控制卵巢所受到的刺激，阻止不成熟卵泡提前排除，从而有助于受孕。
西曲瑞克作为一种肿瘤治疗药物，具有抵抗促性腺激素释放激素(GnRH)的作用，能有效的抑制垂体分泌卵泡刺激素(FSH)及黄体生成素(LH)，从而能有效的抑制肿瘤的生长或者有效的预防、缓解及治疗其他疾病，特别对于前列腺癌、子宫纤维癌以及卵巢癌等相关癌症，并且西曲瑞克可以与癌细胞膜的LHRH受体相结合，从而抑制癌细胞的转移及增殖。此外，西曲瑞克能够有效的诱导卵巢癌细胞的凋亡。并且相关研究证实西曲瑞克还对于子宫内膜异位、卵巢过度刺激综合征以及良性前列腺肥大等疾病具有较好的预防、改善及治疗效果。
西曲瑞克的合成基本分为固相合成及液相合成两种，由于西曲瑞克中含有例如D-2-Nal、D-Phe(4Cl)、D-3Pal以及D-Cit四种特殊氨基酸，液相缩合非常困难，其中D-2-Nal、D-Phe(4Cl)与D-3Pal相连，缩合难度更大，且每一步纯化困难，因此不适合采用液相合成方法。
固相合成通常采用Boc法和Fmoc法。专利CN101863960A采用Boc保护固相合成法，虽然有效避免了HF的使用；但是采用体积比为1～1.6:1的TFA/DCM溶液脱保护时，会造成树脂上的肽被切除，降低粗肽收率；通过H2与Pd进行脱保护反应24h，反应时间长，粗肽收率仅为60～70％，而H2使用较为危险，Pd金属除尽难度大，对设备要求高。
专利CN101284863A采用Fmoc保护固相合成法，虽然采用最小保护原则，但是最后脱保护，对整条链段进行乙酰化，将导致D-Cit的侧链脲基发生乙酰化，从而产生毒性[D-Cit(Ac)]-西曲瑞克工艺杂质，其结构如下：Ac-D-2Nal-D-Phe(4Cl)-D-3Pal-Ser-Tyr-D-Cit(Ac)-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2；这将严重影响西曲瑞克的使用安全，因此不利于大规模工业生产；并且偶联反应温度在30-50摄氏度，很容易产生消旋肽杂质，从而影响最终产品的光学纯度。
专利CN104086632A公开了一种使用Fmoc-D-Orn(Dde)-OH代替侧基无保护的Fmoc-Cit-OH的固相合成法,虽然此合成方法可以控制毒性[D-Cit(Ac)]-西曲瑞克杂质含量在0.1％以下，但是合成过程中采用毒性水合肼试剂脱除Dde保护，并且Fmoc-D-Orn(Dde)-OH价格昂贵，且工艺复杂。
专利CN104892732A固相合成中其末端氨基酸偶联时采取Ac-D-2Nal-OH，酸解切割肽树脂后使用乙醚进行沉淀，虽然其有效的避免了[D-Cit(Ac)]-西曲瑞克毒性杂质的产生，但是合成中其采用Fmoc-D-Cit-OH作为原料,侧链未保护，后续反应操作步骤多，易发生副反应，引起收率低，纯度不高，纯化难度大。
上述专利技术方案的固相合成中使用氨水、H2、Pd或者水合肼等危险有毒试剂，所用保护氨基酸原料较为昂贵，成本高，合成工艺繁琐，不能完全的避免[D-Cit(Ac)]-西曲瑞克毒性杂质的生成，粗肽的产率及纯度较低，为纯化带来较大困难，不利于醋酸西曲瑞克进行规模放大生产。因此，本发明人对西曲瑞克的合成方法进行了研究，从而得到本发明的技术方案。
发明内容
为解决上述指出的技术问题，本发明提供一种片段法合成西曲瑞克的方法，方案如下：
一种片段法合成西曲瑞克的方法，该方法具体步骤如下：
1)固相合成片段A肽树脂:Ac-D-2Nal-D-Phe(4Cl)-D-3Pal-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-CTC树脂；
2)固相合成片段B肽树脂：H-D-Cit-Leu-Arg(Pbf)-Pro-D-Ala-Sieber树脂；
3)裂解片段A肽树脂得肽片段A：Ac-D-2Nal-D-Phe(4Cl)-D-3Pal-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-OH；
4)裂解片段B肽树脂得片段B：H-D-Cit-Leu-Arg(Pbf)-Pro-D-Ala-CONH2；
5)在缩合剂存在下，片段肽A和片段肽B缩合得到西曲瑞克全保护肽：Ac-D-2Nal-D-Phe(4Cl)-D-3Pal-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Cit-Leu-Arg(Pbf)-Pro-D-Ala-CONH2；
6)西曲瑞克全保护肽经裂解试剂脱保护、制备色谱纯化及转盐、冻干后，得到西曲瑞克精肽。
其中以上技术方案步骤1)中，固相合成肽片段A采用CTC树脂为固相载体，与Fmoc-Tyr(tBu)–OH发生偶联反应得到Fmoc-Tyr(tBu)-CTC树脂；然后脱Fmoc保护后，以2-4倍摩尔量的投料比依次偶联相应的Fmoc保护氨基酸，每一个氨基酸的偶联均在缩合剂存在条件下进行，每一步偶联过程中均以Kaiser test试剂检测反应终点，反应结束后，进行洗涤，然后采用脱保护试剂脱Fmoc保护后，再与下一个Fmoc保护氨基酸进行偶联反应；依次分别偶联Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-D-3Pal-OH、Fmoc-D-Phe(4Cl)-OH、Fmoc-D-2Nal-OH，从而得到Fmoc-D-2Nal-D-Phe(4Cl)-D-3Pal-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-CTC树脂；再进行脱Fmoc保护加入乙酰化试剂进行乙酰化封端，从而得到肽树脂片段Ac-D-2Nal-D-Phe(4Cl)-D-3Pal-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-CTC树脂。
上述步骤1)中制备的Fmoc-Tyr(tBu)-CTC树脂替代度为0.3-1.2mmol/g，优选0.6-1.0mmol/g；脱Fmoc保护试剂优选为20％哌啶/DMF(体积百分比)；乙酰化试剂组合可为乙酸酐/吡啶/DCM或者乙酸酐/DIEA/DCM；偶联反应中选用的缩合剂可为以下组合DIC/HOBT、DIC/HOAT、TBTU/HOBT/DIEA、HATU/HOAT/DIEA的一种。
其中以上技术方案步骤2)中，固相合成肽片段B采用Sieber树脂为固相载体；Sieber树脂脱Fmoc后，以2-5倍摩尔量的投料比依次偶联相应的Fmoc保护氨基酸，每一个氨基酸的偶联均在缩合剂存在条件下进行，每一步偶联过程中均以Kaisertest检测反应终点，反应结束后洗涤，然后脱Fmoc保护，再与下一个Fmoc保护氨基酸进行偶联反应；依次分别偶联Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-D-Cit-OH，得到末端带有Fmoc保护的肽树脂片段Fmoc-D-Cit-Leu-Arg(Pbf)-Pro-D-Ala-Sieber树脂，再脱处Fmoc保护后得NH2-D-Cit-Leu-Arg(Pbf)-Pro-D-Ala-Sieber树脂。更进一步优选的，步骤2)中，Sieber树脂替代度为0.3-1.0mmol/g，优选0.6-1.0mmol/g；脱Fmoc试剂为15～25％(体积含量)哌啶/DMF溶液；偶联反应中选用的缩合剂可为以下组合DIC/HOBT、DIC/HOAT、TBTU/HOBT/DIEA、HATU/HOAT/DIEA的一种。
其中以上技术方案步骤3)和步骤4)中，裂解试剂为TFE/DCM、TFA/DCM、AcOH/TFE/DCM、HFIP/DCM组合中的一种。
其中以上技术方案步骤5)中，肽片段A和肽片段B进行液相片段缩合，偶联试剂组合可选取DIC/HOBT、DIC/HOAT、TBTU/HOBT/DIEA、HATU/HOAT/DIEA、PyAOP/HOAT、PyAOP/HOAT/DIEA或者PyBOP/HOBT/DIEA中的一种。
其中以上技术方案步骤6)中，裂解试剂为加入体积比1-5％清除剂的TFA溶液，清除剂为苯甲醚、苯甲硫醚、乙二硫醇、巯基乙醇、苯酚、水中的一种或几种。
相对于现有技术，本发明的有益效果是：
本发明采用片段法5+5合成西曲瑞克，其中两个片段可以同时合成，缩短了合成周期；有效的避免了[D-Cit(Ac)]-西曲瑞克毒性杂质的产生；西曲瑞克粗肽纯度超过96％，产率在90％以上；纯化后精肽收率在71％以上，纯度在99.80％以上；降低了纯化难度，操作简便，有利于工业大规模生产。
具体实施方式：
下面用具体实施案例对本发明相关操作进行详细说明，但不限定本专利；根据本发明改变原料投料比、反应溶剂或缩合剂等，均属本发明的保护范围。
权利要求书与说明书中所提原料与试剂缩写含义：
Fmoc：9-芴甲氧羰基
tBu：叔丁基
Pbf：2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰
Ac：乙酰基
Boc：叔丁氧羰基
D-Ala：D-丙氨酸
Pro：脯氨酸
Arg：精氨酸
Leu：亮氨酸
D-Cit：D-瓜氨酸
Tyr：酪氨酸
Ser：丝氨酸
D-3-Pal：D-3-吡啶基丙氨酸
D-Phe(4-Cl)：D-4-氯-苯丙氨酸
D-2-Nal：D-2-萘基丙氨酸
D-Orn：D-鸟氨酸
Dde：1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代环己基亚甲基)-3-甲基丁基
HATU：2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸酯
HOAt：N-羟基-7-偶氮苯并三氮唑
HBTU：苯并三氮唑-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸酯
HOBt：1-羟基苯并三唑
DMAP：4-二甲氨基吡啶
PyAOP：(3H-1,2,3-三苯并[4,5-b]吡啶-3-氧基)三-1-吡咯烷基膦六氟磷酸盐
PyBOP：六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷
DIC：N,N’-二异丙基碳二亚胺
DIEA：N,N’-二异丙基乙胺
DMF：N,N-二甲基甲酰胺
DCM：二氯甲烷
Kaiser test检测试剂为：茚三酮
TFA:三氟乙酸
TFE:三氟乙醇
实施例1：Fmoc-Tyr(tBu)-CTC Resins的合成
准确称取CTC树脂20.0g(sub＝1.0mmol/g)放入多肽合成柱中，分别用200ml DMF洗涤两次，加入160mL DCM溶胀树脂30min，抽掉DCM后，用200mL DMF洗涤两次，后加入Fmoc-Tyr(tBu)-OH/DCM/DIEA的混合溶液[准确称取Fmoc-Tyr(tBu)-OH 18.38g(40mmol，2eq)加入至100ml锥形瓶中，加入80ml DCM溶解，冰水浴15分钟，加入26.44ml DIEA(160mmol,8.0eq)冰水浴活化4分钟]，氮气搅拌反应1小时。偶联结束后，加入DCM/CH3OH/DIPEA(体积比17：2：1)混合溶液200ml封端3次，每次10min；抽干反应液，分别用180ml DMF洗涤树脂6次，每次洗涤2～3分钟。分别用DCM，甲醇各洗涤树脂2次，每次2～3分钟，真空干燥树脂得26.44g，取少量树脂，测替代度为0.653mmol/g。
实施例2：Ac-D-2Nal-D-Phe(4Cl)-D-3Pal-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-CTC树脂的合成
称取实施例1中替代度为0.653mmol/g Fmoc-Tyr(tBu)-CTC Resins 26.04g(合成规模17.00mmol)置于多肽合成柱中，加入200ml DCM溶胀树脂30min，抽掉DCM，分别用160mlDMF洗涤2次，每次2～3分钟；分别用20％哌啶/DMF溶液200ml脱保护2次，每次脱保护10分钟；然后分别用160ml DMF洗涤树脂6次，每次2～3分钟；抽干DMF后加入Fmoc-Ser(tBu)-OH/HOBT/DIC的混合溶液[称取Fmoc-Ser(tBu)-OH 13.04g(34.00mmol,2eq)、HOBT5.28g(39.10mmol,2.3eq)加入至100ml锥形瓶中，加入80ml DMF溶解，冰水浴15分钟，加入DIC 6.05ml(39.10mmol,2.3eq)冰水浴活化4分钟]，N2搅拌反应2.5小时，反应终点采取Kaiser试剂检测，反应结束抽掉反应液；分别用160ml DMF洗涤树脂6次，每次洗涤2～3分钟；随后再依次进行上述脱保护，洗涤，偶联，洗涤操作，其中偶联氨基酸依次为Fmoc-D-3Pal-OH、Fmoc-D-Phe(4Cl)-OH、Fmoc-D-2Nal-OH。从而得到Fmoc-D-2Nal-D-Phe(4Cl)-D-3Pal-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-CTC树脂，同样反应终点用Kaiser试剂检测。
得到的Fmoc-D-2Nal-D-Phe(4Cl)-D-3Pal-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-CTC树脂后，分别用200ml20％哌啶/DMF试剂脱保护2次，每次10分钟；然后依次用200ml DMF、DCM各洗涤3次，每次2～3分钟；加入乙酸酐、吡啶、DCM(1:0.85:2.15,v/v)的混合溶液160ml进行乙酰化封端，0～25℃温度下封端2.0小时。结束后用160ml DMF洗涤树脂6次，每次2～3分钟；再分别用180ml DCM和甲醇各洗涤收缩树脂3次，每次进行3分钟，收缩完毕后于真空干燥箱干燥树脂。肽树脂称重为36.24g，肽树脂Ac-D-2Nal-D-Phe(4Cl)-D-3Pal-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-CTC增重率为98.86％。
实施例3：Ac-D-2Nal-D-Phe(4Cl)-D-3Pal-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-OH的合成
准确称取36.24g实施例2中的Ac-D-2Nal-D-Phe(4Cl)-D-3Pal-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-CTC肽树脂，加入至500ml三口圆底烧瓶中，然后配置裂解试剂，裂解试剂用量为360ml，裂解试剂配制为TFE:醋酸:DCM体积比为2:2:6，先混合均匀后，加入反应瓶中，室温裂解3.0小时；裂解完成后抽滤，树脂用25ml裂解试剂洗涤树脂2次，合并滤液，加入至4L冰甲叔醚中，沉降半小时后离心，并用甲叔醚洗涤6次，离心转速3500r/min，时间3分钟，真空干燥过夜，称重肽片段Ac-D-2Nal-D-Phe(4Cl)-D-3Pal-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-OH重量为15.76g，产率高达97.34％，纯度99.14％。
实施例4：Fmoc-D-Ala-SieberResins的合成
准确称取Sieber树脂35.0g(sub＝0.60mmol/g)置于多肽合成柱中，分别用350mlDMF洗涤两次，然后加入350ml DMF溶胀树脂30min，抽掉DMF后，加入20％哌啶/DMF溶液260ml脱保护2次，每次10min，然后用300ml DMF洗涤6次；抽掉DMF后加入Fmoc-D-Ala-OH/HOBT/DIC的混合溶液[准确称取Fmoc-D-Ala-OH 13.08g(42mmol，2eq)；HOBT 6.53g(48.3mmol，2.3eq)加入至150ml锥形瓶中，加入130ml DMF溶解，冰水浴15分钟，加入7.47mlDIC(48.3mmol,2.3eq)冰水浴活化4分钟]，将活化溶液加入多肽合成柱中，氮气搅拌反应3小时。反应结束后，抽掉反应液分别用300ml DMF洗涤树脂6次，后进行封端处理，封端试剂为250ml(50ml乙酸酐、42.5ml吡啶和158ml DMF)，封端反应2h。反应结束后抽掉封端液，分别用300ml DMF，DCM，甲醇各洗涤树脂2次，每次2～3分钟，真空干燥树脂得40.5g，取少量树脂，测替代度为0.475mmol/g。
实施例5：H-D-Cit-Leu-Arg(Pbf)-Pro-D-Ala-Sieber树脂的合成
称取实施例4中替代度为0.475mmol/g Fmoc-D-Ala-Sieber树脂38.95g(合成规模18.50mmol)置于多肽合成柱中，加入380ml DCM溶胀树脂30min，抽掉DCM，用350ml DMF洗涤2次，每次2～3分钟；分别用20％哌啶/DMF溶液380ml脱保护2次，每次脱保护10分钟；然后用350ml DMF洗涤树脂6次，每次2～3分钟；抽干后加入Fmoc-Pro-OH/HOBT/DIC的混合溶液[称取Fmoc-Pro-OH 14.66g(37.0mmol,2eq)、HOBT 5.75g(42.55mmol,2.3eq)加入至200ml锥形瓶中，加入150ml DMF溶解，冰水浴15分钟，加入DIC 6.59ml(42.55mmol,2.3eq)冰水浴活化4分钟]，N2搅拌偶联反应2.5小时，反应终点采取Kaiser试剂检测，反应结束抽掉反应液；分别用350ml DMF洗涤树脂6次，每次洗涤2～3分钟；随后再依次进行上述操作：脱保护，洗涤，偶联，洗涤操作。其中，偶联的Fmoc保护氨基酸依次为Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-D-Cit-OH。偶联温度均在20℃，同样偶联每个氨基酸反应终点均采用Kaiser test检测，均在1小时左右完全反应，从而得到Fmoc-D-Cit-Leu-Arg(Pbf)-Pro-D-Ala-Sieber树脂。然后分别用20％哌啶/DMF溶液380ml脱保护2次，每次脱保护10分钟；然后分别用350mlDMF洗涤树脂3次，每次2～3分钟，再分别用360ml DCM和甲醇各洗涤收缩树脂3次，每次进行3分钟，抽掉甲醇后于真空干燥箱干燥树脂。肽树脂称重为48.93g，肽树脂H-D-Cit-Leu-Arg(Pbf)-Pro-D-Ala-Sieber增重率为98.86％。
实施例6：H-D-Cit-Leu-Arg(Pbf)-Pro-D-Ala-CONH2的合成
准确称取48.93g实施例5中合成的肽树脂H-D-Cit-Leu-Arg(Pbf)-Pro-D-Ala-Sieber树脂，加入至1000ml三口圆底烧瓶中，然后配置裂解试剂，裂解试剂用量为500ml，裂解试剂配制为TFE:醋酸:DCM体积比为2:2:6，先混合均匀后，加入反应瓶中，室温裂解3.0小时；裂解完成后抽滤，树脂用40ml裂解试剂洗涤树脂2次，合并滤液，浓缩后加入至冰甲叔醚中，沉降半小时后离心，并用甲叔醚洗涤6次，离心转速3500r/min，时间3分钟，真空干燥过夜，称重片段肽H-D-Cit-Leu-Arg(Pbf)-Pro-D-Ala-CONH2重量为15.03g，产率高达94.12％，纯度98.96％。
实施例7：Ac-D-2Nal-D-Phe(4Cl)-D-3Pal-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Cit-Leu-Arg(Pbf)-Pro-D-Ala-CONH2的合成
准确称取14.97g(16mmol)实施例3中合成的肽片段Ac-D-2Nal-D-Phe(4Cl)-D-3Pal-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-OH加入三口圆底烧瓶中，加入140ml DCM充分溶解同时加入20mlDMF助溶，冰水浴条件下冷却，再依次称取9.18g PyAOP、2.40g HOAT以及8.27g DIEA加入烧瓶中活化后，再加入事先用130ml DCM及20ml DMF溶解的13.82g(16mmol)实施例6中合成的H-D-Cit-Leu-Arg(Pbf)-Pro-D-Ala-CONH2肽片段，升至室温反应2小时，不断进行HPLC检测反应终点。反应结束后，旋蒸浓缩后加入甲叔醚析出固体，并用甲叔醚洗涤，所得固体再进行重结晶得到全保护肽Ac-D-2Nal-D-Phe(4Cl)-D-3Pal-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Cit-Leu-Arg(Pbf)-Pro-D-Ala-CONH2称重为27.23g，产率为95.50％,纯度为97.69％。
实施例8：西曲瑞克粗肽Ac-D-2Nal-D-Phe(4Cl)-D-3Pal-Ser-Tyr-D-Cit-Leu-Arg-Pro-D-Ala-CONH2的合成
将实施例7中得到的全保护肽Ac-D-2Nal-D-Phe(4Cl)-D-3Pal-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Cit-Leu-Arg(Pbf)-Pro-D-Ala-CONH2(26.73g，15mmol)加入至500ml三口圆底烧瓶中，然后配置裂解试剂，裂解试剂用量为220ml，裂解试剂组分为TFA、TIS、苯基甲基硫醚与H2O，其中各组分的体积比分别为90:2.5:2.5:5，先预冻裂解试剂2小时，后加入烧瓶中，冰浴半小时，后升温室温裂解2.0小时；裂解完成后抽滤，合并滤液，加入至冰甲叔醚中沉降半小时后离心，并用甲叔醚洗涤6次，离心转速3500r/min，时间3分钟，真空干燥过夜，得到西曲瑞克粗肽Ac-D-2Nal-D-Phe(4Cl)-D-3Pal-Ser-Tyr-D-Cit-Leu-Arg-Pro-D-Ala-CONH2，重量为20.07g，产率93.05％，纯度96.86％。
实施例9：西曲瑞克粗肽Ac-D-2Nal-D-Phe(4Cl)-D-3Pal-Ser-Tyr-D-Cit-Leu-Arg-Pro-D-Ala-CONH2纯化
将西曲瑞克粗肽溶于乙腈和水的混合溶液中，抽滤，滤液采用C18或者C8反相色谱柱子上样纯化，流动相采用三氟乙酸盐：乙腈(0.1-100:100-0.1，v/v),检测波长为220nm，收集样品峰并合并合格样品后，进行脱盐，冻干，得到西曲瑞克精肽，纯化后精肽收率71.86％，纯度为99.86％。

Claims (10)

1.一种片段法合成西曲瑞克的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(a)固相合成片段A肽树脂:Ac-D-2Nal-D-Phe(4Cl)-D-3Pal-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-CTC树脂；
(b)固相合成片段B肽树脂：H-D-Cit-Leu-Arg(Pbf)-Pro-D-Ala-Sieber树脂；
(c)裂解片段A肽树脂得肽片段A：Ac-D-2Nal-D-Phe(4Cl)-D-3Pal-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-OH；
(d)裂解片段B肽树脂得片段B：H-D-Cit-Leu-Arg(Pbf)-Pro-D-Ala-CONH2；
(e)在缩合剂存在下，片段肽A和片段肽B缩合得到西曲瑞克全保护肽Ac-D-2Nal-D-Phe(4Cl)-D-3Pal-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Cit-Leu-Arg(Pbf)-Pro-D-Ala-CONH2；
(f)西曲瑞克全保护肽经裂解试剂脱保护、制备色谱纯化及转盐、冻干后，得到西曲瑞克精肽。
2.根据权利要求1所述的片段法合成西曲瑞克的方法，其特征在于，步骤(a)固相合成片段A肽树脂的方法为：采用CTC树脂为固相载体，与Fmoc-Tyr(tBu)–OH发生偶联反应得到Fmoc-Tyr(tBu)-CTC树脂；然后脱Fmoc后，以2-4倍摩尔量的投料比依次分别偶联Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-D-3Pal-OH、Fmoc-D-Phe(4Cl)-OH、Fmoc-D-2Nal-OH，每一个氨基酸的偶联均在缩合剂存在条件下进行，每一步偶联过程中均以Kaisertest试剂检测反应终点，反应结束后，进行洗涤，然后采用脱保护试剂脱Fmoc保护后，再与下一个Fmoc保护氨基酸进行偶联反应；从而得到Fmoc-D-2Nal-D-Phe(4Cl)-D-3Pal-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-CTC树脂；再进行脱Fmoc后，加入乙酰化试剂进行乙酰化封端，从而的到片段A肽树脂:Ac-D-2Nal-D-Phe(4Cl)-D-3Pal-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-CTC树脂。
3.根据权利要求2所述的片段法合成西曲瑞克的方法，其特征在于，步骤(a)中CTC树脂替代度为0.3-1.2mmol/g。
4.根据权利要求2所述的片段法合成西曲瑞克的方法，其特征在于，步骤(a)中CTC树脂替代度优选为0.6-1.0mmol/g。
5.根据权利要求1所述的片段法合成西曲瑞克的方法，其特征在于，步骤(b)中固相合成片段B肽树脂的方法为：采用Sieber树脂为固相载体，Sieber树脂脱Fmoc后，以2-5倍摩尔量的投料比依次分别偶联Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-D-Cit-OH，每一个氨基酸的偶联均在缩合剂存在条件下进行，每一步偶联过程中均以Kaiser test检测反应终点，反应结束后洗涤，然后脱Fmoc保护，再与下一个Fmoc保护氨基酸进行偶联反应；得到H-D-Cit-Leu-Arg(Pbf)-Pro-D-Ala-Sieber树脂。
6.根据权利要求5所述的片段法合成西曲瑞克的方法，其特征在于，步骤(b)所述Sieber树脂替代度为0.3-1.0mmol/g。
7.根据权利要求5所述的片段法合成西曲瑞克的方法，其特征在于，步骤(b)所述Sieber树脂替代度优选为0.6-1.0mmol/g。
8.根据权利要求1所述的片段法合成西曲瑞克的方法，其特征在于，步骤(c)和步骤(d)所述裂解所用的裂解试剂为TFE/DCM、TFA/DCM、AcOH/TFE/DCM、HFIP/DCM组合中的一种。
9.根据权利要求2或5所述的片段法合成西曲瑞克的方法，其特征在于，所述脱Fmoc所用的试剂为体积百分含量15～25％哌啶/DMF溶液；偶联反应中选用的缩合剂为DIC/HOBT、DIC/HOAT、TBTU/HOBT/DIEA、HATU/HOAT/DIEA、PyAOP/HOAT、PyAOP/HOAT/DIEA或者PyBOP/HOBT/DIEA组合中的一种。
10.根据权利要求1所述的片段法合成西曲瑞克的方法，其特征在于，步骤(e)中所述裂解试剂为加入体积比1-5％清除剂的TFA溶液，所述清除剂为苯甲醚、苯甲硫醚、乙二硫醇、巯基乙醇、苯酚、水中的一种或几种。
CN201710530244.4A 2017-06-28 2017-06-28 一种片段法合成西曲瑞克的方法 Pending CN107337717A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710530244.4A CN107337717A (zh) 2017-06-28 2017-06-28 一种片段法合成西曲瑞克的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710530244.4A CN107337717A (zh) 2017-06-28 2017-06-28 一种片段法合成西曲瑞克的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN107337717A true CN107337717A (zh) 2017-11-10

Family

ID=60219397

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710530244.4A Pending CN107337717A (zh) 2017-06-28 2017-06-28 一种片段法合成西曲瑞克的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107337717A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110903352A (zh) * 2019-12-27 2020-03-24 中肽生化有限公司 一种西曲瑞克的制备方法
CN112159461A (zh) * 2020-09-29 2021-01-01 开封明仁药业有限公司 一种西曲瑞克的合成方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101918428A (zh) * 2007-11-19 2010-12-15 索尔维公司 用于制造全硅烷化肽的方法
CN104610433A (zh) * 2015-02-13 2015-05-13 泰州施美康多肽药物技术有限公司 一种西曲瑞克的制备方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101918428A (zh) * 2007-11-19 2010-12-15 索尔维公司 用于制造全硅烷化肽的方法
CN104610433A (zh) * 2015-02-13 2015-05-13 泰州施美康多肽药物技术有限公司 一种西曲瑞克的制备方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
古练权等主编: "《生物有机化学》", 30 June 1998, 高等教育出版社 *
石卫华等: "西曲瑞克的固相合成", 《中国药物化学杂志》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110903352A (zh) * 2019-12-27 2020-03-24 中肽生化有限公司 一种西曲瑞克的制备方法
CN112159461A (zh) * 2020-09-29 2021-01-01 开封明仁药业有限公司 一种西曲瑞克的合成方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU723268B2 (en) Improved solid-phase peptide synthesis and agent for use in such synthesis
CN104650219B (zh) 片段缩合制备利拉鲁肽的方法
CN101538315B (zh) 一种固相法和液相法结合制备亮丙瑞林的方法
CN113330024A (zh) 制备gip/glp1双重激动剂的方法
CN107573408B (zh) 一种高纯度亮丙瑞林的合成方法
CN104387454B (zh) 一种片段缩合制备曲普瑞林的方法
CN102702327B (zh) 一种阿拉瑞林的固液相合成法
EP2125862A1 (en) Methods for the synthesis of cyclic peptides
CN104004064B (zh) 一种布舍瑞林的制备方法
CN104892732A (zh) 一种西曲瑞克的制备方法
CN104861042A (zh) 特异性微波合成制备醋酸西曲瑞克的方法
KR20150032265A (ko) 세포 침투성 펩티드 및 세포 침투성 펩티드의 식별 방법
CN107056894B (zh) 一种片段法固相合成醋酸加尼瑞克的方法
CN104177490B (zh) 片段缩合制备醋酸鲑鱼降钙素的方法
EP1701976A2 (en) Peptide synthesis and deprotection with co-solvent
CN107337717A (zh) 一种片段法合成西曲瑞克的方法
CN103980357B (zh) 一种合成胸腺法新的方法
CN105273062B (zh) 片段缩合制备比伐卢定的方法
CN110903352A (zh) 一种西曲瑞克的制备方法
CN102229649A (zh) 一种机体保护多肽(bpc 157肽)的制备方法
CN105622727A (zh) 一种固相和液相结合合成亮丙瑞林的方法
CN110922453B (zh) 一种戈舍瑞林的合成方法
CN107022002A (zh) 一种固液结合制备地加瑞克的方法
CN104277093A (zh) 以Rink Amide-AM Resin为载体制备醋酸西曲瑞克的方法
CN108383896A (zh) 一种片段法合成戈舍瑞林的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20171110